Summary
Presenteras här är ett protokoll för fält identifiering av Matricaria chamomilla med hjälp av en bärbar qPCR system. Detta lättexpedrarliga protokoll är idealiskt som metod för att bekräfta identiteten hos en botanisk art på platser där tillgången till laboratorieutrustning och expertis är begränsad, såsom gårdar och lager.
Abstract
Kvalitetskontroll i botaniska produkter börjar med råvarutillförseln. Traditionellt utförs botanisk identifiering genom morfologisk bedömning och kemiska analysmetoder. Bristen på tillgång till botaniker, särskilt under de senaste åren, i kombination med behovet av att förbättra kvalitetskontrollen för att bekämpa den stress på försörjningskedjan som förs med hjälp av ökad efterfrågan från konsumenterna och klimatförändringarna, kräver alternativa metoder. Målet med detta protokoll är att underlätta botaniska arter identifiering med hjälp av en bärbar qPCR system på fältet eller i någon inställning, där tillgången till laboratorieutrustning och expertis är begränsad. Mål-DNA förstärks med hjälp av färgämnesbaserad qPCR, med DNA som extraheras från botaniska referensmaterial som fungerar som en positiv kontroll. Målet DNA identifieras genom dess specifika förstärkning och matcha dess smältande topp mot den positiva kontrollen. En detaljerad beskrivning av stegen och parametrarna, från praktisk fältprovsinsamling, till DNA-extraktion, PCR-förstärkning, följt av datatolkning, har inkluderats för att säkerställa att läsarna kan replikera detta protokoll. Resultaten producerade anpassa med traditionella laboratorium botaniska identifieringsmetoder. Protokollet är lätt att utföra och kostnadseffektivt, vilket möjliggör kvalitetsprovning på råvaror så nära försörjningskedjans ursprungspunkt som möjligt.
Introduction
Bruket att använda växter för att upprätthålla och förbättra hälsan går tillbaka till tusentals år. På grund av påfrestningar på försörjningskedjan väckts av ökad efterfråganfrån konsumenterna 1, ohållbar skörd metoderoch klimatförändringar 2, botaniska äktenskapsbrott blir en växande oro i livsmedel och kosttillskott industrin3. Förekomsten av odeklarerade eller felidentifierade botaniska arter kan leda till minskad effekt, eller till och med säkerhetsfrågor. Till exempel, svart silverax (Actaea racemosa), används för behandling av premenstruella obehag, kan ersättas med en lågprissasiska asiatiska arter med begränsad kliniska data stöd för dess effekt4. I ett allvarligare fall, substitution av Aristolochia fangchi för Stephania terandra i en klinisk studie för viktminskning med hjälp av kinesiska örter ledde till allvarliga nefrotoxicitet och njursvikt i vissadeltagare 5,6. De två olika arterna delade ett kinesiskt vanligt namn "Fang Ji". Dessa fall belyser behovet av strängare kvalitetskontroll, med början i identifieringenav råvaror 7, helst så nära försörjningskedjans ursprungspunkt som möjligt, så att resurserna effektivt kan tilldelas materialet med korrekt identitet.
Ett antal ortogonala tillvägagångssätt kan användas för botanisk identifiering. Traditionellt utförs botanisk identifiering genom morfologisk bedömning8,9 och kemiska analysmetoder10,11,12,13. Morfologisk identifiering baseras på skillnader i makroskopiska och mikroskopiska funktioner hos växtmaterial om skillnader finns (Figur 1). Men bristen på utbildningsprogram på klassisk botanik under de senaste åren har resulterat i en brist på experter14, vilket gör detta tillvägagångssätt opraktiskt för rutinmässig kvalitetskontroll. Dess tillämpning i pulveriserade botaniska material är också begränsad. Kemiska analysmetoder används ofta i farmakopéer och laboratorier, men är inte idealiska för fälttestning på grund av storleken på instrument som High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC), High Performance Liquid Chromatography (HPLC), och Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) (Figur 2), och miljökrav. På senare tid har genomiska metoder framkommit som en alternativ teknik för botaniska arters autentisering och substitutionsdetektering och har visat sig vara effektiv och exakt. Genomiska metoder utnyttja den höga återgivning och specificitet genetisk information i växtmaterial15,16,17,18,19. Molekylära diagnosverktyg finns i form av bärbara enheter, och ofta omfattar automatiserade data tolkning verktyg som sänker barriären till teknik användning, vilket gör denna metod idealisk förfältidentifiering 20,21,22,23,24. När molekyläranalysmetoden har utformats och validerats25,26,27, kan den utföras av vilken personal som helst med grundläggande molekylärbiologisk träning. Bland de olika bärbara verktyg som finns, realtid PCR på DNA-sekvenser är en av de kostnadseffektiva val28. Kombinationen av en bärbar enhet, tillsammans med anpassad och validerad molekylär analys, möjliggör verifiering av botaniska arter och ingredienser utanför laboratoriet, såsom i gårdar och botaniska materiallager, vilket minskar tiden och kostnaderna i samband med traditionella metoder.
Målet med detta protokoll är att införa en metod för botanisk identifiering i situationer där tillgången till laboratorieutrustning och expertis är begränsad eller inte tillgänglig, med hjälp av ett bärbart qPCR-system. Metoden demonstreras på ett fält av Matricaria chamomilla (Figur 3A), allmänt känd som tysk kamomill, allmänt använd för dess antiinflammatoriska och antioxiderandeegenskaper 29. Det kan förväxlas med närstående arter av liknande utseende eller lukt, särskilt från släktena Chamaemelum, Tanacetum, och Chrysanthemum30,31,32. Bland de besläktade arterna, Chamaemelum nobile, även känd som romersk kamomill, är en märkbar en med jämförbara produktionsnivåer i handeln (Figur 3B). Den metod som demonstrerades var utformad för att inte bara identifiera målet botaniska arter M. chamomilla, men också upptäcka dess nära släkting, C. nobile, baserat på specifika amplifiering av DNA-sekvenser.
Denna artikel förklarar, i detalj, hur man utför fält botaniska identifiering av M. chamomilla med hjälp av intercalating färgämne-baserade qPCR och smälta kurvan analys på en bärbar enhet. Protokollet omfattar insamling av botaniska prover från fältet, på plats DNA-extraktion, och inrättande av realtid PCR reaktion. För att säkerställa en giltig slutsats, mål botaniska M. chamomilla och icke-mål botaniska C. nobile genomisk DNA, pre-extraheras från certifierade botaniska referensmaterial, används som positiv kontroll. Specificiteten hos denna metod visas genom att både M. chamomilla och C. nobile identifieringstester individuellt på prov och kontroller. Icke-mall negativ kontroll används för att utesluta falska positiva resultat som orsakas av PCR kontaminering.
Protocol
1. Provsamling
- Ställ in ett testområde i fält med en plan och vågrät yta.
- Identifiera en representativ växt som återspeglar egenskaperna hos majoriteten av växterna i kamomillblomsfältet (Figur 4).
- Plocka ett blomhuvud från den representativa växten med hjälp av sterila handskar.
- Placera provet i ett 2,0 mL uppsamlingsrör.
- Upprepa steg 1.3 till 1.4 och samla en bipacksedel (ungefär 0,5–0,7 cm lång) från samma anläggning.
OBS: M. chamomilla blomma och blad är tillräckligt små för att sitta längst ner på en 2,0 mL samlingsrör. För andra botaniska växter med större yta kan en pappersstans eller en sax (sköljd i 70% etanol före användning) användas för att isolera vävnadsprover för testning. När flera provtagningar krävs, skölj pappersstansen eller saxen mellan hantering av olika prover.
2. DNA-extraktion
- Värm inkubatorn för torrt bad till 95 °C.
- Till varje uppsamlingsrör, tillsätt 100 μL av extraktionslösningen från anläggningens DNA-extraktionssats (listad i Table of Materials). För bättre DNA-extraktionseffektivitet, slipa vävnadsprovet i extraktionslösningen med hjälp av en vävnadspempning.
- Stäng röret. Se till att den botaniska vävnaden täcks med extraktionslösningen under hela extraktionsprocessen.
- Placera uppsamlingsrören i en förvärmd inkubator för torra bad och inkubera uppsamlingsrören vid 95 °C i 10 min.
- Efter 10 min, ta rören ur torrbad inkubatorn.
- Tillsätt 100 μL av utspädningslösningen från samma DNA-extraktionssats och blanda lösningen genom pipettering upp och ner flera gånger.
- Upprepa samma steg för bipacksedelutsug.
- Skaka för att blanda lösningen ytterligare. Växtvävnaden verkar vanligtvis inte vara nedbrutet efter denna behandling. Den flytande färgen kan förändras och bli grumlig.
OBS: Den utspädda lösningen kan förvaras i rumstemperatur över natten om den inte fortsätter omedelbart. Det är inte nödvändigt att ta bort det cellulära skräpet från växtvävnad före lagring. Vätskan i rören håller DNA-mallar för nedströms PCR förstärkning.
3. PCR-reaktionsinställning
- Konfigurera villkoren för qPCR-instrumentets termocycling enligt tillverkarens specifikationer. Applicera PCR-termokullprofilen som anges i (Tabell 1), som inleds med ett steg med konstant temperatur för initial denaturering, följt av 25 cykler av förstärkning, och slutar med temperaturrampning för att erhålla en smältkurva med hög upplösning.
- Tina qPCR Master Mix och primers (tabell 2) vid rumstemperatur före användning.
- Planera den reaktion som kommer att laddas i varje brunn: brunnar som innehåller positiv kontroll med målarter, positiv kontroll med icke-målarter, prover och negativ kontroll (Figur 5).
- I det här exemplet används tio brunnar – fem för det tyska kamomillidentifieringstestet och de återstående fem för det romerska kamomillidentifieringstestet. För varje typ av artidentifikationstest innehåller en brunn positiv kontroll med DNA som extraherats från målarters referensmaterial, en brunn innehåller positiv kontroll med DNA som extraherats från icke-riktade arters referensmaterial, två brunnar fylls med blom- och blad-DNA-prover som utvinns från fältet, och en brunn tilldelas för en negativ kontroll. I tabell 3 beskrivs varje brunnstyp.
- Förbered en reaktion master-mix enligt manualen för varje botaniska arter identifiering test. En typisk reaktion master-mix innehåller universell qPCR Master Mix (2x), framåt och omvänd artspecifika primers, och nuklea-fritt vatten. I tabell 4 anges reaktionssystemets sammansättning.
OBS: Om du inte använder omedelbart, förvara qPCR reaktion master-mix på +2 °C till +8 °C i en kylare eller mini-kylskåp. - Blanda noggrant reaktionsmästar-mixen genom pipettering före användning.
- Placera qPCR-kassetten med framsidan upp på en plan och stabil yta.
- Ladda 18 μL av reaktionsmästar-mixen konfigurerad i steg 3.4 i patronens brunnar enligt de brunnar som definieras i steg 3.3. För denna demonstration, lägg till den tyska kamomill identifieringstestets master mix i brunnar märkta för GC-test (GCT i brunnarna 1, 3, 5, 7, 9) och den romerska kamomillidentifieringstestets master-mix i brunnar märkta för RC-test (RCT i brunnarna 2, 4, 6, 8, 10) (se figur 5).
- Överför 2 μL prov-DNA från supernatanten för DNA-extraktionsrör och förutvunna DNA-positiva kontroller till patronväldarna förladdade med qPCR master mix. Efter att ha lagt till varje DNA-mall till qPCR-huvudmixen, blanda lösningen försiktigt genom pipettering.
OBS: Undvik flytande cellulärt skräp vid överföring av DNA från DNA-extraktionsröret. Använd minicentrifug för att separera supernatant och cellulära skräp, om det behövs. - Förslut försiktigt patronen med självhäftande film. Lägg fast patronen på termocyklingskammaren och stäng den.
- Ställ in att qPCR-instrumentet ska köras.
Representative Results
Efter det protokoll som beskrivs i avsnitt 1, botaniska DNA från blomma huvud och blad extraherades i supernatanten efter värme inkubation av insamlingsröret vid 95 °C i 10 min. I den aktuella studien visade supernatanten en gul och grönaktig färg för både blomma och blad, vilket indikerar att en mängd naturliga föreningar släpptes ut i supernatanten med botaniskt DNA (Figur 6). Även om tillförlitlig PCR förstärkning uppnåddes senare i tre exemplar för alla fält extraherade DNA mall, DNA kvalitetsbedömning utfördes i laboratoriet som referens. Koncentrationen av blomhuvud-DNA-extrakt, bestämt genom fluorometri, varierade från 3,69–5,36 ng/μL, medan koncentrationen av blad-DNA-extrakt varierade från 6,42–9,29 ng/μL. A260/A280 och A260/A230-absorbanskvoterna av blom- och blad-DNA-extrakt mättes med spektrofotometri. Men på grund av överlappningen mellan DNA och fytokemiska UV absorptionsspektrum, kunde dessa förhållanden inte tillförlitlighet mätt (data visas inte).
Interkalating fluorescerande färgämne användes för att övervaka förstärkning av målfragment i realtid. Eftersom både de specifika primers M. chamomilla och C. nobile rikta den interna transkriberade spacer 2 (ITS2) region, som har tiotals till hundratals kopior i växtgenomet, 25 PCR förstärkning cykler är tillräckliga för att generera tillräckligt amplikoner för identifiering av kamomill arter. I figur 7var Ct-värdet för M. chamomilla positiv kontroll i M. chamomilla identifieringstest mindre än 25 (GCP_GCT), medan efter 25 förstärkningscykler, fluorescensen av samma kontroll i C. nobile identifiering test var under detekteringströskeln (GCP_RCT). Å andra sidan, efter 25 cykler, fluorescensen för C. nobile positiv kontroll i M. chamomilla identifieringstest var under detektionströskeln (RCP_GCT), medan Ct-värdet för samma kontroll i C. nobile identifieringstest var mindre än 25 (RCP_RCT). Förstärkningen av mål- och icke-mål positiva kontroller i sina respektive analyser visar specificiteten hos M. chamomilla identifiering analysen. För prov-DNA gav fältblommahuvud och blad-DNA-extrakt Ct-värden på 15.18 respektive 19.41 i M. chamomilla identification test (Sample1(FLOWER)_GCT och Sample2(LEAF)_GCT). Båda dessa prover förstärktes inte i C. nobile identification test (Sample1(FLOWER)_RCT och Sample2(LEAF)_RCT). Förstärkningsmönstren för båda proverna matchade amplification-mönstret för M. chamomilla positiv kontroll. Negativa kontroller var inte amplifieras i både M. chamomilla och C. nobile identifiering tester (NC_GCT och NC_RCT), exklusive möjligheten till falska positiva som orsakas av PCR kontaminering. För att ytterligare bekräfta specifik förstärkning i positiva kontroller och prover, var fraktioner av PCR slutprodukt från varje brunn köras på 2% agaros gel i laboratoriet (Figur 8). För M. chamomilla identifieringstest gav båda fältproverna amplikoner som körs på samma position som M. chamomilla positiv kontroll med en uppskattad storlek något över 100 bp (teoretisk storlek 102 bp). För C. nobile identifieringstest gav icke-målarter C. nobile positiv kontroll ett band mellan 50 och 100 bp, som passar den teoretiska storleken på 65 bp. Resten av körfälten visade ingen specifik förstärkningsprodukt, som var överens med frånvaron av fluorescerande signal för dessa brunnar, vilket observerades vid fälttester.
Efter PCR-amplifiering utfördes en analys av smältkurvan för att bedöma dissociationsegenskaperna hos dubbelsträngat DNA (dsDNA) under uppvärmningen. När temperaturen ramped upp under den slutliga cykeln för smältkurva analys, ökade temperaturen orsakade dubbelstränga amplikoner att separera. Det interkalerande fluorescerande färgämnet släpptes gradvis ut i lösningen, vilket minskade fluorescensintensiteten (Figur 9A). Böjningspunkten för den första derivatkurvan användes för att bestämma smälttemperaturen (Tm) (Figur 9B), som huvudsakligen beror på DNA-fragmentlängd och GC-innehåll. Att kombinera Ct-värde med smälttemperatur kan öka specificiteten hos qPCR-analys. I den aktuella studien inträffade smälttemperaturtoppen på M. chamomilla positiv kontroll PCR amplicon vid 85,6 °C (GCP_GCT) och den var skild från smälttemperaturtoppen för C. nobile positiv kontroll PCR amplicon vid 79,1 °C (RCP_RCT). PCR-amplikonen från fältblommahuvud och blad producerade smälttemperaturtoppar vid 85,2 °C respektive 84,8 °C (Prov1(BLOMMA)_GCT och Prov2(LEAF)_GCT). För att bedöma smälttemperaturvariationer som uppmätts med det bärbara qPCR-systemet samlades ytterligare datapunkter in för att bekräfta att provsmältningstemperaturer alltid låg nära smälttemperaturen som erhölls från M. chamomilla positive control (inom 2 °C) och var långt borta från smälttemperaturen för C. nobile positiv kontroll amplikon (figur 10). Smälttemperaturtoppar rapporterades ibland i andra brunnar. Deras Ct-värden var dock inte mindre än 25 och smälttemperaturtoppar var inte i närheten av M. chamomilla eller C. nobile positiv kontroll (mer än 2 °C isär).
Sammanfattningsvis kan fält M. chamomilla identifieringstest tolkas baserat på beslutsregler sammanfattas i tabell 5. Med alla positiva kontroller testa positivt för de förmodade botaniska arter, negativt för de andra arterna, och negativa kontroller testa negativa, var båda fältprover fast att innehålla M. chamomilla men inte C. nobile. Dessutom, för att anpassa resultaten fälttestning med andra analytiska tekniker, fältslutsenslutningar bekräftades ytterligare av en tidigare validerad DNA-barkodningmetod 25 (data visas inte).
Figur 1: Morfologisk identifiering av botaniska material. (A) Hibiskus rosa-sinensis blommor, Curcuma longa rötter, Malva Sylvestris blad, Rosmarinus officinalis blad, Coriandrum sativum frön, Zingiber officinale rötter. (B) Petroselinum crispum och Apium graveolens flingor är svåra att skilja. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Kemisk identifiering av botaniska material. (A)HPTLC-instrument och ett representativt HPTLC-kromatogram. (B) HPLC-instrument och ett representativt HPLC-kromatogram. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Matricaria chamomilla och Chamaemelum nobile i fält. (A) Matricaria chamomilla, anpassad från Wikipedia under CC BY-SA 3.0, https://en.wikipedia.org/wiki/Matricaria_chamomilla#/media/File:Matricaria_February_2008-1.jpg. (B) Chamaemelum nobile, anpassad från Wikipedia under CC BY-SA 3.0, https://en.wikipedia.org/wiki/Chamomile#/media/File:Chamaemelum_nobile_001.JPG. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Samla in M. chamomilla växtdelar från fältet. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Layout av test brunnar i demonstrationen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 6: Fält-DNA-extrakt i uppsamlingsrör. Botanisk vävnad finns kvar i originalröret och omfattas av gulaktigt DNA-extrakt. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 7: Fluorescens-tomt som visar ackumulering av PCR-produkter över 25 cykler av termocykling. M. chamomilla positiv kontroll och C. nobile positiv kontroll visar Ct värden mindre än 25 i M. chamomilla och C. nobile identifiering tester, respektive. Proverna för fältblomma och blad förstärktes av M. chamomilla identifieringstest med Ct-värdena 15.18 och 19.41. Resten av brunnarna var inte förstärks. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 8: Gelelektrofores av fält PCR-amplifieringsprodukter. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 9: Smälttemperaturanalys. (A) Fluorescenssignalen i varje brunn minskar med den ökande temperaturen. (B) PCR-produkternas identitet bekräftades av smälttemperaturtoppen i smältkurvaanalys. Proverna för fältblomma och blad visar toppar vid 85,2 °C och 84,8 °C. Dessa är nära toppen produceras av M. chamomilla positiv kontroll. C. nobile positiv kontroll producerade en topp vid 79,1 °C, som skiljer sig från de tre andra proverna. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 10: Smälttemperaturtopvariation mellan positiv kontroll och fältprover. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Scenen | Cykel | Temperatur | Tid |
| Konstant temperatur | 1 | 95 °C | 60s |
| Förstärkning | 25 | 95 °C | 30s |
| 60 °C | 30s | ||
| Smältande kurva | 1 | 60 °C | Ramp 0,05 °C/s |
| 95 °C |
Tabell 1: qPCR termocykling villkor för M. chamomilla och C. nobile identifieringsprov.
| Analys | Primer namn | Sekvens 5'-3' | Position | Regionen | Amplicon Storlek | |
| Matricaria recutita | ZL3 | TCGTCGGTCGCAAGGATAAG | Framåt | ITS2 | 102 bp | |
| ZL4 | TAAACTKAGCGGGTAGTCCC | Omvänd | ||||
| Chamaemelum nobile | ZL11 | TGTCGCACGTTGCTAGGAAGCA | Framåt | ITS2 | 65 bp | |
| ZL12 | TCGAAGCGTCATCCTAAGACAAC | Omvänd | ||||
Tabell 2: Primerpar för M. chamomilla och C. nobile-identifieringsprov.
| Väl position | Väl namn | Beskrivning | |
| 1 | GC_PosCtrl_GC_Test | Tysk kamomill positiv kontroll under GC Test | |
| 2 | GC_PosCtrl_RC_Test | Tysk kamomill positiv kontroll under RC Test | |
| 3 | RC_PosCtrl_GC_Test | Romersk kamomill positiv kontroll under GC Test | |
| 4 | RC_PosCtrl_RC_Test | Romersk kamomill positiv kontroll under RC Test | |
| 5 | Field_Sample_GC_Test | Prov av bladvävnad under GC Test | |
| 6 | Field_Sample_RC_Test | Prov av bladvävnad under RC Test | |
| 7 | Field_Sample_GC_Test | Prov av blomvävnad under GC Test | |
| 8 | Field_Sample_RC_Test | Prov av blomvävnad under RC Test | |
| 9 | NegCtrl_GC_Test | Negativt kontrollprov under GC-test | |
| 10 | NegCtrl_RC_Test | Negativt kontrollprov under RC Test | |
Tabell 3: Brunnstyper och beskrivningar för M. chamomilla och C. nobile identification tests.
| Reagens | GC_Test | RC_Test |
| Universell qPCR Mix* | 10 μL | 10 μL |
| ZL3 grundur (10 μM) | 0,4 μL | Na |
| ZL4 primer (10 μM) | 0,4 μL | Na |
| ZL11 grundur (10 μM) | Na | 0,4 μL |
| ZL12 grundur (10 μM) | Na | 0,4 μL |
| H2O (Nukleasfritt) | 7,2 μL | 7,2 μL |
| * innehåller Hot Start Taq DNA Polymeras | ||
Tabell 4: Master-mix-sammansättning för M. chamomilla och C. nobile identifieringsprov.
| Väl Namn | Förväntat resultat | Kriterier för positivt resultat | Kriterier för negativt resultat |
| Upptäckt / Närvarande | Inte upptäckt / Frånvarande | ||
| GC_PosCtrl_GC_Test | Upptäckt | Ct < 25 och 84 <= Tm <= 86 | - |
| GC_PosCtrl_RC_Test | Inte upptäckt | - | Inget Ct-värde inom 25 cykler |
| RC_PosCtrl_GC_Test | Inte upptäckt | - | Inget Ct-värde inom 25 cykler |
| RC_PosCtrl_RC_Test | Upptäckt | Ct < 25 och 79 <= Tm <= 81 | - |
| Field_Sample_Leaf_GC_Test | Närvarande | Ct < 25 och 84 <= Tm <= 86 | Inget Ct-värde inom 25 cykler |
| Field_Sample_Leaf_RC_Test | Frånvarande | - | Inget Ct-värde inom 25 cykler |
| Field_Sample_Flower_GC_Test | Närvarande | Ct < 25 och 84 <= Tm <= 86 | Inget Ct-värde inom 25 cykler |
| Field_Sample_Flower_RC_Test | Frånvarande | - | Inget Ct-värde inom 25 cykler |
| NegCtrl_GC_Test | Inte upptäckt | - | Inget Ct-värde inom 25 cykler |
| NegCtrl_RC_Test | Inte upptäckt | - | Inget Ct-värde inom 25 cykler |
Tabell 5: Regler för qPCR-resultattolkning.
Discussion
Utformningen av grund- och mallval är de avgörande stegen för att få en effektiv och specifik qPCR-förstärkning. Efter att ha identifierat en lämplig mall, primer design programvara används vanligtvis för att hjälpa val av primers baserat på designvariabler såsom primer längd, smälttemperatur, och GC innehåll33,34. Optimering och validering kan utföras under de förväntade experimentella förhållandena i analysen för att säkerställa specificitet, känslighet och robusthet hos en PCR-reaktion35. Suboptimal primer design kan resultera i primer-dimer formation, vari primer interaktioner producerar icke-specifika produkter36.
De inga mallkontroller (NTC) som används i denna studie kontrollerar både DNA-kontaminering och förekomsten av primer-dimers som kan påverka analysen. Resultaten visade ingen förstärkning, en bra indikation på att både DNA-kontaminering och primer-dimers inte är ett problem. DNA-kontaminering och primer-dimers manifesteras i smältkurvor genom inga mallkontroller, och som extra toppar i smältkurvor av positiva kontroller. Vanligtvis förväntas smältkurvan för en positiv kontroll innehålla en enda topp, om inte AT-rika underdomäner i mallen orsakar ojämn smältning. Dubbla toppar kunde förutsägas genom att simulera smältanalyser med hjälp av uMELT-programvaran37. I denna studie, guldmyntfoten för att köra PCR-produkten på agarosgel användes för att bekräfta förekomsten av mål PCR produkt och avsaknad av kontaminering och primer-dimers.
En avsevärd utmaning inom botanisk materialmolekylanalys är att få DNA av god kvalitet efter den botaniska DNA-extraktionsprocessen. Botaniska material handlas och konsumeras för de aktiva kemiska föreningar som är förknippade med hälsofördelar. I processen för DNA-extraktion, dessa kemiska föreningar kommer också att släppas ut i DNA extraktionslösning, potentiellt orsakar PCR hämning, vilket resulterar i fel i PCR förstärkning. Olika växt-DNA-reningssatser med hjälp av organiska lösningsmedel och kolonner har utvecklats för att avlägsna kemiska föreningar som härrör frånbotaniska 38. Dock är rök huva och höghastighetscentrifug som krävs för att hjälpa dessa kit inte tillgängliga i fältet.
I det aktuella protokollet använder den förenklade DNA-extraktionsmetoden en kommersiell satsen för växt-DNA-extraktion (se Table of Materials för närmare detaljer). Det hade förmågan att neutralisera gemensamma hämmande substanser för reproducerbara resultat och producerade konsekventa resultat för M. chamomilla och C. nobile. Både M. chamomilla och C. nobile blomma huvuden och blad gav PCR amplicons med specifika smälta toppar, vilket tyder på att förekomsten av PCR-hämmare var inte ett bekymmer. För andra växter med högre nivåer av PCR-hämmare, förstärka DNA i deras ursprungliga extraktion kan vara mindre effektiv. För att minska hämning och förbättra förstärkningseffektiviteten, med tillgång till hela anläggningen, kan även andra växtdelar med lägre halt av polysackarid och polyfenol användas för identifieringsändamål. Om det finns begränsad tillgång till olika växtdelar, yngre blad eller kronblad dissekeras från blomma huvuden, som vanligtvis har lägre fenolinnehåll39, kan erbjuda en bättre chans att lyckas. Eftersom DNA-sekvenser är konsekventa över hela växten, kan vilken växtdel som helst användas för att bekräfta artidentiteten. Om PCR-förstärkning fortfarande är suboptimal kan det ursprungliga DNA-extraktet spädas ut ytterligare innan PCR, eller mer sofistikerade laboratoriereningsprotokoll kan användas.
En annan utmaning för PCR-analys är falska positiva resultat orsakade av DNA-kontaminering, som kan påverka datatolkningen negativt. Det är oftast kontrolleras av aktiv hushållning, med hjälp av särskild utrustning, och begränsa arbetet till utsedda områden. Med hjälp av qPCR kan all PCR-analys åstadkommas i ett slutet system, vilket kraftigt minskar risken för PCR-amplikonkontaminering i en miljö som inte är väl kontrollerad. Förutom, miljö-DNA bör inte heller visa ett falskt positivt på grund av specificiteten i analysen, enligt en tidigare valideringsstudie40.
Det finns utrymme för förbättringar. I protokollet som presenteras här, var interkalating färgämne används för att visa mål fragment förstärkning i realtid. Metodens specificitet bekräftas ytterligare av den karakteristiska smälttemperaturen, som är distinkt mellan M. chamomilla och C. nobile-amplikoner. Därför kan interkalating dye-baserade PCR effektivt svara på frågan "Vad är detta växtarter?" i fält. Men förutom behovet av att utföra botanisk identifiering på en enda anläggning isolerad från fältet, i många fall, botaniska pulver eller extrakt i lagret kommer också att dra nytta av en på plats snabb identitetsbedömning. För dessa typer av material kan ytterligare frågor behöva tas upp, till exempel "Vad finns i detta material?", "Innehåller den den botaniska arten jag söker?", "Innehåller den äktenskapsbrytare jag vill undvika?", och "Är det ersatt helt eller delvis av andra botaniska arter som är skadliga?". Istället för att använda interkalerande färgämne, kan olika qPCR-sonder utformas för att rikta amplikoner från olika botaniska i ett reaktionssystem, samtidigt som hög specificitet och effektivitet av analysen bibehålls. Utveckling av sondbaserad qPCR och utnyttjande av ett bärbart qPCR-system som erbjuder flera kanaler upptäckt kan ytterligare utvidga tillämpningen av fälttest som en fit-for-purpose assay till en bredare miljö inställning, såsom botaniska material lager och distributionscentraler att svara på mer komplicerade frågor. Dessutom, med hjälp av flera sonder också tillåter användaren att inkludera intern förstärkning i varje reaktionssystem, så att mer information kommer att finnas tillgänglig när PCR-hämning misstänks.
Det protokoll som presenteras här har följande fördelar jämfört med befintliga tekniker som används för samma ändamål. För det första måste förfarandet och dess resultat för traditionella morfologiska och kemiska identifieringsmetoder genomföras och tolkas av experter. qPCR-baserade identifieringsprov kan genomföras av personer med grundläggande molekylärbiologisk träning och tolkas på ett mer standardiserat sätt. För det andra, jämfört med qPCR-baserade arter identifiering och differentiering normalt utförs i laboratoriet, fältet identifieringsprotokollet med hjälp av ett bärbart instrument inte kräver instrument med ett stort fotavtryck, såsom en höghastighets centrifug, DNA-kvalitet utvärdering utrustning, termisk cycler med fluorescens detektor, och en dator som kör en speciell programvara. Dna-baserad artidentifiering kan alltså utföras i valfri inställning utan dröjsmål. För det tredje är sökning efter botaniska material en uppgift som kräver en global operation. Med framsteg inom molntjänster och artificiell intelligens kan en bärbar enhet potentiellt ta emot metoder som utvecklats och validerats av experter i laboratoriet, drivas av icke-experter i avlägsna områden och producera objektiva certifieringar från tredje part. Därför är detta alternativ mer övertygande än någonsin med fjärrarbete blir trenden.
Sammanfattningsvis, protokollet här visat fält identifiering av M. chamomilla med hjälp av en bärbar qPCR system. Den framgångsrika tillämpningen av denna teknik kommer att generera mycket exakta resultat på botanisk identifiering och hjälpa botaniska tillverkare och leverantörer kvalificera botaniska material i tid och kostnadseffektivt sätt.
Disclosures
Vi intygar att Zhengxiu Yang, Zheng Quan, Tiffany Chua, Leo Li, Yanjun Zhang, Silva Babajanian, Tricia Chua, Peter Chang, Gary Swanson, Zhengfei Lu är anställda i Herbalife International of America, Inc. Vi intygar att Francesco Buongiorno, Isabella Della Noce, och Lorenzo Colombo är anställda hos Hyris Ltd som producerar det bärbara qPCR-instrumentet som används i den här artikeln.
Acknowledgments
Vi tackar James Shan för hans insatser inom fältvideoinspelning. Vi tackar Jon Byron och Matthew Semerau för deras arbete inom videoredigering. Vi tackar Ansen Luo, Harry Du och Frank Deng för deras stöd i att lokalisera testfältet. Vi tackar Maria Rubinsky för hennes värdefulla kommentarer om hela manuskriptet. Alla erkända personer är anställda i Herbalife International of America, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Battery | TNE | 78000mAh | Provide field power supply |
| bCUBE | HYRIS | bCUBE 2.0 | Portable qPCR instrument |
| Cartridges(16 Well) | HYRIS | NA | Consumables for bCUBE |
| Electric pipette | Eppendorf | NA | Handling liquid |
| Extract-N-AmpTM plant PCR kit | SIGMA | XNAP2-1KT | Plant DNA extraction kit |
| German chamomile (Matricaria chamomilla L) flower botanical reference materials | AHP | 2264 | Used as positive control |
| Mini dry bath | Yooning | MiniH-100L | For DNA extraction |
| Nuclease-free water | AMBION | AM9937 | qPCR reaction |
| Primer | Thermo Fisher Scientific | NA | qPCR reaction |
| Roman chamomile (Chamaemelum nobile) flower botancial reference materials | ChromaDex | ASB-00030806-005 | Used as positive control |
| Luna universal qPCR master mix | NEB | M3003L | qPCR reaction |
References
- Smith, T., Gillespie, M., Eckl, V., Knepper, J., Reynolds, C. Herbal supplement sales in US increase by 9.4% in 2018. HerbalGram. 123, 62-73 (2019).
- Israelsen, L. D. The challenge of regulation, globalization and climate change on botanicals and traditional medicines: respecting tradition while embracing change. Planta Medica. 74 (3), 36 (2008).
- Cardellina, J. H. Challenges and opportunities confronting the botanical dietary supplement industry. Journal of Natural Products. 65 (7), 1073-1084 (2002).
- Foster, S. Exploring the peripatetic maze of black cohosh adulteration: a review of the nomenclature, distribution, chemistry, market status, analytical methods and safety. HerbalGram. 98, 32-51 (2013).
- Vanherweghem, J. L. Misuse of herbal remedies: The case of an outbreak of terminal renal failure in Belgium (Chinese herbs nephropathy). The Journal of Alternative and Complementary Medicine. 4 (1), 9-13 (1998).
- Vanherweghem, J. L., et al. Rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming regimen including Chinese herbs. The Lancet. 341 (8842), 387-391 (1993).
- Khan, I. A., Smillie, T. Implementing a "quality by design" approach to assure the safety and integrity of botanical dietary supplements. Journal of Natural Products. 75 (9), 1665-1673 (2012).
- Applequist, W. The Identification of Medicinal Plants: A Handbook of the Morphology of Botanicals in Commerce. , Missouri Botanical Garden Press. (2006).
- Upton, R., Graff, A., Jolliffe, G., Länger, R., Williamson, E. American Herbal Pharmacopoeia: Botanical Pharmacognosy - Microscopic Characterization of Botanical Medicines. , CRC Press. (2016).
- Frommenwiler, D. A., et al. Comprehensive HPTLC fingerprinting for quality control of an herbal drug - the case of angelica gigas root. Planta Medica. 84 (6-7), 465-474 (2018).
- Heyman, H. M., Meyer, J. J. M. NMR-based metabolomics as a quality control tool for herbal products. South African Journal of Botany. 82, 21-32 (2012).
- Lazarowych, N. J., Pekos, P. Use of fingerprinting and marker compounds for identification and standardization of botanical drugs: strategies for applying pharmaceutical HPLC analysis to herbal products. Drug Information Journal. 32 (2), 497-512 (1998).
- Tankeu, S., et al. Hyperspectral imaging and support vector machine: a powerful combination to differentiate black cohosh (actaea racemosa) from other cohosh species. Planta Medica. 84 (6-7), 407-419 (2018).
- Rodman, J. E., Cody, J. H. The taxonomic impediment overcome: NSF's Partnerships for Enhancing Expertise in Taxonomy (PEET) as a model. Systematic Biology. 52 (3), 428-435 (2003).
- Chen, S., et al. A renaissance in herbal medicine identification: from morphology to DNA. Biotechnology Advances. 32 (7), 1237-1244 (2014).
- Li, X., et al. Plant DNA barcoding: from gene to genome. Biological Reviews. 90 (1), 157-166 (2015).
- Madesis, P., Ganopoulos, I., Sakaridis, I., Argiriou, A., Tsaftaris, A. Advances of DNA-based methods for tracing the botanical origin of food products. Food Research International. 60, 163-172 (2014).
- Newmaster, S. G., Ragupathy, S., Janovec, J. A botanical renaissance: state-of-the-art DNA bar coding facilitates an automated identification technology system for plants. International Journal of Computer Applications in Technology. 35 (1), 50-60 (2009).
- Parveen, I., Gafner, S., Techen, N., Murch, S. J., Khan, I. A. DNA barcoding for the identification of botanicals in herbal medicine and dietary supplements: strengths and limitations. Planta Medica. 82 (14), 1225-1235 (2016).
- Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. A pocket-sized convective PCR thermocycler. Angewandte Chemie International Edition. 46 (23), 4316-4319 (2007).
- Almassian, D. R., Cockrell, L. M., Nelson, W. M.
- Benítez-Páez, A., Portune, K. J., Sanz, Y. Species-level resolution of 16S rRNA gene amplicons sequenced through the MinION portable nanopore sequencer. Gigascience. 5 (1), 4 (2016).
- Emanuel, P. A., et al. Detection of Francisella tularensis within infected mouse tissues by using a hand-held PCR thermocycler. Journal of Clinical Microbiology. 41 (2), 689-693 (2003).
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228 (2016).
- Lu, Z., et al. Single-laboratory validation of a two-tiered DNA barcoding method for raw botanical identification. Journal of AOAC International. 102 (5), 1435-1447 (2019).
- Sgamma, T., et al. DNA barcoding for industrial quality assurance. Planta Medica. 83 (14-15), 1117-1129 (2017).
- Wallinger, C., et al. Rapid plant identification using species-and group-specific primers targeting chloroplast DNA. PLoS One. 7 (1), 29473 (2012).
- Newmaster, S. G., et al. Recommendations for validation of real-time PCR methods for molecular diagnostic identification of botanicals. Journal of AOAC International. , (2019).
- Singh, O., Khanam, Z., Misra, N., Srivastava, M. K. Chamomile (Matricaria chamomilla L.): an overview. Pharmacognosy Reviews. 5 (9), 82 (2011).
- Mills, S. Y., Bone, K. The Essential Guide to Herbal Safety. Elsevier Health Sciences. , 325 (2004).
- Avula, B., et al. Quantitative determination of phenolic compounds by UHPLC-UV-MS and use of partial least-square discriminant analysis to differentiate chemo-types of Chamomile/Chrysanthemum flower heads. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 278-288 (2014).
- Guzelmeric, E., Vovk, I., Yesilada, E. Development and validation of an HPTLC method for apigenin 7-O-glucoside in chamomile flowers and its application for fingerprint discrimination of chamomile-like materials. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 108-118 (2015).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. Genome Research. 3 (3), 30-37 (1993).
- Untergasser, A., et al. Primer3Plus, an enhanced web interface to Primer3. Nucleic Acids Research. 35, Web Server issue 71-74 (2007).
- Bustin, S., Huggett, J.
- Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3235-3241 (1997).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), Oxford, England. 1019-1020 (2011).
- Heikrujam, J., Kishor, R., Mazumder, P. B. The chemistry behind plant DNA isolation protocols. Biochemical Analysis Tools - Methods for Bio-Molecules Studies. , (2020).
- Blum-Silva, C. H., Chaves, V. C., Schenkel, E. P., Coelho, G. C., Reginatto, F. H. The influence of leaf age on methylxanthines, total phenolic content, and free radical scavenging capacity of Ilex paraguariensis aqueous extracts. Revista Brasileira de Farmacognosia. 25 (1), 1-6 (2015).
- Lu, Z., et al. Validation of a targeted PCR method for raw and processed botanical material identification: an example using matricaria chamomilla (chamomile). Journal of AOAC International. 102 (6), 1787-1797 (2019).
