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भ्रष्टाचार गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए एक रासायनिक बायोप्सी का उपयोग करना

Published: June 17, 2020 doi: 10.3791/60946
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 2, 3, 3, 2,4, 3, 1
1Department of Pharmacodynamics and Molecular Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Nicolaus Copernicus University in Torun, Collegium Medicum in Bydgoszcz, 2Multi Organ Transplant Program, Department of Surgery, Toronto General Hospital, University Health Network, 3Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland, 4Department of Medicine, Toronto General Hospital
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

प्रोटोकॉल प्रत्यारोपण के लिए आवंटित गुर्दे कलम की गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए व्यापक मेटाबोलॉमिक और लिपिडोमिक विश्लेषण के बाद रासायनिक बायोप्सी दृष्टिकोण का उपयोग प्रस्तुत करता है ।

Abstract

गुर्दा प्रत्यारोपण दुनिया भर में अंतिम चरण गुर्दे की शिथिलता के साथ लोगों की एक बड़ी संख्या के लिए एक जीवन रक्षक उपचार है । प्रक्रिया एक वृद्धि हुई जीवित रहने की दर और रोगी के जीवन की अधिक से अधिक गुणवत्ता के साथ जुड़ा हुआ है जब पारंपरिक डायलिसिस की तुलना में । अफसोस, प्रत्यारोपण अंग गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए विश्वसनीय तरीकों की कमी से ग्रस्त है । मानक नैदानिक तकनीकें स्थूल उपस्थिति निरीक्षण या आक्रामक ऊतक बायोप्सी तक सीमित हैं, जो भ्रष्टाचार के बारे में व्यापक जानकारी प्रदान नहीं करती हैं। प्रस्तावित प्रोटोकॉल का उद्देश्य व्यापक मेटाबोलोमिक्स के लिए एक आदर्श विश्लेषणात्मक विधि के रूप में ठोस चरण माइक्रोएक्सट्राक्शन (एसपीएमई) शुरू करना और प्रत्यारोपण के लिए आवंटित गुर्दे में मौजूद सभी कम आणविक यौगिकों का लिपिडोमिक विश्लेषण करना है। एसपीएमई जांच का छोटा आकार रासायनिक बायोप्सी के प्रदर्शन को सक्षम बनाता है, जो बिना किसी ऊतक संग्रह के अंग से सीधे मेटाबोलाइट्स को निकालने में सक्षम बनाता है। विधि की न्यूनतम आक्रामकता समय के साथ कई विश्लेषणों के निष्पादन की अनुमति देती है: सीधे अंग संचयन के बाद, इसके संरक्षण के दौरान, और प्राप्तकर्ता के शरीर पर पुनर्संवहन के तुरंत बाद। यह परिकल्पना की गई है कि एक उच्च-संकल्प द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर के साथ इस उपन्यास नमूना विधि का संयोजन विशेषता यौगिकों के एक सेट के भेदभाव के लिए अनुमति देगा जो भ्रष्टाचार की गुणवत्ता के जैविक मार्कर और अंग रोग के संभावित विकास के संकेतकों के रूप में काम कर सकता है।

Introduction

संयुक्त राज्य अमेरिका के अंग खरीद और प्रत्यारोपण नेटवर्क के अनुसार, 2019 में अमेरिका में गुर्दा प्रत्यारोपण के लिए 94,756 रोगी इंतजार कर रहे थे; जबकि 2018 में यूरोप में, वह संख्या 10,791 थी। हर दस मिनट में, किसी को अमेरिका में राष्ट्रीय प्रत्यारोपण प्रतीक्षा सूची में जोड़ा जाता है, और यह अनुमान लगाया गया है कि प्रत्येक दिन 20 लोग एक प्रत्यारोपण1, 2,के लिए इंतजार कर मरजातेहैं । गुर्दा प्रत्यारोपण दुनिया भर में अंतिम चरण गुर्दे की शिथिलता के साथ पीड़ित लोगों की एक बड़ी संख्या के लिए एक जीवन रक्षक उपचार है । प्रक्रिया में वृद्धि हुई जीवित रहने की दर और जीवन की अधिक गुणवत्ता के साथ जुड़ा हुआ है जब पारंपरिक डायलिसिस की तुलना में ।

हालांकि, प्रत्यारोपण कई गंभीर समस्याओं का सामना करना पड़ता है, जैसे अंग की कमी या अंग गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए प्रभावी उपकरणों की कमी । मानक प्रोटोकॉल स्थूल उपस्थिति निरीक्षण या आक्रामक ऊतक बायोप्सी तक सीमित हैं, जो भ्रष्टाचार की गुणवत्ता के बारे में व्यापक जानकारी प्रदान नहीं करते हैं। जबकि एक दृश्य मूल्यांकन आंख, शारीरिक असामान्यताओं, या कलम को व्यापक क्षति के लिए दिखाई ट्यूमर की पहचान के लिए अनुमति देता है, यह दृष्टिकोण बहुत व्यक्तिपरक है, पर्यवेक्षकों के अनुभव के अनुसार इसकी प्रभावशीलता में बदलती है । दूसरी ओर, बायोप्सी, पहले से मौजूद गुर्दे के विकारों के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान कर सकते हैं, और इस प्रकार भ्रष्टाचार के परिणामों का निर्धारण करने में उद्देश्य और सबूत मूल्य की एक विधि माना जाता है । हालांकि, बायोप्सी प्रक्रिया खामियों से मुक्त नहीं है; रक्तस्राव जैसी संभावित जटिलताओं का खतरा है और अतिरिक्त 4-5 घंटे के नमूने की तैयारी की आवश्यकता होती है, जो ठंडे इस्कीमिक समय को काफी बढ़ाता है। इसलिए, विशेष रूप से यूरोप में, प्रत्यक्ष ऊतक विश्लेषण का उपयोग संचार मृत्यु (डीसीडी)3,4के बाद विस्तारित मानदंड दाताओं(ईसीडी)और दानदाताओं तक सीमित है।

मेटाबोलोमिक्स और लिपिडोमिक्स को हाल ही में अंग संरक्षण के दौरान होने वाले जैव रासायनिक रास्तों में परिवर्तन की बेहतर समझ प्राप्त करने के लिए आशाजनक दृष्टिकोण के रूप में पहचाना गया है। मेटाबोलॉमिक और लिपिडोमिक प्रोफाइलिंग बाद के परिणामों के साथ अंग हटाने से संबंधित अचानक पर्यावरणीय परिवर्तनों के लिए प्रणाली की तत्काल प्रतिक्रियाओं की निगरानी करने में सक्षम बनाता है: इस्केमिया, ऑक्सीडेटिव तनाव, या भड़काऊ प्रतिक्रियाएं5,,6,,7,,8। गुर्दे एक अंग है कि काफी हद तक मेटाबोलिक प्रक्रियाओं के साथ जुड़ा हुआ है, इस प्रकार मेटाबोलाइट्स और लिपिड सांद्रता के माप संभावित अंग गुणवत्ता बायोमार्कर की पहचान की अनुमति और भ्रष्टाचार के परिणाम की बेहतर भविष्यवाणियों को सक्षम कर सकते हैं ।

वर्तमान अंग गुणवत्ता मूल्यांकन विधियों से जुड़ी उपरोक्त जटिलताओं और सीमाओं को देखते हुए, त्वरित और जटिल अंग गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए कम आक्रामक नैदानिक समाधान की आवश्यकता होती है। ठोस चरण माइक्रोएक्सट्रैक्शन (एसपीएमई) इन आवश्यकताओं का अनुपालन न्यूनतम आक्रामक विश्लेषणात्मक विधि के रूप में करता है जो मेटाबोलाइट्स और लिपिड के व्यापक स्पेक्ट्रम के कवरेज को सक्षम बनाता है। यह तकनीक एक पतली (~ 200 माइक्रोन), बायोसंपस्ध, टाइटेनियम-निकल मिश्र धातु जांच के सम्मिलन पर आधारित है जो थोड़े समय के लिए जांच किए गए अंग में चयनात्मक निष्कर्षण चरण के साथ कवर किया गया है। इस बात पर जोर दिया जाना चाहिए कि एसपीएमई प्रोटीन निष्कर्षण को रोकता है, और इसलिए नमूना संग्रह के चरण में पहले से ही मेटाबोलिज्म अवरोध को सक्षम बनाता है, जो वैकल्पिक तरीकों पर एक महत्वपूर्ण लाभ है। इसके अलावा, डिवाइस का लघुकरण अंग 9 ,10, 11,की कुछ संरचनाओं के दोहराव और एक साथ विश्लेषण के निष्पादन के लिए अनुमतिदेताहै।9,

Protocol

नेशनल सोसायटी फॉर मेडिकल रिसर्च और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, ओंटारियो, कनाडा द्वारा प्रकाशित 'गाइड फॉर द केयर ऑफ लेबोरेटरी एनिमल्स' द्वारा तैयार 'प्रयोगशाला पशु देखभाल के सिद्धांतों' के अनुपालन में सभी जानवरों को मानवीय देखभाल प्राप्त हुई। टोरंटो जनरल रिसर्च इंस्टीट्यूट की एनिमल केयर कमेटी ने सभी अध्ययनों को मंजूरी दे दी । इस शोध में मानव विषयों को शामिल किया गया था, जो टोरून में Bydgoszcz निकोलस कोपर्निकस विश्वविद्यालय में कॉलेजियम मेडिसम में बायोएथिकल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

नोट: उचित नैतिक बोर्डों से अनुमोदन प्राप्त करें। हमेशा सुरक्षा दस्ताने पहनना याद रखें। एसपीएमई जांच के निष्कर्षण चरण को न छुएं। लिपिडोमिक विश्लेषण के लिए निष्क्रिय ग्लास शीशियों के उपयोग की सिफारिश की जाती है।

1. जांच की तैयारी

  1. टाइटेनियम-निकल मिश्र धातु जांच (40 मिमी लंबाई; 0.2 मिमी व्यास) 7 मिमी मिश्रण मोड शर्बत के साथ लेपित तैयार करें। जांच की संख्या पूरी प्रक्रिया के दौरान लक्षित समय बिंदुओं पर निर्भर करती है और प्रतिकृति की संख्या (3 प्रति समय बिंदु की सिफारिश की जाती है)।
    नोट: निष्कर्षण चरण की लंबाई और प्रकार को अध्ययन के तरीके, मेटाबोलाइट्स की ध्रुवीयता और नमूना मैट्रिक्स के आधार पर समायोजित किया जा सकता है।
  2. 2:1 क्लोरोफॉर्म से बना एक सफाई मिश्रण तैयार करें: मेथनॉल (v/v)। प्रत्येक 2.0 एमएल ग्लास शीशी के समाधान का पिपेट 1.0 एमएल और प्रत्येक शीशी में पहले टोपी के माध्यम से छेदा गया एक जांच रखें।
    नोट: उपयोग से पहले, दूषित कणों को हटाने के लिए सभी जांच को साफ करें।
  3. आंदोलनकारी पर शीशियां लगाई और आंदोलन की गति 1,200 आरपीएम तय की। 45 मिनट के बाद, डिवाइस को बंद करें और एलसी-एमएस ग्रेड पानी के साथ कोटिंग्स कुल्ला करें।
  4. चूंकि कोटिंग्स को उन्हें सक्रिय करने के लिए एक पूर्वकंडीशनिंग कदम से गुजरना होगा, 1:1 मेथनॉल: पानी (v/v) से बना एक पूर्वकंडीशनिंग मिश्रण तैयार करें। प्रत्येक 2.0 एमएल ग्लास शीशी के समाधान का पिपेट 1.0 एमएल और प्रत्येक शीशी में पहले टोपी के माध्यम से छेदा गया एक जांच रखें।
  5. भंवर आंदोलनकारी पर शीशियां लगाएं और आंदोलन की गति 1,200 आरपीएम तय की।
  6. 60 मिनट के बाद आंदोलनकारी रुकें और एलसी-एमएस ग्रेड के पानी से कोटिंग्स को कुल्ला करें।
  7. मानक शल्य चिकित्सा उपकरण नसबंदी प्रोटोकॉल के अनुसार जांच को स्टरलाइज करें।

2. निष्कर्षण

  1. बाँझ वातावरण सुनिश्चित करने के लिए नमूने से पहले बाँझ पैकेज खोलें।
  2. हर समय बिंदु पर 10 मिनट के लिए सीधे गुर्दे प्रांतस्था में दो जांच डालें। कोटिंग की पूरी लंबाई ऊतक मैट्रिक्स द्वारा कवर किया जाना चाहिए; कोई विशिष्ट कोण की आवश्यकता नहीं है, लेकिन सीए 90 डेप आमतौर पर उपयोग किया जाता है।
    नोट: पूरी चिकित्सा प्रक्रिया दी गई संस्था में मानक प्रोटोकॉल का पालन करती है। एसपीएमई नमूने से संबंधित कोई संशोधन नहीं माना जाता है। प्रक्रिया में छह निम्नलिखित नमूना समय अंक शामिल हैं:
    क) गुर्दे की रीसेक्शन से पहले, दाता से वीवो में;
    ख-ई) के बाद 1 घंटे, 3 घंटे, 5 घंटे, गुर्दे के परफ्यूजन के 7 घंटे, अंग कक्ष में पूर्व वीवो;
    च) रिफ्यूजन के बाद, प्राप्तकर्ता से वीवो में।
  3. इसे ऊतक से बाहर खींच कर जांच वापस लेना और फिर कोटिंग सतह से किसी भी शेष रक्त को साफ करने के लिए एलसी-एमएस ग्रेड पानी के साथ कोटिंग्स कुल्ला । सर्जिकल साइट से दूर कुल्ला, और जांच को हटाने के तुरंत बाद।

3. परिवहन और भंडारण

  1. अलग शीशियों में जांच रखें और उन्हें बंद करें।
  2. सूखी बर्फ से भरे स्टायरोफोम बॉक्स में या परिवहन के लिए तरल नाइट्रोजन में शीशियों को रखें।
  3. एक फ्रीजर (-80 डिग्री सेल्सियस) में नमूनों को स्टोर करें, या तुरंत अवशोषण कदम शुरू करें।

4. डिसोरपशन

  1. मेटाबोलॉमिक विश्लेषण के लिए 80:20 एसीटोनिट्रिल से बना अवशोषण समाधान तैयार करें: मेटाबोलॉमिक विश्लेषण के लिए पानी (v/v), और लिपिडोमिक विश्लेषण के लिए 1:1 आइसोप्रोपैनॉल: मेथनॉल (v/v) ।
  2. 2.0 एमएल लेबल वाली शीशियों में रखे गए आवेषण के समाधान के 100 माइक्रोन पिपेट करें और प्रत्येक शीशी में पहले टोपी के माध्यम से छेदा गया एक जांच रखें।
  3. भंवर आंदोलनकारी पर शीशियां लगाएं और 120 मिनट के लिए 1,200 आरपीएम पर आंदोलन की गति निर्धारित की।
  4. शीशियों से जांच निकालें। प्राप्त अर्क अब वाद्य विश्लेषण के लिए तैयार हैं।

5. एलसी-एमएस विश्लेषण

  1. एलसी-एमएस सिस्टम के ऑटोसंपलर में अर्क युक्त शीशियों को रखें।
    नोट: तरल क्रोमेटोग्राफी (आरपी, हिलिक) के साथ मिलकर उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री और एक ऑर्बिटरैप मास एनालाइजर का उपयोग इस अध्ययन के लिए किया गया था। मेटाबोलॉमिक विश्लेषण मापदंडों के लिए, चरण 5.2 पर जाएं। लिपिडोमिक विश्लेषण मापदंडों के लिए, चरण 5.6 पर जाएं।
  2. उलट चरण जुदाई के लिए एक पेंटाफ्लोरोफेनिल (पीएफपी) कॉलम (2.1 मिमी x 100 मिमी, 3 माइक्रोन) का उपयोग करें।
    1. प्रवाह दर को क्रमशः 300 माइक्रोल/मिनट और ऑटोसंप्लर और कॉलम तापमान को क्रमशः 4 डिग्री सेल्सियस और 25 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
    2. निम्नलिखित अनुपात के अनुसार मोबाइल चरण तैयार करें: मोबाइल चरण ए: पानी: फोर्मिक एसिड (99.9:0.1, v/v), और मोबाइल चरण बी: एसीटोनिट्रिल: फोर्मिक एसिड (99.9:0.1, v/v)। निम्नलिखित मापदंडों के अनुसार मोबाइल चरण प्रवाह निर्धारित करें: मोबाइल चरण प्रवाह (0-3 मिनट): 100% ए के बाद 10% ए (3-25 मिनट) के लिए एक रैखिक ढाल, 34 मिनट तक 10% ए के आइसोक्रैटिक प्रवाह के साथ समाप्त होता है, इसके बाद 6 मिनट कॉलम री-इक्विलिब्रियम समय होता है।
  3. हिलिक पृथक्करण के लिए, एक हिलिक कॉलम (2.0 मिमी x 100 मिमी, 3 माइक्रोन, 200A) का उपयोग करें। प्रवाह दर को 400 माइक्रोन/मिनट तक सेट करें।
    1. निम्नलिखित अनुपात के अनुसार मोबाइल चरण तैयार करें: मोबाइल चरण ए: एसीटोनीट्रिल: अमोनियम एसीटेट बफर (9:1, वी/वी, प्रभावी नमक एकाग्रता 20 mM), मोबाइल चरण बी: एसीटोनिट्रिल: अमोनियम एसीटेट बफर (1:1, v/v, प्रभावी नमक एकाग्रता 20 mM)।
    2. निम्नलिखित मापदंडों के अनुसार मोबाइल चरण प्रवाह सेट करें: 100% ए पर मोबाइल चरण प्रवाह (0-3 मिनट) शुरू करना, 3.0 मिनट के लिए पकड़ना और फिर 5 मिनट के भीतर 100% बी तक रैंप। 12 मिनट तक 100% बी के साथ पकड़ो, इसके बाद 8 मिनट का कॉलम पुनः संतुलन समय होगा।
  4. स्कैन रेंज को 85-1000 मीटर/जेड सेट करें । सकारात्मक आयनीकरण मोड में HESI आयन स्रोत मापदंडों सेट करने के लिए: स्प्रे वोल्टेज 1,500 V, केशिका तापमान 300 डिग्री सेल्सियस, म्यान गैस 40 a.u., ऑक्स गैस प्रवाह दर 15 एयू, जांच हीटर तापमान 300 डिग्री सेल्सियस, एस लेंस आरएफ स्तर 55%।
  5. उपकरण प्रदर्शन की निगरानी के लिए प्रत्येक विश्लेषण नमूने (नियमित रूप से, हर 10-12 नमूनों) के 10 माइक्रोन से बना क्यूसी नमूने चलाएं।
  6. उलट चरण जुदाई के लिए, C18 कॉलम (2.1 मिमी x 75 मिमी, 3.5 माइक्रोन) का उपयोग करें।
    1. प्रवाह दर को क्रमशः 200 माइक्रोल/मिनट, और ऑटोसंप्लर और कॉलम तापमान को क्रमशः 4 डिग्री सेल्सियस और 55 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें। निम्नलिखित अनुपात के अनुसार मोबाइल चरण तैयार करें: मोबाइल चरण ए: एच2ओ: मेओएच (60:40, v/v), 10 mm अमोनियम एसीटेट और 1 mm एसीटिक एसिड; मोबाइल चरण बी: आईपीए: MeOH (90:10, v/v), 10 mm अमोनियम एसीटेट और 1 mm एसीटिक एसिड ।
    2. निम्नलिखित मापदंडों के अनुसार मोबाइल चरण प्रवाह निर्धारित करें: 0-1 मिनट (20% B), 1-1.5 मिनट (20-50% B), 1.5-7.5 मिनट (50-70% B), 7.1 5-13 मिनट (70-95% B), 13-17 मिनट (95% B), 17-17.1 मिनट (95-20% B), 17.1-23 मिनट (20%)
  7. हिलिक पृथक्करण के लिए, एक हिलिक कॉलम (100 x 2.1 मिमी, 3 माइक्रोन) का उपयोग करें।
    1. प्रवाह दर को क्रमशः 400 माइक्रोल/मिनट और ऑटोसंप्लर और कॉलम तापमान को क्रमशः 4 डिग्री सेल्सियस और 40 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
    2. निम्नलिखित अनुपात के अनुसार मोबाइल चरण तैयार करें: मोबाइल चरण ए: एसीएन; मोबाइल चरण बी: पानी में 5 mm अमोनियम एसीटेट। निम्नलिखित मापदंडों के अनुसार मोबाइल चरण प्रवाह निर्धारित करें: 0-2 मिनट (96% B), 2-15 मिनट (96-80% B), 15-15.1 मिनट (80-96% B), 15.1-21 मिनट (96% B)।
  8. वोल्टेज 3,500 वी, केशिका तापमान 275 डिग्री सेल्सियस, म्यान गैस 20 एयू, ऑक्स गैस प्रवाह दर 10 एयू, प्रोब हीटर तापमान 300 डिग्री सेल्सियस, एस-लेंस आरएफ स्तर 55% स्प्रे करने के लिए सकारात्मक आयनीकरण मोड में HESI आयन स्रोत पैरामीटर सेट करें।
  9. उपकरण प्रदर्शन की निगरानी के लिए प्रत्येक विश्लेषण नमूने (हर 10-12 नमूनों) के 10 माइक्रोन से बना क्यूसी नमूने चलाएं।
  10. उपकरण के साथ संगत सॉफ्टवेयर में डेटा अधिग्रहण करें।

6. डेटा विश्लेषण

  1. अप्रारक मेटाबोलोमिक्स और लिपिडोमिक्स विश्लेषण के लिए समर्पित सॉफ्टवेयर के उपयोग के साथ डेटा प्रसंस्करण, ख्यात पहचान और सांख्यिकीय विश्लेषण करें।
    नोट: प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) और बॉक्स-मूंछ भूखंडों को डेटा संरचना की कल्पना करने के लिए प्राप्त किया जा सकता है।

Representative Results

नमूना संग्रह ऊपर वर्णित SPME विधि के अनुसार किया गया था, 7 मिमी मिश्रित मोड निष्कर्षण चरण के साथ लेपित जांच का उपयोग करके। नमूना सीधे भ्रष्टाचार ऊतक से आयोजित किया गया था (प्रत्यारोपण से पहले वीवो में), 1 घंटे के बाद गुर्दे के चैंबर में पूर्व वीवो, 3 घंटे, 5 घंटे, और परफ्यूजन के 7 घंटे, और प्राप्तकर्ता में पुनर्वैस्कुलराइजेशन के बाद वीवो में । तरल क्रोमेटोग्राफी (आरपी, हिलिक) के उपयोग के साथ उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर, सकारात्मक आयनीकरण मोड में सेट मास एनालाइजर के साथ अलक्षित मेटाबोलोमिक और लिपिडोमिक विश्लेषण किए गए। डेटा की गुणवत्ता का आकलन करने और परिणामों के बारे में सामान्य अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, डेटा को प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) के अधीन किया गया था। जैसा कि चित्रा 1में दिखाया गया है, क्यूसी नमूनों ने विश्लेषण की गुणवत्ता की पुष्टि करते हुए एक तंग क्लस्टर का गठन किया। अध्ययन किए गए समूह अपेक्षाकृत अच्छे अलगाव का प्रदर्शन करते हैं, जो प्रत्यारोपण से पहले और बाद में मेटाबोलिक और लिपिडोमिक प्रोफाइल में मतभेदों के दृश्य के साथ-साथ अंग परफ्यूजन(चित्र 2)के दौरान भी अनुमति देते हैं। एसपीएमई नमूना समय के साथ अंग की मेटाबॉलिक प्रोफाइलिंग की अनुमति देता है। चयनित मेटाबोलाइट्स के बॉक्स-मूंछ भूखंड पूरे प्रयोग(चित्र 3)में मेटाबोलाइट के स्तर में परिवर्तन की मिसाल पेश करने का काम करते हैं। आरपी और एचआईएलआईसी दोनों स्तंभों पर अलग की गई सुविधाओं का विस्तृत स्पेक्ट्रम चित्र 4में दिखाया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रमुख घटक विश्लेषण मेटाबोलॉमिक उत्क्रमित चरण (ए), एचआईएलआईसी (बी) और लिपिडोमिक उत्क्रमित चरण (सी), एचआईएलआईसी (डी) विश्लेषण के लिए गुणवत्ता नियंत्रण नमूनों की क्लस्टरिंग दिखाता है। वाद्य अस्थिरता से प्रेरित किसी भी संभावित परिवर्तन की निगरानी के लिए अलक्षित विश्लेषण में गुणवत्ता नियंत्रण आवश्यक है। क्यूसी नमूनों का तंग क्लस्टर यह सुनिश्चित करता है कि देखे गए सभी परिवर्तन जैविक मूल के हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रमुख घटक विश्लेषण मेटाबोलॉमिक (ए) और लिपिडोमिक (बी) विशेष नमूना बिंदुओं के बीच अंतर दिखा रहा है। एसपीएमई-एलसी-एचआरएमएस के साथ गुर्दे की अलक्षित प्रोफाइलिंग उनके संरक्षण के बाद के चरणों में अंगों में जैव रासायनिक मतभेदों का पालन करने में सक्षम बनाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: पेरिट्रांसप्लांट अवधि के दौरान मेटाबोलाइट्स (ए, बी) और लिपिड (सी, डी) में परिवर्तन दिखाने वाले चयनित यौगिकों के बॉक्स-मूंछ भूखंड। चयन और भेदभाव यौगिकों बॉक्स की पहचान के बाद-मूंछ भूखंडों प्रोटोकॉल के बाद के चरणों में इन यौगिकों के स्तर में परिवर्तन की निगरानी और विभिन्न संरक्षण प्रोटोकॉल के अधीन अंगों में चयापचय के स्तर की तुलना करने में सक्षम बनाता है या विभिन्न दाताओं से काटा जैसे हृदय मृत्यु के बाद दिल की धड़कन दाताओं या दाताओं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: आयन नक्शा (एम/जेड बनाम प्रतिधारण समय) एलसी-एमएस विश्लेषण द्वारा प्राप्त सुविधाओं के साथ (ए) उलट चरण और (बी) HILIC जुदाई । यह भूखंड प्रस्तावित प्रोटोकॉल (निष्कर्षण से पता लगाने तक) के साथ प्राप्त सुविधाओं की कुल संख्या का अनुमान लगाने और ध्रुवता के आधार पर विश्लेषण कवरेज का आकलन करने में सक्षम बनाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

अंग की गुणवत्ता का मूल्यांकन चिकित्सकों के लिए एक बड़ी चुनौती बनी हुई है, जो इस बारे में त्वरित सूचित निर्णय करना चाहिए कि क्या कोई दिया गया अंग प्रत्यारोपण के लिए व्यवहार्य है या क्या इसे त्याग दिया जाना चाहिए । दाता आयु, इस्केमिया की अवधि, और संक्रमण और भड़काऊ प्रक्रियाओं जैसे कई कारक, दीर्घकालिक भ्रष्टाचार परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं। जबकि गुर्दे के एलोबेड़ा समारोह का निदान करने के लिए आज तक विविध तरीके विकसित किए गए हैं, हिस्टोपैथोलॉजिकल निरीक्षण उस मामले,3, 4,,12में स्वर्ण मानक बना हुआ है।4 हालांकि बायोप्सी प्रक्रिया पहले से मौजूद दाता रोग और संवहनी परिवर्तन के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी उपज कर सकते हैं, यह खामियों से मुक्त नहीं है । अंग समारोह के बारे में व्यापक जानकारी के लिए इंटरऑब्जर्वर परिवर्तनशीलता और अपर्याप्त ग्लोमेरुली के नमूने से जुड़ी नमूना त्रुटियां इस संबंध में विशिष्ट चिंताएं बनी हुई हैं । इसके अलावा, नमूना तैयारी जमे हुए वर्गों के मामले में भ्रष्टाचार का अधूरा मूल्यांकन, और पैराफिन अनुभागिंग के लिए प्रक्रिया समय के विस्तार जैसे कुछ मुद्दों को लाती है। हालांकि, रक्तस्राव का बढ़ा जोखिम, जो सूक्ष्म या सकल हेमेटुरिया के रूप में तीव्रता से दिखाई दे सकता है, बायोप्सी प्रक्रिया से जुड़ी प्रमुख जीवन-धमकी देने वाली जटिलता है। इस कारण से, प्रत्यारोपण प्रक्रियाओं में स्वीकार्य बायोप्सी की संख्या सख्ती से सीमित है, एक कारक जो,इस विधि12, 13,,14के माध्यम से गतिशील परिवर्तनों और समय श्रृंखला विश्लेषणों को पकड़ने में बाधा डालता है।14 एक हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लाभों को कार्यप्रणाली से जुड़े जोखिमों के खिलाफ तौला जाना चाहिए। हिस्टोलॉजिकल निष्कर्षों का मूल्य निर्विवाद है, लेकिन वे विपथनों के आणविक तंत्र की व्याख्या नहीं करते हैं।

मेटाबोलोमिक्स और लिपिडोमिक्स "-ओमिक्स" वैज्ञानिक परिवार के सबसे कम उम्र के डोमेन हैं। मेटाबोलिक नेटवर्क के भीतर जुड़े कम आणविक (<1,200 दा) मानव मेटाबोलाइट्स और लिपिड का पूरा सेट मानव मेटाबोलोम के रूप में परिभाषित किया गया है। जीनोम अपने जीवनकाल में अपेक्षाकृत स्थिर रहता है, थोड़ा परिवर्तन की वजह से संशोधनों के साथ अक्सर होने वाली । मेटाबोलोम जीन अभिव्यक्ति का उत्पाद है, जो सभी जैविक प्रक्रियाओं के साथ-साथ पर्यावरणीय कारकों में परिवर्तन के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है। मेटाबोलाइट्स और लिपिड की गतिशील प्रकृति उन्हें वर्तमान अंग स्थिति 7 ,8,15,,16के सही संकेतक बनाती है ।,15 उपर्युक्त प्रोटोकॉल में प्रस्तावित एसपीएमई विधि इसके संरक्षण के दौरान अंग में होने वाले परिवर्तनों का पता लगाने में सक्षम बनाती है, जो दाता के शरीर से अंग हटाने से शुरू होकर प्राप्तकर्ता के पुनर्संवहन तक करती है। जांच का छोटा व्यास (~ 200 माइक्रोन) न्यूनतम आक्रामकता प्रदान करता है और ऊतक को कोई नुकसान पहुंचाए बिना एक ही अंग से कई नमूने के लिए अनुमति देता है। गुर्दे का उपयोग करके अध्ययन करना, सबसे अधिक बार प्रत्यारोपित अंग के रूप में, ग्राफ्ट की गुणवत्ता और कार्य में गिरावट के लिए जिम्मेदार मेटाबोलिक रास्तों की बेहतर समझ और आगे के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है। समय के साथ संशोधनों की निगरानी की संभावना निश्चित रूप से बायोप्सी जैसे पारंपरिक आक्रामक तरीकों की तुलना में तकनीक का एक महत्वपूर्ण लाभ है। वर्तमान में प्रस्तुत विश्लेषण लिपिड और मेटाबोलाइट्स के विभिन्न समूहों की बदली हुई सांद्रता की पहचान की गई, विशेष रूप से आवश्यक अमीनो एसिड, प्यूरीन, प्यूरीन न्यूक्लियोसाइड्स और ग्लाइफोस्फोस्फोलिपिड्स। ये परिणाम पिछले ऊतक विश्लेषण रिपोर्ट 5 ,6,17,,18,619,20के अनुरूप हैं .18 आज तक, प्रत्यारोपण या इस्केमिया/रिफ्यूजन इंजरी (आईआरआई) घटनाओं के बाद जटिलताओं को प्रेरित करने वाली प्रक्रियाओं को समझाने के लिए मेटाबोलोमिक्स या लिपिडोमिक्स का उपयोग करने वाली अधिकांश वैज्ञानिक रिपोर्टें बायोफ्लुइड्स21, 22,,,23के विश्लेषण तक सीमित रही हैं ।22

प्रत्येक नैदानिक आवेदन के लिए नमूना प्रोटोकॉल के अनुकूलन की आवश्यकता होती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि विश्लेषणात्मक विधि का प्रदर्शन अपेक्षित मानदंडों को पूरा करता है। इस संबंध में, एसपीएमई का उपयोग करने का लाभ विभिन्न प्रायोगिक डिजाइनों के लिए शर्तों को समायोजित करने की संभावना है। सुलभ निष्कर्षण चरणों की विविधता विविध ध्रुवों के साथ निकाले गए मेटाबोलाइट्स का एक व्यापक स्पेक्ट्रम प्रदान करती है। साथ ही, इसे इस तथ्य के कारण विधि की सीमा के रूप में माना जा सकता है कि प्रत्येक शर्बत विशिष्ट विशेषताओं के प्रति चयनशीलता प्रदान करता है और नमूना मैट्रिक्स में मौजूद सभी यौगिकों को नहीं निकालता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एसपीएमई कोटिंग्स केवल मुक्त अणुओं के माध्यम से निकालते हैं, और बस विश्लेषण के एक बाध्य अंश के साथ बातचीत नहीं करते हैं। प्रोटीन जैसे बड़े अणुओं के निष्कर्षण को रोकते समय कोटिंग्स की जैव अनुकूलता ऊतक में विषाक्तता का परिचय नहीं देती है; नतीजतन, एंजाइमेटिक प्रक्रियाओं को नमूना संग्रह के चरण में पहले से ही बाधित किया जाता है और कलाकृतियों की उपस्थिति को कम किया जाता है, जो वैकल्पिक नमूना विधियों पर एक बड़ा लाभ है। कोटिंग की लंबाई निष्कर्षण की दक्षता को प्रभावित करती है (यानी, कोटिंग की लंबाई सतह क्षेत्र और निष्कर्षण चरण की मात्रा को नामित करती है); इस प्रकार, अब कोटिंग्स अधिक वसूली उपज। दूसरी ओर, छोटे कोटिंग्स उच्च स्थानिक संकल्प को सक्षम करते हैं। विश्वसनीय परिणामों के लिए, गुर्दे के प्रांतस्था की सटीक गहराई तक जांच को जलमग्न करना महत्वपूर्ण है। प्रविष्टि बहुत गहरी गुर्दे मेडुला में प्रवेश करने का खतरा पैदा करता है। निष्कर्षण का समय भी निष्कर्षण दक्षता के आनुपातिक है। इसलिए, इष्टतम निष्कर्षण समय का चयन एसपीएमई विधि विकास में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है। समय माप की सटीकता उच्चतम पुनरावृत्ति प्रदान करती है। जैविक अनुप्रयोगों जैसे कि एक पर चर्चा की गई है, विश्लेषणात्मक प्रोटोकॉल की संवेदनशीलता और पुनरावृत्ति और चिकित्सा प्रक्रिया के प्रतिबंधों के बीच हमेशा समझौता होता है। जबकि संतुलन निष्कर्षण उच्चतम संवेदनशीलता प्रदान करता है, सुरक्षा कारणों के लिए, पूर्व संतुलन की स्थिति अक्सर ऐसे अनुप्रयोगों में उपयोग की जाती है, क्योंकि निष्कर्षण समय सर्जरी की कुल अवधि को प्रभावित नहीं करना चाहिए। डिसोर्पशन की दक्षता प्रक्रिया के समय और डिऑर्पोरेशन सॉल्वेंट की संरचना द्वारा निर्धारित की जाती है, जो क्रोमेग्राफिक सेपरेशन9,10, 11,11के लिए उपयोग किए जाने वाले मोबाइल चरण के साथ संगत होना चाहिए।,

इंट्रा-सर्जिकल आकलन के लिए उपयोग किए जाने वाले नैदानिक इंस्ट्रूमेंटेशन के लिए प्रमुख आवश्यकताओं में से एक विश्लेषण का समय है। वर्तमान प्रयास वीवो एसपीएमई निष्कर्षण में माइक्रोफ्लुइडिक ओपन इंटरफेस (एमओआई)24 या कोटेड ब्लेड स्प्रे (सीबीएस)25के माध्यम से सीधे एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के लिए एक तेजी से उपकरण विकसित करने के लिए किए जा रहे हैं । इस तरह के दृष्टिकोण वास्तविक या वास्तविक समय के करीब विश्लेषणात्मक परिणामों के प्रकटीकरण के लिए अनुमति देंगे। मेटाबोलिक और लिपिडोमिक प्रोफाइल के पूर्व-हस्तक्षेप विश्लेषणों के लिए इस तरह के तरीकों का उपयोग प्रत्यारोपण प्रक्रियाओं के दौरान निर्णय लेने की प्रक्रिया को बढ़ा सकता है, जिससे अंग विफलता के मामले में सर्वोत्तम संभव व्यक्तिगत दृष्टिकोण और तेजी से प्रतिक्रिया हो सकती है ।

एक सारांश के रूप में, यह परिकल्पना की गई है कि प्रस्तावित प्रोटोकॉल गुर्दे के ग्राफ्ट के पूर्ण मेटाबोलिक और लिपिडोमिक प्रोफाइल की प्राप्ति को सक्षम करेगा, जो बदले में अंग की गुणवत्ता और इस्केमिया-रिफ्यूजन चोट के लिए जिम्मेदार प्रक्रियाओं के लक्षण वर्णन का व्यापक आकलन प्रदान करेगा। परियोजना की नवीनता में ठोस-चरण माइक्रोएक्सट्रैकक्शन (एसपीएमई) का उपयोग शामिल है, जो मेटाबोलोमिक्स और लिपिडोमिक्स विश्लेषण (उदाहरण के लिए ऑर्बिटरप हाई रेजोल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर) के लिए उपलब्ध सबसे नवीन प्रौद्योगिकियों में से एक के संयोजन में जीवित प्रणालियों के कम आक्रामक नमूने की पेशकश करता है। एसपीएमई एक चरण में मेटाबोलाइट्स के नमूना संग्रह, निष्कर्षण और शमन को जोड़ती है, इसलिए यह तेजी से विश्लेषण के लिए एक आदर्श उपकरण बना रही है। यह उम्मीद की जाती है कि यह प्रोटोकॉल गुर्दे की पूर्व-प्रत्यारोपण स्थितियों से संबंधित सवालों के जवाब देने में मदद करेगा, साथ ही प्रत्यारोपण के बाद देरी से अंग समारोह या उसके रोगों के लिए जिम्मेदार हैं, साथ ही साथ भ्रष्टाचार संरक्षण प्रोटोकॉल अंग की जैव रसायन को कैसे प्रभावित करता है। इस तरह के ज्ञान न केवल प्रत्यारोपण से संबंधित संभावित जटिलताओं की रोकथाम पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ेगा, लेकिन वर्तमान भ्रष्टाचार संरक्षण प्रोटोकॉल में सुधार करने में मदद कर सकते हैं, व्यवहार्य प्रत्यारोपण ऊतक के नुकसान को कम करने के साथ ही जीवन की हानि । प्रस्तावित समाधान इस क्षेत्र में आगे की जांच के लिए दरवाजा खोलेगा, जिसमें विशिष्ट संभावित बायोमार्कर का सत्यापन और प्रत्यारोपण में चिकित्सीय परिणामों में सुधार शामिल है ।

Disclosures

लेखक क्यू-सटीक फोकस ऑर्बिटरप मास स्पेक्ट्रोमीटर तक पहुंच के लिए एसपीएमई डिवाइस और थर्मो फिशर साइंटिफिक प्रदान करने के लिए मिलिपोरसिग्मा (मर्क केगा, डार्मस्टेड, जर्मनी) को स्वीकार करना चाहते हैं।

Acknowledgments

इस अध्ययन को राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र से अनुदान रचना यूएएमओ-2017/27/बी/NZ5/01013 द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक SPME उपकरणों को उपलब्ध कराने के लिए मर्क केगा, डार्मस्टेड, जर्मनी के व्यवसाय मिलिपोरसिग्मा को स्वीकार करना चाहते हैं। मर्क का जीवन विज्ञान व्यवसाय अमेरिका और कनाडा में मिलिपोरसिग्मा के रूप में संचालित होता है। इसके अलावा, लेखक क्यू-एकिव फोकस ऑर्बिटरप मास स्पेक्ट्रोमीटर तक पहुंच के लिए थर्मो फिशर साइंटिफिक का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। लेखक डॉ एलेक्सांद्रा वोडरस्का-जसिन्स्का और इस परियोजना में अपनी तरह की सहायता के लिए Bydgoszcz में ट्रांसप्लांटोलॉजी और जनरल सर्जरी विभाग के कर्मियों को धन्यवाद देना चाहते हैं । बीबी वाटरलू विश्वविद्यालय में अपने प्रवास के दौरान टोरंटो जनरल अस्पताल में नमूना संग्रह के अवसर के लिए प्रो Janusz Pawliszyn शुक्रिया अदा करना चाहता हूं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Merck 5330010050 Mobile phase additive
Acetonitrile Alchem 696-34967-4X2.5L HPLC solvent
Ammonium acetate Merck 5330040050 Mobile phase additive
BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXER Benchmark Scientific BV1010 Vortex mixer
Caps Perlan Technologies 5183-2076 Blue scrw tp, pre-slit PTFE/Si spta, 100PK
Chloroform Merck 1024441000
Discovery HS F5 Supelguard Cartridge, 3 μm, L × I.D. 2 cm × 2.1 mm Merck 567570-U HPLC guard column
Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm Merck 567502-U HPLC column
Formic acid Alchem 497-94318-50ML Mobile phase additive
Glass vials Perlan Technologies 5182-0714
HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm Shim-Pol PHX-00D-4449-B0 HPLC column
HILIC SecurityGuard Cartridge, 3 μm, 4 x 2.0 mm Shim-Pol PHX-AJ0-8328 HPLC guard column
Isopropanol Alchem 231-AL03262500 HPLC solvent
Methanol Alchem 696-34966-4X2.5L HPLC solvent
Nano-pure water Merck 1037281002 HPLC solvent
Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS Thermo Scientific Q Exactive Focus Mass Spectrometer
SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm Merck 1506570001 HPLC column
SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm Merck 1504360001 HPLC guard column
SPME LC fiber probes, mixed mode Supelco prototype fibers
UltiMate 3000 HPLC systems Thermo Scientific UltiMate 3000 HPLC system
Vial inserts (deactivated) Perlan Technologies 5181-8872
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm Waters 186005644 HPLC column
XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge 3.5μm, 2.1x5mm Waters 186007811 HPLC guard column

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References

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चिकित्सा अंक 160 प्रत्यारोपण गुर्दे रासायनिक बायोप्सी मेटाबोलोमिक लिपिडोमिक ठोस चरण माइक्रोएक्सेट्राक्शन (एसपीएमई) तरल क्रोमेटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) के साथ मिलकर

Erratum

Formal Correction: Erratum: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment
Posted by JoVE Editors on 08/28/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment. One of the affiliations was updated.

The third affiliation was updated from:

Department of Transplantation and General Surgery, University Hospital, University of Nicolaus Copernicus Torun"

to:

Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland

भ्रष्टाचार गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए एक रासायनिक बायोप्सी का उपयोग करना
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Stryjak, I., Warmuzińska, N.,… More

Stryjak, I., Warmuzińska, N., Łuczykowski, K., Hamar, M., Urbanellis, P., Wojtal, E., Masztalerz, M., Selzner, M., Włodarczyk, Z., Bojko, B. Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment. J. Vis. Exp. (160), e60946, doi:10.3791/60946 (2020).

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