Summary
该协议为从小鼠中生产可行的精确切肝片提供了一种简单可靠的方法。前活体组织样本可在实验室组织培养条件下维持多日，为检查肝病理生物学提供了灵活的模型。
Abstract
了解肝损伤、肝纤维化和肝硬化的机制，这些机制是慢性肝病（即病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、代谢性肝病和肝癌）的基础，需要实验性操作动物模型和体外细胞培养物。这两种技术都有局限性，例如对大量动物进行体内操作的要求。然而，体外细胞培养物不再现多细胞肝环境的结构和功能。使用精密切肝片是一种技术，其中保持一致的可行的小鼠肝脏切片在实验室组织培养进行实验操作。该技术占据了动物研究和体外细胞培养方法之间的实验空白。提出的协议描述了一种从小鼠身上分离和培养精确切肝片的简单而可靠的方法。作为该技术的应用，前活体肝切片用胆汁酸进行治疗，以模拟胆静肝损伤，并最终评估肝纤维成因的机制。
Introduction
大多数慢性肝病（即病毒性肝炎、非酒精性性性性性性肝炎、胆汁性肝病和肝癌）的发病机制涉及多种不同肝细胞类型之间的复杂相互作用，这些细胞类型驱动炎症、纤维生成和癌症发展11、2。2为了了解这些慢性肝基疾病背后的分子机制，必须研究多种肝细胞类型之间的相互作用。虽然多个肝细胞系（以及最近，器官）可以在体外培养，但这些模型不能准确模拟肝微环境3的复杂结构、功能和细胞多样性。此外，培养的肝细胞（特别是转化的细胞系）可能偏离其原始来源生物学。动物模型被实验性地用于研究多种肝细胞类型之间的相互作用。然而，由于肝外器官（例如，在测试潜在治疗药物时），实验操作的范围可能会显著缩小。
在组织培养中使用精密切肝片（PCLS）是首次用于药物代谢和毒性研究的实验技术，它涉及切割可行的超薄（约100~250 μm厚）肝片。这允许直接实验操作肝组织前活体4。该技术填补了体内动物研究与体外细胞培养方法之间的实验差距，克服了两种方法的许多缺点（即，对整个动物可进行的实验范围的实际限制，以及利用体外细胞培养方法丧失结构/功能和细胞多样性）。
此外，与整个动物研究相比，PCLS大大提高了实验能力。由于一只小鼠可以产生超过48个肝切片，这也方便了使用来自同一肝脏的控制和治疗组。此外，该技术将肝脏组织与其他器官系统物理分离;因此，在测试外源性刺激的效果时，它消除了整个动物中可能发生的潜在非目标效应。
在此协议中，PCLS 使用带有横向振动刀片的振动器生成。其他研究已经成功地使用了克鲁姆迪克组织切片机，如奥林加和舒潘5所述。在振动器中，刀片的横向振动可防止剪切应力引起的超薄组织的撕裂，因为刀片被推入组织。振动片和克鲁姆迪克组织切片器都能有效工作，无需对肝脏组织进行结构嵌入，从而简化切片程序。该技术还可用于从患病肝脏创建PCLS，包括那些从小鼠模型纤维化/肝硬化6和肝硬化7。
除了展示PCLS的制备和组织培养所需的技术外，本报告还通过测量腺苷三磷酸（ATP）水平并检查组织组织组织学来评估坏死和纤维化，来检查这些前活体组织的生存能力。作为一项具有代表性的实验程序，PCLS以三种不同的胆汁酸（糖胆酸、黄骨酸和胆酸）的病理生理浓度进行治疗，以模拟胆静肝损伤。在胆汁性肝损伤的情况下，特别是胆碱酸在囊性纤维化相关肝病8的儿童血清和胆汁中都明显增加。
肝祖细胞也接受了在体外用陶罗基酸治疗，以模拟患者观察到的高灰胆酸水平，这种治疗导致肝祖细胞对胆小（胆碱）表型9的增殖和分化增加。随后，PCLS在体内处理，其陶罗乔酸水平升高，并观察到胆碱基标记的增加。这支持体外观察，在小儿囊性纤维化相关肝病9中，陶罗基酸驱动胆汁增殖和/或分化。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有动物实验均根据澳大利亚关于为科学目的护理和使用动物的法典进行，经该研究所动物伦理委员会批准。雄性C57BL/6小鼠（15-20周大）来自澳大利亚西澳大利亚州动物资源中心。
注：所有与样品接触的解决方案、介质、仪器、硬件和管材都必须用70%乙醇溶液消毒或彻底消毒，并使用无菌技术进行处理，以尽量减少培养污染的风险。
1. 振动器的设置
- 准备无菌的克雷布斯-亨塞莱特缓冲液与2克/升葡萄糖（材料表）。检查缓冲区的 pH 值是否为 7.4。如果 pHH 较高，则用肉原（95% O2 + 5% CO2）饱和缓冲液，或在 5% CO2组织培养培养培养箱内孵育以校正碳酸氢盐缓冲系统。在4°C下冷藏密封无菌缓冲液。
- 将振动刀片插入切割臂。确保刀片紧紧固定在切割臂上，因为振动可能导致刀片松动。
- 使用 70% 乙醇溶液对刀片和切割臂进行消毒。
注意：避免与刀片接触。 - 用70%乙醇溶液消毒缓冲盘，并用无菌组织擦拭。
- 将缓冲盘插入振动器并拧紧安装机构。
- 将切割臂设置为最大可用高度。
- 将刀片角度设置为水平以下 10°，向下倾斜到样品。确保刀片角度已紧固定。
注：最佳刀片角度可能因振动模型和组织特性而异。 - 使用 70% 乙醇溶液对试样支架进行消毒。
- 连接缓冲盘下方的 Peltier 热电冷却器的冷却水。
注：某些振动模型使用冰浴进行冷却。 - 将出水管固定到排水沟中并打开水。将冷却器设置为 4 °C。以 >400 mL/min 的速度运行冷却水。
- 用无菌冰冷的 Krebs-Henseleit 缓冲液（2 g/L 葡萄糖）几乎将缓冲盘填充到顶部。在冰上留下额外的克雷布斯-亨塞利特缓冲液。
2. 肝脏切除和准备
- 使用高压扣对所有手术器械进行消毒或消毒，包括弯曲钳、扁平方尖钳、钳子、手术钳和剪刀。
- 在摘肝之前，使用100mg/kg氯胺酮和12.5毫克/千克木拉辛的腹内注射对小鼠进行深度麻醉。
注：可以使用其他麻醉剂，或者如果肝脏被迅速取出以防止缺氧引起的损伤，则小鼠可以通过CO2窒息/宫颈脱位进行安乐死。 - 使用 70% 乙醇溶液润湿小鼠的皮肤表面进行消毒。将所有四肢都固定在解剖板上的老鼠背上。
- 从腹腔底部到隔膜正上方，将垂直中线切口进入皮肤。
注：向四肢倾斜，以方便皮肤的回缩。 - 在切割皮肤和腹腔之间的任何结缔组织时，将皮肤拉回来。尽可能防止头发转移到腹腔。固定或夹紧皮肤远离腹腔。
- 使用干净的钳子和剪刀，打开腹腔和下胸腔。
- 快速取出肝脏，而不会损坏叶
- 使用钝器（例如，扁平的方形尖钳），引导上肝叶向下朝向腹部。用剪刀切开上肝叶周围的结缔组织。
- 引导肝瓣向上朝向隔膜。用钳子握住肝脏的中央血管束。
注：如果中央血管束损坏，不会影响程序。 - 将中央血管束从小鼠身边拉开，切下剩余的结缔组织、血管等，取出肝脏。小心不要损坏肝瓣和2）切入胃肠道，因为这可能会污染肝脏与微生物。
- 将取出的肝脏放入一个无菌的10厘米组织培养皿中，半满冰冷的Krebs-Henseleit缓冲液。使用钝器引导叶，切开肝脏的中心，将其分成单独的叶。
- 选择一个肝叶（使用最大的第一），并将其平侧向下放在一个新的无菌10厘米的菜。将所有其他肝叶保存在储存在冰上的Krebs-Henseleit缓冲液的盘中，以便随后使用。
- 平躺时，从肝瓣的最高边缘修剪大约10%的材料。
注：修剪很重要，因为此组织边缘将首先接触切割刀片;因此，相对垂直于切割刀片的组织边缘将防止因未切割的肝叶中浅角度而可能发生的组织压缩。 - 修剪其他三个组织边缘。
注：这将去除一些纤维格里松的胶囊，并将使分离组织切片更容易。 - 将肝瓣安装在试样支架上
- 将一层薄薄的氰丙烯酸酯胶水（超级胶水或医用/兽医级氰化胶）放在标本支架上，朝向前，大小略大于修剪的肝叶。
注：检查氰丙烯酸酯胶水不含非氰化添加剂。 - 使用远离切削刃的一角用无菌钳子轻轻拾取肝叶，然后用无菌吸收材料从肝叶的平坦侧轻拍干任何残留的缓冲液。
- 将肝瓣的大平侧放在青色丙烯酸酯胶片上，最大边缘朝向前方。让它在空气中固化1⁄2分钟。
注：环丙酸酯胶粘剂能迅速（约2分钟）固化，以响应残留水分和组织蛋白，并将组织牢固地附着在试样支架上。
- 将一层薄薄的氰丙烯酸酯胶水（超级胶水或医用/兽医级氰化胶）放在标本支架上，朝向前，大小略大于修剪的肝叶。
3. 肝切片的生产
- 将带附加的肝瓣的试样支架放入振动缓冲托盘中。确保肝叶完全覆盖在缓冲器中。
注：如果需要，充值冰冷的克雷布斯-亨塞利特缓冲液。如果缓冲液位模糊了切割过程，则增加或降低该水平。 - 设置切削速度。
注：这可能需要根据振动模型和刀片特性进行经验确定。作为起动指南，使用 57 Hz/3，420 rpm 的速度。振动速度可以使用智能手机上的音频频谱分析仪应用程序进行测量。 - 使用高度表盘降低切割刀片，直到它位于肝瓣正上方。将振动切割臂在样品上运行。
- 使用反向曲柄手柄将刀片放回。返回刀片时激活振动。刀片返回且未高于样品后，将刀片高度降低 250 μm。
- 重复切割过程，直到取下组织顶部。丢弃第一或两片，因为这些将包含Glisson的胶囊，因此不包含很多功能性肝组织比其他切片。
- 要切肝片，通过转动手柄，缓慢地将振动刀片推进到组织中。使用小型画笔（用 70% 乙醇溶液消毒）在切割过程中轻轻引导组织。
- 使用画笔抬起切组织切片，并将组织切片放入冰冷的Krebs-Henseleit缓冲液的无菌管中。不使用时，将管放在切片之间的冰上。
注：有时，组织在切割过程中会撕裂，但在大多数情况下，组织仍然可用。 - 重复切割过程，直到达到肝瓣底部。丢弃任何有明显固化胶水的肝片。
注：固化的胶水在组织片上作为白色区域可见。典型的肝叶只有2毫米左右的可用厚度。因此，每个叶只产生大约8个250μm肝切片。 - 切开组织切片，直到接近氰化胶。不要切入胶水。
- 与其他肝叶重复整个过程，直到获得所需数量的组织切片。
- 要从试样支架上清洁固化的氰化胶和组织，请使用刀片刮掉固化的胶水/组织混合物，或者用丙酮或二甲基硫氧化物软化和清洁混合物。
4. 组织培养
注：所有组织培养工作必须在无菌层流罩中执行。
- 在组织培养层状流罩中，将含有2.0克/L葡萄糖、10%胎儿牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺补充剂、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链球菌素的移液剂1 mL放入12个井组织培养板中。
注：其他抗生素和抗真菌剂也可以添加。一些研究在组织孵化介质（即地塞米松和胰岛素10）中使用了添加剂，但这些可以干扰细胞信号。 - 将含有冰块肝片的管子放入组织培养罩中。要去除组织切片，请轻轻旋转混合物，在旋转时轻轻倒入无菌的 10 厘米盘中。
- 使用无菌尖尖钳和手术刀，将组织切片切成大致均匀的大小（例如，15 mm2）。
注： 执行此步骤以确保表面积一致。由于小鼠肝叶的大小明显不同，有些组织切片会撕裂，因此会产生一系列具有不同表面积的PCLS。PCLS 的最终表面积大小取决于后续分析应用中需要多少材料，以及需要复制多少。将大型 PCLS 切成相同近似大小的较小多个部分，将先天允许增加实验复制数量。 - 使用无菌钳或小型画笔，将切割组织切片转移到含有1 mL介质的12孔板的孔中。
注：注意确认组织切片的厚度和形状的一致性。比平均值暗的部分表明组织厚度较大，需要丢弃。较轻的切片表明存在固化的氰化胶，需要丢弃。 - 在95%的湿度下，在37°C和5%CO2孵育肝切片。
注：其他组使用的方法，以提高氧气输送到PCLS，这似乎延长了组织生存时间66，10，11，12，13（见讨论部分）。,10,11,12,13 - 第二天，使用手动移液器（而不是吸力）改变培养介质，以防止因吸入错误而损失组织。随后，每天更改 PCLS 上的介质。PCLS 现已准备好用于实验用途。
5. PCLS 的示例应用
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
为了确定PCLS随时间的细胞可行性，测量了组织ATP水平。ATP 水平通常与可行性成正比。PCLS（面积约15 mm2区域）在正常威廉的E介质中培养，具有10%的FBS，然后在特定的时间点，肝切片从组织培养中去除，并同质化，测量ATP和蛋白质（用于正常化）浓度（材料表）。Figure 1A对于这样的生化测定，规范化很重要，因为切肝片在尺寸上不一定相同。ATP水平（相对于蛋白质）在隔离后立即被抑制，1小时后（图1A），表明冷却和切割过程的短期代谢压力。然而，ATP水平恢复3小时ATP水平仍然升高，在组织培养长达5天，表明没有显著下降的生存能力。肝切片的血红素和欧辛（H&E）染色表明，在培养中发生有限的组织坏死（以核多态性为特征）从第2天和第3天左右发生。组织坏死水平进展到严重第5天（图1B）。考虑到这些形态数据，结合ATP结果，建议使用此实验组织模型长达3天。
PCLS还显示，在后来的培养时间点，胶原蛋白积累增加，如第5天对皮罗-天狼星红染色胶原纤维的增厚（图2）。胶原纤维的增厚表明，自发纤维化过程在使用这种方法获得的PCLS中是活跃的。这个过程看起来与PCLS分离方法无关，胶原纤维6和原纤维基因表达的增厚14分别发生在振动和Krumdieck组织切片器，随着时间的推移。在解释PCLS生物学时，需要考虑这些自发纤维化过程的发展，特别是与纤维化过程相关的实验。
我们之前已经显示，在PCLS9中TCA的胆碱基特异性基因康奈西林43（Cx43）和谷氨基转氨基蛋白（Ggt1）蛋白的分泌显著。Cx43用TCA、GCA或CA处理的PCLS中，与内务控制（甘油醛3-磷酸盐脱氢酶[Gapdh]和低氧辛磷酸酯转移酶1[Hprt1]）中与簿记控制相关的胆碱基特异性基因的表达，由qPCR使用特定的引土剂进行检测。与以前的报告一致，在表达胆碱基细胞特异性基因细胞角蛋白19（CK19;图3A）和康奈辛43（Cx43;GCA和 TCA 均观察到图 3B。Ggt1表达由胆汁酸增加;虽然，这没有达到统计意义，可能是由于实验变异（图3C）。CA 的表达不受任何胆汁酸的影响。胆碱细胞特异性基因的诱导表明，GCA也可能参与胆静肝损伤，如先前报告的TCA88，9。9
图1：精确切割肝切片（PCLS）的组织可行性。（A） PCLS 中的 ATP 和蛋白质水平立即测量 （T + 0）， 并在隔离后 1 小时、3 小时、6 小时和 1⁄5 天测量。（B） 为了检查细胞形态，PCLS 被固定、石蜡嵌入、切片和染色，并立即（第 0 天）和隔离后 1、2 和 5 天染色。与 T = 0 相比，对邓恩的多重比较测试进行了 Kruskal-Wallis 测试。所有数据都表示为均值 = SEM （n = 2+3 小鼠），包含 ±p < 0.05。比例尺表示 100 μm。请点击这里查看此图形的较大版本。
图2：对PCLS中胶原蛋白沉积的评估。PCLS 被固定、石蜡嵌入、切片和染色，在隔离后的第 0 天、1 天、2 天和 5 天中可视化胶原纤维。比例尺代表 200 μm。请点击这里查看此图形的较大版本。
图3：胆汁酸诱导胆碱基特异性基因表达。在隔离后16小时，PCLS上的介质被改变，并加入新的介质，同时加入150μM糖胆碱（GCA）、陶罗乔利（TCA）或胆酸（CA）酸（钠盐）。PCLS在2天后收获，细胞角蛋白的表达19（CK19;A）， 康奈辛 43 （Cx43;B），和β-谷氨基转氨酶1（Ggt1;C） 与Gapdh和Hprt1的几何平均值相对检查。Dunnett 的多重比较测试是相对于未经治疗的对照组织切片 （n = 15） 执行的。所有数据都表示为均值 = SEM（n = 4 个小鼠，三联切片;\p < 0.05，\p < 0.01）。请点击此处查看此图形的较大版本。
表1：qPCR引素。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
该议定书演示了鼠PCLS分离和组织培养的应用，这些程序旨在评估生存能力和效用，以及利用生化测定、组织学和qPCR检查肝病理学外源性中介的影响。PCLS组织培养在啮齿动物和人类的实验效用已在各种应用中得到证明，包括微RNA15/RNA9/蛋白质表达16、代谢17、病毒感染动力学10、18、18感染信号19、肿瘤入侵1012、毒性研究4、13、15、20、DNA13,15,20损伤等实验研究4研究21，细胞生物学14，分泌研究9。
虽然ATP水平表明PCLS中的细胞生存能力在5天的培养，H&E染色表明，严重的坏死发生在5天的培养。似乎限制PCLS生存能力的主要因素是氧气可用性6,6，11。几项研究包括增强氧气供应，从而增加PCLS在组织培养中的生存能力时间。增加氧气供应的方法包括：在富氧环境中孵育组织10、11、,11使用氧载体灌注全氟丁烷12、在孵育期间摇动/滚动培养培养体6,6、10、13,13以及旨在最大化氧合6的组织培养板。
最近，一种创新的液-液界面组织培养系统被描述为功能效用，在培养14中超过7天。该协议在正常组织培养培养培养箱中使用环境大气氧气。该方法允许没有高度专业化的定制设备的实验室能够访问PCLS，从而安全地增强氧气输送。然而，如果这种增强氧气输送的方法可用，它们可能会提高培养中的长期PCLS生存能力。
培养第3天后，胶原蛋白在PCLS中的积累表明，自发纤维化过程在此模型中是活跃的。自发纤维化以前也观察到在PCLS66，14，22，23，24，可能由损伤相关的分子模式（DAMPs）释放的切割过程或组织坏死。,14,22,23,24DAMPs充当信号分子，随后激活亲纤维信号通路25，26。25,此外，PCLS中的自发纤维化可以通过从分离细胞和/或库普弗细胞的活化中释放的化学因子进行调节（即转化生长因子β[TGF-β]）。在此背景下，Bigaeva等人最近发表的一篇文章指出，PCLS中的自发纤维化部分是由TGF-β信号法引起的，因为用TGF-β抑制剂Galunisertib孵育可抑制与自发肝纤维化相关的基因表达变化。另一种可能的机制是，切片程序最初诱导细胞增殖信号通路和肝细胞进入细胞循环;然而，这种机制失败，导致细胞周期在G1期第27期中期被扣。细胞循环逮捕与肝纤维化有关，而不是肝再生28。
在具有代表性的实验过程中，PCLS用三种不同的胆汁酸（GCA、TCA和CA）治疗2天，以模拟胆静肝损伤。两种胆汁酸（GCA和TCA）诱导CK19和Cx43的显著表达，它们是与胆碱基酸盐功能相关的基因。这表明细胞的扩张或分化，在用这些胆汁酸处理的PCLS中，细胞向胆碱系的扩展或分化。这与我们以前在 PCLS 上使用 TCA9表现出的类似效果的工作一致。此外，这也符合体内观测，显示喂养牛头切拉大鼠增加胆碱酸盐数字29。用胆汁酸治疗肝组织切片模拟肝胆汁病，据推测，与胆碱基酸盐功能相关的基因表达的增加是肝组织试图产生额外的胆管，以增加胆汁分泌。鉴于这些基因的特定诱导是由偶联胆汁酸（GCA和TCA）产生的，但不是未结合的CA，因此怀疑这些效应是由狮身人面食-1-磷酸盐受体2，一种由偶联胆酸优先激活的细胞表面受体30。
PCLS 应用的一个关键限制是单个复制变异性。由于肝脏不是同质的，并且生产有变异性，肝片往往比细胞培养实验有更大的生物变异。在几乎没有变量的实验研究中，如上面演示的代表性程序，通过使用更多的复制来克服这一点。然而，这可能成为大型筛查研究的一个问题。综上所述，所述方案是研究肝病理学外野的一种简单可靠的方法，除了振动体外，几乎不需要专门的设备。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了澳大利亚国家卫生和医学研究委员会（NHMRC）的研究资助（赠款号） 的支持。APP1048740 和 APP1142394 到 G.A.R. ;APP1160323 到 J.E.E.T.， J.K.O.， G.A.R.）.A. Ramm 基金由澳大利亚 NHMRC 的高级研究研究奖学金提供支持（赠款号APP1061332）。曼努埃尔·费尔南德斯-罗霍得到西班牙马德里的TALENTO方案（T1-BIO-1854）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
References
- Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).
- Ouchi, R., et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).
- Vickers, A. E., Fisher, R. L. Organ slices for the evaluation of human drug toxicity. Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).
- Olinga, P., Schuppan, D. Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo. Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).
- Paish, H. L., et al. A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
- Prins, G. H., et al. A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices. Nutrients. 11 (3), 507 (2019).
- Ramm, G. A., et al. Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment. Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).
- Pozniak, K. N., et al. Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease. The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).
- Clouzeau-Girard, H., et al. Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices. Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).
- Szalowska, E., et al. Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices. Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Granitzny, A., et al. Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound. Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).
- Wu, X., et al. Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform. Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).
- Zarybnicky, T., et al. Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).
- van de Bovenkamp, M., et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).
- Buettner, R., et al. Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system. Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).
- Lagaye, S., et al. Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model. World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).
- Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).
- Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro. Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).
- Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro. Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).
- Guyot, C., et al. Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices. Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).
- Bigaeva, E., et al. Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices. Biochim Biophys Acta - Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).
- Kiziltas, S. Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases. World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).
- Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases. Gut. 58 (5), 704-720 (2009).
- Finot, F., et al. Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices. International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).
- Marshall, A., et al. Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection. Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).
- Alpini, G., et al. Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes. Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).
- Studer, E., et al. Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes. Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).
