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Medicine

लिवर बायोलॉजी के एक पूर्व वीवो मॉडल के रूप में Murine परिशुद्धता-कट जिगर स्लाइस

Published: March 14, 2020 doi: 10.3791/60992
Automatic Translation
*1, *1, 2,3, 1,4,5, 6, 7, 8,9, 2,10, 1,4
1Hepatic Fibrosis Group, QIMR Berghofer Medical Research Institute, 2School of Pharmacy and Biomedical Sciences, Curtin Health Innovation Research Institute, Curtin University, 3School of Veterinary and Life Sciences, Murdoch University, 4School of Medicine, The University of Queensland, 5Madrid Institute for Advanced Studies (IMDEA) in Food, CEI UAM+CSIC, 6School of Medicine, Griffith University, 7School of Biological Sciences, Queen's University Belfast, 8Department of Gastroenterology & Hepatology, Fiona Stanley and Fremantle Hospital Group, 9School of Medical and Health Sciences, Edith Cowan University, 10Centre for Cell Therapy and Regenerative Medicine, School of Biomedical Sciences, University of Western Australia
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल चूहों से व्यवहार्य सटीक-कट जिगर के स्लाइस के उत्पादन के लिए एक सरल और विश्वसनीय विधि प्रदान करता है। पूर्व वीवो ऊतक नमूनों को प्रयोगशाला ऊतक संस्कृति की स्थिति के तहत कई दिनों तक बनाए रखा जा सकता है, जो जिगर रोगविज्ञान की जांच करने के लिए एक लचीला मॉडल प्रदान करता है।

Abstract

जिगर की चोट, हेपेटिक फाइब्रोसिस, और सिरोसिस के तंत्र को समझना जो क्रोनिक लिवर रोगों (यानी, वायरल हेपेटाइटिस, गैर-मादक फैटी यकृत रोग, मेटाबोलिक यकृत रोग, और यकृत कैंसर) को आबाद करने के लिए प्रयोगात्मक हेरफेर की आवश्यकता होती है पशु मॉडल और इन विट्रो सेल संस्कृतियों। दोनों तकनीकों की सीमाएं हैं, जैसे वीवो हेरफेर में बड़ी संख्या में जानवरों की आवश्यकता। हालांकि, इन विट्रो सेल संस्कृतियों संरचना और बहुकोशिकीय हेपेटिक पर्यावरण के कार्य को पुन: पेश नहीं करते हैं। सटीक-कट यकृत स्लाइस का उपयोग एक तकनीक है जिसमें व्यवहार्य माउस यकृत के समान स्लाइस प्रयोगात्मक हेरफेर के लिए प्रयोगशाला ऊतक संस्कृति में बनाए रखे जाते हैं। यह तकनीक एक प्रयोगात्मक आला है जो पशु अध्ययन और इन विट्रो सेल संस्कृति विधियों के बीच मौजूद है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल चूहों से अलग और संस्कृति सटीक-कट जिगर स्लाइस को अलग करने के लिए एक सीधी और विश्वसनीय विधि का वर्णन करता है। इस तकनीक के एक आवेदन के रूप में, पूर्व वीवो यकृत स्लाइस को कोलेस्टैटिक यकृत चोट का अनुकरण करने और अंततः हेपेटिक फाइब्रोजेनेसिस के तंत्र का आकलन करने के लिए पित्त एसिड के साथ इलाज किया जाता है।

Introduction

अधिकांश पुरानी यकृत रोगों (यानी, वायरल हेपेटाइटिस, नॉनअल्कोहलिक स्टीटोहेपेटाइटिस, कोलेस्टैटिक लिवर इंजरी और लिवर कैंसर) के रोगजनन में कई अलग-अलग यकृत कोशिका प्रकारों के बीच जटिल बातचीत शामिल है जो सूजन, फाइब्रोजेनेसिस और कैंसर विकास1,,2को ड्राइव करते हैं। इन पुरानी जिगर आधारित बीमारियों अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझने के लिए, कई जिगर सेल प्रकार के बीच बातचीत की जांच की जानी चाहिए । जबकि कई हेपेटिक सेल लाइनों (और हाल ही में, ऑर्गेनॉइड) को विट्रो में सुसंस्कृत किया जा सकता है, ये मॉडल हेपेटिक माइक्रोएनवायरमेंट3की जटिल संरचना, कार्य और सेलुलर विविधता का सटीक अनुकरण नहीं करते हैं। इसके अलावा, सुसंस्कृत जिगर की कोशिकाओं (विशेष रूप से, परिवर्तित सेल लाइनों) अपने मूल स्रोत जीव विज्ञान से विचलित हो सकता है । पशु मॉडल प्रयोगात्मक रूप से कई जिगर सेल प्रकार के बीच बातचीत की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है । हालांकि, वे एक्सपेरिमेंटल अंगों में महत्वपूर्ण ऑफ-टारगेट प्रभावों के कारण प्रयोगात्मक हेरफेर की गुंजाइश में काफी कम हो सकते हैं (उदाहरण के लिए, संभावित चिकित्सा विज्ञान का परीक्षण करते समय)।

ऊतक संस्कृति में सटीक-कट यकृत स्लाइस (पीसीएलएस) का उपयोग एक प्रयोगात्मक तकनीक है जिसका उपयोग पहले दवा चयापचय और विषाक्तता अध्ययनों में किया जाता है, और इसमें व्यवहार्य, अल्ट्राथिन (लगभग 100−250 माइक्रोन मोटी) जिगर के स्लाइस की काटना शामिल है। यह जिगर के ऊतकों पूर्व वीवो4के प्रत्यक्ष प्रयोगात्मक हेरफेर की अनुमति देता है । तकनीक वीवो पशु अध्ययन और इन विट्रो सेल संस्कृति विधियों के बीच एक प्रयोगात्मक अंतर को पाटती है, दोनों तरीकों की कई कमियों पर काबू पाने (यानी, प्रयोगों की सीमा पर व्यावहारिक सीमाएं जो पूरे जानवरों में किया जा सकता है और साथ ही संरचना/कार्य और इन विट्रो सेल संस्कृति विधियों के साथ सेलुलर विविधता की हानि) ।

इसके अलावा, पीसीएलएस पूरे पशु अध्ययन की तुलना में प्रयोगात्मक क्षमता को काफी बढ़ाता है। जैसा कि एक माउस 48 से अधिक यकृत स्लाइस का उत्पादन कर सकता है, यह एक ही यकृत से नियंत्रण और उपचार समूहों दोनों के उपयोग की सुविधा भी प्रदान करता है। इसके अलावा, तकनीक शारीरिक रूप से अन्य अंग प्रणालियों से जिगर के ऊतकों को अलग करती है; इसलिए, यह संभावित ऑफ-टारगेट प्रभावों को हटा देता है जो एक्सोजेनस उत्तेजनाओं के प्रभावों का परीक्षण करते समय पूरे जानवरों में हो सकते हैं।

इस प्रोटोकॉल में, पीसीएलएस एक कंपन का उपयोग करके उत्पन्न होते हैं, जिसमें पार्श्व रूप से कंपन ब्लेड होता है। अन्य अध्ययनों ने सफलतापूर्वक एक Krumdieck ऊतक स्लाइसर का उपयोग किया है, जैसा कि ओलिंगा और श्प्पन5में वर्णित है। वाइब्रेटोम में, ब्लेड का पार्श्व कंपन कतरनी तनाव के कारण अल्ट्राथिन ऊतक को फाड़ने से रोकता है, क्योंकि ब्लेड को ऊतक में धकेल दिया जाता है। वाइब्रेटोम और क्रामडिक ऊतक स्लाइसर दोनों यकृत ऊतकों के संरचनात्मक एम्बेडिंग के बिना प्रभावी ढंग से काम करते हैं, जो टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया को सुव्यवस्थित करता है। इस तकनीक का उपयोग रोगग्रस्त यकृत से पीसीएलएस बनाने के लिए भी किया जा सकता है, जिसमें फाइब्रोसिस/सिरोसिस6 और हेपेटिक स्टीटोसिस7के माउस मॉडल शामिल हैं ।

पीसीएलएस की तैयारी और ऊतक संस्कृति के लिए आवश्यक तकनीकों का प्रदर्शन करने के अलावा, यह रिपोर्ट एडेनोसाइन त्रिपोस्फेट (एटीपी) के स्तर को मापने और नेक्रोसिस और फाइब्रोसिस का आकलन करने के लिए ऊतक हिटोलॉजी की जांच करके इन पूर्व वीवो ऊतकों की व्यवहार्यता की भी जांच करती है । एक प्रतिनिधि प्रयोगात्मक प्रक्रिया के रूप में, पीसीएलएस को कोलेस्टैटिक यकृत चोट का अनुकरण करने के लिए तीन अलग-अलग पित्त एसिड (ग्लाइकोकोलिक, तौरोचोलिक और चोलिक एसिड) की पैथोफिजियोलॉजिकल सांद्रता के साथ इलाज किया जाता है। कोलेस्टैटिक लिवर इंजरी के संदर्भ में, विशेष रूप से तौरोचोलिक एसिड को सिस्टिक फाइब्रोसिस से जुड़े जिगर की बीमारी8के साथ बच्चों के सीरम और पित्त दोनों में काफी वृद्धि दिखाई गई है ।

लिवर प्रोजेनिटर कोशिकाओं को रोगियों में देखे गए ऊंचा तारोचोलिक एसिड के स्तर का अनुकरण करने के लिए व्रोचोलिक एसिड के साथ विट्रो में भी इलाज किया गया है, और इस उपचार के कारण एक पित्त (कोलंगियोसाइट) फेनोटाइप9की ओर जिगर की जनक कोशिकाओं का प्रसार और भेदभाव बढ़ गया। बाद में, पीसीएलएस को पूर्व वीवो का इलाज किया गया, जिसमें टैरोचोलिक एसिड के ऊंचा स्तर था, और कोलैंगियोसाइट मार्कर में वृद्धि देखी गई। यह इन विट्रो ऑब्जर्वेशन का समर्थन करता है कि तारोचोलिक एसिड बाल चिकित्सा सिस्टिक फाइब्रोसिस से जुड़े जिगर की बीमारी9के संदर्भ में पित्त प्रसार और/या भेदभाव को चलाता है ।

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Protocol

संस्थान पशु आचार समिति से अनुमोदन के साथ QIMR Berghofer चिकित्सा अनुसंधान संस्थान में वैज्ञानिक प्रयोजनों के लिए जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए ऑस्ट्रेलियाई कोड के अनुसार सभी पशु प्रयोग किए गए थे । पुरुष C57BL/6 चूहों (15−20 सप्ताह पुराने) पशु संसाधन केंद्र, WA, ऑस्ट्रेलिया से प्राप्त किए गए थे ।

नोट: सभी समाधान, मीडिया, उपकरणों, हार्डवेयर, और ट्यूबों कि नमूनों से संपर्क निष्फल या अच्छी तरह से एक ७०% इथेनॉल समाधान से कीटाणुरहित किया जाना चाहिए और बाँझ तकनीकों का उपयोग कर संभाला संस्कृति संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए ।

1. वाइब्रेटोम का सेटअप

  1. 2 जी/एल ग्लूकोज(सामग्री की तालिका)के साथ बाँझ क्रेब्स-हेंसेलिट बफर समाधान तैयार करें। जांच करें कि बफर का पीएच 7.4 है। यदि पीएच अधिक है, तो कार्बोजन (95% ओ2 + 5% सीओ2)के साथ बफर को संतृप्त करें या बाइकार्बोनेट बफरिंग सिस्टम को सही करने के लिए 5% सीओ2 ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर के भीतर इनक्यूबेट करें। सील बंद बाँझ बफर समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करें।
  2. काटने वाले हाथ में वाइब्रेटोम ब्लेड डालें। सुनिश्चित करें कि ब्लेड को काटने वाले हाथ में कसकर तय किया गया है, क्योंकि कंपन ब्लेड को ढीला आ सकता है।
  3. ब्लेड को कीटाणुरहित करना और 70% इथेनॉल समाधान के साथ हाथ काटना।
    सावधानी: ब्लेड के साथ संपर्क से बचें।
  4. बफर ट्रे को 70% इथेनॉल समाधान के साथ कीटाणुरहित करें और बाँझ ऊतक के साथ इसे पोंछ ें।
  5. वाइब्रेटोम में बफर ट्रे डालें और बढ़ते तंत्र को कस ें।
  6. काटने की बांह को अधिकतम उपलब्ध ऊंचाई पर सेट करें।
  7. ब्लेड कोण को क्षैतिज से नीचे 10 डिग्री तक सेट करें, नमूने के नीचे ढलान करें। सुनिश्चित करें कि ब्लेड कोण कसकर तय किया गया है।
    नोट: इष्टतम ब्लेड कोण वाइब्रेटोम मॉडल और ऊतक विशेषताओं के आधार पर भिन्न हो सकता है।
  8. नमूना धारक को 70% इथेनॉल समाधान के साथ कीटाणुरहित करना।
  9. बफर ट्रे के नीचे स्थित पेल्टियर थर्मोइलेक्ट्रिक कूलर के लिए ठंडा पानी कनेक्ट करें।
    नोट: कुछ वाइब्रेटोम मॉडल इसके बजाय ठंडा करने के लिए बर्फ स्नान का उपयोग करते हैं।
  10. पानी से बाहर ट्यूब को एक नाले में ठीक करें और पानी चालू करें। कूलर को 4 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें। 400 मीटर/मिन की दर से ठंडा पानी चलाएं।
  11. बफर ट्रे लगभग बाँझ बर्फ ठंड क्रेब्स-Henseleit बफर (2 जी/एल ग्लूकोज के साथ) के साथ शीर्ष पर भरें । बर्फ पर अतिरिक्त क्रेब्स-हेंसेलिट बफर समाधान छोड़ दें।

2. जिगर हटाने और तैयारी

  1. ऑटोक्लेविंग का उपयोग करके घुमावदार संदंश, फ्लैट स्क्वायर-टिप संदंश, चिमटी, सर्जिकल क्लैंप और कैंची सहित सभी सर्जिकल उपकरणों को स्टरलाइज या कीटाणुरहित करें।
  2. जिगर हटाने से पहले, गहराई से १०० मिलीग्राम/किलो केटामाइन और १२.५ मिलीग्राम/किलो जाइलाज़ीन के एक इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन का उपयोग कर चूहों एनेस्थेटाइज ।
    नोट: अन्य एनेस्थेटिक्स का उपयोग किया जा सकता है, या चूहों को सीओ2 एस्फिक्सिशन/सर्वाइकल अव्यवस्था द्वारा इच्छामृत्यु दी जा सकती है यदि यकृत को हाइपोक्सिया-प्रेरित क्षति को रोकने के लिए जल्दी से हटा दिया जाता है।
  3. 70% इथेनॉल समाधान के साथ गीला करके चूहों पर त्वचा की सतहों को कीटाणुरहित करें। एक विच्छेदन बोर्ड पर टिकी सभी हाथ-पैरों के साथ उनकी पीठ पर चूहों को सुरक्षित करें।
  4. पेट गुहा के आधार से त्वचा में एक ऊर्ध्वाधर मिडलाइन चीरा डायाफ्राम के ठीक ऊपर करें।
    नोट: त्वचा के पीछे हटने की सुविधा के लिए हाथ-पैरों की ओर चीरे लगाए जाते हैं।
  5. त्वचा और पेट गुहा के बीच किसी भी संयोजी ऊतक को काटते समय त्वचा को वापस खींचें। जितना हो सके बालों को पेट की गुहा में स्थानांतरित होने से रोकें। पेट की गुहा से त्वचा को पिन या क्लैंप करें।
  6. साफ संदंश और कैंची का उपयोग करके, पेट गुहा और कम छाती गुहा खोलें।
  7. पालि को नुकसान पहुंचाए बिना जिगर को जल्दी से हटाना
    1. कुंद उपकरणों (जैसे, फ्लैट वर्ग-टिप संदंश) का उपयोग करना, ऊपरी यकृत पालियों को पेट की ओर नीचे की ओर मार्गदर्शन करें। कैंची का उपयोग कर ऊपरी जिगर पालि के आसपास संयोजी ऊतक काटें।
    2. जिगर के पालि को डायाफ्राम की ओर ऊपर की ओर गाइड करें। संदंश के साथ जिगर के केंद्रीय संवहनी बंडल पकड़ो।
      नोट: यदि केंद्रीय संवहनी बंडल क्षतिग्रस्त हो जाता है तो यह प्रक्रिया को प्रभावित नहीं करेगा।
    3. केंद्रीय संवहनी बंडल को माउस से दूर खींचें और जिगर को हटाने के लिए शेष संयोजी ऊतक, रक्त वाहिकाओं आदि को काट लें। ध्यान रखें 1) जिगर की पालि को नुकसान पहुंचाएं और 2) गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट में काट लें, क्योंकि इससे जिगर सूक्ष्मजीवों के साथ दूषित हो सकता है।
  8. हटाए गए जिगर को एक बाँझ 10 सेमी ऊतक संस्कृति डिश में रखें आधा बर्फ-ठंडा क्रेब्स-हेंसेलिट बफर समाधान से भरा हुआ है। पालि का मार्गदर्शन करने के लिए एक कुंद उपकरण का उपयोग करना, इसे अलग पालि में विभाजित करने के लिए यकृत के केंद्र को काट दें।
  9. एक जिगर पालि का चयन करें (सबसे बड़ा पहले का उपयोग करें), और यह एक नया बाँझ 10 सेमी पकवान पर नीचे फ्लैट पक्ष जगह है । बाद के उपयोग के लिए बर्फ पर संग्रहीत क्रेब्स-हेंसेलिट बफर समाधान के पकवान में अन्य सभी यकृत पालि रखें।
  10. फ्लैट झूठ बोलते हुए जिगर पालि के सबसे ऊंचे किनारे से सामग्री के लगभग 10% ट्रिम करें।
    नोट: ट्रिमिंग महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह ऊतक किनारा पहले काटने वाले ब्लेड से संपर्क करेगा; इसलिए, एक ऊतक किनारा जो काटने वाले ब्लेड के लिए अपेक्षाकृत लंबवत है, ऊतक संपीड़न को रोक देगा जो अनकट यकृत पालि में उथले कोणों के कारण हो सकता है।
  11. अन्य तीन ऊतक किनारों ट्रिम करें।
    नोट: यह रेशेदार ग्लिसन कैप्सूल के कुछ निकालता है और ऊतक स्लाइस के जुदाई आसान बना देगा ।
  12. नमूना धारक पर जिगर पालि बढ़ते
    1. सामने की ओर नमूना धारक पर साइनोक्रिलेट गोंद (सुपरग्लू या मेडिकल/पशु चिकित्सा ग्रेड साइनोक्राइलेट गोंद) की एक पतली परत रखें, जो छंटनी किए गए जिगर की पालि से थोड़ा बड़ा है ।
      नोट: जांच लें कि साइनोक्रिलेट गोंद में गैर-साइनोक्रिलेट एडिटिव्स नहीं होते हैं।
    2. धीरे-धीरे जिगर की पालि को अत्याधुनिक से दूर एक कोने का उपयोग करके बाँझ संदंश के साथ उठाएं, फिर बाँझ शोषक सामग्री का उपयोग करके जिगर की पालि के फ्लैट की ओर से किसी भी अवशिष्ट बफर को सूखा करें।
    3. सामने की ओर सबसे बड़ी बढ़त के साथ साइनोक्रिलेट गोंद पैच पर जिगर पालि के बड़े फ्लैट पक्ष रखें। इसे 1−2 मिन के लिए हवा में इलाज करने की अनुमति दें।
      नोट: सायनोक्रिलेट चिपकने वाले अवशिष्ट नमी और ऊतक प्रोटीन के जवाब में जल्दी (~ 2 मिन) का इलाज करते हैं, और वे नमूना धारक को दृढ़ता से ऊतक संलग्न करेंगे।

3. जिगर स्लाइस का उत्पादन

  1. संलग्न जिगर पालि के साथ नमूना धारक कंपन बफर ट्रे में रखें। सुनिश्चित करें कि जिगर पालि पूरी तरह से बफर द्वारा कवर किया जाता है।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो बर्फ-ठंडे क्रेब्स-हेंसेलिट बफर समाधान के स्तर को ऊपर करें। यदि बफर स्तर काटने की प्रक्रिया को अस्पष्ट करता है, तो स्तर को बढ़ाएं या कम करें।
  2. कटिंग स्पीड सेट करें।
    नोट: यह वाइब्रेटोम मॉडल और ब्लेड विशेषताओं के आधार पर अनुभवजन्य निर्धारित करने की आवश्यकता हो सकती है। एक शुरुआती गाइड के रूप में, 57 हर्ट्ज/3,420 आरपीएम की गति का उपयोग करें। वाइब्रेटोम स्पीड को स्मार्टफोन पर ऑडियो स्पेक्ट्रम एनालाइजर एप्लीकेशन का इस्तेमाल करके मापा जा सकता है ।
  3. काटने ब्लेड कम जब तक यह ऊंचाई डायल का उपयोग कर जिगर पालि के ठीक ऊपर स्थित है। नमूने पर कंपन काटने हाथ चलाते हैं।
  4. रिवर्स में सनकी हैंडल का उपयोग करके ब्लेड वापस लें। ब्लेड लौटाते समय कंपन को सक्रिय करें। ब्लेड के लौटने के बाद और नमूने से ऊपर नहीं है, ब्लेड की ऊंचाई को 250 माइक्रोन से कम करें।
  5. काटने की प्रक्रिया तब तक दोहराएं जब तक कि ऊतक के शीर्ष को हटा न दिया जाए। पहले एक या दो स्लाइस को त्यागें, क्योंकि इनमें ग्लिसन कैप्सूल शामिल होगा और इसलिए अन्य स्लाइस की तुलना में अधिक कार्यात्मक यकृत ऊतक शामिल नहीं होंगे।
  6. जिगर के स्लाइस को काटने के लिए, धीरे-धीरे हैंडल को बदलकर कंपन ब्लेड को ऊतक में आगे बढ़ाएं। काटने की प्रक्रिया के दौरान ऊतक को धीरे-धीरे मार्गदर्शन करने के लिए एक छोटे तूलिका (70% इथेनॉल समाधान से कीटाणुरहित) का उपयोग करें।
  7. कट ऊतक स्लाइस उठाने के लिए तूलिका का उपयोग करें और ऊतक टुकड़ा बर्फ ठंडे क्रेब्स-हेंसेलिट बफर की एक बाँझ ट्यूब में रखें। उपयोग में न आने पर इस ट्यूब को स्लाइस के बीच बर्फ पर रखें।
    नोट: कभी-कभी, ऊतक काटने की प्रक्रिया के दौरान आंसू करता है, लेकिन अधिकांश उद्देश्यों के लिए ऊतक अभी भी प्रयोज्य है।
  8. काटने की प्रक्रिया तब तक दोहराएं जब तक कि जिगर की पालि का आधार न पहुंच जाए। किसी भी जिगर स्लाइस है कि ठीक गोंद दिखाई दिया है त्यागें।
    नोट: ठीक गोंद ऊतक स्लाइस पर सफेद क्षेत्रों के रूप में दिखाई देता है। एक ठेठ जिगर पालि केवल लगभग 2 मिमी की एक useable मोटाई होगा। इसलिए, प्रत्येक पालि से केवल लगभग आठ 250 माइक्रोन यकृत स्लाइस उत्पादित किए जाते हैं।
  9. साइनोक्राइलेट गोंद के पास तक ऊतक स्लाइस काटें। गोंद में कटौती न करें।
  10. ऊतक स्लाइस की आवश्यक संख्या प्राप्त होने तक अन्य यकृत पालि के साथ पूरी प्रक्रिया दोहराएं।
  11. नमूना धारक से ठीक साइनोक्रिलेट गोंद और ऊतक को साफ करने के लिए, या तो ठीक गोंद/ऊतक मिश्रण को बंद करने के लिए एक ब्लेड का उपयोग करें, या एसीटोन या डिमेथाइल सल्फासऑक्साइड के साथ मिश्रण को नरम और साफ करें।

4. ऊतक संस्कृति

नोट: सभी ऊतक संस्कृति काम एक बाँझ टुकड़े टुकड़े में किया जाना चाहिए ।

  1. एक ऊतक संस्कृति लैमिनार प्रवाह हुड में, पिपेट 1 विलियम ई माध्यम के mL जिसमें 2.0 ग्राम/एल ग्लूकोज, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन सप्लीमेंट, 100 यू/एमएल पेनिसिलिन, और 100 μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन 12 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटों में।
    नोट: अन्य एंटीबायोटिक दवाओं और एंटीफंगल एजेंटों को भी जोड़ा जा सकता है। कुछ अध्ययनों में ऊतक ऊष्मायन माध्यम (यानी, डेक्सेथेसोन और इंसुलिन10)में एडिटिव्स का उपयोग किया गया है, लेकिन ये सेल सिग्नलिंग में हस्तक्षेप कर सकते हैं।
  2. बर्फ से जिगर के स्लाइस युक्त ट्यूब ऊतक संस्कृति हुड में रखें। ऊतक स्लाइस को हटाने के लिए, धीरे मिश्रण घूमता है और धीरे से एक बाँझ 10 सेमी पकवान में टिप जबकि घूमता है ।
  3. बाँझ तेज बिंदु संदंश और एक स्केलपेल का उपयोग करना, ऊतक स्लाइस को मोटे तौर पर समान आकार (जैसे, 15 मिमी2)में काट लें।
    नोट: यह कदम एक सुसंगत सतह क्षेत्र सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है। क्योंकि माउस जिगर पालि आकार में काफी अलग हैं और कुछ ऊतक स्लाइस आंसू होगा, यह अलग सतह क्षेत्रों के साथ PCLS की एक श्रृंखला का उत्पादन होगा। पीसीएलएस के अंतिम सतह क्षेत्र आकार इस बात पर निर्भर करते हैं कि बाद के विश्लेषण अनुप्रयोगों में कितनी सामग्री की आवश्यकता है और कितने प्रतिकृतियों की आवश्यकता है। एक ही अनुमानित आकार के छोटे कई टुकड़ों में बड़े पीसीएलएस काटना सहज रूप से प्रयोगात्मक प्रतिकृति की संख्या में वृद्धि की अनुमति देगा।
  4. बाँझ संदंश या एक छोटे से तूलिका का उपयोग करना, एक 12 अच्छी तरह से मध्यम के 1 mL युक्त प्लेट के कुओं को कटौती ऊतक स्लाइस हस्तांतरण ।
    नोट: ऊतक स्लाइस की मोटाई और आकार की स्थिरता की पुष्टि करने के लिए ध्यान रखें। वर्गों है कि औसत से गहरे होते है सुझाव है कि ऊतक मोटाई बड़ा है और त्याग ने की जरूरत है । हल्के स्लाइस ठीक साइनोएक्रिलेट गोंद की उपस्थिति का सुझाव देते हैं और उन्हें त्यागने की आवश्यकता होती है।
  5. लिवर स्लाइस को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 अंडर 95% आर्द्रता पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: अन्य समूहों ने पीसीएलएस को ऑक्सीजन डिलीवरी बढ़ाने के तरीकों का उपयोग किया है,,जो ऊतक अस्तित्व के समय6,10,11,,12,,13 (चर्चा अनुभाग देखें) को लम्बा करने के लिए दिखाई देते हैं।,
  6. अगले दिन, सक्शन त्रुटियों के माध्यम से ऊतक के नुकसान को रोकने के लिए एक मैनुअल पिपेट (चूक्शन के बजाय) का उपयोग करके संस्कृति माध्यम को बदलें। बाद में रोजाना पीसीएलएस पर माध्यम बदलें। पीसीएलएस अब प्रायोगिक उपयोग के लिए तैयार है।

5. पीसीएलएस का उदाहरण आवेदन

  1. 16 घंटे के बाद पीढ़ी में, तीन अलग-अलग पित्त एसिड के साथ पीसीएलएस का इलाज करें: ग्लाइकोकोलिक एसिड (जीसीए), तौरोकिल एसिड (टीसीए), और चोलिक एसिड (सीए) (सोडियम लवण के रूप में, सभी 150 माइक्रोन की एकाग्रता पर) 2 दिनों के लिए।
  2. पित्त एसिड उपचार के 2 दिनों के बाद, बर्फ-ठंडे आरएनए लाइसिस बफर में ऊतक स्लाइस रखकर एमआरएनए निकालें और मनका समरूपता(सामग्री की तालिका)के साथ मोतियों का उपयोग करके जल्दी से समरूपता करें।
  3. आरएनए आइसोलेशन किट(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके आरएनए को शुद्ध करें और शुद्ध आरएनए से सीडीएनए बनाएं।
  4. जीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए सीडीएनए पर विशिष्ट प्राइमर(टेबल 1)का उपयोग करके मात्रात्मक बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया(सामग्री की तालिका)करें।

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Representative Results

समय के साथ पीसीएलएस की सेल व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए, ऊतक एटीपी स्तर मापा गया। एटीपी का स्तर आमतौर पर व्यवहार्यता के आनुपातिक होते हैं। पीसीएलएस (क्षेत्र में लगभग 15 मिमी2) को सामान्य विलियम के ई माध्यम में 10% एफबीएस के साथ सुसंस्कृत किया गया था, फिर विशिष्ट टाइमपॉइंट पर, यकृत स्लाइस ऊतक संस्कृति से हटा दिए गए थे और एटीपी और प्रोटीन (सामान्यीकरण के लिए) सांद्रता(सामग्री की तालिका)मापा जा रहा है(चित्रा 1ए)। इस तरह के जैव रासायनिक परखों के लिए, सामान्यीकरण महत्वपूर्ण है, क्योंकि कट लिवर स्लाइस आवश्यक रूप से आयामों में समान नहीं हैं। एटीपी स्तर (प्रोटीन के सापेक्ष) को तुरंत अलगाव के बाद दबा दिया गया था और 1 घंटे(चित्रा 1ए)के बाद, ठंडा और काटने की प्रक्रियाओं से अल्पकालिक मेटाबोलिक तनाव का सुझाव दिया गया था। हालांकि, एटीपी स्तर 3 घंटे से बरामद ऊतक संस्कृति के 5 दिनों तक ऊंचा रहा, जो व्यवहार्यता में कोई महत्वपूर्ण कमी का संकेत है । जिगर के स्लाइस के हेमैटोक्सिलिन और इओसिन (एच एंड ई) ने सुझाव दिया कि सीमित ऊतक परिगलन (परमाणु प्लियोमॉर्फिज्म की विशेषता) लगभग 2 और 3 दिनों से संस्कृति में हुआ। ऊतक परिगलन का स्तर 5 दिन(चित्रा 1बी)तक गंभीर हो गया । एटीपी परिणामों के साथ एक साथ लिए गए इन रूपात्मक डेटा को ध्यान में रखते हुए, इस प्रयोगात्मक ऊतक मॉडल का उपयोग 3 दिनों तक करने की सिफारिश की जाती है।

पीसीएलएस ने बाद की संस्कृति के समय बिंदुओं पर कोलेजन संचय में वृद्धि को भी प्रदर्शित किया, जैसा कि 5 दिन में पिरो-सीरियस लाल-दाग कोलेजन फाइबर के मोटाहोने से दिखाया गया है(चित्रा 2)। कोलेजन फाइबर के इस मोटा होने से पता चलता है कि इस विधि का उपयोग करके प्राप्त पीसीएलएस में सहज फाइब्रोजेनिक प्रक्रियाएं सक्रिय हैं। यह प्रक्रिया पीसीएलएस अलगाव पद्धति से स्वतंत्र प्रतीत होती है, जिसमें कोलेजन फाइबर6 और प्रोफिशिएषण जीन अभिव्यक्ति14 की मोटाई के साथ क्रमशः वाइब्रेटोम और क्रामडिक ऊतक स्लाइसर्स दोनों से होती है। पीसीएलएस जीव विज्ञान की व्याख्या करते समय इन सहज फाइब्रोजेनिक प्रक्रियाओं के विकास को ध्यान में रखा जाना चाहिए, विशेष रूप से फाइब्रोटिक प्रक्रियाओं से जुड़े प्रयोगों के साथ।

हमने पहले पीसीएलएस9में टीसीए द्वारा कोलैंगियोसाइट-विशिष्ट जीन कॉनक्सिन 43(सीएक्स43)और ग्लूटामाइल ट्रांसपेप्टिडेस(जीजीटी1)प्रोटीन का स्राव दिखाया है। हाउसकीपिंग नियंत्रण (ग्लिसराल्डिहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज[गफ्ध]और हाइपोक्सेंथिन फॉस्फोरीबोसिलट्रांसफरेज 1[एचपीआरटी1])के सापेक्ष कोलैंगियोसाइट-विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति टीसीए, जीसीए या सीए के साथ इलाज किए गए पीसीएलएस में विशिष्ट प्राइमर्स का उपयोग करके क्यूपीसीआर द्वारा जांच की गई थी। पिछली रिपोर्ट के अनुरूप, कोलैंगियोसाइट-विशिष्ट जीन साइटोकेराटिन 19(सीके19)की अभिव्यक्ति में एक महत्वपूर्ण प्रेरण ; चित्रा 3ए)और कॉनक्सिन 43 (Cx43; चित्रा 3बी)जीसीए और टीसीए दोनों द्वारा मनाया गया था। जीजीटी1 अभिव्यक्ति दोनों पित्त एसिड द्वारा बढ़ाया गया था; हालांकि, यह संभवतः प्रयोगात्मक भिन्नता(चित्रा 3सी)के कारण सांख्यिकीय महत्व तक नहीं पहुंचा। सीए की अभिव्यक्ति किसी भी पित्त एसिड से अप्रभावित थी। कोलैंगियोसाइट-विशिष्ट जीन के शामिल होने से पता चलता है कि जीसीए को कोलेस्टैटिक लिवर इंजरी में भी शामिल किया जा सकता है, जैसा कि पहले टीसीए8,,9के लिए बताया गया था ।

Figure 1
चित्रा 1: सटीक-कट जिगर स्लाइस (PCLS) के ऊतक व्यवहार्यता । (A)पीसीएलएस में एटीपी और प्रोटीन का स्तर तुरंत मापा गया (टी + 0) और 1 घंटे, 3 एच, 6 एच, और 1−5 दिनों के बाद अलगाव पर । (ख)सेल आकृति विज्ञान की जांच करने के लिए, पीसीएलएस तय किए गए थे, पैराफिन-एम्बेडेड, सेक्शन्ड, और एच एंड ई के साथ तुरंत (दिन 0) और 1, 2 और 5 दिनों के बाद अलगाव पर दाग दिया गया था । डन के मल्टीपल तुलना परीक्षण के साथ एक क्रुस्कल-वालिस परीक्षण टी + 0 के सापेक्ष किया गया था । सभी डेटा * पी एंड एलटी; 0.05 के साथ मतलब ± एसईएम (एन = 2−3 चूहों) के रूप में दर्शाया जाता है। स्केल बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पीसीएलएस में कोलेजन बयान का आकलन। पीसीएलएस को 0, 1, 2 और 5 पोस्ट-आइसोलेशन के दिनों में कोलेजन फाइबर की कल्पना करने के लिए पिरो-सीरियस रेड के साथ स्पेरो-सीरियस रेड के साथ स्थिर, पैराफिन-एम्बेडेड, सेक्शन किया गया था, और दाग दिया गया था। स्केल बार 200 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पित्त एसिड कोलैंगियोसाइट-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करते हैं। 16 घंटे के बाद अलगाव में, पीसीएलएस पर माध्यम बदल दिया गया था, और नए माध्यम १५० μM ग्लाइकोकोलिक (जीसीए), taurocholic (TCA), या cholic (सीए) एसिड (सोडियम लवण) के साथ जोड़ा गया था । पीसीएलएस को 2 दिनों के बाद काटा गया था, और साइटोकेराटिन 19(सीके19)की अभिव्यक्ति ; ए),कॉनेक्सिन 43 (Cx43; बी),और ग्लूटामाइल ट्रांसपेप्टिडेस 1(जीजीटी1), ग) गगध और एचपीआरटी 1के ज्यामितीय अर्थ के सापेक्ष जांच की गई . डननेट का मल्टीपल तुलना परीक्षण अनुपचारित नियंत्रण ऊतक स्लाइस (एन = 15) के सापेक्ष किया गया था। सभी डेटा का प्रतिनिधित्व मतलब ± एसईएम (एन = 4 चूहे, ट्रिपलीकेट स्लाइस; * पी एंड एलटी; 0.05, ** पी एंड एलटी; 0.01) के रूप में किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Table 1
तालिका 1: क्यूपीसीआर प्राइमर।

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Discussion

प्रोटोकॉल मूत्र पीसीएलएस अलगाव और ऊतक संस्कृति के आवेदन को दर्शाता है, और प्रक्रियाओं को व्यवहार्यता और उपयोगिता दोनों का आकलन करने के साथ-साथ जैव रासायनिक परख, हिटोलॉजी और क्यूपीसीआर का उपयोग करके जिगर रोगविज्ञान के बहिर्जात मध्यस्थों के प्रभावों की जांच करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। कृंतक और मनुष्यों में पीसीएलएस ऊतक संस्कृति की प्रायोगिक उपयोगिता को विभिन्न अनुप्रयोगों में प्रदर्शित किया गया है, जिसमें माइक्रोआरएनए15/आरएनए9/प्रोटीनअभिव्यक्ति16,चयापचय17,वायरल संक्रमण गतिशीलता10,,18,संक्रमण सिग्नलिंग19,ट्यूमर आक्रमण12,विषाक्तता अध्ययन4,,13,,15,,20,डीएनए क्षति में प्रायोगिक जांच शामिल है। अध्ययन21, सेल जीव विज्ञान14, और स्राव अध्ययन9.

जबकि एटीपी का स्तर संस्कृति में 5 दिनों तक पीसीएलएस में सेलुलर व्यवहार्यता का संकेत देता है, एच एंड ई धुंधला सुझाव देता है कि गंभीर परिगलन संस्कृति में 5 दिनों तक हो रहा था। पीसीएलएस की व्यवहार्यता को सीमित करने वाला मुख्य कारक ऑक्सीजन उपलब्धता6,11है . कई अध्ययनों में ऑक्सीजन की उपलब्धता में वृद्धि शामिल है और इसके परिणामस्वरूप ऊतक संस्कृति में पीसीएलएस की व्यवहार्यता समय में वृद्धि हुई है। ऑक्सीजन की उपलब्धता बढ़ाने के तरीकों में ऑक्सीजन युक्त वायुमंडल में ऊतकों का ऊष्मायन10,11, ऑक्सीजन वाहक परफ्यूजन परफ्लोरोडेकैलिन12का उपयोग , ऊष्मायन6,10,,13के दौरान संस्कृति को मिलाते हुए / रोलिंग औरऑक्सीजन6को अधिकतम करने के लिए तैयार की गई ऊतक संस्कृति प्लेटें शामिल हैं ।

हाल ही में, संस्कृति14में 7 दिनों से अधिक समय पर बताई गई कार्यात्मक उपयोगिता के साथ एक अभिनव एयर-लिक्विड इंटरफेस ऊतक संस्कृति प्रणाली का वर्णन किया गया है। यह प्रोटोकॉल एक सामान्य ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में परिवेश वायुमंडलीय ऑक्सीजन का उपयोग करता है। विधि पीसीएलएस को उन प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ होने की अनुमति देती है जिनके पास ऑक्सीजन वितरण को सुरक्षित रूप से बढ़ाने के लिए अत्यधिक विशिष्ट, कस्टम उपकरण नहीं हैं। हालांकि, अगर ऑक्सीजन डिलीवरी बढ़ाने के लिए इस तरह के तरीके उपलब्ध हैं, तो वे संस्कृति में दीर्घकालिक पीसीएलएस व्यवहार्यता में सुधार कर सकते हैं।

संस्कृति में 3 दिन के बाद पीसीएलएस में कोलेजन के संचय से पता चलता है कि इस मॉडल के भीतर सहज फाइब्रोजेनिक प्रक्रियाएं सक्रिय हैं। सहज फाइब्रोसिस,भी पहले पीसीएलएस6,14,22,,23,,24 में देखा गया है और संभवतः काटने की प्रक्रिया या ऊतक परिगलन द्वारा जारी नुकसान से जुड़े आणविक पैटर्न (DAMPs) द्वारा मध्यस्थता की जाती है ।, डैम्प संकेत अणुओं के रूप में कार्य करते हैं जो बाद में प्रो -फाइब्रोटिक सिग्नलिंग पाथवे25,26को सक्रिय करते हैं । इसके अलावा, पीसीएलएस में सहज फाइब्रोसिस को स्टेलेट कोशिकाओं और/या कुफर कोशिकाओं (यानी, विकास कारक बीटा [टीजीएफ-]) की सक्रियता से जारी केमोकिनद्वारा मध्यस्थता की जा सकती है। इस संदर्भ में, Bigaeva एट अल.24 द्वारा हाल ही में एक लेख से पता चलता है कि पीसीएलएस में सहज फाइब्रोसिस टीजीएफ-सिग्नलिंग द्वारा मध्यस्थता वाले हिस्से में है, टीजीएफ-अवरोधक Galunisertib सहज हेपेटिक फाइब्रोसिस से जुड़े जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन को बाधित करता है। एक और संभव तंत्र यह है कि टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया शुरू में सेल प्रसार संकेत रास्ते और सेल चक्र में हेपेटोसाइट्स के प्रवेश को प्रेरित करती है; हालांकि, इस तंत्र विफल रहता है और मध्य जी 1 चरण27में सेल चक्र गिरफ्तारी में परिणाम . सेल साइकिल की गिरफ्तारी हेपेटिक पुनर्जनन28के बजाय हेपेटिक फाइब्रोसिस से जुड़ी हुई है ।

प्रतिनिधि प्रायोगिक प्रक्रिया में, पीसीएलएस को कोलेस्टैटिक यकृत चोट का अनुकरण करने के लिए 2 दिनों के लिए तीन अलग-अलग पित्त एसिड (जीसीए, टीसीए और सीए) के साथ इलाज किया जाता है। पित्त एसिड (जीसीए और टीसीए) में से दो CK19 और Cx43की महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति को प्रेरित करते हैं, जो कोलैंगियोसाइट फ़ंक्शन से जुड़े जीन हैं। यह इन पित्त एसिड के साथ इलाज पीसीएलएस में एक cholangiocyte वंश की ओर कोशिकाओं के विस्तार या भेदभाव से पता चलता है । यह हमारे पिछले काम के अनुरूप है जो पीसीएलएस पर टीसीए9 का उपयोग करके समान प्रभाव दिखा रहा है। इसके अलावा, यह वीवो टिप्पणियों के अनुरूप भी है जो चूहों को भोजन करने वाले तौरोचोलेट को दिखाता है, जिससे चोलैंगियोसाइट संख्या29बढ़ जाती है। पित्त एसिड के साथ जिगर के ऊतक स्लाइस का उपचार हेपेटिक कोलेस्टेसिस का अनुकरण करता है, और यह अनुमान लगाया गया है कि कोलैंगियोसाइट फ़ंक्शन से जुड़े जीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि जिगर के ऊतकों द्वारा पित्त स्राव को बढ़ाने के लिए अतिरिक्त पित्त डकुल बनाने का प्रयास है। इन जीनों के विशिष्ट प्रेरण को देखते हुए संयुग्मित पित्त एसिड (जीसीए और टीसीए) द्वारा उत्पादित किया जाता है, लेकिन अनकॉन्जुगेटेड सीए नहीं, यह संदेह है कि इन प्रभावों को स्फिंगनोसिन-1-फॉस्फेट रिसेप्टर 2 द्वारा मध्यस्थता की जाती है, जो एक कोशिका सतह रिसेप्टर द्वारा अधिमानिक सक्रियण के साथ एक कोशिका सतह रिसेप्टरहै।

पीसीएलएस के आवेदन की एक प्रमुख सीमा व्यक्तिगत दोहराने परिवर्तनशीलता है। चूंकि जिगर समरूप नहीं है और उत्पादन में परिवर्तनशीलता है, इसलिए यकृत स्लाइस में सेल संस्कृति प्रयोग की तुलना में बड़ा जैविक भिन्नता होती है। कुछ चरों के साथ प्रयोगात्मक अध्ययनों में, जैसे कि ऊपर प्रदर्शित प्रतिनिधि प्रक्रिया, प्रतिकृति की बढ़ी हुई संख्या का उपयोग करके इसे दूर किया जाता है। हालांकि, यह बड़े स्क्रीनिंग अध्ययन के लिए एक मुद्दा बन सकता है । संक्षेप में, वर्णित प्रोटोकॉल जिगर रोग विज्ञान पूर्व वीवो के पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक सीधी और विश्वसनीय विधि है, जिसमें वाइब्रेटोम को छोड़कर थोड़ा विशेष उपकरण की आवश्यकता होती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को ऑस्ट्रेलिया के नेशनल हेल्थ एंड मेडिकल रिसर्च काउंसिल (एनएचएमआरसी) (ग्रांट नंबर एक) से रिसर्च ग्रांट ्स ने सपोर्ट किया । APP1048740 और APP1142394 से G.A.R.; APP1160323 से J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.) । ग्रांट ए रैम को ऑस्ट्रेलिया के एनएचएमआरसी (ग्रांट नंबर एक) से एक सीनियर रिसर्च फेलोशिप द्वारा समर्थित किया जाता है । APP1061332) । मैनुएल फर्नांडीज-रोजो मैड्रिड, स्पेन (T1-BIO-1854) के टैलेंटो कार्यक्रम द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm Petri Dish GREINER 664160 Sterile Dish
12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom Greiner Bio-one 665180
70% Ethanol Solution (made with AR Grade) Chem-Supply Pty Ltd EA043-20L-P Disinfection solution
Acetone Chem-Supply Pty Ltd AA008-2.5L
Cholic acid Sigma-Aldrich C1129-100G
Cyanoacrylate Super Glue Parfix, DuluxGroup (Australia) Other brands should work
Disposable Single Edge Safety Razor Blades Mixed
Dissection Board Made in-house Sterile material over polystyrene
Fetal Bovine Serum GE Healthcare Australia Pty Ltd SH30084.02
Forceps sharp point 130 mm long ThermoFisher Scientific MET2115-130
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator ThermoFisher Scientific 371
Glutamine Life Technologies Australia Pty Ltd 25030081
Glycocholic acid hydrate Sigma-Aldrich G2878-100G
ISOLATE II RNA Mini Kit Bioline (Aust) Pty Ltd BIO-52073
Ketamine 50 ml Provet KETAI1
Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L Sigma-Aldrich K3753 Can also be made in house
Laminar Flow Hood Hepa air filtration
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers ThermoFisher Scientific
Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml Life Technologies Australia Pty Ltd 15140-122
Picro Sirius Red ABCAM Australia Pty Ltd ab246832
Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath Interpath 24800
Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath Interpath 24300
Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath Interpath 24700
Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath Interpath 24500
Precellys Homogeniser Bertin Instruments P000669-PR240-A
Protractor Generic To measure blade angle
Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific
Scalpel Blade Mixed
Scalpel Blade Holder Mixed
SensiFAST cDNA Synthesis Kit Bioline (Aust) PTY LTD
Small Paintbrush with Plastic Handle Mixed Plastic handle resists ethanol
Square-Head Foreceps Mixed
Sterile 50 ml Plastic Tubes Corning Falcon 352098
Surgical Clamps Mixed
Surgical Forceps Mixed
Surgical Pins Mixed
Surgical Scissors Mixed
Taurochoic acid Sigma-Aldrich T-4009-5G
Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice World Precision Instruments SYS-NVSLM1 With thermoelectric cooling
Williams Medium E Life Technologies Australia Pty Ltd 12551032 2.0 g/l glucose
Xylazine 100 mg/mL 50 mL Provet XYLAZ4

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References

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चिकित्सा अंक 157 जिगर स्लाइस वाइब्रेटोम पूर्व वीवो हेपेटोसाइट्स ऊतक संस्कृति स्टेलेट कोशिकाएं
लिवर बायोलॉजी के एक पूर्व वीवो मॉडल के रूप में Murine परिशुद्धता-कट जिगर स्लाइस
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Pearen, M. A., Lim, H. K., Gratte,… More

Pearen, M. A., Lim, H. K., Gratte, F. D., Fernandez-Rojo, M. A., Nawaratna, S. K., Gobert, G. N., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. E., Ramm, G. A. Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology. J. Vis. Exp. (157), e60992, doi:10.3791/60992 (2020).

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