Summary
Vi presenterer en RT-LAMP analyse for påvisning av TiLV i tilapia fisk ved hjelp av enkle instrumenter over en relativt kort periode sammenlignet med konvensjonelle RT-PCR teknikker. Denne protokollen kan bidra til å kontrollere epidemispredningen av TiLVD, spesielt i utviklingsland.
Abstract
Tilapia lake virus sykdom (TiLVD), en fremvoksende virussykdom i tilapia forårsaket av tilapia innsjø virus (TiLV), er en vedvarende utfordring i akvakulturindustrien som har resultert i masse sykelighet og dødelighet av tilapia i mange deler av verden. En effektiv, rask og nøyaktig diagnostisk analyse for TiLV-infeksjon er derfor nødvendig for å oppdage den første infeksjonen og for å forhindre spredning av sykdommen i akvakulturoppdrett. I denne studien presenteres en svært følsom og praktisk omvendt transkripsjonloop-mediert isothermal forsterkning (RT-LAMP) metode for å oppdage tilapia innsjøvirus i fiskevev. En sammenligning av RT-qPCR- og RT-LAMP-analyser av infiserte prøver viste positive resultater i 63 (100%) og 51 (80,95 %) prøver, henholdsvis. Videre viste en analyse av uinfiserte prøver at alle 63 uinfiserte vev ga negative resultater for både RT-qPCR og RT-LAMP-analyser. Kryssreaktiviteten med fem patogener i tilapia ble evaluert ved hjelp av RT-LAMP, og alle testene viste negative resultater. Både lever- og slimprøvene hentet fra infisert fisk viste sammenlignbare resultater ved hjelp av RT-LAMP-metoden, noe som tyder på at slim kan brukes i RT-LAMP som en nonlethal analyse for å unngå å drepe fisk. Til slutt viste resultatene at den presenterte RT-LAMP-analysen gir en effektiv metode for TiLV-deteksjon i tilapiavev innen 1 h. Metoden anbefales derfor som et screeningverktøy på gårder for rask diagnose av TiLV.
Introduction
Tilapia lake virus sykdom (TiLVD) er en virussykdom i tilapia (Oreochromis spp.) som angivelig forårsaker tilapia dødsfall i mange regioner av verden, inkludert Asia1,2, Afrika og Amerika. Sykdommen ble først anerkjent under massedødeligheten av tilapia i 2009 i Israel, hvor antall vill tilapia i Kinneretsjøen falt dramatisk fra 257 til 8 tonn per år2. Sykdommen er forårsaket av tilapia innsjø virus (TiLV), som har blitt tildelt familien Amnoonviridae som en ny slekt Tilapinevirus og en ny art Tilapia tilapinevirus3. Genetisk karakterisering av TiLV viste at viruset er en roman innhyllet, negativ-sense, enkelt-strandet RNA virus som har 10 segmenter koding 10 proteiner1,2,4. Ulike arter av tilapia i slekten Sarotherodon, Oreochromis, og Tilapine og andre varme vannfisk (f.eks gigantiske gourami (Osphronemus goramy)) har vist seg å være utsatt for TiLV2,5. Foreløpig fortsetter dette viruset å spre seg globalt, muligens gjennom bevegelse av infisert levende fisk6,7, mens risikoen for viral overføring via frossen tilapia eller produktet er begrenset8. Betydelig dødelighet på grunn av TiLV-infeksjon har potensial til å ha en betydelig skadelig økonomisk innvirkning på tilapiaindustrien. For eksempel ble den økonomiske effekten av sommerdødelighetssyndrom i Egypt forbundet med TiLV-infeksjon beregnet til US $ 100 millioner9. Følgelig er det viktig å utvikle en rask og riktig diagnostisk metode for å lette kontrollen av denne sykdommen i oppdrettsanlegg.
Inntil nå har diagnosen TiLVD vært basert på molekylære analyser, viral isolasjon og histopatologi. Ulike PCR-protokoller og primere er utviklet for TiLV diagnose10,11. For eksempel, en SYBR grønn-basert omvendt transkripsjon kvantitativ PCR (RT-qPCR) metode med følsomhet for å oppdage så få som to kopier / μL av viruset er utviklet og validert for TiLV deteksjon10. Andre PCR-metoder for TiLV-deteksjon inkluderer TaqMan kvantitativ PCR11,RT-PCR2,nestet RT-PCR12og halvnestet RT-PCR13. Disse metodene krever imidlertid sofistikert laboratorieutstyr og relativt lengre perioder for å gi resultater på grunn av kompleksiteten i reaksjonene, noe som gjør dem uegnet for feltapplikasjon.
Den loop-medierte isothermal forsterkning (LAMP) analysen er en rask, enkel og praktisk for-feltet søknad14,15. Teknikken benytter prinsippet om en trådforskyvningsreaksjon, mens forsterkningsreaksjonen går under isothermale forhold uten en sofistikert og dyr termisk cycler14,15. Følgelig analyseres forsterkede LAMP-produkter eller RT-LAMP-produkter i stigelignende bånd ved hjelp av agarose gelelektroforese med en fluorescerende flekk for enten sikker visualisering av DNA eller RNA14 eller observasjon med det blotte øye for tilstedeværelse av turbiditet eller en hvit utfelling16,17,18. Av disse grunnene har denne teknikken blitt brukt til påvisning av ulike fiskepatogener17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Hensikten med denne studien var å etablere en rask, følsom og nøyaktig RT-LAMP-analyse for TiLV-deteksjon. RT-LAMP-analysen tilbyr screening for TiLV i fiskeprøver innen 30 min. Teknikken kan brukes for diagnose og overvåking av TiLVD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dette eksperimentet, som involverte bruk av dyrevev, ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of Kasetsart University, Bangkok, Thailand (protokollnummer ACKU61-VET-009).
1. Vev samling
- Euthanize tilapia fisk ved hjelp av en overdose av fedd olje (dvs. mer enn 3 ml / L). Tricaine metansulfonat kan brukes som et alternativ til fedd olje.
- Bruk steril majones saks og tang for å kutte åpne magen i postmortem tilapia og avgiftsfritt ca 30–50 mg levervev, eller ved hjelp av et mikroskopdeksel glass, samle 100 μL slim ved å skrape fiskehudlaget langsgående (fra fremre til bakre) til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Fortsett til RNA-ekstraksjonstrinnet umiddelbart eller hold den innsamlede prøven ved −80 °C til eksperimentet. Siden intakt RNA er mer følsom enn DNA, bruk RNase-frie materialer og reagenser under RNA-ekstraksjonen.
2. RNA-ekstraksjon
- For å trekke ut RNA fra levervevet, tilsett 30–50 mg av tilapiavevet til et 1,5 ml mikrosentrifugerør som inneholder 600–1000 μL guanidiniumsyre-fenolekstraksjonsreagen (Materialbord), og pulveriser prøven til homogen tøvhomogenisator. Vevsprøvene krever ca. 10% av guanidiniumsyre-fenolekstraksjonsreagen. For slimprøvene må du bare bruke 300 μL av guanidiniumsyre-fenolekstraksjonsreagen (3:1).
FORSIKTIG: Guanidinium-syre-fenol ekstraksjonreagen er giftig; derfor må håndtering utføres med forsiktighet. Verneutstyr, for eksempel vernebriller, laboratoriekjole og vernehansker, må brukes. - Sentrifugere homogenisert prøve på 10.000 x g for 30 s ved romtemperatur, og overfør supernatanten til et nytt sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Tilsett et likt volum på 95% etanol til røret og bland godt.
- Overfør løsningen til en spin-kolonne (Materialbord)plassert i et oppsamlingsrør og sentrifuge ved 10 000 x gr i 30 s ved romtemperatur. Kast gjennomstrømningen, og overfør spin-kolonnen til et nytt samlingsrør.
- Tilsett 400 μL RNA Pre-Wash reagens (Materialbord) til kolonnen og sentrifugen ved 10 000 x gr i 30 s ved romtemperatur før du kaster gjennomstrømningen. Gjenta dette trinnet én gang til.
MERK: For å forberede RNA Pre-Wash, tilsett 10 ml 95% etanol til 40 ml RNA Pre-Wash konsentrat. - Tilsett 700 μL RNA Vaskebuffer(Materialbord)i kolonnen og sentrifugen ved 10 000 x gr i 2 min ved romtemperatur. Overfør kolonnen til et sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
MERK: For å forberede RNA Wash Buffer, tilsett 52 ml 95% etanol til 12 ml RNA Wash Buffer konsentrat. - Elute RNA-prøven fanget i spin kolonne matrise navle med 100 μL nkjernevann og sentrifuge på 10.000 x g for 30 s ved romtemperatur.
- Mål konsentrasjonen av den ekstraherte RNA ved hjelp av et mikrovolumspektrometer og fortynn RNA til en ønsket konsentrasjon ved hjelp av nukleosefritt vann.
MERK: Den kvalifiserte absorbansverdien av OD260/OD280 varierer fra 1,6 til 1,9, noe som indikerer akseptabel RNA-renhet for RT-LAMP-analysen. - Fortsett til neste trinn umiddelbart, eller hold prøven ved −80 °C til bruk.
3. Primer design
- Bruk Primer Explorer versjon 4 til å utforme de spesifikke primere for RT-LAMP. Gå til nettstedet, https://primerexplorer.jp/e/, og klikk på PrimerExplorer V4-knappen.
- Velg filen som inneholder sekvensene i segment 3 av TiLV i FASTA-format, og klikk deretter primerdesignknappen.
MERK: Hent sekvensene i FASTA-format fra GenBank-tiltredelsesnummer KX631923, som representerer tilapia lake virus TV1 segment 31. - Hvis du vil utforme primere, skriver du inn følgende grunnleggende parametere:
- Et GC-innhold på 40%–60%
- En amplicon på ≥ 280 basispar (bp)
- En lignende smeltetemperatur (Tm) blant primere med en maksimal forskjell på 5 °C
MERK: Primere må ikke utfylle hverandre- Unngå sekvensregioner som er utsatt for å danne sekundære strukturer.
- Velg dimer primer-analysen med minimum -3,5 for en optimal design for den største ΔG, og velg endene av primere med maksimalt -4 for en optimal design for den mindre ΔG.
- Klikk generer-knappen.
MERK: Når programvaren er ferdig med å behandle inndata, vises primerresultatene (figur 1).
4. RT-LAMP-analyse
- Forbered en RT-LAMP-hovedblanding som inneholder 2,5 μL med 1x SD II-reaksjonsbuffer, 3 μL av 6 m MgSO4,1,4 μL av 1,4 mM dNTP-sett, 4 μL av 0,8 M betain, 1,3 μL av 0,052 mkalsalblanding, 1 μL av 1,6 μM TiLV-F3 primer, 1 μL av 1,6 μM TiLV-B3 primer, 1 μL av 0,2 μM TiLV-BIP primer, 1 μL av 0,2 μM TiLV-FIP primer, 1 μL av 0,3 U BST DNA polymerase, 1 μL av 0,1 U AMV revers transkriptase, og 3,8 μL kjerne av kjerne av asasefritt vann per reaksjon.
MERK: Forbered overflødig masterblanding bestående av minst 10 % av det totale reaksjonsvolumet. - Dispenser 22 μL av RT-LAMP-hovedblandingen i et sterilt 1,5 mikrosentrifugerør.
- Tilsett 3 μL av det ekstraherte RNA på reaksjonsrøret, og bland prøven ved å virvle. For negativ kontroll, bruk destillert vann i stedet for RNA-materialer.
- Inkuber reaksjonen ved 65 °C i 60 min, etterfulgt av 80 °C i 10 minutter for å avslutte reaksjonen.
- Etter inkubasjon, observere fargely de koloriske endringene med det blotte øye. Et positivt resultat vil vises som en fluorescerende grønn farge.
5. Agarose gel elektroforese
- Forbered en 1,5 % w/v agarosegel ved å suspendere 0,6 g agarosepulver i 40 ml 1x TAE-buffer. Smelt blandingen ved å varme den i en mikrobølgeovn i 3–5 min til agarose er helt oppløst, og virvle for å blande.
- La agarose avkjøles til temperaturen når 65 °C. Hell 40 ml av agaroseløsningen på et gelbrett og legg til en kam til gelformen.
- La agarosegelen stille setter ved romtemperatur i 20–30 min til den er fullstendig størknet. Fjern deretter kammen og legg gelen i geltanken.
- Legg til en løpebuffer for å dekke overflaten av gelen i geltanken.
- Tilsett 10 μL av RT-LAMP-prøven og 2 μL med 6x gelinnlastingsbuffer til hver brønn. Tilsett 5 μL av en 1 kb DNA-stige til referansefeltet.
- Plugg lokket festet til katoden og anoden som er koblet til en strømforsyning. Slå på strømforsyningen, sett den til en konstant 100 V, og kjør i 40 min.
- Etter å ha fullført gelseparasjonen, fjern gelen fra gelbrettet. Beis deretter den drenerte gelen ved hjelp av ethidiumbromid (EtBr) med en konsentrasjon på 10 mg/ml i 7 min og restain den i destillert vann i 5 min.
FORSIKTIG: Etbr er giftig og betraktes som et kreftfremkallende; Vær derfor forsiktig når du bruker denne agenten. - Utsett gelen for UV-lys ved hjelp av et geldokumentasjonssystem der båndene vises, og ta et bilde av gelen.
6. Komplementær DNA (cDNA) syntese
- Forbered en cDNA-syntesemasterblanding som inneholder 2 μL 5x RT-buffer, 0,5 μL primerblanding, 0,5 μL RT-enzym og 2 μL nkjernefritt vann per reaksjon.
MERK: Forbered overflødig masterblanding bestående av 1x reaksjonen på grunn av mulig tap under pipettering. - Dispenser 5 μL av masterblandingen i et sterilt mikrosentrifugerør på 1,5 ml.
- Tilsett 100 ng av den fortynnede ekstraherte RNA (hentet fra trinn 2.8) til reaksjonsrøret, bland og spinn ned for å flytte all blandingen til bunnen av fartøyet.
- Inkuber reaksjonene ved 42 °C i 60 min, etterfulgt av 98 °C i 5 min i en PCR-maskin. Oppbevar cDNA ved −20 °C til bruk.
7. RT-qPCR
- Forbered en TiLV qPCR-hovedblanding som inneholder 0,3 μL av 10 μM omvendt primer, 0,3 μL av 10 μM forover primer, 5 μL av 2x SYBR Grønn DNA polymerase og 0,4 μL nukleoskfritt vann per reaksjon. Bruk følgende primere og kontroller:
Forover primer (TiLV-112F): 5'-CTGAGCTAAAAGAGGCAATATGGATT-3'
Omvendt primer (TiLV-112R): 5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGtTCT-3' - Dispenser 6 μL av TiLV qPCR-hovedblandingen i hver brønn på qPCR-stripen som er kompatibel med den termiske syklussyklusen i sanntid som brukes.
- Tilsett 4 μL av cDNA-malen, negativ kontroll (nukleoskfritt vann), positiv kontroll (10 pg/μL) og pTiLV (plasmid)10 eller seriefortynnet TiLV plasmid til brønnen, og bland hver prøve ved å sveipe. Utfør hver prøve i triplicate.
- Plasser qPCR-reaksjonene i den programmerte termiske syklussyklusen i sanntid. Sett qPCR-programmet til å utføre inkubasjonen ved 95 °C i 3 min, etterfulgt av 40 sykluser på 95 °C i trinn på 10 s og 60 °C i 30 s før smeltekurven trinn der temperaturen må øke fra 65 °C til 95 °C ved trinn på 0,5 °C/5.
- Utfør dataanalysen ved å evaluere forsterknings- og smeltekurvene, og beregn deretter antall TiLV-kopier ved hjelp av standardkurven hentet fra dataene ved hjelp av de seriefortynnede plasmidene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien ble en RT-LAMP-analyse utviklet for å oppdage TiLV-infeksjon i tilapia. De testede prøvene ble samlet inn fra 14 gårder i ulike deler av Thailand mellom 2015 og 2016. Den infiserte og uinfiserte fisken ble hovedsakelig gruppert basert på fysiske diagnoser og utseendet til symptomatisk TiLVD. TiLV-infeksjon ble senere bekreftet ved hjelp av RT-PCR etter innsamlingsprosessen. Agarose gel elektroforese og påvisning av en selvlysende grønn farge ble valgt som evalueringsmetoder for LAMP amplicons (Figur 2). Leveren og slimet efter den infiserte og uinfiserte tilapiafisken var preget av det kliniske utseendet av TiLV sykdomssymptomer, inkludert huderosjon, hudrødhet, exophthalmos og abdominal hevelse. Tidligere rapporter har vist bruk av leverprøver i molekylærdiagnostiske analyser for å bestemme tilstedeværelsen av TiLV35. Alternativt kan slim være gunstig i analysen, da det kan bidra til å unngå å drepe dyrene. Resultatene viste et stigelignende DNA-båndmønster og en fluorescerende grønn farge i de infiserte lever- og slimprøvene av infisert fisk (Figur 2), mens ingen DNA-bånd og den gule fargen på kalsering ble observert i RT-LAMP-blandingene i uinfiserte dyrevev (Figur 2). Interessant, en TiLV-infisert tilapia prøve samlet fra en gård i Malaysia ble også diagnostisert som positiv ved hjelp av denne RT-LAMP analyse; Variasjoner i PCR-produktets størrelse sammenlignet med prøvene som ble samlet inn fra lokale thailandske gårder, ble imidlertid observert (figur 2).
For å verifisere følsomheten og spesifisiteten til RT-LAMP-analysen ble totalt 63 TiLV-infisertvev og 63 uinfiserte vev analysert ved hjelp av både RT-LAMP og RT-qPCR-analysene (tabell 1). En sammenligning av RT-qPCR- og RT-LAMP-analyser av de infiserte prøvene viste et positivt resultat i 63 (100%) og 51 (80,95 %) av prøvene. Videre viste en analyse av de uinfiserte prøvene at alle 63 uinfiserte vev ga negative resultater ved hjelp av både RT-qPCR og RT-LAMP-analysene (Tabell 1). Denne analysen viste påliteligheten til RT-LAMP-analysen for primær TiLV-deteksjon. For å teste spesifisiteten til RT-LAMP-analysen, vev fra fisk infisert med andre patogene bakterier og virus, inkludert Streptococcus agalactiae, Francisella noatunensis, Flavobacterium columnare, Aeromonas hydrophila, og Iridovirus ble brukt som maler for RT-LAMP og RT-qPCR analyser. Både RT-LAMP- og RT-qPCR-primerene ga negative resultater uten koloriske endringer og ingen fluorescerende signaler i noen av de testede prøvene (tabell 2). I tillegg ble følsomheten til RT-LAMP-analysen vurdert ved hjelp av en seriell 10-fold fortynning av RNA-malene hentet fra TiLV-infisert fisk. Til sammenligning var RT-qPCR-analysen mer følsom enn RT-LAMP-analysen da RT-qPCR-analysen hadde en deteksjonsgrense på 10-8, mens RT-LAMP-metoden krevde en 10-7-foldfortynning for å oppdage TiLV-genomet (tabell 2).
Figur 1. Nukleotidsekvensene til de seks RT-LAMP-primere som ble brukt i denne studien som var spesifikke for påvisning av TiLV. Plasseringen av hver primer ble justert på segment 3 av TiLV-genomet (tiltredelsesnummer KX631923). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Analyse av RT-LAMP amplicons hentet fra TiLV-infiserte og uinfiserte prøver (A) i 1,5% agarose gel elektroforese og (B) ved fluorescerende visualisering. M = 1 kb DNA stige, 1–2 = RNA fra leveren av TiLV-infisert fisk, 3–4 = cDNA av TiLV-infisert fisk, 5–6 = RNA fra slimet av TiLV-infisert fisk, 7–8 = cellelinjer av TiLV-infisert fisk, 9 = RNA fra leverav TiLV-infisert fisk (Malaysia), 10 = RNA fra leverav ikke-TiLV-infisert fisk, 11 = cDNA av ikke-TiLV-infisert fisk, 12 = RNA fra slim av ikke-TiLV-infisert fisk, 13 = ingen malkontroll Vennligst her for å vise en større versjon av denne figuren.
| Typer prøver | Antall eksempler | Deteksjonsgyldighet (%) | |
| RT-qPCR (andre kan være på spill) | RT-LAMPE | ||
| Infiserte prøver | 63 | 100.00 (63/63) | 80.95 (51/63) |
| Uinfiserte prøver | 63 | 0 (0/63) | 0 (0/63) |
Tabell 1. Verifisering av RT-LAMP for TiLV-deteksjon i infiserte og uinfiserte fiskeprøver ved hjelp av RT-qPCR og RT-LAMP
| Spesifisitet | S.a. | F.n. | F.c. | A.h. | Iv. | |||||
| QPCR (andre kan være på spill) | Lampe | QPCR (andre kan være på spill) | Lampe | QPCR (andre kan være på spill) | Lampe | QPCR (andre kan være på spill) | Lampe | QPCR (andre kan være på spill) | Lampe | |
| – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | |
| Følsomhet | metode/ | 10-1 (10 -1) | 10-2 (10 -2) | 10-3 (10 -3) | 10-4 (10 -4) | 10-5 (10 -5) | 10-6 (10 -6) | 10-7 (10 -7) | 10-8 (10 -8) | 10-9 (10 -9) |
| Fortynning | ||||||||||
| QPCR (andre kan være på spill) | + | + | + | + | + | + | + | + | – | |
| Lampe | + | + | + | + | + | + | + | – | – | |
Tabell 2. Spesifisitet og følsomhet for RT-LAMP-analysen sammenlignet med RT-qPCR. For spesifisitetsevalueringen, RNA hentet fra fiskevev infisert med andre bakterier eller virus, inkludert Streptococcus agalactiae (S.a.), Francisella noatunensis (F.n.), Flavobacterium columnare (F.C.), Aeromonas hydrophila (A.h.), og Iridovirus (I.v.), ble brukt som maler for RT-qPCR og RT-LAMP. For følsomhetsevalueringen var RNA hentet fra TiLV-infisert fisk 10 ganger serielt fortynnet fra 100 ng til 1 fg og brukt som maler for RT-qPCR og RT-LAMP. + og – tegn betyr henholdsvis positive og negative resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Havbruksnæringen er stadig truet av virusinfeksjoner som forårsaker betydelige økonomiske tap9,23,28. For eksempel utgjør den nye TiLV en stor trussel mot tilapia-produserende land i mange deler av verden1,6,9. Inntil nå har det ikke vært noen spesifikke terapeutiske midler tilgjengelig for å forhindre TiLVD. Mens utviklingen av en vaksine pågår, vil en effektiv vaksine kreve betydelig tid før den er tilgjengelig for kommersielle formål. Gitt disse omstendighetene, strenge biosecurity målinger, slik som anvendelse av desinfeksjonsmidler, er nødvendig i oppdrettsanlegg for å hindre spredning av TiLVD29,30. For tiden er et av de mest effektive kontrolltiltakene for å redusere TiLV-overføring screening av juvenil fisk og voksne for tilstedeværelse eller fravær av TiLV31. For screeningformål må diagnoseverktøyet være raskt, følsomt og spesifikt, slik at det kan bidra til å eliminere infiserte populasjoner og forhindre videre spredning av sykdom. Dagens molekylære analyser for TiLV er imidlertid vanskelige å implementere på stedet. I første omgang krever de dyktige forskere og dyrt utstyr. For det andre kan det ta flere dager å oppnå laboratorieresultatene, noe som gjør det vanskelig å kontrollere og forhindre spredning av sykdom raskt15,16.
For å overvinne disse problemene etablerte Notomi et al.14 en ny nukleinsyrebasert forsterkningsanalyse kalt loop-mediert isothermal forsterkning (LAMP) i 2000. LAMP reaksjonen har siden blitt brukt til å oppdage ulike fiskevirus16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,32,33,34. I denne studien utviklet vi en RT-LAMP-protokoll for å oppdage TiLV i tilapia fiskeprøver. Selv om følsomheten til RT-LAMP-metoden er 10 ganger mindre effektiv enn rt-qPCR, kan RT-LAMP-analysen oppdage tilstedeværelsen av et TiLV RNA-genom så lavt som 100 fg, noe som er tilstrekkelig for TiLV-deteksjon i klinisk syke fisk34. Spesielt gir RT-LAMP-analysen et resultat innen 60 min og krever bare et enkelt vannbad eller varmeblokkinstrumenter34, mens RT-qPCR-analysen tar mer tid og krever dyrere sanntids PCR-utstyr for analysen15,34. Videre ble sluttproduktet av RT-LAMP observert gjennom en endring i fargen på fluorescerende fargestoff fra lys gul til fluorescerende grønn, noe som gjør det synlig for det blotte øye uten krav til sofistikert utstyr34. Disse fordelene gjør RT-LAMP egnet for feltdiagnose. Videre, studien funn antydet at både lever og slim kan brukes til TiLV deteksjon ved hjelp av RT-LAMP. I likhet med tidligere studier tillot en ikke-dødelig prøve ved hjelp av slim diagnosen TiLV uten å drepe fisk eller verdifulle stamfisk35. Nylig ble en RT-LAMP-analyse utviklet for å oppdage kinesiske og thailandske isolater av TiLV nukleotidsekvenser i segment 1 (S1-regionen) ved hjelp av et sett med seks primere36. Den nåværende studien viste at den utviklede RT-LAMP-analysen diagnostiserte et falskt negativt signal om TiLV-infeksjon ved 27,78% sammenlignet med RT-PCR når du bruker samme primersett. Ved videre sammenligning var det falske negative resultatet relativt mindre på 19,05 % ved detektering av segment 3 av TiLV sammenlignet med RT-PCR. Når du sammenligner effektiviteten av viral deteksjonsmetode med andre rapporter, vi var i stand til å oppdage TiLV infeksjon på 80,95%, mens andre arbeider oppdaget viruset på 72,22%36 og 82,89%37. Til sammen kan det være hypotetisk at de forskjellige komponentene i RT-LAMP-analysen, for eksempel de forskjellige primersettene og de forskjellige målrettede segmentene av TiLV-genomet er viktige faktorer som påvirker gyldigheten av analysen.
Selv om RT-LAMP-analysen er et kraftig verktøy for sykdomsscreening og har flere påviselige fordeler, var denne studien ikke uten begrensninger. Et av de kritiske punktene for RT-LAMP-analysen var utformingen av et passende primersett bestående av fire til seks primere. For å fremme dannelsen av stammen-sløyfe strukturer av PCR-produkter, de riktige lengdene på målrettede gener eller nukleotid sekvenser måtte være lengre enn ca 500 bp, mens de målrettede genene i RT-PCR analyse måtte være relativt kort, i området 50-150 bp14,38,39.
Til slutt er den utviklede RT-LAMP-analysen rask, kostnadseffektiv, følsom og spesifikk for TiLV-deteksjon. Analysen kan fullføres innen 1 time sammenlignet med 4–5 timer for RT-qPCR-analysen. Spesielt er RT-LAMP-analysen praktisk for feltforhold, da positive resultater kan observeres med det blotte øye uten å kreve bruk av sofistikert utstyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Prosjektet er finansiert av Thailand Research Fund (TRF) stipendnummer RDG6050078 og Senter for avanserte studier for landbruk og mat, Institutt for avanserte studier, Kasetsart University, Bangkok, Thailand under Higher Education Research Promotion og National Research University Project of Thailand, Office of the Higher Education Commission, Ministry of Education, Thailand. Forskningen støttes delvis av Graduate Program Scholarship fra Graduate School, Kasetsart University. Forfatterne vil gjerne takke Dr. Kwanrawee Sirikanchana for fortellingen som snakker om videoen og Piyawatchara Sikarin for redigering av videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue collection: | |||
| Clove oil | Better Pharma | N/A | |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative option to clove oil |
| RNA extraction: | |||
| Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) | ThermoFisher Scientific Corp. | 15596026 | |
| Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol RNA Kit: | Zymo Research | R2071 | |
| - Direct-zol RNA PreWash | |||
| - RNA Wash Buffer | |||
| - DNase/RNase-free water | |||
| - Zymo-spin IIICG columns | |||
| - Collection Tubes | |||
| RT-LAMP: | |||
| 1x SD II reaction buffer | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP set | Bioline | BIO-39053 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| Calcein mixture | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst DNA polymerase | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV reverse transcriptase | Promega | M510A | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite dry bath incubator, single unit | Major Science | EL-01-220 | |
| Gel electrophoresis: | |||
| Agarose | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer: | |||
| - Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| - Acetic acid (glacial), EMSURE | Merck Millipore | 1000632500 | |
| - Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen | NeoScience Co., Ltd. | GR107 | |
| DNA gel loading dye (6X) | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| DNA ladder and markers | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) | Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC power supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Gel Doc EZ System | Bio-Rad | 1708270 | |
| UV sample tray | Bio-Rad | 1708271 | |
| NαBI imager | Neogene Science | ||
| cDNA synthesis: | |||
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis Technologies | cDSK01 | An alternative option for cDNA synthesis |
| NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR: | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| Nuclease-free water, sterile water | MultiCell | 809-115-CL | |
| 8-tube PCR strips, white | Bio-Rad | TLS0851 | |
| Flat PCR tube 8-cap strips, optical | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1855196 | |
| General equipment and materials: | |||
| Mayo scissors | N/A | ||
| Forceps | N/A | ||
| Vortex Genie 2 (vortex mixer) | Scientific Industries | ||
| Microcentrifuge LM-60 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE mini microcentrifuge | Corning | 6765 | |
| Pipettes | Rainin | Pipete-Lite XLS | |
| QSP filtered pipette tips | Quality Scientific Plastics | TF series | |
| Corning Isotip filtered tips | Merck | CLS series | |
| Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST | Wuxi NEST Biotechnology | 615601 |
References
- Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
- Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
- Adams, M. J., et al. Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017). Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).
- Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), 00431 (2016).
- Jaemwimol, P., et al. Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection. Aquaculture. 497, 462-468 (2018).
- Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Rome, Italy. (2017).
- Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Genome Announcements. 6 (26), (2018).
- Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets. Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).
- Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by 'summer mortality' syndrome. Aquaculture. 473, 430-432 (2017).
- Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
- Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture. 497, 184-188 (2018).
- Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
- Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture. 476, 111-118 (2017).
- Notomi, T., et al.
- Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).
- Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal. 2, 83 (2005).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).
- Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS). Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).
- Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).
- Shivappa, R. B., et al. Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).
- Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).
- Chinabut, S., Puttinaowarat, S. The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products. Developmental Biology. 121, 255-261 (2005).
- Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine. Aquaculture. 512, 734342 (2019).
- Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).
- Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry. Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).
- Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Aquaculture. 507, 35-39 (2019).
- Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture. 486, 75-80 (2018).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Khan, R. S. A., et al. Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis. Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
- Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. The influence of amplicon length on real-time PCR results. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).
