Summary
Vi præsenterer en RT-LAMP analyse til påvisning af TiLV i tilapia fisk ved hjælp af enkle instrumenter over en relativt kort periode i forhold til konventionelle RT-PCR teknikker. Denne protokol kan bidrage til at kontrollere den epidemiske spredning af TiLVD, især i udviklingslandene.
Abstract
Tilapia sø virus sygdom (TiLVD), en spirende virussygdom i tilapia forårsaget af tilapia sø virus (TiLV), er en vedvarende udfordring i akvakulturindustrien, der har resulteret i masse sygelighed og dødelighed af tilapia i mange dele af verden. Det er derfor nødvendigt med en effektiv, hurtig og nøjagtig diagnostisk analyse for TiLV-infektion for at påvise den oprindelige infektion og forhindre spredning af sygdommen i akvakulturbrug. I denne undersøgelse, en meget følsom og praktisk omvendt transskription loop-medieret isotermisk forstærkning (RT-LAMP) metode præsenteres for at opdage tilapia sø virus i fiskevæv. En sammenligning af RT-qPCR- og RT-LAMP-analyserne af inficerede prøver viste positive resultater i 63 (100 %) og 51 (80,95 %) prøver. Desuden viste en analyse af ikke-inficerede prøver, at alle 63 ikke-inficerede væv gav negative resultater for både RT-qPCR- og RT-LAMP-analyserne. Krydsreaktivitet med fem patogener i tilapia blev evalueret ved hjælp af RT-LAMP, og alle test viste negative resultater. Både lever- og slimprøver fra inficerede fisk viste sammenlignelige resultater ved hjælp af RT-LAMP-metoden, hvilket tyder på, at slim kan anvendes i RT-LAMP som en ikke-dødelig analyse for at undgå at dræbe fisk. Resultaterne viste, at den præsenterede RT-LAMP-analyse giver en effektiv metode til TiLV-detektion i tilapiavæv inden for 1 time. Metoden anbefales derfor som screeningsværktøj på bedrifterne med henblik på hurtig diagnosticering af TiLV.
Introduction
Tilapia sø virus sygdom (TiLVD) er en virussygdom i tilapia(Oreochromis spp.), der efter sigende forårsager tilapia dødsfald i mange regioner i verden, herunder Asien1,2,Afrika og Amerika. Sygdommen blev først anerkendt under massedødeligheden af tilapia i 2009 i Israel, hvor antallet af vilde tilapia i Lake Kinneret styrtdykkede dramatisk fra 257 til 8 tons om året2. Sygdommen er forårsaget af tilapia sø virus (TiLV), som er blevet tildelt familien Amnoonviridae som en ny slægt Tilapinevirus og en ny art Tilapia tilapinevirus3. Genetisk karakterisering af TiLV viste, at virussen er en roman indhyllet, negativ-sans, enkeltstrenget RNA-virus, der har 10 segmenter kodning 10 proteiner1,2,4. Forskellige arter af tilapia i slægten Sarotherodon, Oreochromis, og Tilapin og andre varmt vand fisk (f.eks kæmpe gourami (Osphronemus goramy)) har vist sig at være modtagelige for TiLV2,5. I øjeblikket, denne virus fortsætter med at sprede sig globalt, muligvis gennem flytning af inficerede levende fisk6,7, mens risikoen for viral transmission via frosne tilapia eller dens produkt er begrænset8. Betydelig dødelighed som følge af TiLV-infektion har potentiale til at have en betydelig skadelig økonomisk indvirkning på tilapiaindustrien. For eksempel, de økonomiske konsekvenser af sommerdødelighed syndrom i Egypten i forbindelse med TiLV infektion blev beregnet til at være US $ 100 millioner9. Det er derfor vigtigt at udvikle en hurtig og korrekt diagnostisk metode til at lette kontrollen med denne sygdom i dambrug.
Indtil nu har diagnosen TiLVD været baseret på molekylære analyser, viral isolation og histopatologisk. Forskellige PCR protokoller og primere er blevet udviklet til TiLV diagnose10,11. For eksempel, en SYBR grøn-baseret omvendt transskription kvantitative PCR (RT-qPCR) metode med følsomhed til at opdage så få som to kopier / μL af virus er blevet udviklet og valideret for TiLV påvisning10. Andre PCR-metoder til TiLV-registrering omfatter TaqMan quantitative PCR11, RT-PCR2, indlejret RT-PCR12og semi-indlejret RT-PCR13. Disse metoder kræver imidlertid avanceret laboratorieudstyr og relativt længere tid til at give resultater på grund af reaktionernes kompleksitet, hvilket gør dem uegnede til anvendelse i marken.
Den loop-medieret isotermisk forstærkning (LAMP) assay er en hurtig, enkel og praktisk for-felt anvendelse14,15. Teknikken anvender princippet om en streng forskydning reaktion, mens forstærkning reaktion løber under isomale forhold uden en sofistikeret og dyr termisk cycler14,15. Derfor analyseres forstærkede LAMP-produkter eller RT-LAMP-produkter i stigelignende bånd ved hjælp af agarose gel elektroforese med en fluorescerende plet til enten sikker visualisering af DNA eller RNA14 eller observation med det blotte øje for tilstedeværelsen af turbiditet eller en hvid bundfald16,17,18. Denne teknik er derfor blevet anvendt til påvisning på stedet af forskellige fiskepatogener17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Formålet med denne undersøgelse var at etablere en hurtig, følsom og nøjagtig RT-LAMP-analyse til tilvdetektion. RT-LAMP-analysen tilbyder screening for TiLV i fiskeprøver inden for 30 min. Teknikken kan anvendes til diagnosticering og overvågning af TiLVD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dette eksperiment, som omfattede anvendelse af animalsk væv, blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of Kasetsart University, Bangkok, Thailand (protokolnummer ACKU61-VET-009).
1. Vævsindsamling
- Euthanize tilapia fisk ved hjælp af en overdosis af fed olie (dvs. mere end 3 ml/L). Tricaine methanesulfonat kan bruges som et alternativ til fed olie.
- Brug steril mayo saks og pincet til at skære åbne maven af postmortem tilapia og punktafgifter ca 30-50 mg levervæv, eller ved hjælp af et mikroskop dække glas, indsamle 100 μL slim ved at skrabe fisk hudlag et langsgående (fra anterior til posterior) i en 1,5 ml mikrorørcentrifuge.
- Fortsæt straks til RNA-ekstraktionstrinnet, eller hold den udtagne prøve ved −80 °C, indtil forsøget. Da intakt RNA er mere følsomt end DNA, skal du bruge RNase-frie materialer og reagenser under RNA-ekstraktionen.
2. RNA-ekstraktion
- For at udtrække RNA fra levervævet tilsættes 30-50 mg af tilapiavævet til et 1,5 ml mikrocentrifugerør, der indeholder 600-1.000 μL guanidinium-syre-phenolekstraktikreagen ( Materialetabel ), og prøvenpulveriseres,indtil prøven homogene ved hjælp af en håndholdt vævshomogenisator. Vævsprøverne kræver ca. 10% af guanidinium-syre-phenol ekstraktionsreagens. Til slimprøverne anvendes kun 300 μL guanidiniumsyre-phenolekstrakteragens (3:1).
FORSIGTIG: Guanidinium-syre-phenol ekstraktionreagens er giftigt; derfor skal håndteringen udføres med forsigtighed. Der skal bæres beskyttelsesudstyr, såsom sikkerhedsbriller, laboratoriekjole og sikkerhedshandsker. - Homogeniseres prøven ved 10.000 x g ved stuetemperatur, og supernatanten overføres til et nyt sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Tilsæt et tilsvarende volumen på 95% ethanol til røret og bland godt.
- Opløsningen overføres til en spinkolonne ( Materialetabel ) anbragt i etopsamlingsrørog centrifugeres ved 10.000 x g ved stuetemperatur. Kassér gennemstrømningen, og overfør spinsøjlen til et nyt opsamlingsrør.
- 400 μL RNA Pre-Wash reagens (Materialetabel) tilkolonnen og centrifugeres ved 10.000 x g ved stuetemperatur, før gennemstrømningen kasseres. Gentag dette trin endnu en gang.
BEMÆRK: For at forberede RNA Pre-Wash tilsættes 10 ml 95% ethanol til 40 ml RNA Pre-Wash koncentrat. - Der tilsættes 700 μL RNA-vaskebuffer(materialetabel)til kolonnen og centrifugeres ved 10.000 x g i 2 min ved stuetemperatur. Kolonnen overføres til et sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
BEMÆRK: For at forberede RNA Wash Buffer tilsættes 52 ml 95% ethanol til 12 ml RNA Wash Buffer koncentrat. - Eluer RNA-prøven, der er indfanget i spinkolonnematrixen med 100 μL nucleasefrit vand og centrifugerer ved 10.000 x g ved stuetemperatur.
- Koncentrationen af det ekstraherede RNA måles ved hjælp af et mikrovolumenspektrofotometer, og RNA fortyndes til en ønsket koncentration ved hjælp af nukleasfrit vand.
BEMÆRK: Den kvalificerede absorbansværdi af OD260/OD280 varierer fra 1,6 til 1,9, hvilket angiver den acceptable RNA-renhed for RT-LAMP-analysen. - Fortsæt straks til næste trin, eller opbevar prøven ved −80 °C, indtil den tages i brug.
3. Primer design
- Brug Primer Explorer version 4 til at designe de specifikke primere til RT-LAMP. Gå til webstedet, https://primerexplorer.jp/e/, og klik på PrimerExplorer V4-knappen.
- Vælg den fil, der indeholder sekvenserne af segment 3 i TiLV i FASTA-format, og klik derefter på knappen Primer design.
BEMÆRK: Hent sekvenserne i FASTA-format fra GenBank-tiltrædelsesnummeret KX631923, som repræsenterer tilapia søvirus TV1-segment31. - Hvis du vil designe primerne, skal du indtaste følgende grundlæggende parametre:
- Et GC-indhold på 40%-60%
- En amplicon på ≥280 basispar (bp)
- En tilsvarende smeltetemperatur (Tm) blandt primere med en maksimal forskel på 5 °C
BEMÆRK: Primerne må ikke supplere hinanden- Undgå sekvens regioner tilbøjelige til at danne sekundære strukturer.
- Vælg dimerprimeranalysen med et minimum på −3,5 for at opnå et optimalt design til den største ΔG, og vælg enderne af primerne med et maksimum på −4 for et optimalt design til den mindre ΔG.
- Klik på knappen Generer.
BEMÆRK: Når softwaren er færdig med at behandle inputdataene, vises primerresultaterne (figur 1).
4. RT-LAMP-analyse
- Der fremstilles en RT-LAMP-masterblanding indeholdende 2,5 μL 1x SD II-reaktionsbuffer, 3 μL på 6 mM MgSO4,1,4 μL af 1,4 mM dNTP-sæt, 4 μL på 0,8 M betain, 1,3 μL på 0,052 mM calceinblanding, 1 μL 1,6 μM TiLV-F3 primer, 1 μL af 1,6 μM TiLV-B3 primer, 1 μL af 0,2 μM TiLV-BIP primer, 1 μL af 0,2 μM TiLV-FIP primer, 1 μL 0,3 U Bst DNA polymerase, 1 μL af 0,1 U AMV omvendt transkriptase og 3,8 μL nuclease-frit vand pr. reaktion.
BEMÆRK: Der fremstilles overskydende mastermix, der omfatter mindst 10 % af det samlede reaktionsvolumen. - 22 μL af RT-LAMP-masterblandingen hældes i et sterilt 1,5 mikrocentrifugerør.
- 3 μL af det ekstraherede RNA til reaktionsrøret tilsættes, og prøven blandes ved vortexing. Til negativ kontrol anvendes destilleret vand i stedet for RNA-materialer.
- Reaktionen inkuberes ved 65 °C i 60 min, efterfulgt af 80 °C i 10 minutter for at afslutte reaktionen.
- Efter inkubation observeres de kolorimetriske ændringer med det blotte øje visuelt. Et positivt resultat vises som en fluorescerende grøn farve.
5. Agarose gel elektroforese
- Der fremstilles en 1,5% w/v agarosegel ved at suspendere 0,6 g agarosepulver i 40 ml 1x TAE buffer. Smelt blandingen ved at opvarme den i en mikrobølgeovn i 3-5 minutter, indtil agarose er helt opløst, og hvirvle at blande.
- Agarose skal køle af, indtil temperaturen når 65 °C. Hæld 40 ml agaroseopløsningen på en gelbakke og tilsæt en kam til gelformen.
- Lad agarosegelen indstille ved stuetemperatur i 20-30 min. Fjern derefter kammen og læg gelen i geltanken.
- Tilføj en løbebuffer til at dække gelens overflade i geltanken.
- 10 μL af RT-LAMP-prøven og 2 μL 6x gelbelastningsbuffer til hver brønd. Der tilsættes 5 μL af en 1 kb DNA-stige til referencebanen.
- Sæt låget i, der er fastgjort til katoden, og anoden, der er tilsluttet en strømforsyning. Tænd for strømforsyningen, sæt den til en konstant 100 V, og kør i 40 min.
- Når geladskillelsen er afsluttet, fjernes gelen fra gelbakken. Derefter plette den drænede gel ved hjælp af ethidium bromid (EtBr) i en koncentration på 10 mg /ml i 7 min og restain det i destilleret vand i 5 min.
FORSIGTIG: EtBr er giftigt og betragtes som kræftfremkaldende; Vær derfor forsigtig, når du bruger dette middel. - Udsæt gelen for UV-lys ved hjælp af et geldokumentationssystem, hvor båndene vises, og tag et billede af gelen.
6. Supplerende DNA -syntese (cDNA)
- Der fremstilles en cDNA-syntesemasterblanding indeholdende 2 μL 5x RT-buffer, 0,5 μL primerblanding, 0,5 μL RT-enzym og 2 μL nuklleasefrit vand pr. reaktion.
BEMÆRK: Forbered overskydende master mix bestående af 1x reaktionen på grund af potentielt tab under pipettering. - 5 μL af masterblandingen hældes i et sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- 100 ng af det fortyndede ekstraherede RNA (fremstillet af trin 2.8) til reaktionsrøret, blandes og spinned for at flytte hele blandingen til bunden af beholderen.
- Der inkuberes ved 42 °C i 60 min, efterfulgt af 98 °C i 5 min i en PCR-maskine. Opbevar cDNA'et ved −20 °C, indtil det bruges.
7. RT-qPCR
- Der fremstilles en TiLV qPCR-masterblanding indeholdende 0,3 μL af 10 μM omvendt primer, 0,3 μL 10 μM fremadgående primer, 5 μL 2x SYBR Green DNA polymerase og 0,4 μL nukleasfrit vand pr. reaktion. Brug følgende primere og kontrolelementer:
Fremadprimer (TiLV-112F): 5'-CTGAGCTAAAGAGGCAATATGGATT-3'
Omvendt primer (TiLV-112R): 5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT-3' - Dispenser 6 μL af TiLV qPCR-masterblandingen i hver brønd af qPCR-strimlen, der er kompatibel med den anvendte termiske cycler i realtid.
- Der tilsættes 4 μL af cDNA-skabelonen, negativ kontrol (nukleasefrit vand), positiv kontrol (10 pg/μL) og pTiLV (plasmid)10 eller seriefortyndet TiLV plasmid til brønden, og hver prøve blandes ved at svippe. Udtag hver prøve i tre eksemplarer.
- Placer qPCR-reaktionerne i den programmere termiske cycler i realtid. QPCR-programmet indstilles til at udføre inkubationen ved 95 °C i 3 min, efterfulgt af 40 cyklusser på 95 °C for 10 s og 60 °C i 30 sekunder, før smeltekurven trin, hvor temperaturen skal stige fra 65 °C til 95 °C ved 0,5 °C/5 s intervaller.
- Dataanalysen udføres ved at evaluere forstærknings- og smeltekurverne, og der beregnes derefter antallet af TiLV-kopier ved hjælp af den standardkurve, der er opnået ud af dataene ved hjælp af de seriefortyndede plasmider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne undersøgelse blev der udviklet en RT-LAMP-analyse til påvisning af TiLV-infektion i tilapia. De testede prøver blev indsamlet fra 14 gårde i forskellige dele af Thailand mellem 2015 og 2016. De inficerede og ikke-inficerede fisk var primært grupperet baseret på fysiske diagnoser og optrædener af symptomatisk TiLVD. TiLV-infektion blev efterfølgende bekræftet ved hjælp af RT-PCR efter indsamlingsprocessen. Agarose gel elektroforese og påvisning af en selvlysende grøn farve blev valgt som evalueringsmetoder af LAMP amplicons (Figur 2). Leveren og slim af de inficerede og ikke-inficerede tilapia fisk var karakteriseret ved den kliniske udseende TiLV sygdom symptomer, herunder huderosion, hud rødme, exophthalmos, og abdominal hævelse. Tidligere rapporter har vist, at der er brug af leverprøver i molekylærdiagnostiske analyser til bestemmelse af tilstedeværelsen af TiLV35. Alternativt kan slim være gavnligt i analysen, da det kan hjælpe med at undgå at dræbe dyrene. Resultaterne viste en stige-lignende DNA-bånd mønster og en fluorescerende grøn farve i den inficerede lever og slim prøver af inficerede fisk (Figur 2), mens ingen DNA-bånd og den gule farve calcein blev observeret i RT-LAMP blandinger i ikke-inficerede animalske væv (Figur 2). Interessant, en TiLV-inficeret tilapia prøve indsamlet fra en gård i Malaysia blev også diagnosticeret som positiv ved hjælp af denne RT-LAMP assay; Der blev dog observeret variationer i PCR-produktets størrelse i forhold til de prøver, der blev indsamlet fra lokale thailandske gårde (figur 2).
For at kontrollere RT-LAMP-analysens følsomhed og specificitet blev i alt 63 TiLV-inficerede væv og 63 ikke-inficerede væv analyseret ved hjælp af både RT-LAMP- og RT-qPCR-analyserne (tabel 1). En sammenligning af RT-qPCR- og RT-LAMP-analyserne af de inficerede prøver viste et positivt resultat i 63 (100 %) og 51 (80,95 %) af prøverne. Desuden viste en analyse af de ikke-inficerede prøver, at alle 63 ikke-inficerede væv gav negative resultater ved hjælp af både RT-qPCR- og RT-LAMP-analyser (tabel 1). Denne analyse viste pålideligheden af RT-LAMP-analysen til primær TiLV-detektion. For at teste rt-lamp-analysens specificitet blev væv fra fisk inficeret med andre patogene bakterier og vira, herunder Streptococcus agalactiae, Francisella noatunensis, Flavobacterium columnare, Aeromonas hydrophilaog Iridovirus brugt som skabeloner til RT-LAMP- og RT-qPCR-analyserne. Både RT-LAMP- og RT-qPCR-primerne gav negative resultater uden kolorimetriske ændringer og ingen fluorescerende signaler i nogen af de testede prøver (tabel 2). Desuden blev RT-LAMP-analysens følsomhed vurderet ved hjælp af en seriel 10-foldfortynding af RNA-skabelonerne udvundet af TiLV-inficerede fisk. Til sammenligning var RT-qPCR-analysen mere følsom end RT-LAMP-analysen, da RT-qPCR-analysen havde en detektionsgrænse på10-8, mens RT-LAMP-metoden krævede en10-7-foldfortynding for at detektere TiLV-genomet (tabel 2).
Figur 1. Nukleotidsekvenserne af de seks RT-LAMP primere, der anvendes i denne undersøgelse, og som var specifikke for påvisning af TiLV. Hver primers position blev justeret på segment 3 af TiLV-genomet (tiltrædelsesnummer KX631923). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Analyse af RT-LAMP amplicons fremstillet af TiLV-inficerede og ikke-inficerede prøver ( A)i 1,5% agarose gel elektroforese og (B) ved fluorescerende visualisering. M = 1 kb DNA-stige, 1-2 = RNA fra leveren af TiLV-inficerede fisk, 3-4 = cDNA af TiLV-inficerede fisk, 5-6 = RNA fra slim af TiLV-inficerede fisk, 7-8 = cellelinjer af TiLV-inficerede fisk, 9 = RNA fra leveren af TiLV-inficerede fisk (Malaysia), 10 = RNA fra leveren af ikke-TiLV-inficerede fisk, 11 = cDNA af ikke-TiLV-inficerede fisk, 12 = RNA fra slim af ikke-TiLV-inficerede fisk, 13 = ingen skabelon kontrol Klik her for at se en større version af dette tal.
| Typer af prøver | Antal prøver | Detektionsgyldighed (%) | |
| RT-qPCR delte et samarbejde med RT-QPCR. | RT-LAMPE | ||
| Inficerede prøver | 63 | 100.00 (63/63) | 80.95 (51/63) |
| Ikke-inficerede prøver | 63 | 0 (0/63) | 0 (0/63) |
Tabel 1. Verifikation af RT-LAMP til TiLV-påvisning i inficerede og ikke-inficerede fiskeprøver ved hjælp af RT-qPCR og RT-LAMP
| Specificitet | S.a. | F.N. | Fc. | A.h. | I.v. | |||||
| qPCR delte et andet spørgsmål til qPCR | Lampe | qPCR delte et andet spørgsmål til qPCR | Lampe | qPCR delte et andet spørgsmål til qPCR | Lampe | qPCR delte et andet spørgsmål til qPCR | Lampe | qPCR delte et andet spørgsmål til qPCR | Lampe | |
| – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | |
| Følsomhed | metode/ | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | 10-8 | 10-9 |
| Fortynding | ||||||||||
| qPCR delte et andet spørgsmål til qPCR | + | + | + | + | + | + | + | + | – | |
| Lampe | + | + | + | + | + | + | + | – | – | |
Tabel 2. RT-LAMP-analysens specificitet og følsomhed sammenlignet med RT-qPCR. Til specificitetsevalueringen blev RNA fremstillet af fiskevæv inficeret med andre bakterier eller vira, herunder Streptococcus agalactiae (S.a.), Francisella noatunensis (F.n.), Flavobacterium columnare (F.c.), Aeromonas hydrophila (A.h.) og Iridovirus (I.v.), brugt som skabeloner for RT-qPCR og RT-LAMP. Til følsomhedsevalueringen blev RNA fra TiLV-inficerede fisk 10 gange serielt fortyndet fra 100 ng til 1 fg og brugt som skabeloner til RT-qPCR og RT-LAMP. Tegnene + og – betyder henholdsvis positive og negative resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Akvakulturindustrien trues konstant af virusinfektioner , der forårsager betydelige økonomiske tab9,23,28. F.eks. udgør den nye TiLV en stor trussel mod tilapiaproducerende lande i mange dele af verden1,6,9. Indtil nu har der ikke været nogen specifik terapeutisk til rådighed for at forhindre TiLVD. Mens udviklingen af en vaccine er i gang, en effektiv vaccine vil kræve betydelig tid, før det er til rådighed til kommercielle formål. Under disse omstændigheder er det nødvendigt med strenge biosikkerhedsmålinger, såsom anvendelse af desinfektionsmidler, i dambrug for at forhindre spredning af TiLVD29,30. På nuværende tidspunkt er en af de mest effektive kontrolforanstaltninger til reduktion af TiLV-smitte screening af ungfisk og voksne for forekomst eller fravær af TiLV31. Til screeningsformål skal diagnosticeringsværktøjet være hurtigt, følsomt og specifikt, så det kan hjælpe med at eliminere inficerede populationer og forhindre yderligere spredning af sygdomme. De nuværende molekylære analyser for TiLV er imidlertid vanskelige at gennemføre på stedet. I første omgang kræver de dygtige forskere og dyrt udstyr. For det andet kan det tage flere dage at opnå laboratorieresultaterne, hvilket gør det vanskeligt at kontrollere og forhindre spredning af sygdom straks15,16.
For at løse disse problemer etablerede Notomi et al.14 en ny nukleinsyrebaseret forstærkningsanalyse kaldet loop-medieret isotermisk forstærkning (LAMP) i 2000. Lampens reaktion er siden blevet anvendt med succes til at detektere forskellige fiskevira16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,32,33,34. I denne undersøgelse udviklede vi en RT-LAMP protokol til at detektere TiLV i tilapia fiskeprøver. Selv om RT-LAMP-metodens følsomhed er 10 gange mindre effektiv end RT-qPCR's, kan RT-LAMP-analysen detektere tilstedeværelsen af et TiLV RNA-genom så lavt som 100 fg, hvilket er tilstrækkeligt til TiLV-påvisning hos klinisk syge fisk34. Især RT-LAMP assay giver et resultat inden for 60 min og kræver kun en simpel vandbad eller varmeblok instrumenter34, mens RT-qPCR assay tager længere tid og kræver dyrere real-time PCR udstyr til analyse15,34. Desuden blev slutproduktet af RT-LAMP observeret gennem en ændring i farven på fluorescerende farvestof fra lys gul til fluorescerende grøn, hvilket gør det synligt for det blotte øje uden krav om sofistikeret udstyr34. Disse fordele gør RT-LAMP velegnet til feltdiagnose. Desuden, undersøgelsens resultater antydede, at både lever og slim kan anvendes til TiLV detektion ved hjælp af RT-LAMP. I lighed med tidligere undersøgelser, en ikke-dødelige prøve ved hjælp af slim tilladt diagnosticering af TiLV uden at dræbe fisk eller værdifulde yngel35. For nylig, en RT-LAMP assay blev udviklet til at opdage kinesiske og thailandske isolater af TiLV nukleotid sekvenser i segment 1 (S1 region) ved hjælp af et sæt af seks primere36. Denne undersøgelse viste, at den udviklede RT-LAMP assay diagnosticeret en falsk-negativt signal om TiLV infektion på 27,78% i forhold til RT-PCR, når du bruger samme primer sæt. Ved nærmere sammenligning var det falsk-negative resultat relativt mindre på 19,05 %, når det ekfandt segment 3 af TiLV sammenlignet med RT-PCR. Når man sammenligner effektiviteten af den virale detektionsmetode med andre rapporter, vi var i stand til at opdage TiLV infektion på 80,95%, mens andre værker opdaget virus på 72,22%36 og 82,89%37. Alt i alt kan det være en hypotese, at de forskellige komponenter i RT-LAMP-analysen, f.eks.
Selv om RT-LAMP assay er et kraftfuldt værktøj til sygdomsscreening og har flere påviselige fordele, denne undersøgelse var ikke uden begrænsninger. Et af de kritiske punkter for RT-LAMP-analysen var udformningen af et passende primersæt bestående af fire til seks primere. For at fremme dannelsen af pcr-produkternes stamløkkestrukturer skulle de målrettede geners eller nukleotidsekvensers passende længder være længere end ca. 500 bp, mens de målrettede gener i RT-PCR-analysen skulle være relativt korte i intervallet 50-150 bp14,38,39.
Afslutningsvis vil jeg sige, at den udviklede RT-LAMP-analyse er hurtig, omkostningseffektiv, følsom og specifik til TiLV-detektion. Analysen kan gennemføres inden for 1 time sammenlignet med 4-5 timer for RT-qPCR-analysen. Rt-LAMP-analysen er især praktisk til feltforhold, da positive resultater kan observeres med det blotte øje uden at kræve brug af avanceret udstyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Projektet er finansieret af Thailand Research Fund (TRF) tilskud nummer RDG6050078 og Center for Advanced Studies for Landbrug og Fødevarer, Institut for Avancerede Studier, Kasetsart University, Bangkok, Thailand under Higher Education Research Promotion og National Research University Project of Thailand, Office of the Higher Education Commission, Ministry of Education, Thailand. Forskningen er delvist støttet af Graduate Program Scholarship fra Graduate School, Kasetsart University. Forfatterne vil gerne takke Dr. Kwanrawee Sirikanchana for den fortælling, der taler om videoen og Piyawatchara Sikarin for redigering af videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue collection: | |||
| Clove oil | Better Pharma | N/A | |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative option to clove oil |
| RNA extraction: | |||
| Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) | ThermoFisher Scientific Corp. | 15596026 | |
| Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol RNA Kit: | Zymo Research | R2071 | |
| - Direct-zol RNA PreWash | |||
| - RNA Wash Buffer | |||
| - DNase/RNase-free water | |||
| - Zymo-spin IIICG columns | |||
| - Collection Tubes | |||
| RT-LAMP: | |||
| 1x SD II reaction buffer | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP set | Bioline | BIO-39053 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| Calcein mixture | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst DNA polymerase | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV reverse transcriptase | Promega | M510A | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite dry bath incubator, single unit | Major Science | EL-01-220 | |
| Gel electrophoresis: | |||
| Agarose | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer: | |||
| - Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| - Acetic acid (glacial), EMSURE | Merck Millipore | 1000632500 | |
| - Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen | NeoScience Co., Ltd. | GR107 | |
| DNA gel loading dye (6X) | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| DNA ladder and markers | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) | Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC power supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Gel Doc EZ System | Bio-Rad | 1708270 | |
| UV sample tray | Bio-Rad | 1708271 | |
| NαBI imager | Neogene Science | ||
| cDNA synthesis: | |||
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis Technologies | cDSK01 | An alternative option for cDNA synthesis |
| NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR: | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| Nuclease-free water, sterile water | MultiCell | 809-115-CL | |
| 8-tube PCR strips, white | Bio-Rad | TLS0851 | |
| Flat PCR tube 8-cap strips, optical | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1855196 | |
| General equipment and materials: | |||
| Mayo scissors | N/A | ||
| Forceps | N/A | ||
| Vortex Genie 2 (vortex mixer) | Scientific Industries | ||
| Microcentrifuge LM-60 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE mini microcentrifuge | Corning | 6765 | |
| Pipettes | Rainin | Pipete-Lite XLS | |
| QSP filtered pipette tips | Quality Scientific Plastics | TF series | |
| Corning Isotip filtered tips | Merck | CLS series | |
| Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST | Wuxi NEST Biotechnology | 615601 |
References
- Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
- Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
- Adams, M. J., et al. Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017). Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).
- Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), 00431 (2016).
- Jaemwimol, P., et al. Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection. Aquaculture. 497, 462-468 (2018).
- Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Rome, Italy. (2017).
- Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Genome Announcements. 6 (26), (2018).
- Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets. Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).
- Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by 'summer mortality' syndrome. Aquaculture. 473, 430-432 (2017).
- Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
- Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture. 497, 184-188 (2018).
- Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
- Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture. 476, 111-118 (2017).
- Notomi, T., et al.
- Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).
- Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal. 2, 83 (2005).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).
- Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS). Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).
- Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).
- Shivappa, R. B., et al. Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).
- Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).
- Chinabut, S., Puttinaowarat, S. The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products. Developmental Biology. 121, 255-261 (2005).
- Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine. Aquaculture. 512, 734342 (2019).
- Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).
- Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry. Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).
- Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Aquaculture. 507, 35-39 (2019).
- Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture. 486, 75-80 (2018).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Khan, R. S. A., et al. Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis. Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
- Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. The influence of amplicon length on real-time PCR results. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).
