Summary
אנו מציגים שיטה לחקור שינויים אוסטאופתית מוקדם ברמה התאית בסחוס הפרקולריות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).
Abstract
תכונות ביומכאניות של תאים ורקמות לא רק לווסת את צורתם ואת התפקוד אלא גם חיוני לשמירה על החיוניות שלהם. שינויים אלסטיות יכול להפיץ או להפעיל את תחילתה של מחלות גדולות כמו סרטן או אוסטיאוארתריטיס (OA). המיקרוסקופיה של הכוח האטומי (AFM) התפתחה ככלי חזק לאיכות ולכימות המאפיינים את התכונות הביומכאניות של מבני יעד ביולוגיים ספציפיים בקנה מידה מיקרוסקופי, כוחות מדידה בטווח מ קטן כמו piconewton אל מיקרואוטון. תכונות ביומכאניות הן בעלות חשיבות מיוחדת ברקמות שריר השלד, אשר חשופים לרמות גבוהות של מתח. OA כמחלה ניוונית של הסחוס תוצאות השיבוש של המטריצה הפראיסלנדי lular (PCM) ואת הסידור המרחבי של כונדרוציטים מוטבע מטריצה החילוץ שלהם (ECM). שיבוש PCM ו ECM כבר שויך שינויים בתכונות הביומכאניות של סחוס. במחקר הנוכחי השתמשנו AFM לכמת את השינויים האלה ביחס השינויים דפוס מרחבית ספציפיים של כונדרוציטים. עם כל שינוי דפוס, שינויים משמעותיים אלסטיות נצפו עבור ה-PCM ו-ECM. מדידת האלסטיות המקומית ובכך מאפשרת רישום מסקנות ישירות על מידת ניוון רקמות מקומיות OA.
Introduction
הסחוס הנמק העצם. הוא רקמה מיועלת כונדרוציטים בדלילות לייצר, לארגן, ולשמור על מטריצה החילוץ ולקיבולת (ECM) שאליו הם מוטבעים. כחלק ברור ומיוחד של ECM, כונדרוציטים מוקפים בשכבה דקה של מטריצה מיוחדת המכונה מטריצה הפראיסלנדי lular (PCM). ה-PCM משמש ממשק מטריצות של מטריצת תאים1 המגן על כונדרוציטים2 ומודול התגובה הביוסינתטית שלהם3. כפי שתוארה בעבר4, ב סחוס בריא, כונדרוציטים מסודרים דפוסים ספציפיים, ברורים מרחביים, כי הם ספציפיים עבור כל שכבת רקמה משותף4,5 ותלוי במנגנון משותף ספציפי הטעינה מכני6. דפוסים אלה משתנים מזוגות ומיתרים בסחוס בריא כדי כפול מחרוזות עם תחילתה של אוסטיאוארתריטיס (OA). עם התקדמות נוספת של המחלה כונדרוציטים הטופס אשכולות קטנים, הגדלת בהדרגה בגודל לאשכולות גדולים OA מתקדם. אובדן מוחלט של כל מבנה ארגוני אינדוקציה של אפופטוזיס הוא נצפה בסוף השלב OA. כך, הסדר הסלולר כchondrocyte יכול לשמש כסמנים מבוססי תמונה עבור התקדמות OA4.
תכונות ביומכאניות של תאים ורקמות לא רק לווסת את צורתם ואת התפקוד אלא גם חיוני לשמירה על החיוניות שלהם. שינויים אלסטיות יכול להפיץ או להפעיל את תחילתה של מחלות גדולות כמו סרטן או OA. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) התפתחה ככלי רב-עוצמה לאפיון ולכימות המאפיינים הביומכאניות של מבני יעד ביולוגיים ספציפיים בקנה מידה מיקרוסקופי, מדידת מגוון רחב של כוח, מ piconewton ל מיקרוקטון. היישום העיקרי של AFM הוא למדוד את הטופוגרפיה פני השטח ותכונות מכניות של דגימות ברזולוציה subnanometer7. התקן המדידה כולל שלושה מרכיבים עיקריים: 1) בדיקה AFM, שהיא עצה חדה הנטענת על הזיז ומשמשת לאינטראקציה ישירה עם פני השטח של המדגם. כאשר הכוח מוחל על הזיז, העיוות של האחרון מתרחש על פי המאפיינים של רקמת נמדד. 2) מערכת אופטית המשעלת קרן לייזר על הזיז, המשתקף לאחר מכן ליחידת מגלאי. 3) גלאי פוטודיודה התופס את האור החוצה מהזיז. הוא ממיר את המידע שהתקבל על הסטה לייזר על ידי הזיז לתוך עקומת כוח שניתן לנתח.
לפיכך, העיקרון העיקרי של AFM הוא גילוי של הכוח הפועל בין הבדיקה AFM ואת מבנה היעד של המדגם. עקומות הכוח השיגו לתאר את התכונות המכאניות של מבני היעד על פני השטח לדוגמה כמו גמישות, הפצת הטעינה, מגנטיזציה, מתח התשואה, ואת עיוות פלסטיק אלסטי הדינמיקה8. יתרון חשוב של AFM על טכניקות דימות אחרות היא כי AFM ניתן להשתמש כדי למדוד את התכונות המכאניות של תאים חיים בינונית או רקמות במצב מקורי מבלי לפגוע ברקמה. AFM יכול לפעול הן בתנאי נוזלי או יבש. אין דרישה להכנה לדוגמא. AFM מספק את האפשרות לדמות דגימה ולמדוד את תכונותיו המכאניות בו זמנית בדגימות הסמוכות לתנאים פיזיולוגיים. במחקר הנוכחי אנו מתארים גישה הרומן להעריך התקדמות OA על ידי מדידת האלסטיות של ה-PCM ו ECM בסחוס מקורי המתאר. המתאם של הארגון המרחבי של כונדרוציטים עם מידת ניוון רקמות מקומיות מספק פרספקטיבה חדשה לחלוטין לגילוי מוקדם של OA. עם זאת, הרלוונטיות הפונקציונלית של תבניות אלה לא הוערכו עד כה. מכיוון שתפקידה העיקרי של הסחוס הראשי הוא טעינת הנושאת בחיכוך נמוך, הרקמה חייבת להיות בעל תכונות אלסטיים. AFM מאפשר למדוד לא רק את האלסטיות של ECM אלא גם של דפוסי הסלולר מרחבי מוטבע ב-PCM שלהם. המתאם הנצפה של אלסטיות עם שינוי דפוס מרחבי של כונדרוציטים הוא כל כך חזק מדידת אלסטיות לבד יכול לאפשר ריבוד של ניוון רקמות מקומיות.
אלסטי מודולים של ה-PCM ו ECM העריכו בסעיפים 35 μm-דק באמצעות מערכת AFM משולב לתוך מיקרוסקופ לעומת שלב הפוכה שאיפשר ויזואליזציה סימולטני של דגימת הסחוס. פרוטוקול זה מבוסס על מחקר כבר פורסם מהמעבדה שלנו9 ובמיוחד מתאר כיצד לאפיין את ההסדר המרחבי של כונדרוציטים וכיצד למדוד את האלסטיות של ה-PCM שלהם ו-ecm הקשורים. עם כל שינוי דפוס של כונדרוציטים, שינויים משמעותיים אלסטיות יכול גם להיות נצפתה הן PCM ו-ECM, המאפשר טכניקה זו כדי לשמש ישירות למדוד את השלב של ניוון של הסחוס.
גישה זו מאומתת פותחת דרך חדשה להערכת התקדמות OA והשפעות טיפוליות בשלבים המוקדמים לפני השפלה רקמות מאקרוסקופי למעשה מתחיל להופיע. ביצוע מדידות AFM באופן עקבי הוא תהליך מפרך. בפרוטוקול הבא נתאר כיצד להכין את המדגם שנמדד על ידי AFM, כיצד לבצע את מדידות AFM בפועל החל בהכנת הזיז, כיצד לכייל את ה-AFM, ולאחר מכן כיצד לבצע את המידות. הוראות שלב אחר שלב נותנות גישה ברורה ותמציתית כדי לקבל נתונים אמינים ולספק אסטרטגיות בסיסיות לעיבוד ולפענוח זה. סעיף הדיון מתאר גם את החסרונות הנפוצים ביותר של שיטה קפדנית זו ומספק עצות מועילות לפתרון בעיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דגימות הסחוס האנושי הושגו מחולים שעברו מפרק הברך הכולל במחלקה לכירורגיה אורתופדיים של בית החולים של האוניברסיטה של טואבינגן, גרמניה, וויגעופר-בית חולים, רוטנבורג a.N., גרמניה, עבור השלב הסופי OA של הברך. אישור מחלקתי מלא, מוסדי, והוועדה אתית מקומית התקבלו לפני תחילת המחקר (מספר פרוייקט 674/2016BO2). הסכמה מושכלת בכתב התקבלה מכל המטופלים לפני השתתפות. השיטות בוצעו בהתאם להנחיות שאושרו.
1. הכנה לדוגמא
- הכנת הסחוס להקפאה
- כדי להעריך שינויים ניווניות במפרק הברך, לקחת דגימות סחוס המוח המתקבל מהאזור הנושאת העומס של condyles הירך לאחר כריתת רקמות מהחולים.
הערה: דגימות שנחקרו עדיין צריך להכיל לפחות שכבה דקה של עצם subchondral כדי לאפשר זיהוי ברור של התמצאות רקמות ביחס למשטח הפנימי והחיצוני, ובכך גם לאפשר הקציר רקמה סטנדרטית של שכבת הסחוס העליון. הסחוס יכול לשמש מדידות AFM עד 24 שעות לאחר הניתוח. הרקמה יכולה להיות מאוחסן סרום ללא שינוי מדיום של הנשר שונה של העיט (DMEM) עם 2% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין ו 1.2% (v/v) אמפוריטיצין B לפני השימוש. אחסון הדגימות עבור יותר מ -24 שעות יכול לגרום לפריטים במדידות AFM בשל נפיחות ברקמות, עם זאת. - חותכים את הסחוס הפרקולארית כמכלול מעצם subchondral בעזרת אזמל ולאחר מכן להטביע את דגימת הסחוס במדיום הטבעה מסיסים במים על כפתור קריוטומה כי קופא תחת טמפרטורה נמוכה במכשיר קריוטום.
הערה: המדיום הקפוא מייצב את הרקמה שהיא עוטפת. זה גם התוצאה הקפאה של דגימת הסחוס יחד עם מדיום הטבעה. כאשר חותכים את הסחוס מן העצם, לעקוב אחר כיוון הרקמה. הרקמה המוטבעת עבור הקריודורים חייב להיות ממוקם בצורה כזאת, כי השכבה העליונה (כלומר, משטח פרקיות) של הסחוס פונה ללהב. שימו לב כי הרקמה צריכה להיות מכוסה לחלוטין על ידי מדיום הטבעה.
- כדי להעריך שינויים ניווניות במפרק הברך, לקחת דגימות סחוס המוח המתקבל מהאזור הנושאת העומס של condyles הירך לאחר כריתת רקמות מהחולים.
- קריוטום שאיפה של הסחוס
- באמצעות קריוטומה סטנדרטי, מקטע את הרקמה בעובי של 35 יקרומטר מן השכבה העליונה (כלומר, משטח פרקיות) של הסחוס הפרקולארית המוטבע במדיום הטבעה מסיסים במים קפואים.
הערה: בסך הכל, עד 300 יקרומטר (המתאים לתשעה מקטעים) ניתן להגדיר ולהשתמש בהם לניתוח. המגבלה המוצעת של 300 יקרומטר מקבילה לעומק החדירה החזותית שניתן בדרך כלל לקבל עם מיקרוסקופ הזריחה בסחוס ההיאלין כגון סחוס הפרקולארית. כך, ניתן למיין את הסחוס על פי התבנית המרחבית מקומי השולט ולאחר מכן למדוד דפוסים אלה בסעיפים המתאימים. - לאסוף את הסעיפים על שקופית זכוכית ולשטוף את סעיפים 3x עם מלוחים באגירה פוספט (PBS) כדי להסיר את מדיום הטבעה מסיסים במים.
- באמצעות קריוטומה סטנדרטי, מקטע את הרקמה בעובי של 35 יקרומטר מן השכבה העליונה (כלומר, משטח פרקיות) של הסחוס הפרקולארית המוטבע במדיום הטבעה מסיסים במים קפואים.
- הדבקת חתכי סחוס על צלחת פטרי תואמת AFM
הערה: מכיוון ש-AFM אוסף נתונים על-ידי כניסה מכנית על המדגם, הסעיפים צריכים להיות קבועים במקום כדי לאפשר מדידות מדויקות.- הדבק בעדינות את החלקים העבים של 35 יקרומטר עם דבק מדגם ביולוגי על מנות תרבות הרקמה התואמות להתקן afm. כדי לעשות זאת, לקחת 2-3 טיפות של הדבק ולשים אותם על הצלחת תרבות הרקמה במקום שבו קצה המקטע יהיה בסופו של דבר. עכשיו לשים את סעיף הסחוס על הדבק ולאפשר לו לדבוק בחוזקה על פני השטח של הצלחת תרבות רקמות.
הערה: מקטעים עבים של 35 יקרומטר של הסחוס החילין אינם נוטים מאוד סלסול. עם זאת, אם הסלסול מתרחש בעת הסרת דגימות מתוך המדיום מאגר, ודא כי כמעט נוזל ככל האפשר מקלות לדגימות. ברגע עודף המים מתייבש, הפיצו ישירות את הרקמה על הכתמים המפוזרים של הדבק כך שהוא יתוקן אל פני השטח של הצלחת תרבות התא. הדבק מוחל בשכבה דקה רק בקצות הדגימה ולא במקטע כולו. למדוד רק את החלק הזה של המדגם כי הוא רחוק מהאזור מודבק כדי לחסל את האפשרות של הדבק מפריעה המידות. - מודטת את הסעיפים בטמפרטורת החדר (RT) עבור 2 דקות כדי לאפשר את הדבק והרקמה להיקשר כראוי. לאחר מכן לכסות את הסעיפים עם L-15 בינוני של ליבוביץ ללא L-גלוטמין וללא נתרן ביקרבונט, כך שהם שקועים לחלוטין.
הערה: תנועות פתאומיות של המדגם במהלך קיבעון או יישום דבק מספיק הם טעויות נפוצות כי התוצאה של ניתוק הרקמה מן הצלחת התרבות. יתרה מזאת, יש לבצע את המדיום ליבוביץ בצורה עדינה, כדי לא לנתק את המדגם מהמשטח עקב "גלים" שנוצרו על-ידי המדיום. - הניחו את צלחת הפטרי עם הסעיפים המודבקים בחממה הסטנדרטית לתרבות התא ב-37 ° צ' עד לביצוע המדידות.
הערה: ודא שמקטעי הרקמה יציבים ואינם מתנתק מפני השטח של המנה התרבותית של הרקמה על-ידי ביצוע כל צעד באיטיות.
- הדבק בעדינות את החלקים העבים של 35 יקרומטר עם דבק מדגם ביולוגי על מנות תרבות הרקמה התואמות להתקן afm. כדי לעשות זאת, לקחת 2-3 טיפות של הדבק ולשים אותם על הצלחת תרבות הרקמה במקום שבו קצה המקטע יהיה בסופו של דבר. עכשיו לשים את סעיף הסחוס על הדבק ולאפשר לו לדבוק בחוזקה על פני השטח של הצלחת תרבות רקמות.
2. הכנת זיז (הדבקת המיקרו-ספירות)
- הכנת התקן AFM ודילול המיקרוספירות
- מניחים את הזיז על בלוק הזכוכית שצוין עבור מדידות האוויר, לתקן את זה עם האביב, ו הר את גוש הזכוכית על הראש AFM.
- לדלל את המיקרוספירות ב 100% אתנול (100 חלקיקים/10 μL) ו ultrasonicate עבור 10 s, כך המיקרוספירות מופרדים ולא לקבץ יחד.
- הכנת הכיוונון להדבקה
- נקה שקופית זכוכית עם 70% אתנול ולטעון אותו על מחזיק המדגם במכשיר AFM.
הערה: ניקוי השקופית מונע כתמים של אבק שעלולים להפריע לתהליך ההדבקה מצבירת במשטח השקופית. - מקום 2 μl של ההשעיה המיקרוספירה באמצע השקופית ו 2 μl של דבק ליד ההשעיה ננו-ספירה.
הערה: הצבת ההשעיה המיקרוספירה ודבק קרוב זה לזה מומלץ לאפשר מעבר מהיר של הזיז בין הדבק לבין המיקרוספירות. אם המעבר בין לטבול את הזיז לתוך הדבק ויצירת קשר עם מיקרוספירה ארוך מדי, הדבק יהיה בסופו של דבר הקשה, ובכך לאבד את התכונות דבק שלו. - תנו לאתנול להתייבש במיקרו-כדור באוויר, ולהשאיר את המיקרוספירות במקום.
- נקה שקופית זכוכית עם 70% אתנול ולטעון אותו על מחזיק המדגם במכשיר AFM.
- הדבקת המיקרוספירות בקצה הזיז
- טובלים את הזיז באופן ידני לתוך הדבק בעזרת מנוע stepper ב 10 יקרומטר שלבים עד הקצה מכוסה על ידי דבק. בצע צעד זה במהירות, כאשר הדבק מתייבש מהר.
- למשוך את הזיז שוב על ידי 100 μm, להעביר אותו לכיוון המיקרוספירות, ולמקם את קצה הזיז ישירות מעל מיקרוספירה אחת.
- הפעל מדידה של כוח ספקטרוסקופיית כדי לטבול את קצה הזיז על המיקרו-ספירה שנבחר עם הפרמטרים המוצגים בטבלה 1.
הערה: על-ידי ביצוע שלב זה, מדידת משטח המיקרוספירה משמשת ליצירת קשר בין הקצה של הזיז לבין המיקרו-ספירה. זמן יצירת הקשר הארוך יחסית המוצג בטבלה 1 מאפשר זמן מליטה בשפע בין הדבק למיקרו-ספירה. עקומת מרחק הכוח המתקבל במהלך שלב זה נוצרת כתוצר למעלה של הדבקת המיקרו-ספירה על קצה הזיז ואינה מעובדת לצורך ניתוח נוסף. - לאחר מיקרוספירה מחוברת הזיז, למשוך את בלוק זכוכית עם הזיז רכוב על גבי ולאחר מכן להסיר את הראש AFM מן המיקרוסקופ. לבסוף, בטל את הטעינה של בלוק הזכוכית והזיז מראש AFM.
- מודאת הזיז ב 65 ° c עבור 2 h ולתת לו להתייבש לילה בשעה RT לפני תחילת המידות.
הערה: הדגירה של הזיז מגביר את תכונות הדבק של ההדבקה, והוא מחזק את מתחם המיקרו-מיקרוספירה.
3. הכנת מכשיר AFM למדידות
- כוונן בלוק זכוכית שצוין למדידה בסביבה נוזלית על מחזיק AFM כך שהמשטח העליון יהיה ישר ומקביל למחזיק AFM.
- בעזרת מלקחיים, לטעון בזהירות את הזיז הנבחר על פני השטח של בלוק זכוכית, כך את הטיפ AFM עם המיקרוספירה בולט מעל המישור האופטי מלוטש.
הערה: הקצה של הזיז צריך לבלוט מעל המישור המלוטש כדי שיוכל לשקף את לייזר ה-AFM בגלאי התמונות. להיות זהיר מאוד כאשר הצבת את הזיז על AFM כדי לא לשרוט את המשטח האופטי מלוטש של בלוק זכוכית. גירוד בבלוק הזכוכית עלול לגרום לקשיים בהתאמת היישור לייזר ועלול להפריע למידות הבאות. - , כי הזיז יהיה כפוף ללחץ מכני. צריך לתקן אותו במקום ייצוב הזיז על בלוק הזכוכית על ידי הזזת המעיין המתכתי לתוך החריץ של הבלוק והסטת החלק העליון של הזיז עם המעיין בעזרת מלקחיים.
- מניחים בזהירות את בלוק הזכוכית עם הזיז על הראש AFM ולאבטח אותו עם מנגנון נעילה משולב. ודא שהאביב פונה לצד שמאל כך שהזיז מוצב בכיוון הנכון. ואז לטעון את ראש AFM עם הזיז על המכשיר AFM.
4. טעינת המדגם והכיול של הזיז
הערה: כאן, כיול המכשיר מבוצע על-ידי הפעלת עקומת כוח על פני השטח הנקי של צלחת פטרי המלאה במדיום של ליבוביץ ' ללא כל רקמה לדוגמא. ניתן גם לבצע כיול באמצעות צלחת שליטה נפרדת AFM מלא רק עם מדיום AFM ללא המדגם.
- טעינת המדגם בהתקן AFM
- מניחים את צלחת פטרי מוכן בשלב 1.3.3 על מחזיק דגימת AFM.
- הפעל את מחמם כלי פטרי והגדר אותה ב-37 ° c. אפשר לצלחת תרבות הרקמה להגיע לטמפרטורה אופטימלית (כלומר, 20 דקות).
- מניחים נייר הגנה על בסיס מכלול הזיז כדי למנוע עיבוי של בינוני בראש AFM.
- כיול ההתקן
- פתח את התוכנה (טבלת חומרים), ואחריו חלון יישור לייזר, והחלון המתאר את הגדרות הפרמטרים של הגישה. ואז להפעיל את מנוע stepper, אור לייזר, ואת CCD-מצלמה.
- השתמש CCD-מצלמה במיקרוסקופ כדי להמחיש ולזהות את הזיז. באמצעות הפונקציה stepper המנוע, להנמיך את הזיז בשלבים 100 יקרומטר עד הזיז הוא לגמרי שקוע במדיום.
הערה: מיזוג המשנה של הזיז בנוזל ניתן לזיהוי חזותי באמצעות מצלמות CCD. כאשר הוא שובר את פני המים, קצה הזיז יוצר בקלות השתקפויות מעגליות במים. - לכוון את הלייזר על גבי הזיז באמצעות בורגי ההתאמה.
הערה: אין למתוח את הברגים, מאחר שפעולה זו תגרום נזק למנגנון יישור הלייזר. הזיז מוצג מלמטה וקרן הלייזר מגיעה מלמעלה. - לאחר הלייזר ממוקם על הזיז, להתאים את קרן הלייזר בעזרת ברגים במכשיר AFM, כך הקרן משתקף נופל על מרכז הגלאי. המשיכו לעקוב אחר מיקום קרן הלייזר באמצעות הפונקציה ליישור לייזר.
הערה: הגלאי מרים את הסטיה של קרן הלייזר המשתקף על ידי הזיז וממיר אותו לאות חשמל. - לאחר התאמת מסדר הלייזר, האות ' סכום ' חייב להיות 1 V או מעלה, בעוד שהdefלרוחב והאנכי חייבים להיות קרובים ל-0. אם ערכים אלה לא מתקבלים, התאימו את מזהה התמונה.
- קבלת עקומת כוח הכיול
- על מנת להגיע אל פני השטח על מנת AFM להתחיל את המידות, להפעיל גישה סורק עם הגישה פרמטרים שניתנו בטבלה 2. לאחר התחתון של הצלחת תרבות הרקמה הוא הגיע, למשוך את הזיז על ידי 100 μm.
הערה: בשלב זה הגשוש הוא בדיוק 100 יקרומטר מעל מהחלק התחתון של הצלחת תרבות הרקמה. - הגדר את הפרמטרים של ההפעלה והתאם את הפרמטרים המוצגים בטבלה 3. לחץ על לחצן הפעלה כדי להפעיל מדידה ולקבל עקומת כיול של מרחק.
הערה: עקומת הכוח המתקבלת כאן מוצגת באיור 1. - בעקומת מרחק של כיול, בחר את האזור להתאמה ליניארית של העקומה המ, בתוכנה.
הערה: ההתאמה הליניארית נעשית כדי למדוד את רגישות הזיז. לאחר ההתאמה הליניארית נמצאת במקום, הערכים יישמרו על-ידי התוכנה. המדידה המתמדת של האביב או הרעש התרמי של הזיז מחושבת על ידי התוכנה לאחר מכן. - ככל שהמדידות מתבצעות בטמפרטורה של 37 ° c, קבעו את משתנה הטמפרטורה ב-37 ° c בתוכנה לחיקוי התנאים הפיסיולוגיים הקרובים ככל האפשר.
הערה: בתום הכיול, הסטיה האנכית נשמרת ומוצגת ביחידת הכוח, ניוטון (N), במקום וולט (V), שהיא יחידת הרישום המקורי של גלאי הפוטודיודה.
- על מנת להגיע אל פני השטח על מנת AFM להתחיל את המידות, להפעיל גישה סורק עם הגישה פרמטרים שניתנו בטבלה 2. לאחר התחתון של הצלחת תרבות הרקמה הוא הגיע, למשוך את הזיז על ידי 100 μm.
5. אפיון ביומכאני של ECM ו-PCM על-ידי ביצוע מדידות אלסטיות באמצעות AFM
- זיהוי דפוסי כונדרוציטים בחלק הסחוס
- שימו לב בסעיף הסחוס תחת מיקרוסקופ הניגודיות פאזה משולבים במערכת AFM ולזהות את דפוסי הסלולר הספציפיים10 של סחוס משני מתוך הברך האוסטאופתית: מחרוזות בודדות (שטחים רקמה בריאים), מחרוזות כפולות (מתחיל ניוון רקמות), אשכולות קטנים וגדולים (שניהם ניוון רקמות מתקדם). ראה איור 2א – ד.
- לאחר שהתבנית הרצויה מזוהה, למדוד שני אתרים לכל תבנית שנבחרה לכל סוג מטריצה (PCM או ECM) ולבצע תשע חזרות מדידה על כל אתר מדידה (איור 2E, F). ודא שגודל המדגם גדול מספיק כדי להסביר אי-דיוקים אפשריים.
הערה: עבור מדידות ה-PCM, הצב את הזיז בסמיכות לתאים (כפי שמוצג על-ידי העיגולים האדומים באיור 2E, F). כדי לבצע מדידות של ECM, בחר אזור ללא תאים (המוצג על-ידי האזור הכחול באיור 2E, F) ובצע את ההזחה כמתואר בשלב 5.2.
- הזחה של אתר היעד
- בצע גישה ואחריו הכחשה כך הזיז ממוקם 100 יקרומטר מעל הרקמה, אשר יהיה המיקום ההתחלתי עבור המידות העוקבות.
- התמקד ב-PCM או ב-ECM של התבנית שיש למדוד ולתקן את עכבר המחשב בנקודה זו.
הערה: העכבר ישמש כסמן חזותי עבור אתר היעד של הכניסות. ברגע שהמוקד משתנה לקצה הזיז, מבני הרקמה יהפכו להיות זהים או מטושטשים. - עכשיו להתמקד במכשיר ולהעביר את קצה הגשוש לנקודה שתוקנה בעבר על ידי חץ המחשב. לאחר מכן, הפעל את המידות בהפעלה, תוך שימוש בפרמטר נקודת הערכה שהושג על-ידי כיול של הזיז.
הערה: עקומת כוח למופת שמתקבלת ממדידת ה-PCM של מחרוזת אחת מוצגת באיור המשלים 1.
6. עיבוד נתונים
הערה: ניתוח הנתונים או קביעת מודול האלסטי מבוצע באמצעות מודל הרץ כמתואר בעבר11,12. צורתו של הכניסה הייתה כדורית בשל השימוש במיקרו-כדורים על הקצה ויחס הפואסון נשמר ב-0.5 בהתבסס על הספרות הקודמת13,14,15.
- פתח את תוכנת עיבוד הנתונים (טבלת חומרים) התואמת לנתונים שהתקבלו מהתקן afm.
- בחרו בדגם הרץ בתוכנה לעיבוד עקומות מרחק הכוח. הגדר את יחס הפואסון ב-0.5 ובחר את צורת הקצה כדורית ורדיוס קצה של 12.5 μm.
- לאחר כל הפרמטרים מותאמים, התוצאות מותאמות, ואת מודולוס של צעירים מחושב ומוצג על ידי התוכנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאורך המודל הphysiopathological ממחרוזות למחרוזות כפולות, קטן ולבסוף לאשכולות גדולים, הן ECM (איור 3A) ו-PCM (איור 3a) אלסטי מודולים ירד באופן משמעותי בין כל שינוי דפוס. החריג היחיד היה ההבדל ב-ECM בין מחרוזות למחרוזות כפולות (p = 0.072). התוצאות מראות כי יחס ECM/PCM (איור 4B) לא השתנה באופן משמעותי, ואילו ירידה מסומנת בהבדלים המוחלט באלסטיות בין ecm ו-PCM נצפתה (איור 4b). יתרה מזאת, התוצאות אינן מציגות כל קשר משמעותי בנוגע ליחס ECM/PCM או שינויים סלולריים מרחביים (r =-0.099, p = 0.281).
איור 1: ייצוג סכמטי של עקומת מרחק כוח במצב יצירת קשר AFM. כאשר הגשוש מתקרב לפני השטח, הכוחות קטנים מדי כדי לתת הטיה מדידה של הטיפ בתחילה, ובכך להשאיר את הקצה במקומו ללא הפרעה (1). לאחר מכן, כאשר הזיז הוא קרוב מאוד למדגם, בשל כוחות דבק פעיל בין הקצה לבין הגשוש, הזיז במהירות מצמיד לעבר המדגם (2). כאשר הגשוש מתקרב למדגם, הסטיה הדוחה מתקרבת לתנועה של כיוון, עם תפקוד כמעט ליניארי של גובה והטיה עד שהסטיה האנכית מגיעה לערך נקודת ההגדרה היחסית (3). כאשר הזמן נסוג (4), בנוסף על הפחתת כוחות ההסיט, כוחות הדבקה נמצאים גם בזמן שהזיז נסוג בציר Z מהמדגם. כמו הבדיקה AFM משכה את הקשר עם המדגם, זה הראשון מקבל "תקוע" לפני שהוא מסוגל להשתחרר מן הדבקה בממשק, אפילו המוביל הסטה שלילית קצרה של הזיז, לפני שהוא מגיע שוב מעמדה ניטרלי מכופף ללא קשר עם הגשוש (5). מידת הטיה באה לידי ביטוי בכוח העבודה על הזיז, המבוטא בידי nanonewtons. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: האפיון המרחבי של כונדרוציטים ומדידות AFM של מטריצת החילוץ (ECM) ופראיסלנדי לבלר (PCM). (A-D) אפיון דפוסי הסלולר:מיתרים (א), מחרוזות כפולות (ב), אשכולות קטנים (C) ואשכולות גדולים (D). מודולים אלסטי של PCM (עיגולים אדומים) ו ECM (אזור כחול) (E/F) העריכו את דפוסי הסלולר שונים הסחוס האוסטדלקת. אתרי מדידה עבור ECM ו-PCM נבחרו על ידי הנסזנה ומסומנים בצורה גרפית על-ידי צלבים שחורים. קצה הזיז המשמש את המידות מסומן על-ידי כוכב לבן. סרגלי קנה מידה מייצגים 10 יקרומטר (A-D) ו-100 יקרומטר (E/F). הדמות מותאמת ומשתנה מ Danalache ואח '9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השוואה בין המודוללי הצעירות של מטריצת החילוץ (ECM) והמטריצה הפראיסלנדי (PCM) כפונקציה של ארגון כchondrocyte מרחבי. עם ארגון כונדרוציטויום פתולוגי מתקדם, ירידה הדרגתית של אלסטיות צוין במגרשים עבור ECM (a) ו-PCM (ב) (* p < 0.05, * * * p < 0.001). קיצורים: SS: מחרוזות בודדות, DS: מחרוזות כפולות, SC: אשכולות קטנים, לפנה ס: אשכולות גדולים. הנתונים נלקחים מ Danalache ואח '9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מערכת היחסים של הצעירים מודוללי של מטריקס החילוץ (ECM) ואת המטריצה הפראיסלנדי (PCM) כפונקציה של ארגון מרחבי הסלולר. ארגון כchondrocyte פתולוגי והולך להיות מקושר עם ירידה של המודוללי של הצעירים עבור ECM ו-PCM (א). בעוד ששינויים מרחביים אלה המתרחשים, היחס של אלסטיות ECM ו-PCM נשאר קבוע, ולא מראה שינויים משמעותיים (ב). הנתונים מוצגים כדיאגרמת קו עם שגיאה ממוצע של ± סטנדרטי (a) ומגרשים(ב). קיצורים: SS: מחרוזות בודדות, DS: מחרוזות כפולות, SC: אשכולות קטנים, לפנה ס: אשכולות גדולים. הנתונים נלקחים מ Danalache ואח '9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
משלים איור 1: עקומת כוח נציג המתקבל על ידי הכניסה של מטריצה הפראיסלנדי lular (PCM) של תבנית מחרוזת אחת המציגה את תוצאות ההתאמה (חץ כתום), כמו גם את ריבוע שיורית ממוצע של השורש (RMS שיורית; חץ שחור). תוצאות ההתאמה כוללות את נקודת המגע בין המדגם והטיפ, מודולוס הצעיר, ואת קו הבסיס. השאריות של RMS המוצגות להלן מתארות את ההפרש בין ההתאמה לבין נתוני הכוח, ובכך מייצגים את איכות עקומת הכוח. אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.
| . שולחן 1 פרמטרים להדבקה של מיקרוספירה במכשיר AFM | |
| פרמטרים | ערך |
| סטפוינט | 5.0 V |
| התאם תוכנית בסיסית | 1 |
| אורך מושך | 90.0 יקרומטר |
| תנועת Z | מהירות תמידית |
| מהירות הרחבה | 5.0 μm/s |
| זמן הארכה | 18.0 ס |
| זמן יצירת קשר | 90.0 ס |
| מצב השהיה | כוח קבוע |
| קצב דגימה | 2000 הרץ |
. שולחן 1 פרמטרים להדבקה של מיקרוספירה במכשיר AFM-לווין.
| . שולחן 2 גישה לפרמטרים | |
| גישה לפרמטרים | ערך |
| הגישה IGain | 5.0 הרץ |
| הגישה PGain | 0.0002 |
| התקרב לגובה היעד | 10.0 יקרומטר |
| גישה ל-setpoint | 5.00 V |
| גישה בסיסית | 0.00 V |
. שולחן 2 . גישה לפרמטרים
| . שולחן 3 הפעלת פרמטרים | |
| פרמטרים | ערך |
| סטפוינט | 1.0 V |
| התאם תוכנית בסיסית | 1 |
| אורך מושך | 90.0 יקרומטר |
| תנועת Z | מהירות תמידית |
| מהירות הרחבה | 5.0 μm/s |
| זמן הארכה | 18.0 ס |
| זמן יצירת קשר | 0.0 ס |
| מצב השהיה | כוח קבוע |
| קצב דגימה | 2000 הרץ |
. שולחן 3 . הפעל פרמטרים
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
באמצעות AFM כטכניקה חדשנית ורבת עוצמה כדי למדוד את התכונות הביומכאניות של חומרים ביולוגיים ברמת ננו-סקאלה, מדדנו את התכונות האלסטיים של ECM ו-PCM בסחוס הגוף האנושי האוסטאופתית. דגימות סחוס נבחרו על פי דפוס מרחבית השולט שלהם של הארגון כchondrocyte כגון התמונה מבוססת ביואריקר עבור ניוון רקמות מקומיות. כצפוי, ירידה חזקה בערכי האלסטיות של ECM ו-PCM נצפתה לאורך מתארגנות כונדרוציט מרחבית. תצפיות אלה מדגישים בבירור כי הסטיות בהסדר המרחבי של כונדרוציטים לא היו קשורות רק לשינויים בתכונות האלסטיים של המיקרו-סביבה התאית (PCM), אלא גם ברחבי הסחוס כולו (ECM). יתרה מזאת, יחס ECM/PCM לא הראה שינויים משמעותיים למרות השינויים החזקים במודוללי האלסטיים של PCM ו-ECM במהלך OA. ממצאים אלה מצביעים על כך שהשינויים בתכונות המכאניות של ה-ECM ו-PCM התרחשו באופן משני ובמקביל, שעשוי להצביע על כך שאופי ההרס המתקדם דומה הן ל-PCM והן ל-ECM. חניכה OA והתקדמות ובכך מפעילה PCM משמעותי ECM השפלה בסופו של דבר הרס. שני ההפסדים היו קשורים לאובדן משמעותי של תכונות ביומכאניות של הסחוס הפרקולייתי, כגון גמישותו, כפי שמוצג במחקר הנוכחי. הדבר מדגיש את הרלוונטיות הפונקציונלית של הארגון המרחבי של כונדרוציטים כסמן לתכונות ביומכאניות. לעומת זאת, זה מאפשר לנו להשתמש במדידות אלסטיות מקומיות כדי להסיק מסקנות על דפוסי המרחב השולט מקומית וכך הניוון רקמות המקומי של הסחוס.
מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) התפתחה ככלי ברזולוציה גבוהה כדי ללמוד רקמות בצורה גמישה. היא פועלת על ידי בדיקה פיזית דגימות עם מזיז עדין וגמיש המשקף לייזר על פוטודיודה. כל שינוי בשיקוף זה נרשם ומומר לאות חשמל. בעוד AFM הוא כלי רב עוצמה כדי לבצע מדידות ננו-סקאלה, זה לא בא בלי מגבלותיו ומלכודות שלה. במיוחד קריטי הוא הכנת הזיז על ידי הדבקת המיקרוספירות. בהקשר של שיטה זו, המיקרוספירות משמשות לשינוי עומק הכניסות והלחץ המקומי במהלך המדידות. שימוש במיקרוכדורים קטנים המחוברים לקצה המקדח מאפשר למדידה של התכונות הביומכאניות של רשת סיבים במקום האלסטיות של סיבים בודדים כאשר משתמשים בעצה בלבד. זה גם מונע נזק לרקמות במהלך תהליך המדידה. בשל אופיו העדין של חיישני הזיז, צריך להקים מצב קשוב וזהיר של הכנה על מנת להשיג מדידות עקבית ומדויקות. כדי למנוע מהמיקרוספירות להתנתק מקצה החיישן, אנו ממליצים על הדבקה מעורבת טרייה שאינה ישנה יותר משבוע אחד. יתר על כן, זה חיוני לפונקציונליות של החיישן כדי למקם את המיקרוספירה במרכז הקצה כמו סטייה לרוחב הקובץ המצורף ננו-ספירה בקלות תוצאות במידות לא עקביות.
הצבת הזיז על בלוק הזכוכית ותיקונן בעזרת קפיץ הולם, היא תהליך עדין ונוטה לטעויות, הזקוק לתשומת לב קפדנית ולידיים יציבות. מכיוון שיש סבירות גבוהה שהמנופים יושמדו על-ידי מפעילים לא מאומן, אנו ממליצים על ניהול מספר מבצעים ותרגול כדי לטפל בנוחות ברכיבים השבירים בקלות של AFM.
בלוק זכוכית נקייה חיוני כדי לכייל כראוי את המכשיר ולקבל מדידות אמין. עפר או אבק על המשטח האופטי של הבלוק עלול למנוע יישור לייזר תקין על מזהה התמונה. לכן, אם הבעיות במהלך היישור לייזר נתקלים, לשטוף את הבלוק זכוכית עם אתנול בפעם השנייה עשוי להיות הכרחי.
ניתן לבצע ניתוח נתונים או קביעת מודול האלסטי באמצעות מודל הרץ כמתואר בעבר11,12. בקיצור, הנתונים שנוצרו באמצעות כניסות הם מגרשים של כוח מעל התנועה של קצה הזיז. במהלך המדידות, הזיז מועבר לכיוון המדגם. הדבר מוביל אל הזיז היוצר קשר עם המדגם ולאחר מכן לכיפוף שלו בכיוון המנוגד לאחד שבו הועבר במקור. במקביל, מתרחשת הזחה של המדגם בסכום מסוים. כדי להשתמש במודל הרץ-fit, יש לחשב את הכניסה של המדגם ולכוונן אותה כדי לבודד את הפרמטר של כיפוף הזיז. הפרמטר המתאר את המדגם הוא היחס של פואסון, התלוי בחומר הנחקר. לדגימות ביולוגיות רכות, היחס של פואסון מוגדר לעתים קרובות ל-0.515. כפי שהוזכר לעיל, צורת הכניסה המשמשת לשימוש רלוונטית לחישוב מודולוס של יאנג, כפי שהיא מכתיבה את ההרחבות שצריכות להתבצע במשוואה המקורית של הרץ. במקרה של הניסוי המתואר, צורת הכניסה כדורית מניחים עקב השימוש של מיקרוספירות.
בעוד AFM עשוי להציע אפשרויות חדשות ומעניינות של איסוף נתונים, העקביות והאמינות של הנתונים הניבו מאוד תלוי בניסיון של המפעיל המתאים. כמה מהשלבים המפורטים לעיל נוטים לטעות אנוש ודורשים סבלנות והקפדה לבצע אותם כראוי.
בשל משתנים רגישים רבים שיכולים להשפיע על תוצאות המדידה, ערכי הכוח המוחלט שדווחו במחקר זה לא יכול להיות מוכללת, אך הם ספציפיים למדי עבור ההתקנה הניסיונית שלנו. בעת שימוש בטכניקה זו כדי להעריך את הניוון רקמות של הסחוס, כמה מדידות נרמול על דפוסי מרחבית שונים צריך תחילה להתבצע כדי לשנות את התוצאות של הגדרות מדידה ניסיוני ספציפיים להציג. עם זאת, היחסים בין האלסטיות השונות למודוללי והדפוסים המרחביים לא יושפעו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים למחברים שלנו מהפרסום המקורי לעזרתם ולתמיכתם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
References
- Guilak, F., et al. The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).
- Peters, H. C., et al. The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis. Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).
- Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production. Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Maver, U., Velnar, T., Gaberšček, M., Planinšek, O., Finšgar, M. Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).
- Polini, A., Yang, F. Physicochemical characterization of nanofiber composites. Nanofiber Composites for Biomedical Applications. Ramalingam, M., Ramakrishna, S. , Woodhead Publishing. Cambridge, UK. 97-115 (2017).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).
- Choi, A. P., Zheng, Y. P. Estimation of Young's modulus and Poisson's ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect. Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).
- Jin, H., Lewis, J. L. Determination of Poisson's ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).
