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Immunology and Infection

आईडिस्को+ और लाइट शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कशेरुकी लिम्फेटिक वाक्यूलेचर और ड्रेनेज की त्रि-आयामी इमेजिंग

Published: May 22, 2020 doi: 10.3791/61099
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,3
1Université Pierre et Marie Curie Paris, Sorbonne Université, Institut du Cerveau et de la Moelle Epinière, 2Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 3Department of Neurology, Yale University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

एक प्रोटोकॉल प्रकाश शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (LSFM) के साथ ऊतक समाशोधन के संयोजन के लिए लिम्फेटिक जहाजों और लिम्फ नोड्स (एलएनएस) के तीन आयामी और सेलुलर संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है जो सेरेब्रोस्पाइनल द्रव (सीएसएफ) और रीढ़ की हड्डी में द्रवण का संग्रह करता है।

Abstract

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) से जुड़ी लिम्फेटिक प्रणाली में मस्तिष्क, रीढ़ की हड्डी और उससे जुड़े एलएन के आसपास स्पिन करने वाला लिम्फेटिक वैक्यूलेचर शामिल है। सीएनएस से जुड़ी लिम्फेटिक प्रणाली सीएनएस-ड्रेनिंग एलएन की ओर सीएसएफ मैक्रोमॉलिक्यूल्स और मेनिंगियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं की जल निकासी में शामिल है, जिससे सीएनएस ऊतकों के भीतर अपशिष्ट निकासी और प्रतिरक्षा निगरानी को विनियमित किया जाता है। प्रस्तुत किया गया एक उपन्यास दृष्टिकोण है जो आसपास के ऊतकों के भीतर अपने सर्किट की अखंडता को संरक्षित करते हुए सीएनएस से जुड़े लिम्फाटिक्स के त्रि-आयामी (3 डी) और सेलुलर संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए है। iDISCO+ प्रोटोकॉल का उपयोग डिक्लेस्काइड में लिम्फेटिक जहाजों को इम्यूनोलेबल करने के लिए किया जाता है और कशेरुकी स्तंभ की पूरी माउंट तैयारी को मंजूरी दे दी जाती है जिसे बाद में प्रकाश शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम) के साथ चित्रित किया जाता है। इस तकनीक से रीढ़ की हड्डी के चारों ओर मेनिंगियल और एपिड्यूरल रिक्त स्थान को बाहरी लिम्फेटिक जहाजों से जोड़ने वाले लिम्फेटिक नेटवर्क की 3डी संरचना का पता चलता है । बशर्ते आणविक ट्रेसर्स के ड्रेनेज सर्किट की 3डी छवियां पहले सिस्टर्ना मैग्ना या थोराकोलंबर स्पाइनल पैरान्चिमा के माध्यम से सीएसएफ में इंजेक्ट की गई हों। iDISCO+/LSFM दृष्टिकोण न्यूरोवैस्कुलर जीव विज्ञान, न्यूरोइम्यूनोलॉजी, मस्तिष्क और कशेरुकी कैंसर, या कशेरुकी हड्डी और संयुक्त जीव विज्ञान में सीएनएस से जुड़े लिम्फेटिक सिस्टम की संरचना और कार्य का पता लगाने के लिए अभूतपूर्व अवसर लाता है ।

Introduction

सीएनएस सीएसएफ से घिरा हुआ है और मेनिंग्स, एपीड्यूरल ऊतक और हड्डियों की परतों को ओवरलेइंग करता है। कुल मिलाकर, सीएसएफ नरम मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को शारीरिक सुरक्षा प्रदान करता है। यह मुख्य रूप से कोरॉइड प्लेक्सस और मेनिंगियल झिल्ली (यानी, पिया मेटर, आरेक्नोइड, और ड्यूरा मेटर) द्वारा स्रावित किया जाता है। सीएसएफ-मेनिंगियल कॉम्प्लेक्स सीएनएस ऊतकों और शरीर के बाकी हिस्सों के बीच एक कार्यात्मक इंटरफेस भी स्थापित करता है, जिससे सीएनएस हो्योस्टेसिस में योगदान होता है। सबसे पहले, सीएसएफ सीएनएस पैरा-धमनी रिक्त स्थान के माध्यम से सीएनएस पैरान्चिमा में प्रवेश करता है और ग्लाइम्फेटिक (ग्लिया-लिम्फेटिक) प्रणाली के माध्यम से इंटरस्टिशियल द्रव (आईएसएफ)1 के साथ गतिशील रूप से बातचीत करता है,,जिसमें सीएनएस जहाजों2,3,4के आसपास पैरास्कुलर रिक्त स्थान और एस्ट्रोसाइट एंड-फीट झिल्ली शामिल हैं।, मेटाबोलिक अपशिष्ट और अतिरिक्त तरल पदार्थ को अंततः मस्तिष्क परृन्चिमा से सीधे प्रणालीगत परिसंचरण3की ओर इंट्राम्यूरल पेरिवासुलर ड्रेनेज द्वारा मंजूरी दी जाती है, साथ ही सीएसएफ की ओर पैरावेनस रिक्त स्थान और मस्तिष्क-सूखा लिम्फेटिक जहाजों के माध्यम से, ग्लाम्फेटिक मॉडल2,,4के अनुसार। सीएसएफ बहिर्वाह मुख्य रूप से लिब्रिकेट सिस्टम के माध्यम से, क्रिब्रिफॉर्म प्लेट और संबद्ध एक्सट्राक्रैनियल लिम्फेटिक जहाजों5,,6, 7के7साथ-साथ मेनिंगियल लिम्फेटिक जहाजों द्वारा होता है, जो मस्तिष्क-निकासी वाले एलएनएस8,,9,10,,,11,,12 (चित्रा 1)पर एकाग्र होते हैं। सीएसएफ आउटफ्लो में एक महत्वपूर्ण, हालांकि माध्यमिक भूमिका कपाल आरेक्नोइड विली द्वारा ली जाती है, जो मेनिंगियल वेनस साइनस13की कमी को भेदती है।

सीएनएस या सीएसएफ में रंगीन/फ्लोरोसेंट ट्रेसर्स के इंजेक्शन के आधार पर प्रायोगिक दृष्टिकोणों के माध्यम से सीएफएस ड्रेनेज सर्किट की बड़े पैमाने पर जांच की गई है, जिसके बाद सीएनएस के अंदर ट्रेसर्स पैटर्न की इमेजिंग और इंजेक्शन13के बाद विभिन्न टाइमपॉइंट्स पर शरीर के अंगों और ऊतकों में । लंबे समय तक, सीएसएफ के बहिर्वाह को विशेष रूप से माना जाता था और सीधे रक्त परिसंचरण द्वारा प्रभारी माना जाता था, आरेक्नोइड विली के माध्यम से ड्यूरल वेनस साइनस13में पेश किया गया था। हालांकि, सीएसएफ बहिर्वाह मुख्य रूप से लिम्फेटिक वाक्यूलेचर द्वारा किया जाता है, जैसा कि हाल ही में चूहों9,,10में सीएसएफ-इंजेक्शन ट्रेसर परिवहन के निकट-अवरक्त (एनआईआर) गतिशील इमेजिंग द्वारा दिखाया गया है। सीएसएफ-ड्रेनिंग लिम्फेटिक वाहिकाएं फिर सही सबक्लेवियन नस के माध्यम से खून में लिम्फ वापस करते हैं । ,पूरक अनुमानों ने सीएसएफ-इंजेक्शन ट्रेसर्स के दोनों एक्सट्राक्रैनियल6,,7,,13 और इंट्राक्रैनियल9,,10,11,,12 लिम्फेटिक रास्ते का पता लगाया है और सुझाव दिया है कि सीएसएफ दो लिम्फेटिक रास्तों, एक बाहरी और खोपड़ी औरवर्टेब्रल कॉलम के लिए आंतरिक एक द्वारा अवशोषित किया जाता है। सीएसएफ जल निकासी का मुख्य हिस्सा तेजी से नाक म्यूकोसा में खोपड़ी के बाहर,,एथिमॉइड हड्डी 3,6,,13के क्रिब्रिफॉर्म प्लेट के माध्यम से, लिम्फेटिक जहाजों के माध्यम से होता है और, कोडाली, डोरसोलेटरल मार्गों के माध्यम से लुम्बोसाक्राल कशेरुकी हड्डियों के बाहर, जो अभी तक पूरी तरह से13 7,,14की विशेषता नहीं है। इसके अलावा, खोपड़ी के मेनिंग्स में, ड्यूरा मेटर डायरेक्टी की लिम्फेटिक केशिकाएं सीएसएफ और मेनिंगियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं को ड्यूरल लिम्फेटिक कलेक्टरों की ओर अवशोषित करती हैं जो खोपड़ी की हड्डियों को पार करती हैं और सीएनएस-ड्रेनिंग एलएनएस12, 14,14से जुड़ती हैं। ये मेनिंगियल लिम्फेटिक जहाज सीएनएस रोगविज्ञान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, क्योंकि मस्तिष्क मेनिंगियल लिम्फिटिक्स उम्र बढ़ने पर बदल जाते हैं और न्यूरोडिजेनरेशन, न्यूरोइंफ्लैमेशन, और मस्तिष्क कैंसर,15, 16,,17सहित न्यूरोलॉजिकल मस्तिष्क रोगों के परिणाम को भी प्रभावित करते हैं।16 इसलिए, सीएनएस से जुड़े लिम्फेटिक वाक्यूलेचर (यानी, सीएसएफ को निकालने वाले ड्यूरल और परिधीय लिम्फेटिक जहाज) मनुष्यों में सीएनएस रोगों का मुकाबला करने के लिए एक आशाजनक उपन्यास लक्ष्य हो सकता है।

इम्यूनोहिस्टोलॉजी और उच्च-संकल्प चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग के साथ किए गए अभिसरण अध्ययनों से पता चला है कि मेनिंगियल लिम्फेटिक वैक्यूलेचर भी वानरों में मौजूद है, जिसमें आम मार्मोसेट बंदर और मनुष्य7,11,,13शामिल हैं।, इसके अलावा, मेनिंगियल लिम्फेटिक जहाज खोपड़ी तक सीमित नहीं हैं, बल्कि कशेरुकी स्तंभ के भीतर रीढ़ की हड्डी गैंगलिया और रामी13, 18,18की सतह तक विस्तारित होते हैं। कशेरुकी स्तंभ लिम्फाटिक्स की त्रि-आयामी (3 डी) इमेजिंग लेबल वाले कशेरुकी और रीढ़ के नमूनों की समग्र शरीर रचना विज्ञान को संरक्षित करती है, जिसमें ओवरलाइंग हड्डियों, मांसपेशियों, स्नायुबंधन, साथ ही पड़ोसी आंत के ऊतकों को शामिल किया गया था, हाल ही में14प्रदर्शन किया गया था। iDisco+ प्रोटोकॉल19,,20 का उपयोग झिल्ली रिसेप्टर LYVE1 21 या ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर PROX122 के खिलाफ लिम्फेटिक-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ पूरे कशेरुकी स्तंभ की पूरी कशेरुकी स्तंभ की तैयारी को इम्यूनोलेबेल करने के लिए कियागयाथा।21 छवि अधिग्रहण और विश्लेषण तो प्रकाश शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (LSFM) और Imaris सॉफ्टवेयर के साथ किया गया । एलएसएफएम रोशनी के अक्षीय कारावास द्वारा बड़े नमूनों की तेजी से और न्यूनतम आक्रामक 3 डी इमेजिंग की अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप कम फोटोब्लैचिंग और फोटोटॉक्सीसिटी23होती है।

iDISCO+/LSFM दृष्टिकोण ड्यूरल और एपीड्यूरल लिम्फेटिक जहाजों की अलग परतों के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है, और इस वाक्यूलेचर का संबंध एक्सवर्टिकल लिम्फेटिक सर्किट और एलएनएस कशेरुकी स्तंभ के पड़ोसी के लिए। प्रोटोकॉल पहले कशेरुकी नहर जल निकासी का प्रदर्शन करने के लिए फ्लोरोसेंट ट्रेसर के साथ इंजेक्शन ऊतकों के लिए लागू किया गया था । वर्तमान पत्र कशेरुकी लिम्फेटिक वैक्यूलेचर की छवि के लिए iDISCO+/LSFM पद्धति पर विवरण प्रदान करता है और सीएसएफ और एपीड्यूरल द्रव जल निकासी जांच के लिए अपनी प्रासंगिकता दिखाता है ।

Protocol

इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली वीवो प्रक्रियाओं में सभी ने प्रायोगिक पशु उपयोग दिशानिर्देशों (L358-86/609EEC) के लिए यूरोपीय समुदाय के अनुसार पशु परीक्षण और अनुसंधान के लिए सभी प्रासंगिक नैतिक नियमों का पालन किया। अध्ययन को आईएनएसईआरएम की नैतिक समिति (एन डिग्री 2016111111111126651) और आईसीएम की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (इंस्टीटयूट डु सेरवेउ एट डे ला मोएले épinière) द्वारा नैतिक अनुमोदन प्राप्त हुआ।

1. तैयारी

  1. सर्जरी के लिए निम्नलिखित विच्छेदन उपकरण तैयार करें: स्केलपेल (1), माइक्रोफोर्सप्स (2), संदंश (1), विच्छेदन कैंची, और मिशेल सीवन क्लिप। 26 जी सुई (0.45 मिमी x 13 मिमी), 1 एमएल सिरिंज, और 10 माइक्रोल माइक्रोसिरिंग तैयार करें।
  2. एक ग्लास माइक्रोपिपेट खींचने के साथ 67.5 डिग्री सेल्सियस पर एक एकल कदम प्रोटोकॉल के साथ माइक्रोकैपिलरी खींचो। प्रति इंजेक्शन दो माइक्रोकैपिलरी तैयार करें।
  3. इमेजिंग लिम्फेटिक ड्रेनेज(टेबल 1):ओवलबुमिन एलेक्सा फ्लोर 555 कंजूगेट (ओवा-ए555,2 मिलीग्राम/एमएल इन 1x फॉस्फेट बफर खारा [पीबीएस]) और एंटी-LYVE1 एंटीबॉडी (1x PBS में 1 मिलीग्राम/एमएल) के लिए रिएजेंट तैयार करें।
  4. आईडिस्को+ के लिए एंटीबॉडी(टेबल 1)तैयार करें । प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए, एंटी-LYVE1 खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (1:1,600) और एंटी-प्रोक्स 1 बकरी पॉलीक्लोनल आईजीजी एंटीबॉडी (1:2,000) का उपयोग करें। माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए, एलेक्सा फ्लोर गधे विरोधी खरगोश-568, गधा विरोधी खरगोश-647, और गधा विरोधी बकरी-647 (1:2,000) का उपयोग करें।

2. इंट्रा-सिस्टर्ना मैग्ना (आईसीएम) और थोराकोलंबर (ThLb) इंजेक्शन के लिए सर्जरी प्रक्रियाएं

  1. सर्जरी के लिए जानवर की तैयारी
    1. वयस्क पुरुष और महिला C57BL6/J चूहों, 8-12 सप्ताह पुराने का प्रयोग करें ।
    2. माउस इंट्रापेरिटोनली (आईपी) को 0.015 मिलीग्राम/एमएल बुप्रेनोरफिन समाधान के साथ 0.9% सोडियम क्लोराइड में 0.1 मिलीग्राम/किलो, सर्जरी से पहले 15 मिनट में पतला करें।
    3. माउस को 2-3% आइसोफ्लुन गैस के साथ इंडक्शन बॉक्स में एनेस्थेटाइज करें।
  2. ट्रेसर इंजेक्शन के लिए एनेस्थेटाइज्ड जानवर की तैयारी
    1. एनेस्थेटाइज्ड माउस और उसके हीटिंग पैड को स्टीरियोटैक्सिक उपकरण पर रखें। माउस के सिर को पकड़ने के लिए कान की सलाखों का उपयोग करें, और सिर पर ~ 135 डिग्री कोण पर शरीर को लेट जाएं या रीढ़ की हड्डी के अनुकूल के साथ थएलबी कशेरुकी स्तर (Th12-L1) पर रीढ़ की हड्डी को स्थिर करें। संज्ञाहरण की दक्षता की जांच करने के लिए शक्ति के साथ पूंछ या पंजा चुटकी।
    2. माउस हाइड्रेशन के लिए 0.9% सोडियम क्लोराइड के आईपी 200 माइक्रोन इंजेक्ट करें।
    3. एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करना, आईसीएम इंजेक्शन के लिए गर्भाशय ग्रीवा क्षेत्र की ओर ऑक्सीपिटल क्षेत्र में या थएलबी कशेरुकी स्तर (Th10-L3) में थएलबी स्पाइनल पैरेंचिमा में इंजेक्शन के लिए त्वचा का चीरा बनाएं।
  3. ट्रेसर इंजेक्शन
    1. पैराला मेटर की सतह, मेनिंग्स की सबसे बाहरी परत की कल्पना करने के लिए गर्दन और स्तंभ को कवर करने वाली पैरासेर्विकल और पैरास्पाइनल मांसपेशियों को त्यागें।
    2. ड्यूरा मेटर के केंद्रीय क्षेत्र को सावधानीपूर्वक और 26 जी सुई के साथ आरेक्नोइड को कम करें।
    3. माइक्रोकैपिलरी इम्प्लांटेशन
      1. ग्लास केशिका टिप के 2 मिमी काटें (चरण 1.2 देखें), फिर ओवी-ए555 या LYVE1 एंटीबॉडी के 2−8 माइक्रोल को एस्पिरेट करने के लिए 10 माइक्रोल सिरिंज से जुड़े कैनुला से जुड़े माइक्रोकैपिलरी का उपयोग करें।
      2. आईसीएम इंजेक्शन के लिए 30 डिग्री कोण या थएलबी स्पाइनल इंजेक्शन के लिए 10 डिग्री कोण पर ड्यूरा मेटर के मध्य क्षेत्र में माइक्रोकैपिलरी का परिचय दें, और इसे ड्यूरा मेटर के नीचे 1.5 मिमी तक धकेलें।
        नोट: स्नायु पंचर है, लेकिन कोई टुकड़े टुकड़े पर नहीं किया जाता है।
      3. कांच के केशिका के चारों ओर चीरा बंद करने के लिए सर्जिकल गोंद के 10 माइक्रोन जोड़ें और इसके सूखने की प्रतीक्षा करें।
    4. धीरे-धीरे फ्लोरोसेंट ट्रेसर को 1 माइक्रोल/मिनट पर इंजेक्ट करें। एक बार इंजेक्शन की मात्रा वितरित हो जाने के बाद, 1 मिनट के लिए जगह में केशिका बनाए रखें। माइक्रोकैपिलरी को वापस लें और इंजेक्शन छेद को बंद करने के लिए सर्जिकल गोंद जोड़ें।
  4. पोस्टइंजेक्शन, सीवन क्लिप के साथ त्वचा के चीरों को बंद करें। स्टीरियोटैक्सिक उपकरण से माउस निकालें और इसे ठीक होने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर पोस्टसर्जरी वार्मिंग चैंबर में रखें।

3. परफ्यूजन और ऊतक विच्छेदन

  1. सीएसएफ ट्रेसर इंजेक्शन के बाद या तो 15 मिनट या 45 मिनट पर, आईपी को सोडियम पेंटोबार्बिटल की घातक खुराक (100 माइक्रोल) इंजेक्ट करें। पूंछ या पंजा चुटकी सत्यापित करने के लिए कि कोई पलटा नहीं है।
  2. विच्छेदन कैंची के साथ, त्वचा को काटें और छाती के पिंजरे की ओर पेट के निचले क्षेत्र से पेरिटोनियल परत खोलें। दिल तक पहुंच रखने के लिए कैंची के साथ वक्ष पिंजरे खोलें।
  3. दिल के बाएं वेंट्रिकुल में 26 जी सुई डालें और 2x पीबीएस में 2x पीबीएस में 20 मिली लीटर बर्फ-ठंडे 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड (पीएफए) के साथ 2 मिलियन/मिनट के साथ छिद्रित करना शुरू करें । सही एट्रियम को तेजी से काटने और परफ्यूजन फ्लूइड स्ट्रीम को छोड़ने के लिए कैंची का उपयोग करें।
  4. चर्मना को पूरी तरह से संदंश से हटा दें और कैंची से चारों पैरों को काट लें। सभी आंतरिक अंगों को हटा दें लेकिन एलएनएस को बरकरार रखने के लिए सावधान रहें।
    नोट: मंडीबुलर एलएन सतही होते हैं, इसलिए ध्यान रखें कि त्वचा को काटते समय उन्हें न हटाएं। आंतरिक जुगुलर नसों की पार्श्व सतह और स्टीरियोमास्टोइड मांसपेशियों के करीब के संपर्क में, ट्रेकिया के प्रत्येक तरफ डीप-सर्वाइकल एलएन (डीसीएलएन) स्थित हैं।
  5. पसलियों को काटें रीढ़ की हड्डी के साथ कशेरुकी स्तंभ को रीढ़ की हड्डी के साथ को गर्भाशय ग्रीवा से काठ के खंडों में काटें।
  6. 1x पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 एमएल ट्यूब रात (~ 18 एच) में आइस-कोल्ड 4% पीएफए में विच्छेदित ऊतकों को विसर्जित करें। 1x पीबीएस के 50 एमएल में फिक्स्ड टिश्यू 3x को 5 मिनट के लिए धोएं।

4. कशेरुका खंड की फ्लोरेसेंस मैक्रोस्कोपी

  1. फ्लोरेसेंस स्टीरियोज़ोम माइक्रोस्कोप के नीचे एक कैमरे(सामग्री की तालिका) केसाथ नमूने की स्थिति। किसी विशिष्ट क्षेत्र पर नमूने का अवलोकन करें या ज़ूम करें।

5. पूरे माउंट इम्यूनोदाता के लिए नमूना तैयारी

  1. एक माइक्रोटॉम ब्लेड का उपयोग करके, ओसीपिटल और सर्वाइकल स्तर पर सिर और कशेरुकी स्तंभ को ट्रांसवर्ल रूप से काट दिया जाता है।
    नोट: यह विच्छेदन कशेरुका स्तंभ के बाकी हिस्सों से सिर और ग्रीवा कशेरुकी क्षेत्र के अलगाव की अनुमति देता है।
  2. एक सूक्ष्म ब्लेड के साथ, कशेरुकी स्तंभ के सर्वाइकल, थोराकोलंबर और पवित्र क्षेत्रों को 2−4 कशेरुकी के खंडों में काट दें, लगभग 0.5 सेमी आकार प्रत्येक।
  3. प्रत्येक खंड को अलग करने के क्रम में इसे कशेरुकी स्तंभ के गर्भाशय ग्रीवा और छाती क्षेत्रों की पूरी लंबाई के साथ कशेरुकी धुरी से अलग किया गया था। 2 एमएल 1x पीबीएस की ट्यूब में प्रत्येक नमूने को संरक्षित करें।

6. iDISCO+ एक कशेरुकी खंड के पूरे माउंट इम्यूनोस्टेटिंग

नोट: iDISCO+ प्रोटोकॉल का विस्तृत विवरण http://www.idisco.info पर सुलभ है।

  1. दिन 1: ऊतक निर्जलीकरण
    1. आंदोलन के साथ 1 घंटे के लिए 1x पीबीएस में 20%, 40%, 60%, 80%, और 100% मेथनॉल में लगातार विसर्जन करके निर्जलित कशेरुकी ऊतक नमूने (यानी, एक कशेरुकी खंड) ।
    2. आंदोलन के साथ कमरे के तापमान (आरटी) पर 33% मेथनॉल/66% डाइक्लोरोमेथेन (डीसीएम) के समाधान में रात भर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  2. दूसरा दिन: टिशू ब्लीचिंग
    1. आरटी में 1 घंटे के लिए 100% मेथनॉल के साथ नमूनों को धोएं। 5% एच2ओ2 में मेथनॉल (30% एच2ओ2 और मेथनॉल 1:5 वी/वी) में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें ।
  3. 3 दिन: Decalcification और पारयीकरण कदम
    1. आंदोलन के साथ आरटी में 80%, 60%, 40%, 20% मेथनॉल, फिर 1x पीबीएस (प्रत्येक समाधान में 1 घंटे) में नमूनों को धीरे-धीरे हाइड्रेट करें।
    2. हड्डी संरचना को संरक्षित करने के लिए आरटी में 30 मिनट के लिए मोर्स के समाधान (10% ट्राइसोडियम साइट्रेट और 45% फॉरमिक एसिड 1:1 वी/वी) में नमूनों को इनक्यूबेटिंग करके कशेरुका को डिक्लेम करें।
    3. 1x पीबीएस के साथ नमूनों को कुल्ला और PTx2 समाधान में 1 घंटे के लिए 2x (1x PBS में 0.2% ट्राइटन एक्स-100, आंदोलन के साथ आरटी में दूसरी इनक्यूबेशन) के लिए नवीनीकृत करें। फिर परमीबिलाइजेशन समाधान (20% डिमेथिल सल्फॉक्साइड [डीएमएसओ] और 2.3% डब्ल्यू/वी ग्लाइसिन के साथ 2.3% डब्ल्यू/वी ग्लाइसिन) में प्रीट्रीट किए गए नमूनों को 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. 4 दिन: कदम अवरुद्ध
    1. ब्लॉकिंग सॉल्यूशन में इनक्यूबेट नमूने (6% गधे सीरम के साथ पीटीएक्स2 और 10% डीएमएसओ) 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  5. दिन 5−16: पूरे माउंट इम्यूनोबेलिंग
    1. प्राथमिक एंटीबॉडी में इनक्यूबेट नमूने पीटीडब्ल्यूएच में पतला (1x पीबीएस जिसमें 0.2% ट्वीन-20 और 0.1% हेपरिन 1x पीबीएस में 10 मिलीग्राम/एमएल पर) 5% DMSO/3% गधा सीरम के साथ 6 दिनों के लिए 37 सी पर । रात भर आंदोलन के साथ आरटी में पीटीडब्ल्यूएच में 4−5x नमूने धोएं।
    2. PTWH में माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने में 3% गधा सीरम के साथ 4 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट नमूने। समाशोधन से पहले रात भर आंदोलन के तहत आरटी में पीटीडब्ल्यूएच 4−5x में नमूने धोएं।
  6. दिन 17 और 18: iDISCO+ ऊतक समाशोधन
    1. 1x पीबीएस में लगातार विसर्जन से धीरे-धीरे नमूनों को निर्जलित करें, फिर 20%, 40%, 60%, 80%, और 100% मेथनॉल (प्रत्येक समाधान में 1 घंटे) में 2x। 33% मेथनॉल/66% डीसीएम के समाधान में प्रत्येक नमूना रात भर इनक्यूबेट करें।
    2. मेथनॉल को हटाने के लिए 15 मिनट के लिए 100% डीसीएम में 2x धोएं। डिबेंज़िल ईथर (डीबीई) में बिना मंजूरी दिए (4 एच) और फिर इमेजिंग से पहले आरटी में डीबीई में स्टोर करें।

7. एलएसएफएम इमेजिंग

  1. छवि एक 4x/0.3 उद्देश्य से लैस LSFM के साथ एक ट्रांसवर्सल विमान में नमूनों को मंजूरी दे दी ।
    1. एक तरफा तीन शीट रोशनी विन्यास, फिक्स्ड एक्स स्थिति (कोई गतिशील ध्यान केंद्रित) का उपयोग करें। 561 एनएम, 100 एमडब्ल्यू के लिए देखते एलईडी लेजर का उपयोग करें; और 639 एनएम, 70 एमडब्ल्यू। लाइट शीट न्यूमेरिकल अपर्चर को 30% तक सेट करें।
    2. विभिन्न उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग करें: एलेक्सा फ्लोरर-568 या -555 के लिए 595/40, और एलेक्सा फ्लोर-647 के लिए -680/30।
  2. डीबीई के साथ माइक्रोस्कोप चैंबर भरें।
  3. 2.5 माइक्रोन जेड चरणों के साथ एक्वायर स्टैक और कैमरे के साथ प्रति चरण 30 एमएस एक्सपोजर समय(सामग्री की तालिका)। (x8), 0.8 μm/pixel के प्रभावी आवर्धन के लिए x2 ऑप्टिकल ज़ूम का उपयोग करें, और पूर्ण फ्रेम पर 10% ओवरलैप के साथ मोज़ेक अधिग्रहण करें।
  4. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ .tif प्रारूप में छवियों का अधिग्रहण करें और उन्हें फ़ाइल रूपांतरण सॉफ्टवेयर के साथ 3 डी प्रारूप में परिवर्तित करें।
  5. सिलाई सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका)के साथ मोज़ेक अधिग्रहण का पुनर्निर्माण करें। छवियों को खोलें और दिशानिर्देश के रूप में छवियों के बीच 10% ओवरलैप का उपयोग करके, पूरे मोज़ेक चित्र का पुनर्गठन करने के लिए मैन्युअल रूप से आगे बढ़ें।
  6. डेटा के ऑर्थोगोनल अनुमानों को उत्पन्न करने के लिए 3डी सॉफ़्टवेयर(सामग्री की तालिका)का उपयोग करें, जैसा कि चित्र 1, चित्रा 2, चित्रा 3और चित्रा 4में दिखाया गया है, और लिम्फेटिक जहाजों और प्रदर्शन पर अन्य शारीरिक संरचनाओं के लिए एक रंग कोड विशेषता जोड़ें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एलएसएफएम से प्राप्त कच्चे डेटा में 1.47 का गामा सुधार सेट करें।

Representative Results

कशेरुकी लिम्फेटिक वाक्यूलेचर की 3डी इमेजिंग
चित्रा 1 iDISCO+ केकदम और iDISCO + के कशेरुकी नहर के अंदर लिम्फेटिक सर्किट की एक LSFM छवि प्रस्तुत करता है+-इलाजThLb कशेरुकी । एलएसएफएम के साथ आईडीस्को+ के संयोजन ने कशेरुकी शरीर रचना विज्ञान को संरक्षित किया और लिम्फेटिक वैस्कुलर नेटवर्क (यानी, बाहरी जहाजों से जुड़े इंट्रावर्टेब्रल जहाजों को आसपास की हड्डियों, स्नायुओं, मांसपेशियों और तंत्रिका गैंगलिया के भीतर पृष्ठीय और बाद में कशेरुकी शरीर से बाहर निकलने वाले इंट्रावर्टेब्रल जहाजों के दृश्य पर कब्जा कर लिया।

डीसीएलएन ड्रेनेज की फ्लोरेसेंस मैक्रोस्कोपी इमेजिंग
सीएनएस से जुड़े लिम्फेटिक सिस्टम में मैक्रोमॉल्यूल ड्रेनेज की छवि बनाने के लिए, मैक्रोमॉलिकुलर ट्रेसर्स को वीवो में इंजेक्शन द्वारा सीएसएफ या स्पाइनल पैरान्चिमा में प्रशासित किया गया था। एक मैक्रोमॉलिकुलर ट्रेसर को आसानी से सिस्टर्ना मैग्ना में सीएसएफ में वितरित किया जा सकता है। सिस्टर्ना मैग्ना फोरमेन मैग्नम के ऊपर सेरिबैलम और मेडुला ओब्लोंगटा की पृष्ठीय सतह के बीच स्थित है। मैक्रोमॉलिकुलर ट्रेसर को कशेरुकी कॉलम के साथ विभिन्न स्तरों पर स्टीरियोटैक्टिक सर्जरी द्वारा स्पाइनल पैरान्चिमा में भी इंजेक्ट किया जा सकता है।

उपयोग किए जाने वाले मैक्रोमॉलिक्यूलर ट्रेसर या तो सीधे फ्लोरोफोर के साथ लेबल किए गए थे या विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा पोस्टमॉर्टम का पता लगाया गया था। चित्रा 2A OVA-A555,एक लाल फ्लोरोसेंट और छोटे आणविक वजन ट्रेसर (लगभग 45 केडीए) पर नज़र रखने के लिए प्रायोगिक योजना को दिखाता है, जिसे सीएसएफ(चित्रा 2B)या रीढ़ की हड्डी के थएलबी क्षेत्र(चित्रा 2C)में इंजेक्ट किया गया था।

मैक्रोमॉलिक्यूलर ट्रेसर इंजेक्शन के बाद 45 मिनट पर, चूहों का बलिदान किया गया था, 4% पीएफए के साथ छिद्रित किया गया था, और सिर के मस्तिष्क स्टेम क्षेत्र के विच्छेदित खंडों और कशेरुकी स्तंभ को अलग करने के लिए संसाधित किया गया था जिन्हें डिक्लेयर और स्पष्ट किया गया था। मैक्रोमॉल्यूल ड्रेनेज को तब एलएन की फ्लोरेसेंस मैक्रोस्कोपी इमेजिंग द्वारा आसानी से मूल्यांकन किया गया था जो सीएसएफ और एपीड्यूरल तरल पदार्थ इकट्ठा करते हैं। जैसा कि चित्रा 2में दिखाया गया है, ओवी-ए555 इंजेक्शन या तो सीएसएफ(चित्रा 2B)या रीढ़ की हड्डी के टीएचएलबी(चित्रा 2 सी)क्षेत्र में इंजेक्शन के बाद 45 मिनट पर डीसीएलएन में555 संचय हुआ। यह अवलोकन लिम्फेटिक सिस्टम द्वारा फ्लोरोसेंट ट्रेसर के तेज और जल निकासी को इंगित करता है; कशेरुकी लसीका जल निकासी की छवि के लिए iDISCO+/LSFM प्रक्रिया का पीछा करने से पहले यह एक शर्त है ।

कशेरुका लिम्फेटिक सिस्टम में मैक्रोमॉल्यूल ड्रेनेज की 3डी इमेजिंग
डीसीएलएन में ओवीए-ए555 लेबलिंग का पता लगाने के आधार पर, आईवीए-ए-इंजेक्शन चूहों से अलग किए गए डीवीए-ए555-इंजेक्शन वाले नमूनों को डिक्लेयर और प्रीक्लियर किए गए कशेरुकी नमूनों पर iDISCO + /LSFM प्रक्रिया लागू की जा सकती है। इस दृष्टिकोण ने ट्रेसर इंजेक्शन के बाद एक विशिष्ट समय बिंदु पर सीएसएफ और स्पाइनल एपिड्यूरल तरल पदार्थ के लिम्फेटिक ड्रेनेज के 3 डी मानचित्र के निर्माण की अनुमति दी। यह 3 डी मानचित्रण इंजेक्शन बिंदु से कशेरुकी कॉलम के प्रत्येक स्तर पर लगातार सीएनएस सेगमेंट इमेजिंग द्वारा किया जा सकता है।

चित्रा 3 ए THLb रीढ़ की हड्डी परेंचिमा में OVA-A555 इंजेक्शन के लिए प्रायोगिक डिजाइन और एक गर्भाशय ग्रीवा में ओवी-ए555 वितरण के परिणामस्वरूप 3 डी पैटर्न और लिम्फेटिक वैक्यूलेचर के साथ संयोजन के रूप में एक छाती कशेरुकी खंड से पता चलता है। ओवा-ए555 इंजेक्शन के बाद 45 मिनट पर, ओडब्ल्यूए-ए555 संचय रीढ़ की हड्डी के ऊतकों और डीसीएलएन (चित्रा 3बीमें सफेद तीर) में पता चला, चित्र 2में सचित्र माइक्रोस्कोप टिप्पणियों के साथ समझौते में। हालांकि, यह पता नहीं चला था, गर्भाशय ग्रीवा और वक्ष लिम्फेटिक वैकुलेचर में एंटी-LYVE1 एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया था। कशेरुकी लिम्फेटिक जहाजों में सीएसएफ-इंजेक्शन ट्रेसर की अनुपस्थिति या तो लिम्फेटिक जहाजों के अंदर ट्रेसर के एक छोटे हठ समय या लिम्फेटिक जहाजों(चित्रा 3 सी)द्वारा ट्रेसर के तेज की कमी के कारण हो सकती है।

पहली परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, खरगोश एंटी-LYVE1 एंटीबॉडी का उपयोग सीएनएस से जुड़े लिम्फेटिक जहाजों को बांधने के लिए लिम्फेटिक एंडोथेलियल सेल टैग के रूप में किया गया था। इंजेक्शन खरगोश विरोधी LYVE1 एंटीबॉडी इसके बाद इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा एक एंटी-खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ पता लगाया गया था, जबकि लिम्फेटिक एंडोथेलियल कोशिकाओं को एंटी-प्रोक्स1 एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोलेबल किया गया था । चित्रा 4 ThLb रीढ़ की हड्डी परेंचिमा(चित्रा 4A)में एंटी-LYVE1 इंजेक्शन के प्रयोगात्मक डिजाइन का प्रतिनिधित्व करता है, और जिसके परिणामस्वरूप LYVE1 एंटीबॉडी के परिणामस्वरूप 3 डी वितरण पैटर्न इंजेक्शन साइट के करीब एक ThLb खंड में, PROX1+ लिम्फाटिक्स(चित्रा 4B)के संबंध में। कशेरुकी लिम्फेटिक और उनके एक्सवर्टरल लिम्फेटिक कनेक्शन दोनों को एंटी-LYVE1 एंटीबॉडी द्वारा लेबल किया गया था, जिसने कशेरुकी लिम्फेटिक जहाजों और बाहरी लिम्फेटिक सिस्टम की ओर लिम्फेटिक जल निकासी द्वारा ट्रेसर तेज को प्रमाणित किया। टीएचएलबी क्षेत्र में एलएन की कमी थी और इस प्रकार, चित्रित खंड में कल्पना नहीं की जा सकती थी। इसके अलावा, लिम्फेटिक जहाजों के साथ मनाए गए LYVE1 मार्कर के असतत पैटर्न ने लिम्फेटिक वैक्यूलेचर में LYVE1 की असतत अभिव्यक्ति को प्रतिबिंबित किया, जैसा कि पिछले अध्ययनों में14,,21था। कुल मिलाकर, वर्तमान अध्ययन के परिणामों से पता चला है कि, ट्रेसर इंजेक्शन के बाद 45 मिनट में, LYVE1 एंटीबॉडी, लेकिन ओवा-ए555नहीं, स्थानीय कशेरुकी लिम्फेटिक तेज का पता लगाने की अनुमति दी और स्थानीय कशेरुकी लिम्फेटिक जल निकासी के लगातार मार्कर के रूप में ओवा-ए555 के लिए पसंद किया गया था।

Figure 1
चित्र 1: कशेरुकी लिम्फेटिक वाक्यूलेचर का त्रि-आयामी दृश्य। (A)प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ख)एक डोरसोफ्रंटल परिप्रेक्ष्य से Thlb कशेरुकी लसीका वास्कुलेचर के एक 3 डी दृश्य का Planar प्रक्षेपण । लिम्फेटिक जहाजों को iDISCO+ प्रोटोकॉल का उपयोग करके एंटी-प्रोक्स 1 एंटीबॉडी (ग्रीन) के साथ इम्यूनोलेबल किया गया था और फिर एलएसएफएम द्वारा इमेज किया गया था। लगातार तीन कशेरुकी (सफेद तीर) के कशेरुकी नहर के भीतर वैक्यूलेचर के मेटामेरिक जैसे पैटर्न पर ध्यान दें। अर्धवृत्ताकार पृष्ठीय जहाजों (सफेद तीर) के अलावा, प्रत्येक कशेरुकी नेटवर्क में वेंट्रल शाखाएं (पीले तीर), रीढ़ की हड्डी रामी और गंगलिया (सफेद तीर) के साथ द्विपक्षीय पार्श्व निकास मार्ग, साथ ही मिडलाइन (सफेद डबल एरो) पर एक पृष्ठीय निकास मार्ग शामिल थे। कशेरुकी नेटवर्क एक देशांतर पोत (बैंगनी तीर) से जुड़े हुए थे। एक पूर्ण विवरण के लिए, जैकब एल एट अल देखें18 अनुसूचित जाति = रीढ़ की हड्डी; एस्टरिस्क = वेंट्रल कशेरुका शरीर; D = पृष्ठीय; एल = पार्श्व; V = वेंट्रल; स्केल बार = 300 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: dcLNs एकत्र OVA-A555-लेबल CSF तरल पदार्थ. {प्रायोगिकडिजाइन की योजना। OVA-एक५५५ या तो ICM या ThLb रीढ़ की हड्डी परेंचिमा में इंजेक्शन था, तो चूहों इंजेक्शन के बाद ४५ मिनट बलिदान किया गया । नमूनों को फ्लोरेसेंस मैक्रोस्कोप इमेजिंग(बी,सी)द्वारा मंजूरी दी गई और देखा गया। आईसीएम से गर्भाशय ग्रीवा कशेरुकी की फ्लोरेसेंस मैकरोस्कोप छवियां-(बी)और थएलबी-(सी)इंजेक्शन चूहों। ध्यान दें कि ओवी-ए555 डीसीएलएन(बी,सी,सफेद एरोहेड), ग्रीवा रीढ़ की हड्डी(बी,सी)के पियाल और पैरास्कुलर रिक्त स्थान और आईसीएम इंजेक्शन के बाद, वेंट्रोलेट्रल निकास मार्गों में, गर्भाशय ग्रीवा नसों(बी,सफेद तीर) के साथ संभावित रूप से जमा होता है। अनुसूचित जाति = रीढ़ की हड्डी। एस्टरिस्क = वेंट्रल कशेरुका शरीर; D = पृष्ठीय; एल = पार्श्व; V = वेंट्रल; बी और सी = 2 मिमी में स्केल बार । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: कशेरुकी लिम्फेटिक सिस्टम में ओवीए-ए555-लेबलवाले सीएसएफ तरल पदार्थों का पता लगाना। {प्रायोगिकडिजाइन की योजना। ओवा-ए५५५ को थएलबी स्पाइनल पैरान्चिमा में इंजेक्ट किया गया था, फिर इंजेक्शन के बाद ४५ मिनट पर चूहों की बलि दी गई । नमूनों का इलाज आईआईडस्को+ प्रोटोकॉल के साथ किया गया और एलएसएफएम के साथ चित्रित किया गया। ((B,C) एलएसएफएम-कैप्चर किए गए ललाट 3डी दृश्यों के ग्रीवा(बी)और छाती(सी)स्पाइन सेगमेंट के प्लानर अनुमान। ओवीए-ए555 संचय (लाल) रीढ़ की हड्डी के ऊतकों और डीसीएलएन(बी,सफेद तीर) में पाया गया था, जैसा कि चित्र 2में दर्शाया गया है, लेकिन गर्भाशय ग्रीवा और वक्ष लिम्फेटिक वैक्यूलेचर इम्यूनोलेबल में एंटी-LYVE1 एंटीबॉडी (हरा) के साथ नहीं। अनुसूचित जाति = रीढ़ की हड्डी; एस्टरिस्क = वेंट्रल कशेरुका शरीर; D = पृष्ठीय; एल = पार्श्व; V = वेंट्रल; स्केल बार = 1 मिमी(बी),300 माइक्रोन(सी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: एंटी-LYVE1 एंटीबॉडी के इंट्रास्पिनल इंजेक्शन के बाद कशेरुकी लिम्फेटिक ड्रेनेज का पता लगाना। {प्रायोगिकडिजाइन की योजना। एंटी-LYVE1 एंटीबॉडी को थएलबी स्पाइनल पैरान्चिमा में इंजेक्ट किया गया था, फिर इंजेक्शन के बाद चूहों को ४५ मिनट का बलिदान दिया गया । नमूनों का इलाज आईआईडस्को+ प्रोटोकॉल के साथ किया गया और एलएसएफएम के साथ चित्रित किया गया। (ख)एलएसएफएम के साथ कैप्चर किए गए थएलबी(बी)स्पाइन सेगमेंट के फ्रंटल 3डी व्यूज के प्लानर अनुमान । एंटी-LYVE1 एंटीबॉडी एंटी-रैबिट एंटीबॉडी (बैंगनी) और एंटी-प्रोक्स 1 एंटीबॉडी (हरे रंग) के साथ लिम्फेटिक वैक्यूलेचर के साथ पाया गया था। सफेद जहाजों को एंटी-LYVE1 एंटीबॉडी(बी)के साथ PROX1+ लिम्फाटिक्स कोलेबल किया जाता है; इनमें कशेरुकी (पीले तीर) और एक्सट्रावर्टेब्रल (डबल येलो एरो) लिम्फाटिक्स शामिल हैं। अनुसूचित जाति = रीढ़ की हड्डी; एस्टरिस्क = वेंट्रल कशेरुका शरीर; D = पृष्ठीय; एल = पार्श्व; V = वेंट्रल; स्केल बार = 300 माइक्रोन(बी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अभिकर्मकों लक्ष्य आंकड़ा प्रोटोकॉल कदम टिप्पणी
ओवा-ए555 सीएसएफ ट्रेसर चित्रा 2 और चित्रा 3 2. आईसीएम या ThLb इंजेक्शन
7. एलएसएफएम इमेजिंग।		 पानी में घुलनशील, इंजेक्शन और उच्च तीव्र फ्लोरेसेंस के लिए आसान
एंटी-Lyve1 एंटीबॉडी एलवी कोशिकाओं का झिल्ली मार्कर अंक 3 6. iDISCO + पूरे माउंट immnunostaining ।
7. एलएसएफएम इमेजिंग।		 पूरे माउंट immnunostaining के लिए कुशल एंटीबॉडी
ड्यूरल और एपीड्यूरल एलवी का ट्रेसर ड्रेनेज अंक 4 2. आईसीएम या ThLb इंजेक्शन
6. iDISCO + पूरे माउंट immnunostaining
7. एलएसएफएम इमेजिंग
एंटी-प्रॉक्स1 एंटीबॉडी एलवी कोशिकाओं का परमाणु मार्कर चित्रा 1 और चित्रा 4 6. iDISCO + पूरे माउंट immnunostaining
7. एलएसएफएम इमेजिंग		 पूरे माउंट immnunostaining के लिए कुशल एंटीबॉडी

तालिका 1: अध्ययन में एंटीबॉडी और ट्रेसर का उपयोग किया जाता है।

समस्या संभावित कारण समाधान
ट्रेसर इंजेक्शन के लिए सर्जरी अवांछित सीएनएस ऊतक घाव 1. कांच केशिका प्रविष्टि के नियंत्रण की कमी
2. कांच केशिका प्रविष्टि की गलत गहराई		 1. देखभाल के साथ समयनिष्ठ, लेकिन पूरी तरह से, कांच के केशिका प्रविष्टि से पहले 26 जी सुई के साथ ड्यूरा मेटर।
2. कांच केशिका प्रविष्टि की गहराई को कम करें (ड्यूरा मेटर से <1.5 मिमी)।
3. कांच केशिका व्यास को कम करें।
एपिड्यूरल या एक्स्ट्रा कशेरुकी स्थानों में इंजेक्ट किए गए ट्रेसर का अवांछित अशुद्धि ट्रेसर का गलत इंजेक्शन 1. जांच लें कि क्या कांच के माइक्रो केशिका को ड्यूरा मेटर को पंक्चर में अच्छी तरह से डाला गया है।
2. ट्रेसर इंजेक्शन से पहले ग्लास माइक्रोकैपिलरी और घिरे ऊतक के बीच सर्जिकल गोंद जोड़ें।
इंजेक्शन ट्रेसर की अत्यधिक मात्रा इंजेक्ट किए गए ट्रेसर (एंड एलटी;2 माइक्रोल) की मात्रा कम करें।
आईडिस्को + इम्यूनोस्टेपिंग ऊतक में लेबलिंग की अनुपस्थिति, विषमता या अत्यधिक पृष्ठभूमि 1. प्राथमिक एंटीबॉडी की एकाग्रता के साथ मुद्दे
2. अपर्याप्त पारमेबिलाइजेशन
3. अपर्याप्त धुलाई
4. अपर्याप्त समाशोधन		 संख्या और/या इनक्यूबेशन चरणों के समय में वृद्धि: पारमेबिलाइजेशन, whashing, प्राथमिक एंटीबॉडी और समाशोधन । http://www.idisco.info देखें (एफएक और समस्या निवारण)।
अपर्याप्त डिक्लेक्टिफिकेशन विशेष रूप से सिर के ऊतकों के लिए EDTA21 या मोर्स समाधान के साथ नमूने के अधिक कठोर डिकलेक्टिफिकेशन उपचार का उपयोग करें।
आईडिस्को + समाशोधन नमूने अपारदर्शी या भूरे रंग के होते हैं अपर्याप्त ब्लीचिंग ताजा एच2O2 समाधान का उपयोग करें, मात्रा में वृद्धि और/या इनक्यूबेशन समय ।
ऑक्सीकरण की उपस्थिति हवा की उपस्थिति से बचने के लिए ट्यूब को पूरी तरह से भरें।
अपर्याप्त समाशोधन मात्रा और/या इनक्यूबेशन समय बढ़ाएं । http://www.idisco.info देखें (एफएक और समस्या निवारण)।
ट्रेसर डिटेक्शन अज्ञेय ट्रेसर चयनित ट्रेसर का गलत संयोजन एलेक्सा 555, 594 और 647 फ्लोरोक्रोम आईडिस्को + प्रोटोकॉल,5, 6,7,,6,8,,9,10के प्रतिरोधी हैं।, हालांकि, फिटसी, जीएफपी, आरएफपी फ्लोरोक्रोम के लिए यह मामला नहीं है।
इंजेक्शन के बाद समय का त्याग स्थानीय कशेरुकी लिम्फाटिक्स में अल्पकालिक (15 मिनट) जल निकासी विश्लेषण के लिए ओवा-ए555 पसंद करें। लिम्फ नोड्स ड्रेनेज विश्लेषण के लिए, ओवीए-ए555 और लिवे1 एंटीबॉडी का उपयोग लंबी अवधि (>45 मिनट) विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।
इमेजिंग: कैप्चर और विश्लेषण लिम्फेटिक सर्किट की कैप्चर की गई छवियां संतोषजनक नहीं हैं विच्छेदन मुद्दा (लिम्फ नोड्स गायब हैं) आप छवि चाहते हैं कि लसीड़ा सर्किट के अनुसार, अपने विच्छेदित नमूने में कशेरुकी/खोपड़ी पड़ोसी ऊतकों को ध्यान से शामिल करें।
इमेजिंग मुद्दा 1. एलएसएफएम के अधिग्रहण मापदंडों को संशोधित करें: लेजर तीव्रता, प्रकाश-शीट संख्यात्मक अपर्चर, प्रकाश-शीट की मोटाई, प्रदर्शनी समय।
2. उद्देश्य तक ऊतक के माध्यम से प्रकाश द्वारा यात्रा पथ को कम करने के लिए नमूना को समर्थन में रखें।
3. सुनिश्चित करें कि अधिग्रहण के दौरान ऊतक नमूने के अंदर कोई बुलबुले नहीं हैं।

तालिका 2: संभावित मुद्दों और समाधानों सहित प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण के लिए समस्या निवारण सलाह।

Discussion

iDISCO+/LSFM प्रोटोकॉल एक सेलुलर संकल्प स्तर पर अपने आसपास के ऊतकों के भीतर सीएनएस से जुड़े लसीका नेटवर्क के अभूतपूर्व 3 डी विचार प्रदान करता है । यह प्रोटोकॉल मध्यम आकार के नमूनों के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित है, 1.5 सेमी3नहीं, एलएसएफएम ऑप्टिकल सिस्टम की सीमाओं, कम काम की दूरी और उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी23के लिए वाणिज्यिक उद्देश्य लेंस के बड़े आकार के कारण। यह सीमा पूरे मस्तिष्क से जुड़ी लिम्फेटिक प्रणाली को कैप्चर करने से रोकती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि जांच के क्षेत्र को सावधानी से सीमित किया जाना चाहिए और सीएनएस के आसपास के ऊतकों को सावधानीपूर्वक विच्छेदित किया जाना चाहिए ताकि एक्सट्राक्रैनियल लिम्फेटिक जहाजों और एलएन को शामिल किया जा सके जो पूरे लिम्फेटिक सर्किटरी(तालिका 2)में योगदान देते हैं।

आकार और शारीरिक विचारों के अलावा, आसपास के मेसेंचिमल ऊतकों की जटिलता खोपड़ी और कशेरुकी स्तंभ के साथ भिन्न होती है, जिसके लिए एक सजातीय नमूना स्पष्टीकरण प्राप्त करने और नरम आइसोट्रोपिक जैविक ऊतक के भीतर प्रकाश बीम प्रचार की अनुमति देने के लिए डिक्लेबिलिटी और प्रीक्लीयरिंग उपचार के अनुकूलन की आवश्यकता होती है। हड्डियों के अभाव में, मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के एलएफएसएम इमेजिंग को डिकलिफिकेशन चरण की आवश्यकता नहीं होती है, और कैप्चर की गई छवियों का अंतिम संकल्प इष्टतम19है। उपरोक्त वर्णित प्रोटोकॉल, जिसमें मोर्स के समाधान के साथ एक हल्का डिक्लेक्टिफिकेशन कदम शामिल है, को चित्र 1 और चित्रा 4में सचित्र कशेरुका स्तंभ के एलएसएफएम इमेजिंग के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित किया गया है। इसके विपरीत, गर्दन क्षेत्र मांसपेशियों, वसा और ग्रंथि ऊतकों की कई परतों के अलावा एक विशेष रूप से जटिल हड्डी शरीर रचना विज्ञान प्रदर्शित करता है, जो चित्र 3बीमें परिलक्षित होने वाले एलएसएफएम छवियों की गुणवत्ता को कम करता है। इस प्रकार ऊतकों के अधिक कठोर उपचार से गर्दन और गर्भाशय ग्रीवा क्षेत्र की एलएसएफएम इमेजिंग में सुधार हो सकता है; उदाहरण के लिए, EDTA के साथ, जैसा कि पहले24रिपोर्ट किया गया था । इसलिए डिक्लेक्टिफिकेशन स्टेप महत्वपूर्ण है और डिक्लेक्टिफिकेशन कंडीशन को पहले पूर्ण iDISCO+ प्रोटोकॉल(टेबल 2)शुरू करने से पहले इस्तेमाल किए जाने वाले प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए ।

जबकि iDISCO+/LSFM प्रोटोकॉल मेनिंगियल और एपीड्यूरल रिक्त स्थान और संबद्ध एलएन के बीच सर्किट को जोड़ने के 3 डी दृश्य की उत्पादन की अनुमति देता है, LSFM-कैप्चर की गई छवियों से लिम्फेटिक वैक्यूलेचर का प्रत्यक्ष मात्रात्मक विश्लेषण निम्नलिखित कारणों से संभव नहीं है: 1) लिम्फेटिक मार्कर अभिव्यक्ति के असतत पैटर्न के कारण लिम्फेटिक पोत सर्किट का चित्रण अविश्वसनीय है, क्योंकि मेम्ब्रानार LYVE1 को21 वितरित किया गया है और प्रोक्स 1 में परमाणु अभिव्यक्ति पैटर्न22है; 2) एंटीबॉडी के विषम प्रवेश, साथ ही साथ एनिसोट्रोपी जो अपूर्ण और विषम डिसलिफिकेशन और प्रीक्लीयरिंग के कारण जैविक ऊतकों में बनी रह सकती है। एलएसएफएम इमेजिंग को इस प्रकार आभासी वास्तविकता उपकरणों द्वारा विस्तारित करने की आवश्यकता है जो इंटरैक्टिव दृश्य को सक्षम करते हैं और इस प्रकार लिम्फेटिक वैक्यूलेचर (www.syglass.io) के मात्राकरण की सुविधा प्रदान करते हैं। यह भी उल्लेखनीय है कि सीएनएस से जुड़े सर्किटरी के सटीक विवरण के लिए एलएसएफएम जानकारी को उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल डेटा के साथ समर्थन देने की आवश्यकता होती है, जो पारंपरिक इम्यूनोलाबेलिंग द्वारा प्राप्त की गई पतली (5-10 माइक्रोन) क्रायोस्टेट या पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक वर्गों पर है, विशेष रूप से ड्यूरा मेटर और सीएसएफ के संबंध में लिम्फेटिक जहाजों की स्थिति को ठीक से स्थानीयकृत करने के लिए, जैसा कि पहले11,14,,18बताया गया था।,

आईआईडस्को+/LSFM प्रोटोकॉल सीएनएस से जुड़े लिम्फेटिक सिस्टम में मैक्रोमॉलिक्यूलर ड्रेनेज के त्रि-आयामी दृश्य की अनुमति देता है, जैसा कि चित्र 3 और चित्रा 4 में दर्शाया गया है । Figure 4 हालांकि, लिम्फेटिक ड्रेनेज के कार्यात्मक मूल्यांकन की आवश्यकता होती है, उपरोक्त विस्तृत iDISCO+/LSFM प्रोटोकॉल पर सिफारिशों के अलावा, एक कठोर प्रक्रिया का पालन करते हुए, क्योंकि अंतिम परिणाम इंजेक्शन सर्जरी की गुणवत्ता, वितरण स्थल की पसंद, मैक्रोमॉलिकेल मार्कर के प्रकार और इंजेक्शन मात्रा पर निर्भर करता है, और ट्रेसर प्रशासन(टेबल 2)के बाद बलिदान कासमय। इंजेक्शन जानवरों के बीच ट्रेसर पैटर्न की विविधताओं के कारण, लिम्फेटिक ड्रेनेज सर्किट के लक्षण वर्णन के लिए बड़े प्रायोगिक समूहों (इंजेक्शन की स्थिति से & 10) की आवश्यकता होती है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, 1) ड्यूरा मेटर को इंजेक्शन से पहले पंचर किया जाना चाहिए ताकि अवांछित घावों और सीएनएस ऊतकों में प्रवेश को रोका जा सके; 2) इंजेक्शन की मात्रा को इंजेक्शन छेद के माध्यम से अवांछित प्रसार को सीमित करने के लिए इंजेक्शन केशिका के साथ, एपीड्यूरल स्पेस या एक्सवर्टेब्रल ऊतकों में इंजेक्शन की मात्रा 2 माइक्रोन से कम होनी चाहिए; 3) इंजेक्शन केशिका प्रविष्टि की गहराई को क्रमशः आईसीएम और इंट्रास्पिनल इंजेक्शन में सीएनएस चोट या मिस्टैर्गेटिंग से बचने के लिए ड्यूरा मेटर के नीचे 2 मिमी तक सीमित होना चाहिए। यह भी ध्यान दें कि पड़ोसी कशेरुकी खंडों के एक पूरक उच्च संकल्प कॉन्फोकल विश्लेषण किया जाना चाहिए, जैसा कि ऊपर संकेत दिया गया है, लिम्फेटिक जहाजों के अंदर इंजेक्शन ट्रेसर की उपस्थिति का आकलन करने के लिए। इस विश्लेषण में ट्रेसर के लिए तीव्रता प्रोफाइल भूखंडों और मार्कर-लेबल वाले लिम्फेटिक जहाजों के क्रॉस सेक्शन पर लिम्फेटिक मार्कर की स्थापना की आवश्यकता होती है। इस दृष्टिकोण को पहले इंजेक्शन के बाद 15 मिनट में ThLb लिम्फाटिक्स द्वारा OVA555 तेज प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है (याकूब एट अल में पूरक चित्रा5F)। हालांकि, यह वर्तमान अध्ययन(चित्रा 4)में एंटी-LYVE1 ट्रेसर के लिए सचित्र नहीं किया गया है ।

संभावित सीएसएफ ट्रेसर्स में, ओवीए-ए555 एक उत्कृष्ट विकल्प है क्योंकि यह आईआईडस्को+ प्रोटोकॉल उपचार के लिए प्रतिरोधी है और एलएसएफएम इमेजिंग के लिए उच्च फ्लोरेसेंस रखता है। हालांकि, ध्यान दें कि ट्रेसर के प्रकार को विश्लेषण समय बिंदु(तालिका 1 और तालिका 2)के अनुसार चुना जानाचाहिए। जैसा कि ऊपर बताया गया है, स्थानीय कशेरुकी लिम्फेटिक जहाजों की ओवा-ए555 लेबलिंग इंजेक्शन14के बाद 15 मिनट पर देखी जाती है। हालांकि, OVA-A555 अब एंटी-LYVE1 एंटीबॉडी (चित्रा 4) के विपरीत इंजेक्शन(चित्रा 3)के बादFigure 445 मिनट पर इन स्थानीय लसीका सर्किट में पता नहीं चला है।

समाप्त करने के लिए, iDISCO+/LSFM प्रोटोकॉल अच्छी तरह से 3 डी संरचना और सीएनएस से जुड़े लिम्फेटिक प्रणाली के जल निकासी की जांच के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित है जैसे सीएनएस और कशेरुकी कॉलम कैंसर, या कशेरुकी हड्डी और संयुक्त रोगों के रूप में शारीरिक और रोग की स्थिति में । हालांकि पूरी प्रक्रिया लंबी है और पद्धतिगत कठोरता की आवश्यकता है, यह मूल्यवान, अद्वितीय जानकारी प्रदान करता है जब आभासी वास्तविकता उपकरण और उच्च संकल्प कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग कर पूरक विश्लेषण के साथ इस्तेमाल किया ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को इंस्टीटयूट नेशनल डी ला सेंटे एट डी ला रेचेचे मेडिकल द्वारा समर्थित किया गया था, Agence Nationale Recherche (ANR-17-CE14-0005-03), फेडरेशन डालना ला Recherche सुर le Cerveau (FRC २०१७), Carnot Maturation (एल जे के लिए), Universidade फेडरल डी रियो डी Janiero (जेबी के लिए UFRJ), NIH (R01EB016629-01) और येल स्कूल हम आईसीएम प्लेटफार्मों को स्वीकार करते हैं: सेलुलर इमेजिंग के लिए आईसीएम-क्वांट और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए आईसीएम-हिस्टोमिक्स। सभी पशु कार्य फेनो-आईसीमाइक सुविधा में आयोजित किए गए थे। कोर को 2 "इन्वेस्टिसमेंट्स डी एवेनिर" (एएनआर-10- आईएआईएचयू-06 और एएनआर-11-आईएनबीएस-0011-न्यूरेट्रिस) और "प्रियतम डालना ला रेचेचे मेडिडेल" द्वारा समर्थित है। हम विधि पद्धति सलाह और पांडुलिपि पढ़ने के लिए निकोलस रेनियर स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables
Centrifuge tubes: 0.2ml Eppendorf 30124359
Centrifuge tubes: 2ml Eppendorf 30120094
Conical centrifuge tubes: 15ml Falcon 352096
Conical centrifuge tubes: 50ml Falcon 352070
Microtome blade 80mm Microm Microtech France F/MM35P
Needles 26G (0.45x13 mm) Terumo AN*2613R1
Syringe 1ml Terumo SS+01H1
Microscopes and imaging softwares
AxioZoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope, equipped with an ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera (Hamamatsu Photonics) or an OptiMOS sCMOS camera Zeiss
Imspector Microscope controller software, Version v144 (acquisiton software) Abberior instruments
Imaris File Converter x64 9.2.0(file convertion software) , Imaris stitcher software 9.2.0 (stitcher software), Imaris x64 9.2.0 (3D software) OXFORD instruments
LED lasers (OBIS) LVBT Laser module 2nd generayion COHERENT
Ultramicroscope II equipped with a sCMOS camera (Andor Neo) and a 4 × /0.3 objective lens (LVMI-Fluor WD6) LaVision Biotec
Reagents
Alexa Fluor 568 Donkey anti Rabbit Thermo Fisher A10042
Alexa Fluor 647 Donkey anti goat Jackson ImmunoResearch 705-605-147
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit Jackson ImmunoResearch 711-605-152
Anti-LYVE1 polyclonal antibody Angiobio #11-034
Anti-PROX1 goat polyclonal IgG antibody R&D systems #AF2727
Buprenorphine Injection Ampoules (Buprecare solution, 0.3mg/ml) Animalcare Ampule 1ml
Dibenzyl Ether 100% (DBE) Sigma Aldrich 108014
Dichloromethane 100% (DCM) Sigma Aldrich 270997
Formic acid 99% CARLO ERBA 405793
Glycine Sigma Aldrich G.7126
Heparine sodium salt from porcine Sigma Aldrich H4784
Hydrogen peroxide solution (H2O2 30%) Sigma Aldrich H1009
Isoflurane (Iso-Vet 100%) Piramal NDC 66794-013-10
Methanol 100% Sigma Aldrich 322415
Ovalbumin Alexa Fluor 555 Conjugate Invitrogen 11549176
Phosphate Buffer Solution PBS (stock solution 10X) Euromedex ET330-A
Sodium Pentobarbital (Euthasol 400mg/mL) Dechra 08718469445110
Tri-sodium citrate VWR 6132-04-3
Surgical tools and equipments
Anaesthesia system Univentor Univentor 410 Anaesthesia Unit
Glass micropipette puller Narishige PC-10
Heating pad CMA Microdialysis AB CMA 450 Temperature controller
Microcapillaries (Glass Capillaries) Harvard Apparatus GC120-15
Microforceps, forceps,dissection scissors and Michel Suture Clips (7.5 × 1.75mm) Fine Science Tool 12040-01
Scalpel (sterile disposable scalpel 23) Swann-Norton 0510
Stereotaxic apparatus KOPF Model 940
Syringe Hamilton 10µl 701N Hamilton 28618-U
Warm air System Vet-Tech LTD HE011

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 159 मेनिंगियल और कशेरुकी लिम्फेटिक वैक्यूलेचर लिम्फ नोड्स ड्रेनेज आईडिस्को+,लाइट शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप केंद्रीय तंत्रिका तंत्र
आईडिस्को<sup>+</sup> और लाइट शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कशेरुकी लिम्फेटिक वाक्यूलेचर और ड्रेनेज की त्रि-आयामी इमेजिंग
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Jacob, L., Brito, J., Thomas, J. L.… More

Jacob, L., Brito, J., Thomas, J. L. Three-Dimensional Imaging of the Vertebral Lymphatic Vasculature and Drainage using iDISCO+ and Light Sheet Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (159), e61099, doi:10.3791/61099 (2020).

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