Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

التصوير ثلاثي الأبعاد للأوعية الدموية اللمفية الفقارية والصرف باستخدام iDISCO+ والمجهر الفلوري ورقة الضوء

Published: May 22, 2020 doi: 10.3791/61099
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,3
1Université Pierre et Marie Curie Paris, Sorbonne Université, Institut du Cerveau et de la Moelle Epinière, 2Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 3Department of Neurology, Yale University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

يتم تقديم بروتوكول يجمع بين إزالة الأنسجة مع المجهر الفلوري ورقة الضوء (LSFM) للحصول على صور ثلاثية الأبعاد والخلوية دقة الأوعية اللمفاوية والعقد الليمفاوية (LNs) جمع السائل النخاعي (CSF) والسوائل فوق الجافية الشوكي.

Abstract

الجهاز اللمفاوي المرتبط بالجهاز العصبي المركزي (CNS) يشمل الأوعية اللمفاوية التي تدور حول الدماغ والحبل الشوكي واللسنان المرتبطة بها. ويشارك الجهاز اللمفاوي المرتبط ب CNS في تصريف الجزيئات الضامة CSF والخلايا المناعية السحائية نحو النفثالينات التي تستنزف الجهاز العصبي المركزي، وبالتالي تنظيم إزالة النفايات والمراقبة المناعية داخل أنسجة الجهاز العصبي المركزي. يقدم هو نهج جديد للحصول على ثلاثي الأبعاد (3D) وصور القرار الخلوية من اللمفاويات المرتبطة CNS مع الحفاظ على سلامة دوائرها داخل الأنسجة المحيطة بها. يستخدم بروتوكول iDISCO+ لأوعية اللمفاوية في مستحضرات الزاميكبل ومصونة كاملة من العمود الفقري التي يتم تصويرها في وقت لاحق مع المجهر الفلورية ورقة الضوء (LSFM). وتكشف هذه التقنية عن البنية ثلاثية الأبعاد للشبكة اللمفاوية التي تربط المساحات السحاية وفوق الجافية حول الحبل الشوكي بالأوعية اللمفاوية خارج الفقر. وتقدم صور 3D من دوائر الصرف من المقتفيات الجزيئية حقن سابقا في إما CSF عبر ماغنا cisterna أو البارنشيما الشوكي الصدري. يقدم نهج iDISCO+/ LSFM فرصًا غير مسبوقة لاستكشاف بنية ووظيفة الجهاز اللمفاوي المرتبط ب CNS في علم الأحياء العصبية الوعائية ، وعلم المناعة العصبية ، وسرطان الدماغ والفقاري ، أو العظام الفقارية وبيولوجيا المفاصل.

Introduction

ويحيط الجهاز العصبي المركزي من قبل CSF وطبقات من الطبقات من السحايات، والأنسجة فوق الجافية، والعظام. وإجمالا، يوفر CSF الحماية المادية للدماغ الناعم والحبل الشوكي. ويفرز أساسا من قبل plexus المشيمية والأغشية السحائية (أي، ماطر بيا، arachnoid، وماطر دورا). كما ينشئ مجمع CSF-meningeal واجهة وظيفية بين أنسجة الجهاز العصبي المركزي وبقية الجسم، مما يساهم في تحلل الجهاز العصبي المركزي. أولاً، تخترق CSF الجهاز العصبي المركزي من خلال المساحات شبه الشريانية للجهاز العصبي المركزي وتتفاعل ديناميكيًا مع السائل الخلالي (ISF)1 عبر نظام الزلمية (glia-lymphatic) الذي يتكون من المساحات شبه الوعائية وأغشية نهاية القدمين الفلكية حول أوعية الجهاز العصبي المركزي2،3،4. ثم يتم مسح النفايات الأيضية والسوائل الزائدة في نهاية المطاف عن طريق الصرف الصحي داخل الجسمية الداخلية مباشرة من الدماغ parenchyma نحو الدورة الدموية الجهازية3، وكذلك المساحات البارافينيوس نحو CSF وعبر اوعية اللمفاوية المستنزفة للدماغ ، وفقا لنموذج غليففياتيك2،4. تدفق السائل السائل السائل هو أساسا عن طريق النظام اللمفاوي، من خلال صفيحة cribriform والأوعية اللمفاوية خارج الوكرالية المرتبطة5،6،7، وكذلك من قبل الأوعية اللمفاوية السحاية ، والتي تتلاقى في LNs هجرة الأدمغة8،9،10،11،12 ( الشكل1). مهم, على الرغم الثانوية, يتم اتخاذ دور في تدفق CSF من قبل الزغب العنكبوتي القحفي, التي تخترق الثغرات في الجيوب الأنفية الوريدية13.

وقد تم التحقيق على نطاق واسع الدوائر الصرف CFS من خلال النهج التجريبية على أساس حقن الملون / الفلورسنت التتبع في الجهاز العصبي المركزي أو CSF، تليها تصوير نمط التتبع داخل الجهاز العصبي المركزي وفي جميع أنحاء أعضاء الجسم والأنسجة في نقاط زمنية مختلفة بعد الحقن13. لفترة طويلة، واعتبر تدفق CSF أن تكون حصرا ومباشرة في تهمة الدورة الدموية، من خلال الزغب arachnoid إسقاط في الجيوب الأنفية الوريدية13. ومع ذلك، يتم إجراء تدفق CSF في الغالب من قبل الأوعية الدموية اللمفاوية، كما هو موضح مؤخرا من قبل الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR) التصوير الديناميكي من نقل التتبع CSF حقن في الفئران9،10. ثم تعود الأوعية اللمفاوية التي تستنزف الغدد الليمفاوية CSF إلى مجرى الدم عبر الوريد تحت التفكاني الأيمن. وقد اكتشفت approches التكميلية كلا من خارج الجمجمة6,,7,,13 و9,,10,,11,12 مخارج اللمفاوية من المقتفيات حقن CSF وتشير إلى أن يتم امتصاص CSF من قبل اثنين من المسارات اللمفاوية, واحد خارجي والآخر الداخلية إلى الجمجمة وعمود العمود الفقري. الجزء الرئيسي من التصريف CSF يحدث بسرعة من خلال الأوعية اللمفاوية الموجودة على شكل مري، خارج الجمجمة في الغشاء المخاطي للأنف، من خلال قنوات لوحة cribriform من عظم ethmoid3،6،13 و ، caudally ، خارج عظام العمود الفقري lumbosacral عبر الطرق دورزولاترال التي لم تتميز بعد بشكل كامل7،14. وبالإضافة إلى ذلك، في شيائن الجمجمة، الشعيرات الدموية من دورا ماطر مباشرة امتصاص CSF والخلايا المناعية السحاية نحو جامعي اللمفاوية dural التي تعبر عظام الجمجمة والاتصال إلى CNS استنزاف LNs12،14. هذه الأوعية اللمفاوية السحابية تلعب أدوارا هامة في علم الفيزيولوجيا المرضية CNS، لأن يتم تغيير اللمفيات السحايا الدماغ عند الشيخوخة وتؤثر أيضا على نتيجة أمراض الدماغ العصبية، بما في ذلك التنكس العصبي، العصبية، وسرطان الدماغ15،16،17. ولذلك، فإن الأوعية الدموية اللمفاوية المرتبطة بـ CNS (أي الأوعية اللمفاوية اللانفائية الطرفية التي تستنزف الـ CSF) قد تكون هدفًا جديدًا واعدًا لمكافحة أمراض الجهاز العصبي المركزي في البشر.

أظهرت الدراسات المتقاربة التي أجريت مع علم المناعة والتصوير بالرنين المغناطيسي عالي الدقة أن الأوعية الدموية اللمفاوية السحائية موجودة أيضًا في الرئيسيات ، بما في ذلك marmoset المشتركة والبشر7،11،13. وعلاوة على ذلك، لا تقتصر الأوعية اللمفاوية السحاية على الجمجمة، بل تمتد داخل العمود الفقري إلى سطح العقدة الشوكية ورامي13،18. ثلاثي الأبعاد (3D) التصوير من اللمفيات العمود الفقري الحفاظ على التشريح العام للعينات الفقرية والعمود الفقري المسمى، بما في ذلك العظام الإفراط والعضلات والأربطة، فضلا عن الأنسجة الحشوية المجاورة، أجريت مؤخرا14. و iDISCO+ بروتوكول19،20 تم استخدامها لdealalbel decalcified وتطهير الاستعدادات من العمود الفقري كله مع الأجسام المضادة الليمفاوية محددة ضد مستقبلات الغشاء LYVE121 أو عامل النسخ PROX122. ثم تم الحصول على الصور وتحليلها باستخدام المجهر الفلوري الخفيف (LSFM) وبرنامج Imaris. LSFM يسمح للتصوير 3D سريعة و الحد الأدنى من الأساليب الجراحية للعينات الكبيرة عن طريق الحبس المحوري للإضاءة، مما يؤدي إلى انخفاض الإضاءة الضوئية وxicity23.

يسمح نهج iDISCO+/ LSFM بتوصيف الطبقات المتميزة من الأوعية اللمفاوية الدوارة وفوق الجافية ، واتصال هذا الأوعية الدموية بالدوائر اللمفاوية اللافقرية وLNs المجاورة للعمود الفقري. وقد طبق البروتوكول على الأنسجة التي تم حقنها سابقاً بتتبعات الفلورسنت لإثبات تصريف القناة الفقرية. تقدم هذه الورقة تفاصيل عن منهجية iDISCO+/ LSFM لتصوير الأوعية الدموية اللمفاوية الفقارية وتوضح مدى أهميتها لـ CSF وتحري تصريف السوائل فوق الجافية.

Protocol

جميع الإجراءات في الجسم الحي المستخدمة في هذه الدراسة امتثلت لجميع الأنظمة الأخلاقية ذات الصلة لاختبار الحيوانات والبحوث، وفقا للجماعة الأوروبية للمبادئ التوجيهية لاستخدام الحيوانات التجريبية (L358-86/609EEC). وقد حظيت الدراسة بموافقة أخلاقية من اللجنة الأخلاقية لـ INSERM (رقم 2016110111126651) ومن اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه في ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle épinière).

1- الإعداد

  1. إعداد أدوات التشريح التالية للجراحة: مشرط (1)، microforceps (2)، ملقط (1)، مقص تشريح، ومقاطع خياطة ميشيل. إعداد 26 غ الإبر (0.45 مم × 13 مم)، 1 مل حقنة، و 10 ميكرولترينغ 10 ميكرولترينغ.
  2. سحب microcapillaries مع بروتوكول خطوة واحدة في 67.5 درجة مئوية مع جرة ميكروبيت الزجاج. إعداد اثنين من الكاميلات الدقيقة لكل حقنة.
  3. تحضير الكواشف للتصوير اللمفاوي الصرف (الجدول 1): أوفالبويمين اليكسا فلور 555 conjugate (OVA-A555, 2 ملغ / مل في 1x الفوسفات المخزنة المالحة [PBS]) والأجسام المضادة ل-LYVE1 (1 ملغ / مل في 1X PBS).
  4. إعداد الأجسام المضادة (الجدول 1) للإيسكو+. بالنسبة للأجسام المضادة الأولية، استخدم الأجسام المضادة للأرانب المضادة للوَيَفِي 1:600(1: 1600) والأضداد المضادة للماعز بولي كلونال IgG (1:2,000). للأجسام المضادة الثانوية، استخدم اليكسا فلور حمار المضادة للأرانب-568، حمار المضادة للأرنب-647، والحمار المضادة للماعز-647 (1:2,000).

2. إجراءات الجراحة للحقن داخل cisterna (ICM) والثابروم (ThLb)

  1. إعداد الحيوان للجراحة
    1. استخدام البالغين ذكورا وأنثى C57BL6 / J الفئران، 8-12 أسابيع من العمر.
    2. حقن الماوس intraperitoneally (IP) مع 0.015 ملغ / مل حل البوبرينورفين المخفف في 0.9٪ كلوريد الصوديوم في 0.1 ملغم / كغ، 15 دقيقة قبل الجراحة.
    3. تخدير الماوس في مربع التعريفي مع 2-3٪ غاز ايزوفلوران.
  2. إعداد تخدير لحقن المقتفي
    1. ضع الماوس المُحسَّن ومنصة التسخين الخاصة به على الجهاز المُجسم. استخدم قضبان الأذن للاحتفاظ برأس الماوس، ووضع الجسم في زاوية 135 درجة تقريبًا على الرأس أو قم بشل الحبل الشوكي عند مستوى ThLb الفقري (Th12-L1) باستخدام محول العمود الفقري. قرصة الذيل أو مخلب مع قوة للتحقق من كفاءة التخدير.
    2. حقن IP 200 μL من 0.9٪ كلوريد الصوديوم لترطيب الماوس.
    3. باستخدام شفرة مشرط، قم بعمل شق جلدي، إما في المنطقة القذالية نحو منطقة عنق الرحم لحقن ICM، أو على مستوى ThLb الفقري (Th10-L3) للحقن في البارينشيما الشوكية ThLb.
  3. حقن التتبع
    1. تجاهل عضلات الباراسرفية والطفيلية التي تغطي الرقبة والعمود لتصور سطح ماطر الجافية ، وهي الطبقة الخارجية من السحايا.
    2. دقيق دقيق في المنطقة المركزية من ماطر دورا و تحتية arachnoid مع إبرة 26 G.
    3. زرع كابيتري دقيق
      1. اقطع 2 مم من طرف الشعيرات الدموية الزجاجية (انظر الخطوة 1.2)، ثم استخدم الكابيلا الدقيقة المتصلة بقنبة مرتبطة بحقنة 10 ميكرولتر لpirate 2−8 ميكرولتر من الأجسام المضادة دوف-A555 أو LYVE1.
      2. تقديم الككابية الدقيقة في المنطقة الوسطى من ماطر دورا في زاوية 30 درجة لحقن ICM أو زاوية 10 درجة للحقن في العمود الفقري ThLb، ودفعه في إلى 1.5 ملم تحت ماطر دورا.
        ملاحظة: يتم ثقب الرباط، ولكن لا يتم إجراء استئصال لامينك.
      3. أضف 10 ميكرولتر من الغراء الجراحي لإغلاق الشق حول الشعيرات الدموية الزجاجية وانتظر حتى يجف.
    4. حقن ببطء التتبع الفلورسنت في 1 ميكرولتر / دقيقة. مرة واحدة وقد تم تسليم حجم الحقن، والحفاظ على شعري في مكان لمدة 1 دقيقة. تراجع عن الكابيلا الصغيرة وإضافة الغراء الجراحية لإغلاق ثقب الحقن.
  4. بعد الحقن، أغلق شقوق الجلد بمقاطع خياطة. إزالة الماوس من جهاز stereotaxic وضعه في غرفة الاحترار بعد الجراحة في 37 درجة مئوية حتى يتعافى.

3. perfusion وتشريح الأنسجة

  1. في 15 دقيقة أو 45 دقيقة بعد حقن متتبع CSF، حقن IP جرعة قاتلة (100 ميكرولتر) من بينتوبربيتال الصوديوم. قرصة الذيل أو مخلب للتحقق من عدم وجود رد فعل.
  2. مع مقص تشريح، وقطع الجلد وفتح طبقة الصفاق من منطقة أسفل البطن نحو القفص الصدري. افتح القفص الصدري مع مقص للوصول إلى القلب.
  3. أدخل إبرة 26 G في الجزء الأيسر من القلب وابدأ في التخبط مع 20 مل من الثلج البارد 4٪ شبهفورمالدهيد (PFA) في PBS 1x عند 2 مل/دقيقة. استخدام مقص لقطع بسرعة الأذين الأيمن والإفراج عن تيار السائل في الفير.
  4. إزالة الجلد تماما مع ملقط وقطع الساقين الأربعة مع مقص. إزالة جميع الأعضاء الداخلية ولكن يجب الحرص على الحفاظ على LNs سليمة.
    ملاحظة: النافل المانودبي سطحية، لذا يجب الحرص على عدم إزالتها عند قطع الجلد. توجد اللانمسات الحلقية العميقة (dcLNs) على كل جانب من القصبة الهوائية، في اتصال مع السطح الجانبي للأوردة الداخلية الوداجية وعلى مقربة من العضلات المجسمة.
  5. قطع الأضلاع لإزالة العمود الفقري مع الحبل الشوكي داخل من عنق الرحم إلى شرائح القطنية.
  6. غمر الأنسجة تشريح في الجليد الباردة 4٪ PFA في 1X PBS في أنبوب 50 مل بين عشية وضحاها (~ 18 ساعة) في 4 درجة مئوية. غسل الأنسجة الثابتة 3x في 50 مل من 1X PBS لمدة 5 دقائق.

4. التحليل الجزئي للفلوريس من الجزء الفقري

  1. ضع العينة تحت المجهر stereozoom الفلوريس مع كاميرا (جدول المواد). أخذ نظرة عامة على العينة أو تكبير منطقة معينة.

5. إعداد عينة لكامل جبل مناعة

  1. باستخدام شفرة ميكروتوم، قطع عرضية العمود الرأس والفقارية على المستويين القذالي وعنقي الرحم.
    ملاحظة: يسمح هذا التشريح بعزل الرأس والمنطقة الفقرية العنقية عن بقية العمود الفقري.
  2. مع شفرة ميكروتوم، قطع عنق الرحم، والثشورا، والمناطق sacral من العمود الفقري عرضية إلى شرائح من 2-4 فقرات، حوالي 0.5 سم حجم كل.
  3. عزل كل قطعة بالترتيب الذي تم فصله عن المحور الفقري، على طول مناطق عنق الرحم والصدر في العمود الفقري. الحفاظ على كل عينة في أنبوب من 2 مل 1X PBS.

6. iDISCO+ كامل جبل مناعة من الجزء الفقري

ملاحظة: يمكن الوصول إلى الوصف التفصيلي لبروتوكول iDISCO+ في http://www.idisco.info.

  1. اليوم 1: جفاف الأنسجة
    1. يجفف عينات الأنسجة الفقرية (أي، جزء فقري) عن طريق الغمر المتعاقبة في 20٪، 40٪، 60٪، 80٪، و 100٪ الميثانول في 1x PBS لمدة 1 ساعة مع الانفعالات.
    2. احتضان العينات بين عشية وضحاها في محلول من 33٪ الميثانول/66٪ ثنائي كلور الميثان (DCM) في درجة حرارة الغرفة (RT) مع الانفعالات.
  2. اليوم الثاني: تبييض الأنسجة
    1. غسل العينات 2x مع 100٪ الميثانول لمدة 1 ساعة في RT. Incubate العينات في 5٪ H2O2 في الميثانول (30٪ H2O2 والميثانول 1:5 v/v) في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  3. اليوم الثالث: خطوة التصميم والتأميم
    1. إعادة هيدرات العينات تدريجيا في 80٪ 60٪، 40٪، 20٪ الميثانول، ثم في برنامج تلفزيوني 1X (1 ح في كل حل) في RT مع الانفعالات.
    2. Decalcify الفقرات عن طريق احتضان العينات في حل مورس (10٪ سترات ثلاثية الصوديوم و 45٪ حمض فورميك 1:1 v/v) لمدة 30 دقيقة في RT للحفاظ على بنية العظام.
    3. شطف العينات 2x مع 1X PBS و 2x احتضان 1 ساعة في حل PTx2 (0.2٪ تريتون X-100 في 1x PBS، تجديد لاحتضان الثانية) في RT مع الانفعالات. ثم احتضان العينات المعالجة مسبقا في محلول permeabilization (PTx2 مع 20٪ ثنائي الفينيل أكسيد [DMSO] و 2.3٪ ث / الخامس جليسين) في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  4. اليوم الرابع: خطوة الحظر
    1. عينات احتضان في محلول الحجب (PTx2 مع مصل حمار 6٪ و 10٪ DMSO) عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  5. أيام 5−16: مناعة جبلية كاملة
    1. عينات احتضان في الأجسام المضادة الأولية المخففة في PTwH (1x PBS تحتوي على 0.2٪ Tween-20 و 0.1٪ الهيبارين في 10 ملغ / مل في 1X PBS) مع 5٪ دمسو/ 3٪ مصل الحمير في 37 درجة مئوية لمدة 6 أيام. غسل العينات 4−5x في PTwH في RT مع الانفعالات بين عشية وضحاها.
    2. عينات احتضان في التخفيفات الأجسام المضادة الثانوية في PTwH مع مصل حمار 3٪ في 37 درجة مئوية لمدة 4 أيام. غسل العينات في PTwH 4−5x في RT تحت الهياج بين عشية وضحاها قبل تطهيرها.
  6. أيام 17 و 18: iDISCO+ تنظيف الأنسجة
    1. يجفف العينات تدريجيا عن طريق الانغماس المتعاقبة في 1X PBS، ثم 20٪، 40٪، 60٪، 80٪، و 2x في الميثانول 100٪ (1 ح في كل حل). احتضان كل عينة بين عشية وضحاها في محلول من 33٪ الميثانول/66٪ DCM.
    2. غسل 2x في 100٪ DCM لمدة 15 دقيقة لإزالة الميثانول. احتضان في ثنائي اثير (DBE) دون اهتزاز حتى مسح (4 ح) ومن ثم تخزينها في DBE في RT قبل التصوير.

7. LSFM التصوير

  1. مسح الصورة عينات في طائرة عرضية مع LSFM مجهزة هدف 4x/0.3.
    1. استخدام واحد على جانب ثلاثة ورقة تهيئة الإضاءة، ثابت x موقف (لا تركيز ديناميكي). استخدام الليزر LED ضبطها إلى 561 نانومتر, 100 ميغاواط; و 639 نانومتر، 70 ميغاواط. تعيين الفتحة الرقمية ورقة الضوء إلى 30٪.
    2. استخدم فلاتر الانبعاثات المختلفة: 595/40 لـ Alexa Fluor-568 أو -555، و-680/30 لـ Alexa Fluor-647.
  2. ملء غرفة المجهر مع DBE.
  3. أكوير مكدسات مع 2.5 μm z الخطوات و 30 مللي ثانية وقت التعرض في خطوة مع الكاميرا (جدول المواد). استخدم التكبير البصري x2 لتكبير فعال من (x8)، 0.8 ميكرومتر/بكسل، وتنفيذ عمليات الاستحواذ على الفسيفساء مع تراكب 10٪ على الإطار الكامل.
  4. الحصول على الصور في شكل .tif مع اقتناء البرمجيات وتحويلها إلى تنسيق 3D مع برنامج تحويل الملف.
  5. إعادة بناء الفسيفساء الاستحواذ مع برنامج خياطة (جدول المواد). افتح الصور وتحرك يدويًا لإعادة تكوين صورة الفسيفساء بالكامل ، باستخدام تداخل 10٪ بين الصور كمبدأ توجيهي.
  6. استخدام البرنامج 3D (جدول المواد) لتوليد الإسقاطات متعامد من البيانات ، كما هو مبين في الشكل 1، الشكل 2، الشكل 3، والشكل 4، وإضافة لون رمز سمة للسفن اللمفاوية وغيرها من الهياكل التشريحية على الشاشة. تعيين تصحيح غاما من 1.47 إلى البيانات الخام التي تم الحصول عليها من LSFM وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

Representative Results

التصوير ثلاثي الأبعاد للأوعية الدموية اللمفاوية الفقارية
الشكل 1 يعرض الخطوات من iDISCO+/ LSFM الإجراء وصورة LSFM من الدوائر اللمفاوية داخل القناة الفقارية من iDISCO+- معالجة ThLb الفقرات. مزيج من iDISCO+ مع LSFM الحفاظ على التشريح الفقري واستولت على وجهة نظر من شبكة الأوعية الدموية الليمفاوية (أي، والأوعية داخل الفقرات متصلة مع الأوعية خارج الفقرات الخروج دورسوميا وجنبليا من الجسم الفقري) داخل العظام المحيطة، والأربطة، والعضلات، والعصبية.

التصوير المجهري الفلوري للصرف بالانفاح بالفلورس
من أجل صورة الصرف الضخام في الجهاز اللمفاوي المرتبط ب CNS ، تم إدارة أجهزة التتبع الجزيئات في الجسم الحي عن طريق الحقن في إما CSF أو parenchyma الشوكي. يمكن بسهولة تسليم جهاز تتبع الجزيئات الجزيئية إلى CSF في ماغنا سيستيرنا. يقع الماجنا سيستيرنا بين المخيخ والسطح الظهري من oblongata النخاع، فوق ماغنوم الفرجان. يمكن أيضًا حقن جهاز تتبع الجزيئات في البارينتشيما الشوكي عن طريق جراحة مجسمة على مستويات مختلفة على طول العمود الفقري.

وكانت أجهزة التتبع الجزيئية الكلية المستخدمة إما تحمل اسمًا مباشرًا بفلوروفور أو تم اكتشافها بعد الوفاة بواسطة الكيمياء العضوية المناعية مع أجسام مضادة محددة. يوضح الشكل 2A الخطة التجريبية لتتبع OVA-A555، وهو متتبع فلوري أحمر وصغير الوزن الجزيئي (حوالي 45 كيلو Da) ، تم حقنه في إما CSF (الشكل 2B) أو منطقة ThLb من الحبل الشوكي (الشكل 2C).

في 45 دقيقة بعد حقن التتبع الجزيئات، تم التضحية الفئران، perified مع 4٪ PFA، ومعالجتها لعزل شرائح تشريح منطقة جذع الدماغ من الرأس وعمود العمود الفقري التي تم decalcified وتوضيحها. Macromolecule drainage was then readily assessed by fluorescence macroscopy imaging of the LNs that collect the CSF and epidural fluids. كما هو مبين في الشكل 2, OVA-A555 حقن في إما CSF (الشكل 2B) أو ThLb (الشكل 2C) منطقة الحبل الشوكي أدى إلى تراكم OVA-A555 في dcLNs في 45 دقيقة بعد الحقن. هذه الملاحظة تشير إلى امتصاص وتصريف الفلورسنت التتبع من قبل الجهاز اللمفاوي; بل هو شرط مسبق قبل متابعة إجراء iDISCO+/ LSFM لتصوير الصرف اللمفاوي الفقري.

التصوير ثلاثي الأبعاد للصرف الضدي في الجهاز اللمفاوي الفقري
استنادا إلى الكشف عن555 555 OVA في العلامات dcLNs، يمكن تطبيق الإجراء iDISCO+/ LSFM على عينات العمود الفقري decalcified وdeded مسبقا معزولة عن555الفئران حقن OVA-A. سمح هذا النهج بإنشاء خريطة ثلاثية الأبعاد للصرف اللمفاوي لسائل CSF والسوائل فوق الجافية في العمود الفقري عند نقطة زمنية محددة بعد حقن التتبع. ويمكن إجراء هذا التخطيط ثلاثي الأبعاد عن طريق تصوير أجزاء متعاقبة من الجهاز العصبي المركزي، عند كل مستوى من العمود الفقري، من نقطة الحقن.

ويبين الشكل 3A التصميم التجريبي لحقن OVA-A555 في البارينتشيما الشوكي ThLb والنمط ثلاثي الأبعاد الناتج عن توزيع OVA-A555 في عنق الرحم والجزء الفقري الصدري ، بالاقتران مع الأوعية الدموية اللمفاوية. في 45 دقيقة بعد OVA-A حقن555، تم الكشف عن تراكم OVA-A555 في أنسجة الحبل الشوكي و dcLNs (السهام البيضاء في الشكل 3B)،بالاتفاق مع ملاحظات المجهر الموضحة في الشكل 2. ومع ذلك، لم يتم اكتشافه في الأوعية اللمفاوية اللمفاوية العنقية والصدرية التي تحمل علامات الأجسام المضادة لـ LYVE1. قد يكون غياب التتبع الذي حقنه CSF في الأوعية اللمفاوية الفقارية راجعًا إما إلى وقت قصير من الثبات داخل الأوعية اللمفاوية أو عدم امتصاص المتتبع من قبل الأوعية اللمفاوية (الشكل 3C).

لاختبار الفرضية الأولى، تم استخدام الأجسام المضادة للأرنب المضادة LYVE1 كعلامة خلية بطانةية لمفاوية لربط الأوعية اللمفاوية المرتبطة ب CNS. تم الكشف عن الأجسام المضادة المضادة للأرانب LYVE1 التي تم حقنها بعد ذلك بواسطة الكيمياء المناعية مع جسم مضاد ثانوي مضاد للأرنب ، في حين تم تصنيف الخلايا البطانية اللمفاوية مناعيًا بالأجسام المضادة PROX1. يمثل الشكل 4 التصميم التجريبي لحقن مضاد LYVE1 في البارينشيما الشوكية ThLb (الشكل 4A) ، ونمط التوزيع ثلاثي الأبعاد الناتج عن الأجسام المضادة LYVE1 في جزء ThLb قريب من موقع الحقن ، فيما يتعلق بـ PROX1+ lymphatics (الشكل 4B). تم تسمية كل من اللمفاوية الفقارية واتصالاتها اللمفاوية خارج العمود الفقري من قبل الأجسام المضادة المضادة للLYVE1 المحقونة ، والتي أثبتت امتصاص التتبع من قبل الأوعية اللمفاوية الفقارية والصرف اللمفاوي نحو الجهاز اللمفاوي خارج الفقرية. كانت LNs تفتقر في منطقة ThLb و, وبالتالي, لا يمكن تصور في الجزء imaged. وعلاوة على ذلك، فإن نمط متقطع من علامة LYVE1 لوحظ على طول الأوعية اللمفاوية يعكس على الأرجح التعبير غير المتجاورة من LYVE1 في الأوعية الدموية الليمفاوية، كما ورد في الدراسات السابقة14،21. بالإجمال, أظهرت نتائج هذه الدراسة أنه, في 45 دقيقة بعد حقن التتبع, LYVE1 الأجسام المضادة, ولكن ليس OVA-A555, سمح الكشف عن امتصاص اللمفاوية الفقرية المحلية وكان يفضل أن OVA-A555 كعلامة ثابتة للصرف اللمفاوي الفقري المحلية.

Figure 1
الشكل 1: عرض ثلاثي الأبعاد للأوعية الدموية اللمفاوية الفقارية. (أ)التمثيل التخطيطي للبروتوكول. (ب) إسقاط 3D من عرض ThLb thLb اللمفية الفقارية من منظور الظهروفينال. تم تصنيف الأوعية اللمفاوية مناعيًا بالأجسام المضادة لـ PROX1 (الخضراء) باستخدام بروتوكول iDISCO+ ثم تم تصويرها بواسطة LSFM. لاحظ نمط افسانتي الشبيه بالأوعية الدموية داخل القناة الفقرية لثلاث فقرات متتالية (رؤوس سهام بيضاء). بالإضافة إلى الأوعية الظهرية نصف الدائرية (رؤوس الأسهم البيضاء)، شملت كل شبكة فقرية فروعًا بطنية (سهام صفراء)، ومسارات خروج جانبية ثنائية على طول رامي العمود الفقري وغانغليا (السهام البيضاء)، بالإضافة إلى طريق خروج ظهري عند خط الوسط (السهم الأبيض المزدوج). وكانت الشبكات الفقارية مترابطة مع وعاء طولي (السهام الأرجوانية). للحصول على وصف كامل، انظر جاكوب L.وآخرون. 18 SC = الحبل الشوكي; النجمة = الجسم الفقري البطني; D = dorsal; L = الجانبي; V = فينترال; أشرطة المقياس = 300 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: dcLNs جمعت OVA-A555-المسمى السوائل CSF. (أ) مخطط التصميم التجريبي. تم حقنOVA-A 555 في ICM أو البارينشيما الشوكي ThLb ، ثم تم التضحية بالفئران 45 دقيقة بعد الحقن. تم مسح العينات وملاحظة من قبل التصوير macroscope fluorescence (B,C). المنظار الفلوري صور من الفقرات cervival من ICM - (B) وThLb - (C) حقن الفئران. لاحظ أن OVA-A555 المتراكمة في dcLNs (B,C, رؤوس الأسهم البيضاء), المساحات البطنية و شبه الرأس من الحبل الشوكي العنقي (B,C) وبعد الحقن ICM, في طرق الخروج البطينية, على الأرجح على طول الأعصاب العنقية (B, السهام البيضاء). SC = الحبل الشوكي. النجمة = الجسم الفقري البطني; D = dorsal; L = الجانبي; V = فينترال; أشرطة مقياس في B و C = 2 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الكشف عن OVA-A555-المسمى السوائل CSF في الجهاز اللمفاوي الفقري. (أ) مخطط التصميم التجريبي. تم حقن OVA-A555 في البارينشيما الشوكي ThLb، ثم تم التضحية بالفئران في 45 دقيقة بعد الحقن. تم التعامل مع العينات مع بروتوكول iDISCO+ وصورت مع LSFM. (B,C) الإسقاطات بلانار من LSFM القبض على 3D وجهات النظر الأمامية من عنق الرحم (B) والصدر (C) قطاعات العمود الفقري. تم الكشف عن تراكم OVA-A555 (أحمر) في أنسجة الحبل الشوكي و dcLNs (B، السهم الأبيض) ، كما هو موضح في الشكل 2، ولكن ليس في عنق الرحم والصدر اللمفاوي الأوعية الدموية المثبطة للمناعة هنا مع الأجسام المضادة لـ LYVE1 (الأخضر). SC = الحبل الشوكي; النجمة = الجسم الفقري البطني; D = dorsal; L = الجانبي; V = فينترال; أشرطة مقياس = 1 مم (B) ، 300 ميكرومتر (C). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الكشف عن التصريف اللمفاوي الفقري بعد الحقن داخل الجسم من الأجسام المضادة LYVE1. (أ) مخطط التصميم التجريبي. تم حقن الأجسام المضادة LYVE1 في البارينشيما الشوكي ThLb ، ثم تم التضحية بالفئران بعد 45 دقيقة من الحقن. تم التعامل مع العينات مع بروتوكول iDISCO+ وصورت مع LSFM. (B).الإسقاطات planar من وجهات النظر 3D الأمامية من ThLb (B) شريحة العمود الفقري ، التي تم التقاطها مع LSFM. تم الكشف عن الأجسام المضادة LYVE1 مع الأجسام المضادة للأرنب (الأرجواني) والأوعية الدموية اللمفاوية مع الأجسام المضادة لبرو إكس 1 (الأخضر). الأوعية البيضاء هي PROX1+ اللمفاويات كولايميث مع الأجسام المضادة LYVE1 (B); وتشمل هذه الغدد الفقري (السهام الصفراء) و اللافقرية (الأسهم الصفراء المزدوجة) اللمفاويات. SC = الحبل الشوكي; النجمة = الجسم الفقري البطني; D = dorsal; L = الجانبي; V = فينترال; أشرطة المقياس = 300 ميكرومتر (B). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الكواشف الهدف الرقم خطوة البروتوكول التعليق
OVA-A555 متتبع CSF الشكل 2 والشكل 3 2. حقن ICM أو ThLb
7. LSFM التصوير.		 قابل للذوبان في الماء، وسهلة لحقن وفلورسين مكثفة عالية
الأجسام المضادة Lyve1 علامة غشاء خلايا LVs الشكل 3 6. iDISCO + كامل جبل immnustaining.
7. LSFM التصوير.		 فعال الأجسام المضادة لل جبل كامل immnustaining
تتبع الصرف الصحي من LVs دورال وبركالوري الشكل 4 2. حقن ICM أو ThLb
6. iDISCO + كامل جبل immnunostaining
7. LSFM التصوير
الأجسام المضادة Prox1 العلامة النووية لخلايا LVs الشكل 1 والشكل 4 6. iDISCO + كامل جبل immnunostaining
7. LSFM التصوير		 فعال الأجسام المضادة لل جبل كامل immnustaining

الجدول 1: الأجسام المضادة والمتتبعات المستخدمة في الدراسة.

المشكله السبب المحتمل حل
جراحة لحقن التتبع آفة أنسجة الجهاز العصبي المركزي غير المرغوب فيها 1. عدم السيطرة على إدخال الشعيرات الدموية الزجاجية
2. عمق غير صحيح من الزجاج إدراج الشعرية		 1. Punctate مع الرعاية، ولكن تماما، وdura ماطر مع إبرة 26 G قبل إدخال الشعيرات الدموية الزجاج.
2. تقليل عمق إدخال الشعيرات الدموية الزجاجية (< 1.5 مم من مادة dura).
3. تقليل قطر الشعيرات الدموية الزجاجية.
تدنيس غير مرغوب فيه من المقنّع المحقن في المساحات فوق الجافية أو خارج العمود الفقري حقن غير صحيح من التتبع 1. تحقق إذا كان الزجاج الشعرية الصغيرة قد تم إدراجها بشكل جيد في punctate ماطر dura.
2. إضافة الغراء الجراحية بين الزجاج microcapillary والأنسجة المحيطة قبل حقن التتبع.
حجم مفرط من المقنن التتبع تقليل حجم المقنن التتبع (<2 μL).
iDISCO+ مناعة غياب أو عدم تجانس أو خلفية مفرطة من وضع العلامات في الأنسجة 1. القضايا مع تركيز الأجسام المضادة الأولية
2. عدم كفاية التهيئة
3. الغسيل غير كافية
4- عدم كفاية المقاصة		 زيادة عدد و / أو وقت من خطوات الحضانة: permebilization، whashing، الأجسام المضادة الأولية والمقاصة. راجع http://www.idisco.info (الأسئلة الشائعة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها).
عدم كفاية الاحتقان استخدام أكثر صرامة علاج decalcification العينة مع EDTA21 أو مورس حل للأنسجة الرأس خاصة.
iDISCO+ المقاصة العينات معتمة أو بنية اللون عدم كفاية التبييض استخدام الطازجة H2O2 الحل، وزيادة حجم و / أو وقت الحضانة.
وجود الأكسدة ملء الأنبوب تماما لتجنب وجود الهواء.
إزالة غير كافية زيادة حجم و / أو حضانة الوقت. راجع http://www.idisco.info (الأسئلة الشائعة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها).
كشف التتبع التتبع غير القابل للكشف تركيبة غير صحيحة من المتعقب المحدد اليكسا 555 و 594 و 647 fluorochromes تقاوم بروتوكول iDISCO +5،6،7،8،9،10. ومع ذلك، ليس هذا هو الحال بالنسبة ل FITC، GFP، RFP fluorochromes.
نقطة زمن التضحية بعد الحقن تفضل OVA-A555 لتحليل الصرف الصحي قصير الأجل (15 دقيقة) في اللمفيات الفقرية المحلية. لتحليل الغدد الليمفاوية الصرف، OVA-A555 و Lyve1 الأجسام المضادة يمكن استخدامها على المدى الطويل (> 45 دقيقة) تحليل.
التصوير: التقاط وتحليل الصور الملتقطة من الدائرة اللمفاوية ليست مرضية مسألة تشريح (الغدد الليمفاوية مفقودة) قم بتضمين الأنسجة المجاورة للفقاري/الجمجمة بعناية في العينة التشريحية الخاصة بك ، وفقًا للدائرة اللمفاوية التي تريد تصويرها.
مشكلة التصوير 1. تعديل المعلمات اقتناء LSFM: الليزر كثافة، الفتحة الرقمية ورقة الضوء، سمك ورقة الضوء، وقت المعرض.
2. ضع العينة في الدعم لتقليل المسار الذي يسلكه الضوء من خلال الأنسجة حتى الهدف.
3. تأكد من عدم وجود فقاعات داخل عينة الأنسجة أثناء الاستحواذ.

الجدول 2: نصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها لكل خطوة من خطوات البروتوكول، بما في ذلك المشكلات والحلول المحتملة.

Discussion

يوفر بروتوكول iDISCO+/LSFM وجهات نظر ثلاثية الأبعاد غير مسبوقة للشبكة اللمفاوية المرتبطة بـ CNS داخل الأنسجة المحيطة بها على مستوى الدقة الخلوية. هذا البروتوكول هو تتكيف بشكل جيد مع عينات متوسطة الحجم ، وليس exeeding 1.5 سم3، نظرا للقيود على النظام البصري LSFM ، وانخفاض مسافة العمل ، وحجم كبير من العدسات الهدف التجاري لمجهر عالية الدقة23. يمنع هذا القيد التقاط الجهاز اللمفاوي المرتبط بالمخ بأكمله. من المهم أن نلاحظ أن مجال التحقيق يجب أن يكون محددًا بحذر ويجب تشريح الأنسجة المحيطة ب CNS بعناية من أجل تضمين الأوعية اللمفاوية الخارجية واللندق LNs التي تساهم في الدوائر اللمفاوية بأكملها(الجدول 2).

بالإضافة إلى الحجم والاعتبارات التشريحية ، يختلف تعقيد الأنسجة المينشية المحيطة على طول الجمجمة وعمود العمود الفقري ، مما يتطلب تكييف التشذيب والمعالجة المسبقة من أجل الحصول على توضيح عينة متجانسة والسماح بنشر شعاع الضوء داخل نسيج بيولوجي متجانس. في غياب العظام، التصوير LFSM من أنسجة المخ أو الحبل الشوكي لا يتطلب خطوة decalcification، والقرار النهائي للصور التي تم التقاطها هو الأمثل19. البروتوكول الموصوف أعلاه ، والذي يتضمن خطوة خفيفة decalcification مع حل مورس ، هو مكيفة بشكل جيد لLSFM التصوير من العمود الفقري كما هو موضح في الشكل 1 والشكل 4. في المقابل، منطقة الرقبة يعرض تشريح العظام معقدة بشكل خاص بالإضافة إلى طبقات متعددة من العضلات والدهون والأنسجة الغدية، والتي تقلل من جودة الصور LSFM القبض، كما ينعكس في الشكل 3B. وهكذا يمكن تحسين التصوير LSFM من منطقة العنق وعنقها من خلال معاملة أكثر صرامة من الأنسجة; على سبيل المثال، مع EDTA، كما ذكر سابقا24. وبالتالي فإن خطوة التصميم هي شروط حرجة ويجب اختبارها مسبقًا لكل جسم مضاد يستخدم قبل بدء iDISCO+ البروتوكول الكامل(الجدول 2).

في حين أن بروتوكول iDISCO+/LSFM يسمح بتوليد عرض ثلاثي الأبعاد للدوائر التي تربط بين المساحات السحاية والمساحات فوق الجافية واللونات LNs المرتبطة بها ، التحليل الكمي المباشر للأوعية اللمفاوية من الصور التي تم التقاطها LSFM غير ممكن للأسباب التالية: 1) ترسيم دوائر الأوعية اللمفاوية غير موثوق بها بسبب النمط غير المتبقى للتعبير علامة اللمفاوية، لأن membranar LYVE1 هو هنا توزعت21 وPROX1 لديها نمط التعبير النووي22؛ 2) اختراق heterogenous من الأجسام المضادة، فضلا عن الانيسونروبيا التي قد تستمر في الأنسجة البيولوجية بسبب decalccification غير مكتملة وهئية وpreclearing. وهكذا يحتاج التصوير LSFM إلى توسيعه بأدوات الواقع الافتراضي التي تمكن من التصور التفاعلي وبالتالي تسهيل القياس الكمي للأوعية اللمفاوية (www.syglass.io). ومن الجدير بالذكر أيضا أن الوصف الدقيق للدوائر المرتبطة ب CNS يتطلب النسخ الاحتياطي معلومات LSFM مع بيانات التقاء عالية الدقة التي تم الحصول عليها من قبل مناعة التقليدية على رقيقة (5-10 ميكرومتر) اقسام اضماب الأنسجة أو البارافين جزءا لا يتجزأ من الأنسجة، خاصة لتوطين على وجه التحديد موقف الأوعية اللمفاوية فيما يتعلق بماطر دورا و CSF، كما ذكرت سابقا11،14،18.

يسمح بروتوكول iDISCO+/ LSFM بالتصور ثلاثي الأبعاد للصرف الجزيئي الكلي في الجهاز اللمفاوي المرتبط ب CNS ، كما هو موضح في الشكل 3 والشكل 4. ومع ذلك ، يتطلب التقييم الوظيفي للصرف اللمفاوي ، بالإضافة إلى التوصيات الواردة على بروتوكول iDISCO+/ LSFM المفصل أعلاه ، بعد إجراء صارم ، حيث تعتمد النتيجة النهائية على جودة جراحة الحقن ، واختيار موقع التسليم ، ونوع وحجم حقن علامة الجزيئات الصغيرة المستخدمة ، ووقت التضحية بعد إدارة التتبع(الجدول 2).. بسبب الاختلافات في نمط التتبع بين الحيوانات المحقونة ، يتطلب توصيف دوائر الصرف اللمفاوي مجموعات تجريبية كبيرة (> 10 حسب حالة الحقن). في البروتوكول المقدمة، 1) يجب ثقب ماطر دورا قبل الحقن لمنع الآفات غير المرغوب فيها واختراق أنسجة الجهاز العصبي المركزي؛ 2) حجم حقن يجب أن يكون أقل من 2 ميكرولتر للحد من الانتشار غير المرغوب فيها من خلال ثقب الحقن، على طول الشعيرية حقن، في الفضاء فوق الجافية أو الأنسجة خارج الفقرات؛ 3) عمق حقن إدخال الشعيرات الدموية يجب أن تقتصر على 2 مم تحت ماطر دورا لتجنب إصابة CNS أو سوء التخطيط في ICM والحقن داخل باطن، على التوالي. لاحظ أيضا أن تحليلاً تكميلياً عالي الدقة للشرائح الفقرية المجاورة يحتاج إلى إجراء، كما هو مبين أعلاه، لتقييم وجود المقذّع المحقون داخل الأوعية اللمفاوية. يتطلب هذا التحليل إنشاء مخططات الملامح كثافة للمتتبع وعلامة اللمفاوية على أقسام عرضية من الأوعية اللمفاوية المسمى علامة. وقد سبق استخدام هذا النهج لإثبات امتصاص OVA555 من قبل اللمفيات ThLb في 15 دقيقة بعد الحقن (الشكل التكميلي 5F في يعقوب وآخرون14). ومع ذلك، لم يتم توضيحه لمتتبع مكافحة LYVE1 في هذه الدراسة(الشكل 4).

من بين التتبعات CSF المحتملة، OVA-A555 هو خيار ممتاز لأنه مقاوم لعلاجات iDISCO+ البروتوكول ويحافظ على الفلورسين عالية للتصوير LSFM. ومع ذلك، لاحظ أنه يجب اختيار نوع التتبع وفقًا لنقطة التحليل(الجدول 1 والجدول. 2). كما ذكر أعلاه، OVA-A555 وضع العلامات من الأوعية اللمفاوية الفقارية المحلية لوحظ في 15 دقيقة بعد الحقن14. ومع ذلك، لم يعد الكشف عن OVA-A555 في هذه الدوائر اللمفاوية المحلية في 45 دقيقة بعد الحقن (الشكل 3) على النقيض من الأجسام المضادة LYVE1 (الشكل 4).

في الختام ، يتم تكييف بروتوكول iDISCO+/ LSFM جيدًا للتحقيق في الهيكل ثلاثي الأبعاد والصرف في الجهاز اللمفاوي المرتبط ب CNS في الحالات الفسيولوجية والمرضية مثل CNS وسرطان العمود الفقري ، أو أمراض العظام والفقارية والمفاصل. على الرغم من أن الإجراء الكامل طويل ويتطلب دقة منهجية ، فإنه يوفر معلومات قيمة وفريدة من نوعها عند استخدامها مع التحليل التكميلي باستخدام أدوات الواقع الافتراضي والتصوير confocal عالية الدقة.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للعلوم الطبية، والوكالة الوطنية للRcherche (ANR-17-CE14-0005-03)، الاتحاد من أجل إعادة التشيرش في سيرفو (FRC 2) 2000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 نحن نعترف منصات ICM: ICM-QUANT للتصوير الخلوي و ICM-histomics للكيمياء المناعية. وقد أجريت جميع الأعمال الحيوانية في منشأة فينو ICMice. ويدعم الأساسية من قبل 2 "Investissements d'avenir" (ANR-10- IAIHU-06 و ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS) و "مؤسسة من أجل recherche Médicale". نحن نعترف نيكولاس رينييه للمشورة المنهجية وقراءة المخطوطات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables
Centrifuge tubes: 0.2ml Eppendorf 30124359
Centrifuge tubes: 2ml Eppendorf 30120094
Conical centrifuge tubes: 15ml Falcon 352096
Conical centrifuge tubes: 50ml Falcon 352070
Microtome blade 80mm Microm Microtech France F/MM35P
Needles 26G (0.45x13 mm) Terumo AN*2613R1
Syringe 1ml Terumo SS+01H1
Microscopes and imaging softwares
AxioZoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope, equipped with an ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera (Hamamatsu Photonics) or an OptiMOS sCMOS camera Zeiss
Imspector Microscope controller software, Version v144 (acquisiton software) Abberior instruments
Imaris File Converter x64 9.2.0(file convertion software) , Imaris stitcher software 9.2.0 (stitcher software), Imaris x64 9.2.0 (3D software) OXFORD instruments
LED lasers (OBIS) LVBT Laser module 2nd generayion COHERENT
Ultramicroscope II equipped with a sCMOS camera (Andor Neo) and a 4 × /0.3 objective lens (LVMI-Fluor WD6) LaVision Biotec
Reagents
Alexa Fluor 568 Donkey anti Rabbit Thermo Fisher A10042
Alexa Fluor 647 Donkey anti goat Jackson ImmunoResearch 705-605-147
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit Jackson ImmunoResearch 711-605-152
Anti-LYVE1 polyclonal antibody Angiobio #11-034
Anti-PROX1 goat polyclonal IgG antibody R&D systems #AF2727
Buprenorphine Injection Ampoules (Buprecare solution, 0.3mg/ml) Animalcare Ampule 1ml
Dibenzyl Ether 100% (DBE) Sigma Aldrich 108014
Dichloromethane 100% (DCM) Sigma Aldrich 270997
Formic acid 99% CARLO ERBA 405793
Glycine Sigma Aldrich G.7126
Heparine sodium salt from porcine Sigma Aldrich H4784
Hydrogen peroxide solution (H2O2 30%) Sigma Aldrich H1009
Isoflurane (Iso-Vet 100%) Piramal NDC 66794-013-10
Methanol 100% Sigma Aldrich 322415
Ovalbumin Alexa Fluor 555 Conjugate Invitrogen 11549176
Phosphate Buffer Solution PBS (stock solution 10X) Euromedex ET330-A
Sodium Pentobarbital (Euthasol 400mg/mL) Dechra 08718469445110
Tri-sodium citrate VWR 6132-04-3
Surgical tools and equipments
Anaesthesia system Univentor Univentor 410 Anaesthesia Unit
Glass micropipette puller Narishige PC-10
Heating pad CMA Microdialysis AB CMA 450 Temperature controller
Microcapillaries (Glass Capillaries) Harvard Apparatus GC120-15
Microforceps, forceps,dissection scissors and Michel Suture Clips (7.5 × 1.75mm) Fine Science Tool 12040-01
Scalpel (sterile disposable scalpel 23) Swann-Norton 0510
Stereotaxic apparatus KOPF Model 940
Syringe Hamilton 10µl 701N Hamilton 28618-U
Warm air System Vet-Tech LTD HE011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
  2. Iliff, J. J., Goldman, S. A., Nedergaard, M. Implications of the discovery of brain lymphatic pathways. The Lancet Neurology. 14 (10), 977 (2015).
  3. Engelhardt, B., et al. Vascular, glial, and lymphatic immune gateways of the central nervous system. Acta Neuropathologica. 132, 317-338 (2016).
  4. Benveniste, H., et al. The Glymphatic System and Waste Clearance with Brain Aging: A Review. Gerontology. , 1-14 (2018).
  5. Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Lymphatics in Neurological Disorders: A Neuro-Lympho-Vascular Component of Multiple Sclerosis and Alzheimer's Disease. Neuron. 91 (5), 957-973 (2016).
  6. Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).
  7. Ma, Q., Decker, Y., Müller, A., Ineichen, B. V., Proulx, S. T. Clearance of cerebrospinal fluid from the sacral spine through lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 216 (11), 2492-2502 (2019).
  8. Louveau, A., et al. Understanding the functions and relationships of the glymphatic system and meningeal lymphatics. The Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3210-3219 (2017).
  9. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  10. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. The Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  11. Antila, S., et al. Development and plasticity of meningeal lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3645-3667 (2017).
  12. Ahn, J. H., et al. Meningeal lymphatic vessels at the skull base drain cerebrospinal fluid. Nature. 572 (7767), 62-66 (2019).
  13. Pollay, M. The function and structure of the cerebrospinal fluid outflow system. Cerebrospinal Fluid Research. 7, 9 (2010).
  14. Jacob, L., et al. Anatomy and function of the vertebral column lymphatic network in mice. Nature Communications. 10 (1), 1-16 (2019).
  15. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  16. Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  17. Song, E., et al. VEGF-C-driven lymphatic drainage enables immunosurveillance of brain tumours. Nature. 577 (7792), 689-694 (2020).
  18. Absinta, M., et al. Human and nonhuman primate meninges harbor lymphatic vessels that can be visualized noninvasively by MRI. eLife. 6, 29738 (2017).
  19. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  20. Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  21. Jackson, D. G., Prevo, R., Clasper, S., Banerji, S. LYVE-1, the lymphatic system and tumor lymphangiogenesis. Trends in Immunology. 22 (6), 317-321 (2001).
  22. Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
  23. Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. Light-sheet microscopy: a tutorial. Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).
  24. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 159، السحايا والفقارية الأوعية الدموية اللمفية، الغدد الليمفاوية، الصرف الصحي، iDISCO+، ضوء ورقة المجهر fluorescence، الجهاز العصبي المركزي
التصوير ثلاثي الأبعاد للأوعية الدموية اللمفية الفقارية والصرف باستخدام iDISCO<sup>+</sup> والمجهر الفلوري ورقة الضوء
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jacob, L., Brito, J., Thomas, J. L.… More

Jacob, L., Brito, J., Thomas, J. L. Three-Dimensional Imaging of the Vertebral Lymphatic Vasculature and Drainage using iDISCO+ and Light Sheet Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (159), e61099, doi:10.3791/61099 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter