Summary
프로토콜은 뇌척수액(CSF) 및 척추 경막수액을 수집하는 림프관 및 림프절(LNs)의 3차원 및 세포 분해성 이미지를 얻기 위해 조직 클리어링과 가벼운 시트 형광 현미경 검사법(LSFM)을 결합하여 제시된다.
Abstract
중추 신경계 (CNS)와 관련되었던 림프 계통에는 두뇌, 척수 및 관련 LN의 주위에 회전하는 림프 혈관을 포함합니다. CNS 관련 림프 계통은 CNS 배수 LN을 향한 CSF 거대 분자 및 수막 면역 세포의 배수에 관여하여 CNS 조직 내의 폐기물 정리 및 면역 감시를 조절합니다. 제시는 주변 조직 내에서 회로의 무결성을 유지하면서 CNS 관련 림프의 3차원 (3D) 및 세포 분해성 이미지를 얻는 새로운 접근 방식입니다. iDISCO+ 프로토콜은 광시트 형광 현미경 검사법(LSFM)으로 이후에 이미지되는 척추 컬럼의 탈화 및 전체 마운트 제제에서 림프성 혈관을 면역 라벨에 사용한다. 이 기술은 척수 주위의 수막 및 경막외 공간을 외피 림프관에 연결하는 림프 네트워크의 3D 구조를 보여줍니다. 제공된 분자 추적기의 배수 회로의 3D 이미지는 이전에 시스테나 마그나 또는 흉부 척추 parenchyma를 통해 CSF에 주입된다. iDISCO+/LSFM 접근법은 신경 혈관 생물학, 신경 면역학, 뇌 및 척추암 또는 척추 뼈 및 관절 생물학에서 CNS 관련 림프시스템의 구조와 기능을 탐구할 수 있는 전례 없는 기회를 제공합니다.
Introduction
CNS는 CSF와 수막, 경막외 조직 및 뼈의 겹치에 둘러싸여 있습니다. CSF는 모두 부드러운 뇌와 척수에 물리적 인 보호를 제공합니다. 그것은 주로 choroid 신경총과 수막 (즉, 피아 마터, 거미류 및 듀라 마터)에 의해 분비된다. CSF-수막 복합체는 또한 CNS 조직과 신체의 나머지 부분 사이의 기능적 인터페이스를 확립하여 CNS 항상성에 기여합니다. 첫째, CSF는 CNS 파라 동맥 공간을 통해 CNS parenchyma를 관통하고 CNS혈관2,3,,4,4 주위에 파라바 공간 및 성상세포 말발 막으로 구성된 글리프파틱 (glia-lymphatic) 시스템을 통해 중간 유체 (ISF)1과 동적으로 상호 작용합니다. 대사 폐기물및 과잉 유체는 궁극적으로 전신 순환을 향한 뇌 의 정맥 내 배수에 의해 궁극적으로 지워집니다3,뿐만 아니라 CSF를 향한 정맥 공간과 뇌 배수 림프혈관을 통해, 글리프파틱 모델2에따르면2,4. CSF 유출은 주로 림프계를 통해, 크리브리폼 플레이트및 관련 외두개,,림프혈관5,,6,,7을통해, 뿐만 아니라 뇌 배수 LN8,9,910,11,,12(도 1)에수렴되는 수막 림프혈관에 의해서이다. 중요한, 비록 보조, CSF 유출에서 역할은 수막 정맥 부비동의 lacuna를 관통 하는 두개골 거미 악에 의해 촬영13.
CFS 배수 회로는 CNS 또는 CSF로 착색/형광 추적기를 주입한 다음, CNS 내부및 체내 장기 및 조직 전체에 대한 추적자 패턴의 이미징이 주입후 13후에 다른 시점에서 추적자 패턴의 이미징을 기반으로 실험적 접근법을 통해 광범위하게 조사되었다. 오랜 시간 동안, CSF의 유출은 거미 정맥부비동(13)으로투사되는 거미악을 통해 혈액 순환에 의해 독점적으로 직접 적으로 담당한 것으로 간주되었다. 그러나, CSF 유출은 주로 림프혈관에 의해 수행되며, 최근에는 마우스9,,10에서CSF 주입 추적기 수송의 근적외선(NIR) 동적 이미징에 의해 도시된다. CSF 배수 림프관은 오른쪽 서브클라비아 정맥을 통해 림프를 혈류로 돌려보습니다. 보완 적 어프로치는 CSF 주입 추적자의 외두개66,7,,13 및 두개 내9,,10,,11,,12 림프 출구를 모두 검출하고 CSF가 두 개의 림프 경로, 하나 외부 및 두개골 및 척추 컬에 내부에 흡수되는 것을 제안합니다. CSF 배수의 주요 부분은 비강 점막의 두개골 바깥쪽에 있는 림프관을 통해 빠르게 발생하며, ethmoid bone3,,6,,13의 크리브리폼 플레이트의 채널을 통해, 소들, 요추성 척추 뼈 의 외부는 아직 완전히 특징적이지 않은 등쪽 경로7,,14. 또한, 두개골의 수막에서, 두라 마터의 림프모세혈관은 두개골 뼈를 교차하고 CNS 배수 LNs12,,14에연결하는 격막 림프 수집기를 향해 CSF 및 수막 면역 세포를 흡수한다. 이러한 뇌 수막 림프관은 노화 시 뇌 수막 림프제가 변하고 신경변성, 신경염증 및 뇌암15,,16,,17을포함한 신경뇌질환의 결과에영향을 미치기 때문에 CNS 병리생리학에서 중요한 역할을 한다. 따라서, CNS-관련 림프 혈관(즉, CSF를 배수하는 두랄 및 말초 림프관)은 인간에서 CNS 질병에 대항하는 유망한 새로운 표적이 될 수 있다.
면역 조직학 및 고해상도 자기 공명 영상으로 수행 된 수렴 연구는 수막 림프혈관이 일반적인 마모셋 원숭이와 인간7,,11,,13을포함한 영장류에도 존재한다는 것을 입증했습니다. 더욱이, 수막 림프관은 두개골에 국한되지 않고 척추 컬럼 내에서 척추 신경리아와라미(13,18)의18표면으로 확장한다. 뼈, 근육, 인대 뿐만 아니라 인접한 내장 조직을 포함하여 표지된 척추 및 척추 샘플의 전반적인 해부학을 보존하는 척추 컬럼 림프제의 3차원(3D) 이미징은 최근14회수행되었다. 상기 iDISCO+ 프로토콜(19)은,,20은 림프계 항체를 가진 전체 척추컬럼의 탈칼화 및 클리어된 제제를 막 수용체 LYVE1(LYVE1 21) 또는 전사인 PROX1(22)에 대해 사용하였다.21 22 영상 수집 및 분석은 광시트 형광 현미경 검사법(LSFM) 및 Imaris 소프트웨어로 수행하였다. LSFM은 조명의 축 감금에 의해 대형 표본의 신속하고 최소 침습적인 3D 이미징을 허용하여 광표백 및광독성(23)을감소시다.
iDISCO+/LSFM 접근법은 두막 및 경막외 림프관의 뚜렷한 층의 특성화와 이 혈관을 외피 림프 회로및 척추 기둥에 인접한 LN에 연결할 수 있습니다. 이 프로토콜은 이전에 형광 추적기로 주입된 조직에 적용되어 척추 운하 배수를 입증했습니다. 본 논문은 iDISCO+/LSFM방법론에 대한 세부 정보를 제공하여 척추 림프 혈관을 이미지화하고 CSF 및 경막외 유체 배수 조사와의 관련성을 보여줍니다.
Protocol
이 연구에 사용된 모든 생체 내 절차는 실험적인 동물 사용 지침에 대한 유럽 공동체에 따라 동물 실험 및 연구에 대한 모든 관련 윤리 규정을 준수합니다(L358-86/609EEC). 이 연구는 INSERM의 윤리위원회 (n° 2016101111126651)와 ICM의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (Institut du Cerveau et de la Moelle épinière)의 윤리적 승인을 받았습니다.
1. 준비
- 메스 (1), 마이크로 포스 (2), 집게 (1), 해부 가위 및 미셸 봉합사 클립 : 수술을위한 다음과 같은 해부 도구를 준비합니다. 26G 바늘(0.45mm x 13mm), 1mL 주사기 및 10 μL 현미경 주사기를 준비합니다.
- 유리 마이크로피펫 풀러와 함께 67.5 °C에서 단단계 프로토콜로 미세 모세 혈관을 당깁니다. 주사당 두 개의 미세 모세 혈관을 준비하십시오.
- 이미징 림프 배수에 대한 시약을 준비(표 1):Ovalbumin 알렉사 플루오 555 컨쥬게이트 (OVA-A555,1 x 인산 완충 식염수 [PBS]에서 2 mg / mL) 및 안티 LYVE1 항체 (1 x PBS에서 1 mg / mL).
- iDISCO+항체(표 1)를준비하십시오. 1차 항체의 경우, 항-LYVE1 토끼 폴리클론 항체(1:1,600) 및 항-PROX1 염소 폴리클론 IgG 항체(1:2,000)를 사용하십시오. 이차 항체의 경우 알렉사 플루오르 당나귀 항토끼-568, 당나귀 안티 래빗-647 및 당나귀 항 염소-647 (1:2,000)을 사용하십시오.
2. 시스테나 마그나 (ICM) 및 흉부 (ThLb) 주사에 대한 수술 절차
- 수술을 위한 동물의 준비
- 성인 남성과 여성 C57BL6/J 마우스를 사용 하 여, 8-12 주 오래 된.
- 0.015 mg/mL buprenorphine 용액으로 마우스 내 역류(IP)를 0.9% 염화나트륨0.1 mg/kg, 수술 15분 으로 희석시 주입한다.
- 유도 상자에 마우스를 2-3% 이소플루란 가스로 마취합니다.
- 추적자 주입을 위한 마취동물의 준비
- 마취 된 마우스와 가열 패드를 스테레오 탁스 장치에 놓습니다. 이어 바를 사용하여 마우스의 머리를 잡고 머리에 ~ 135° 각도로 몸을 내려놓거나 척추 어댑터로 ThLb 척추 수준(Th12-L1)에서 척수를 고정시하십시오. 꼬리 나 발을 포스프로 꼬집어 마취의 효율성을 확인합니다.
- 마우스 수분 공급을 위해 0.9% 염화나트륨의 IP 200 μL을 주입하십시오.
- 메스 블레이드를 사용하여, ICM 주사를 위한 자궁 경부 부위를 향한 후두 부위또는 ThLb 척추 parenchyma에 주입하기 위한 ThLb 척추 수준(Th10-L3)에서 피부 절개를 합니다.
- 트레이서 주입
- 목과 컬럼을 덮고 있는 파라체비골과 기생충 근육을 버리고 수막의 가장 바깥쪽 층인 두라 마터의 표면을 시각화합니다.
- 두라 마터의 중앙 부위를 조심스럽게 천공하고 26 G 바늘로 거미를 밑설.
- 미세 모세관 이식
- 유리 모세관 팁의 2mm를 잘라 (단계 1.2 참조), 다음 OVA-A555 또는 LYVE1 항체의 흡인 2-8 μL에 10 μL 주사기에 연결된 캐뉼라에 연결된 마이크로 모세관을 사용합니다.
- ICM 주사를 위한 30° 각도 또는 ThLb 척추 주사를 위한 10° 각도에서 듀라 마터의 내측 부위에 있는 마이크로모세필을 소개하고, 듀라 마터 아래 1.5mm로 밀어 넣습니다.
참고 : 인대가 구멍이 있지만 라미네절제술은 수행되지 않습니다. - 10 μL의 수술 접착제를 추가하여 유리 모세관 주위의 절개를 닫고 건조할 때까지 기다립니다.
- 1 μL/분에 형광 추적자를 천천히 주입하십시오. 주사 부피가 전달되면 1 분 동안 모세관을 유지하십시오. 미세 모세관을 철회하고 수술 접착제를 추가하여 주사 구멍을 닫습니다.
- 사후 주입, 봉합사 클립으로 피부 절개를 닫습니다. 스테레오탁스 장치에서 마우스를 제거하고 복구될 때까지 37°C의 수술 후 온난화 챔버에 놓습니다.
3. 관류 및 조직 해부
- CSF 트레이서 주입 후 15분 또는 45분 에서, 나트륨 펜토바르비탈의 치명적인 용량(100 μL)을 IP에 주입하십시오. 꼬리 나 발을 꼬집어 반사가 없는지 확인합니다.
- 해부 가위를 사용하면 피부를 자르고 하복부 부위에서 흉부 케이지쪽으로 복막 층을 엽니다. 심장에 접근할 수 있도록 가위를 가진 흉부 케이지를 엽니다.
- 심장의 왼쪽 심실에 26 G 바늘을 삽입하고 2 mL / 분에서 1 x PBS에서 얼음 차가운 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 20 mL로 perfuse 하기 시작합니다. 가위를 사용하여 오른쪽 아트리움을 빠르게 자르고 관류 유체 스트림을 방출합니다.
- 집게로 피부를 완전히 제거하고 가위로 네 다리를 잘라냅니다. 모든 내부 장기를 제거하지만 온전한 LN을 유지하십시오.
참고: 만디큘러 LN은 피상적이므로 피부를 절단할 때 제거하지 않도록 주의하십시오. 심층 경부 LNs (dcLNs)는 기관의 각 측면에 위치하며 내부 경정맥의 측면 표면과 접촉하여 스테레오마스토이드 근육에 가깝습니다. - 갈비뼈를 잘라 척수컬을 자궁경부에서 요추 세그먼트로 안쪽으로 제거합니다.
- 4°C에서 하룻밤 사이에 50mL 튜브(~18h)에 1x PBS로 해부된 조직을 1x PBS로 담급니다. 고정 된 조직을 50 mL의 50 mL에서 5 분 동안 1 x PBS로 씻으시면 씻습니다.
4. 척추 세그먼트의 형광 매크로 검사
- 형광 스테레오줌 현미경 아래에 카메라를 배치(재료의 표). 샘플에 대한 개요를 가져오거나 특정 영역을 확대합니다.
5. 전체 마운트 면역 염색을위한 샘플 준비
- 마이크로톤 블레이드를 사용하여 후두및 자궁 경부 수준에서 머리와 척추 컬럼을 변형으로 자른다.
참고: 이 해부는 척추 열의 나머지 부분에서 머리와 자궁 경부 척추 부위의 격리를 허용합니다. - 마이크로톤 블레이드를 사용하여 척추 컬럼의 자궁 경부, 토라컬룸바 및 천년 영역을 각각 약 0.5cm 크기의 2-4 척추 세그먼트로 반경으로 자른다.
- 척추 기둥의 자궁 경부 및 흉부 영역의 전체 길이를 따라 척추 축으로부터 분리된 순서로 각 세그먼트를 분리합니다. 각 샘플을 2mL 1x PBS 튜브에 보존합니다.
6. iDISCO+ 척추 세그먼트의 전체 마운트 면역 염색
참고: iDISCO+ 프로토콜에 대한 자세한 설명은 http://www.idisco.info 액세스할 수 있습니다.
- 1일차: 조직 탈수
- 탈수 척추 조직 샘플 (즉, 척추 세그먼트)에 연속 침수에 의해 20%, 40%, 60%, 80 %, 및 1x PBS에서 1x PBS에 1 시간 교반.
- 교반을 가진 실온 (RT)에서 33 % 메탄올 / 66 % 디클로로메탄 (DCM)의 용액에서 밤새 샘플을 배양합니다.
- 2일차: 티슈 표백
- 세척 시료는 RT에서 1시간 동안 100% 메탄올로 2배 세척합니다.22 22
- 3일차: 탈화 및 투과성 단계
- 80%, 60%, 40%, 메탄올 20%, 반응성으로 1x PBS(각 솔루션1h)로 샘플을 점진적으로 재수화합니다.
- 뼈 구조를 보존하기 위해 RT에서 30 분 동안 모스의 용액 (10 % 삼중나트륨 구연산 및 45 % 포믹 산 1 :1 v / v)에서 샘플을 배양하여 척추를 탈칼시피하십시오.
- 1x PBS로 샘플을 2배 헹구고 PTx2 솔루션에서 1h로 2배 인큐베이션(1x PBS에서 0.2% 트리톤 X-100, 두 번째 인큐베이션을 위해 갱신). 그런 다음 전처리된 샘플을 37°C에서 24시간 동안 20%의 디메틸 설산화물[DMSO]와 2.3%w/v 글리신으로 배양한다.
- 4일차: 차단 단계
- 블로킹 용액(PTx2 와 6% 당나귀 혈청, 10% DMSO)에서 24시간 동안 37°C의 시료를 배양한다.
- 일 5-16: 전체 마운트 면역 라벨링
- PTwH에서 희석된 1차 항체의 시료(1x PBS는 1x PBS에서 10 mg/mL에서 0.2% Tween-20 및 0.1% 헤파린을 함유하고 있음)로 6일 동안 37°C에서 5% DMSO/3% 당나귀 혈청을 함유하고 있다. 밤새 동요와 RT에서 PTwH에서 샘플 4-5 배 세척.
- PTwH의 이차 항체 희석제에서 시료를 37°C에서 37°C로 4일 동안 배양한다. 클리어링 하기 전에 하룻밤 교반에서 RT에서 PTwH 4-5 x에서 샘플을 세척합니다.
- 일 17 및 18: iDISCO+ 조직 정리
- 1x PBS에서 연속적으로 침수하여 점차적으로 샘플을 탈수한 다음 20%, 40%, 60%, 80%, 100% 메탄올(각 솔루션1h)에서 2배입니다. 각 샘플을 33% 메탄올/66% DCM의 용액으로 하룻밤 동안 배양합니다.
- 메탄올을 제거하기 위해 15 분 동안 100 % DCM로 2 배 세척하십시오. 디벤질 에테르 (DBE)에서 지워질 때까지 흔들리지 않고 배양 한 다음 화상 진찰 전에 RT에서 DBE에 저장하십시오.
7. LSFM 이미징
- 이미지는 4x/0.3 목표를 갖춘 LSFM을 장착한 트랜스버럴 평면에서 샘플을 지웠습니다.
- 단일 면 3 시트 조명 구성, 고정 된 x 위치 (동적 초점 없음)을 사용합니다. 561 nm, 100 mW로 조정 LED 레이저를 사용; 및 639 nm, 70 mW. 라이트 시트 수치 조리개를 30%로 설정합니다.
- 다른 방출 필터를 사용: 595/40 알렉사 플루오-568 또는 -555, 알렉사 플루오르-647에 대 한 -680/30.
- 현미경 챔버를 DBE로 채웁니다.
- Aquire는 2.5 μm z 단계와 카메라(재료의 표)와단계 당 30 ms 노출 시간으로 스택. x2 광학 줌을 사용하여 (x8), 0.8 μm/픽셀의 효과적인 배율을 수행하고 전체 프레임에 10% 겹쳐모자이크 획득을 수행합니다.
- 획득 소프트웨어로 .tif 형식으로 이미지를 획득하고 파일 변환 소프트웨어로 3D 형식으로 변환합니다.
- 스티처 소프트웨어(재료의 표)로모자이크 인수를 재구성합니다. 이미지를 열고 수동으로 이동하여 이미지 간에 10% 겹치는 것을 지침으로 사용하여 전체 모자이크 그림을 재구성합니다.
- 도 1, 도 2, 도 3및 도 4에도시된 바와 같이 3D 소프트웨어(재료표)를사용하여 데이터의 직교 투영을 생성하고, 디스플레이에 림프용기 및 기타 해부학적 구조에 색코드 특성을 추가한다. 제조업체의 지침에 따라 LSFM에서 얻은 원시 데이터에 1.47의 감마 보정을 설정합니다.
Representative Results
척추 림프 혈관의 3D 이미징
도 1은 iDISCO+/LSFM 절차의 단계와 iDISCO+-treated ThLb 척추의 척추 운하 내부의 림프 회로의 LSFM 이미지를 제시한다. iDISCO+와 LSFM의 조합은 척추 해부학을 보존하고 주변 뼈, 인대, 근육 및 신경 조직 내에서 림프관 네트워크 (즉, 척추 몸에서 뒤늦게 빠져 나가는 외피 혈관과 연결된 내무척추 혈관)의 시야를 캡처했습니다.
dcLN 배수의 형광 매크로 현미경 이미징
CNS 관련 림프계에서 거대 분자 배수를 이미지하기 위해, 거대 분자 추적자는 CSF 또는 척추 parenchyma에 주입하여 생체 내에서 관리되었다. 매크로 분자 추적기는 시스테나 마그나에서 CSF로 쉽게 전달될 수 있습니다. 시스테나 마그나는 소뇌와 메둘라 직사각형의 등대 표면 사이에 위치하고 있으며, 포멘 매그넘 위에 있습니다. 거시 분자 추적자는 또한 척추 컬럼을 따라 다른 수준에서 입체 수술에 의해 척추 부렌키마에 주입 될 수 있습니다.
사용된 매크로 분자 추적자는 특정 항체를 가진 면역 히스토케화학에 의해 직접 플루오로포레로 표지되거나 사후 평가를 검출했다. 도 2A는 CSF(도2B)또는 척수의 ThLb부위(도 2C)에주입된 OVA-A555,적색 형광 및 소형 분자량 추적기(약 45kDa)를 추적하기 위한 실험 계획을 도시한다.
매크로 분자 추적자 주입 후 45 분에서, 마우스는 희생, 4 % PFA로 perfed, 그리고 머리의 뇌 줄기 영역과 탈화 및 명확화 된 척추 컬럼의 해부 세그먼트를 격리하기 위해 처리되었다. 거대 분자 배수는 CSF 및 경막외 유체를 수집하는 LNs의 형광 매크로 스코피이미징에 의해 쉽게 평가되었다. 도 2에도시된 바와 같이, OVA-A555는 CSF(도2B)또는 척수의 ThLb(도2C)부위로 주입하여 주사 후 45분 만에 DCLNs에 OVA-A555가 축적되었다. 이 관측은 림프계에 의한 형광 추적기의 섭취및 배수를 나타낸다. 그것은 척추 림프 배수를 이미지하기 위해 iDISCO+/ LSFM 절차를 추구하기 전에 전제 조건이다.
척추 림프계의 거대 분자 배수의 3D 이미징
DCLN에서 OVA-A555 라벨링의 검출에 기초하여, iDISCO+/LSFM절차는 OVA-A555-주입된마우스로부터 분리된 탈질및 미리 삭제된 척추 시료에 적용될 수 있었다. 이 접근은 추적자 주입 후에 특정 시점에서 CSF 및 척추 경막외 액체의 림프 배수의 3D 지도의 생성을 허용했습니다. 이 3D 매핑은 사출 지점에서 각 척추 컬럼 수준에서 연속적인 CNS 세그먼트를 이미징하여 수행될 수 있습니다.
도 3A는 림프혈관과 함께 자궁경부 및 흉부 척추 세그먼트에서 OVA-A555 분포의 결과3D 패턴과 THLb 척추 빈맥에 대한 OVA-A555 주입에 대한 실험 설계를 나타낸다. OVA-A555 주사 후 45분, OVA-A555 축적은 척수 조직 및 dcLN(도 3B의백색 화살표)에서 검출되었으며, 도 2에도시된 현미경 관찰과 일치한다. 그러나 항-LYVE1 항체로 표지된 자궁경부 및 흉부 림프 혈관에서 는 검출되지 않았다. 척추 림프관에 CSF 주입 추적기가 없는 것은 림프관 내부의 추적자의 짧은 지속성 시간 또는 림프관에 의한 트레이서의 섭취부족(도 3C)에기인할 수 있다.
첫 번째 가설을 테스트하기 위해 토끼 안티-LYVE1 항체는 CNS 관련 림프혈관을 결합하기 위해 림프내막 세포 태그로 사용되었다. 주입된 토끼 항-LYVE1 항체는 그 후 항토끼 이차 항체를 가진 면역 조직화학에 의해 검출되었고, 림프 내피 세포는 항 PROX1 항체로 면역 라벨을 부착하였다. 도 4는 PROX1+ 림프액에 대하여 주사 부위에 가까운Figure 4AThLb 세그먼트에서 THLb 세그먼트에서 LYVE1 항체의 결과 3D 분포 패턴에 대한 항-LYVE1 주입의 실험 설계를 나타낸다(도4B). 척추 림프와 그들의 외피 림프 연결은 척추 림프관및 림프성 림프계를 향한 림프 배수에 의해 추적자 섭취를 입증한 주입 된 안티 LYVE1 항체에 의해 표지되었습니다. LLb 영역에서는 LN이 부족하여 이미지 세그먼트에서 시각화할 수 없었습니다. 더욱이, 림프혈관을 따라 관찰된 LYVE1 마커의 불연속 패턴은 이전 연구에서 보고된 바와 같이 림프혈관에서 LYVE1의 불연속발현을 반영할 가능성이 있다14,,21. 전부, 본 연구의 결과는, 추적자 주입 후에 45 분, LYVE1 항체, 그러나 OVA-A555가아니라, 현지 척추 림프량 섭취량의 검출을 허용하고 현지 척추 림프 배수의 지속적인 마커로 OVA-A555에 선호되었다는 것을 보여주었습니다.
그림 1: 척추 림프혈관의 입체적 보기. (A)프로토콜의 회로도 표현. (B)등쪽 관점에서 ThLb 척추 림프 혈관의 3D 뷰의 평면 투영. 림프용기는 iDISCO+ 프로토콜을 이용하여 항 PROX1 항체(green)로 면역라벨을 부착한 다음 LSFM에 의해 이미지되었다. 3개의 연속된 척추 (백색 화살촉)의 척추 운하 내의 혈관의 메타메라와 같은 패턴을 유의하십시오. 반원형 등쪽 혈관(흰색 화살촉) 외에도 각 척추 망에는 복부 가지(노란색 화살표), 척추 라미및 갱리아(흰색 화살표)를 따라 양자 측측 출구 경로, 중간선(흰색 이중 화살표)의 등쪽 출구 경로가 포함되었습니다. 척추 네트워크는 세로 혈관 (보라색 화살표)과 상호 연결되었습니다. 전체 설명은 Jacob L.외. 18 SC = 척수를 참조하십시오. 별표 = 복부 척추 몸체; D = 등쪽; L = 측면; V = 복부; 스케일 바 = 300 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 2: DCLN은 OVA-A555-표지된CSF 유체를 수집했습니다. (A)실험 설계의 계획. OVA-A555는 ICM 또는 ThLb 척추 parenchyma에 주입된 다음, 마우스는 주입 후에 45 분 희생되었습니다. 샘플은 형광 거시스코프이미징(B,C)에의해 지워지고 관찰하였다. ICM-(B) 및 ThLb-(C) 주입된 마우스로부터B자궁경부 척추의C형광 거시현미경 이미지. DCLNs(B,C,흰색 화살촉),B자궁경부 척수(B,C)의피알 및 파라혈관 공간에 축적된 OVA-A555는 자궁 경부신경(B,백색 화살)을 따라 심실 출구 경로에서 ICM 주사 후 축적된다.B SC = 척수. 별표 = 복부 척추 몸체; D = 등쪽; L = 측면; V = 복부; B및 C = 2mm의 축척 막대를 보려면 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 3: 척추 림프계에서 OVA-A555-표지된CSF 유체의 검출. (A)실험 설계의 계획. OVA-A555는 ThLb 척추 빈맥에 주입된 다음 주사 후 45분 후에 마우스를 희생했습니다. 샘플은 iDISCO+ 프로토콜로 처리되고 LSFM으로 이미지화되었습니다. (B,C) 경부(B)및 흉부(C)척추 세그먼트의 LSFM 캡처 정면 3D 뷰의 평면 투영. OVA-A555 축적(red)은 도 2에도시된 척수 조직 및 dcLNs(B, 흰색 화살표)에서 검출되었지만, 자궁 경부 및 흉부 림프 혈관 면역표지에서 항-LYVE1 항체(green)로 표기되지 않았다.B SC = 척수; 별표 = 복부 척추 몸체; D = 등쪽; L = 측면; V = 복부; 스케일 바 = 1mm(B),300 μm(C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 항-LYVE1 항체의 척추 주사 후 척추 림프 배수의 검출. (A)실험 설계의 계획. 항-LYVE1 항체는 ThLb 척추 parenchyma에 주입된 다음, 마우스는 주입 후에 45 분 희생되었습니다. 샘플은 iDISCO+ 프로토콜로 처리되고 LSFM으로 이미지화되었습니다. (B).LSFM으로 캡처된 ThLb(B) 척추B세그먼트의 정면 3D 뷰의 평면 투영. 항-LYVE1 항체는 항토끼 항체(보라색) 및 항-PROX1 항체(green)를 가진 림프 혈관으로 검출되었다. 백색 혈관은 PROX1+ 림프제와 항-LYVE1 항체(B)와공동 표지된다; 이들은 척추 (노란 화살표) 및 외피성 (이중 노란 화살표) 림프제가 포함됩니다. SC = 척수; 별표 = 복부 척추 몸체; D = 등쪽; L = 측면; V = 복부; 스케일 바 = 300 μm(B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | 대상 | 그림 | 프로토콜 단계 | 코멘트 |
| OVA-A555 | CSF 트레이서 | 그림 2 및 그림 3 | 2. ICM 또는 ThLb 주입 7. LSFM 이미징. |
수용성, 주입하기 쉽고 강렬한 형광이 높음 |
| 안티 리베1 항체 | LV 세포의 멤브레인 마커 | 그림 3 | 6. iDISCO + 전체 마운트 immnunostaining. 7. LSFM 이미징. |
전체 마운트 immnunostaining에 효율적인 항체 |
| 듀랄 및 경막외 LV의 트레이서 배수 | 그림 4 | 2. ICM 또는 ThLb 주입 6. iDISCO+ 전체 마운트 immnunostaining 7. LSFM 이미징 |
||
| 안티 프록시1 항체 | LV 세포의 핵 마커 | 그림 1 및 그림 4 | 6. iDISCO+ 전체 마운트 immnunostaining 7. LSFM 이미징 |
전체 마운트 immnunostaining에 효율적인 항체 |
표 1: 연구에 사용되는 항체 및 추적기.
| 문제 | 가능한 이유 | 솔루션 | |
| 트레이서 주사 수술 | 원치 않는 CNS 조직 병변 | 1. 유리 모세관 삽입의 제어 부족 2. 유리 모세관 삽입의 잘못된 깊이 |
1. 유리 모세관 삽입 전에 26 G 바늘을 가진 듀라 마터를 주의 깊게 천공하십시오. 2. 유리 모세관 삽입의 깊이를 줄입니다 (듀라 마터에서 1.5 mm). 3. 유리 모세관 직경을 줄입니다. |
| 경막외 또는 여분의 척추 공간에 주입 된 추적자의 원치 않는 삭제 | 트레이서의 잘못된 주입 | 1. 유리 마이크로 모세관이 두라 마터의 천막에 잘 삽입되었는지 확인하십시오. 2. 트레이서를 주입하기 전에 유리 미세 모세관과 둘러싸인 조직 사이에 수술 접착제를 추가하십시오. |
|
| 주입된 트레이서의 과도한 부피 | 주입된 트레이서의 부피를 줄입니다(&2 μL). | ||
| iDISCO+ 면역 염색 | 부재, 이질성 또는 조직에 라벨링의 과도한 배경 | 1. 1 차 항체의 농도 문제 2. 불충분 한 투과성 3. 세탁 부족 4. 불충분 한 청산 |
침투, whashing, 1 차적인 항체 및 청산: 잠복기 단계의 수 및/또는 시간을 늘립니다. http://www.idisco.info(FAQ 및 문제 해결)을 참조하십시오. |
| 불충분한 탈화 | 특히 머리 조직에 대한 EDTA21 또는 모스 용액을 사용하여 샘플의 보다 엄격한 탈석화 처리를 사용하십시오. | ||
| iDISCO+ 클리어링 | 샘플은 불투명하거나 갈색으로 변합니다. | 표백 부족 | 신선한 H2O2 솔루션을 사용하여 볼륨 및/또는 인큐베이션 시간을 증가시면 됩니다. |
| 산화의 존재 | 공기의 존재를 피하기 위해 튜브를 완전히 채웁니다. | ||
| 불충분 한 클리어링 | 볼륨 및/또는 인큐베이션 시간을 증가시면 됩니다. http://www.idisco.info(FAQ 및 문제 해결)을 참조하십시오. | ||
| 트레이서 감지 | 탐지할 수 없는 추적자 | 선택한 트레이서의 잘못된 조합 | 알렉사 555, 594 및 647 플루오로크롬은,iDISCO + 프로토콜5,,6,,7,8,89,,10에저항한다. 그러나 FITC, GFP, RFP 플루오로크롬의 경우는 그렇지 않습니다. |
| 주입 후 시점을 희생 | 현지 척추 림프학에서 단기 (15 분) 배수 분석을 위해 OVA-A555를 선호합니다. 림프절 배수 분석을 위해 OVA-A555 및 Lyve1 항체를 장기간(>45분) 분석에 사용할 수 있습니다. | ||
| 이미징: 캡처 및 분석 | 림프 회로의 캡처 된 이미지는 만족스럽지 않습니다. | 해부 문제(림프절이 누락됨) | 당신이 이미지하려는 림프 회로에 따라, 해부 샘플에 척추 / 두개골 이웃 조직을 주의 깊게 포함. |
| 이미징 문제 | 1. LSFM의 획득 매개 변수를 수정 : 레이저 강도, 라이트 시트 수치 조리개, 빛 시트의 두께, 박람회 시간. 2. 목표까지 조직을 통해 빛으로 이동하는 경로를 줄이기 위해 서포트에 샘플을 놓는다. 3. 획득 하는 동안 조직 샘플 안에 거품이 없는 지 확인 합니다. |
표 2: 가능한 문제 및 해결 을 포함하여 프로토콜의 각 단계에 대한 문제 해결 조언입니다.
Discussion
iDISCO+/LSFM 프로토콜은 세포 해상도 수준에서 주변 조직 내에서 CNS 관련 림프 네트워크의 전례없는 3D 보기를 제공합니다. 이 프로토콜은 LSFM 광학 시스템의 한계, 작업 거리 감소 및 고해상도 현미경검사기(23)를위한 상용 목표 렌즈의 큰 크기로 인해 1.5cm3을방출하지 않고 중간 크기의 샘플에 잘 적응된다. 이 제한은 전체 두뇌 관련 림프 계통을 포착하는 것을 방지합니다. 조사 영역은 신중하게 구분되어야 하며 CNS를 둘러싼 조직은 전체 림프회로에 기여하는 외두개 림프관과 LN을 포함시키기 위해 신중하게 해부되어야한다(표 2).
크기 및 해부학적 고려 사항 외에도 주변 중간 엽 조직의 복잡성은 두개골과 척추 컬럼에 따라 다양하며, 이는 균일한 샘플 설명을 얻고 연동 식물성 생물학적 조직 내에서 광선 전파를 허용하기 위해 탈매화 및 프리클리어링 처리의 적응을 필요로 합니다. 뼈가 없는 경우 뇌 또는 척수 조직의 LFSM 이미징은 탈석화 단계를 필요로 하지 않으며 캡처된 이미지의 최종 해상도가 최적19이다. 모스의 용액을 가진 온화한 탈화 단계를 포함하는 전술한 프로토콜은 도 1 및 도 4에도시된 바와 같이 척추 컬럼의 LSFM 이미징에 잘 적응된다. 대조적으로, 목 영역은 도 3B에반영된 바와 같이, 포착된 LSFM 심상의 질을 감소시키는 근육, 지방 및 선 조직의 다층 이외에 특히 복잡한 뼈 해부학을 표시합니다. 목과 자궁 경관 지역의 LSFM 화상 진찰은 이렇게 조직의 더 엄격한 처리에 의해 향상될 수 있습니다; 예를 들어 EDTA를 사용하면 이전에 보고된24. 따라서 탈화 단계는 전체 iDISCO+ 프로토콜(표2)을시작하기 전에 사용되는 각 항체에 대해 이전에 테스트되어야 한다.
iDISCO+/LSFM 프로토콜은 수막 및 경막외 공간과 관련 LN 사이의 연결 회로의 3D 뷰생성을 허용하지만, LSFM-캡처된 이미지로부터 림프혈관의 직접적인 정량적 분석은 다음과 같은 이유로 실현 가능하지 않다: 1) 림프용기 회로의 형상은 림프마커 발현의 불연속 패턴으로 인해 신뢰할 수 없는, membranar LYVE1은 이체로 분포되어 있기 때문에21 및 PROX1은 핵발현 패턴을22; 2) 항체의 이종성 침투뿐만 아니라 불완전하고 이종성 탈화 및 사전 정리로 인해 생물학적 조직에서 지속될 수 있는 이소성.. 따라서 LSFM 이미징은 대화형 시각화를 가능하게 하고 림프 혈관(www.syglass.io)의 정량화를 용이하게 하는 가상 현실 도구에 의해 확장되어야 합니다. 또한 CNS 관련 회로의 정확한 설명은 종래의 면역 라벨링에 의해 얻어진 고해상도 공초점 데이터로 LSFM 정보를 백업해야 하며, 특히 두라 마터 및 CSF에 관한 림프관의 위치를 정확하게 지역화하기 위해,118,18, 118이전에보고된 바와 같이,14,118.
iDISCO+/LSFM 프로토콜은 도 3 및 도 4에도시된 바와 같이 CNS 관련 림프계에서 거시 분자 배수의 3차원 시각화를 허용한다. 그러나, 림프 배수의 기능적 평가는, iDISCO+LSFM 프로토콜에 대한 권장 사항 외에도, 엄격한 절차에 따라, 최종 결과는 주사 수술의 품질에 따라 달라지므로, 전달 부위의 선택, 사용된 거대분자 마커의 종류 및 주입량, 및 추적자 투여 후의 희생 시간(표2)이필요하다. 주입된 동물 사이의 트레이서 패턴의 변화로 인해 림프 배수 회로의 특성화는 큰 실험 군(주사 조건에 의한 10)을 필요로 합니다. 제시된 프로토콜에서, 1) 듀라 마터는 CNS 조직에 원치 않는 병변및 침투를 방지하기 위하여 주입의 앞에 구멍을 뚫어야 합니다; 2) 주입된 부피는 주사 구멍을 통해 원치 않는 확산을 제한하기 위해 2 μL 미만이어야 하며, 주입 모세관을 따라 경막외 공간 또는 외피 조직으로; 3) 분사 모세관 삽입의 깊이는 각각 ICM 및 척추 주사에서 CNS 부상 이나 오타겟팅을 피하기 위해 듀라 마터 아래 2mm로 제한되어야한다. 또한 상기와 같이, 림프관 내부에 주입된 트레이서의 존재를 평가하기 위해, 상기와 같이, 인접한 척추 세그먼트의 보완적인 고해상도 공초점 분석을 수행해야 합니다. 이 분석은 마커 표지 림프관의 단면에 트레이서 및 림프 마커에 대한 강도 프로파일 플롯을 확립해야합니다. 이 접근법은 이전에 주사 후 15 분에서 ThLb 림프학에 의해 OVA555 섭취량을 입증하는 데 사용되었습니다 (야곱 외14에서보충 도 5F). 그러나, 본 연구에서 안티-LYVE1 트레이서에 대해서는 설명되지않았다(도 4).
가능한 CSF 트레이서 중, OVA-A555는 iDISCO+ 프로토콜 치료에 내성이 있고 LSFM 이미징에 대한 높은 형광을 유지하기 때문에 훌륭한 옵션입니다. 그러나 분석시점(표 1 및 표 2)에따라 트레이서 유형을 선택해야합니다. 위에서 보고한 바와 같이, OVA-A555 국소 척추 림프혈관의 라벨링은 주사 후 15분 후에 관찰된다14. 그러나, OVA-A555는 주사 후 45분(도 3)에서 이러한 국소 림프회로에서 더 이상 검출되지않는다(도 3)항-LYVE1항체(도 4)와대조적이다.
결론적으로, iDISCO++/LSFM 프로토콜은 CNS 및 척추 컬럼 암, 척추뼈 및 관절 질환과 같은 생리적 및 병리학적 조건에서 CNS 관련 림프계의 3D 구조 및 배수를 조사하기 위해 잘 적응된다. 전체 절차는 길고 방법론적 엄격이 필요하지만 가상 현실 도구및 고해상도 공초점 이미징을 사용하여 상호 보완 분석과 함께 사용할 때 귀중하고 독특한 정보를 제공합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 Institut 국립 드 라 산테 에 드 라 Recherche Medicale에 의해 지원되었다, 기관 내셔널 레체체 (ANR-17-CE14-0005-03), 연맹 부어 라 레체쉬 쉬르 르 세르베오 (FRC 2017), 카노트 성숙 (L.J.), 유니버시드 연방 드 리오 드 자니에로 (J.B.에 대한 UFRJ), NIH (R01EB0166-019 의 학원) 우리는 ICM 플랫폼을 인정합니다: 면역 조직화학을 위한 세포 화상 진찰및 ICM-조직학을 위한 ICM-QUANT. 모든 동물 작업은 PHENO-ICMice 시설에서 수행되었습니다. 코어는 2 "투자 d'avenir"(ANR-10-IAIHU-06 및 ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS)와 "퐁디부어 라 레쉐 메디칼"에 의해 지원됩니다. 우리는 방법론적 조언과 원고 읽기니콜라스 레니에를 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Centrifuge tubes: 0.2ml | Eppendorf | 30124359 | |
| Centrifuge tubes: 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
| Conical centrifuge tubes: 15ml | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tubes: 50ml | Falcon | 352070 | |
| Microtome blade 80mm | Microm Microtech France | F/MM35P | |
| Needles 26G (0.45x13 mm) | Terumo | AN*2613R1 | |
| Syringe 1ml | Terumo | SS+01H1 | |
| Microscopes and imaging softwares | |||
| AxioZoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope, equipped with an ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera (Hamamatsu Photonics) or an OptiMOS sCMOS camera | Zeiss | ||
| Imspector Microscope controller software, Version v144 (acquisiton software) | Abberior instruments | ||
| Imaris File Converter x64 9.2.0(file convertion software) , Imaris stitcher software 9.2.0 (stitcher software), Imaris x64 9.2.0 (3D software) | OXFORD instruments | ||
| LED lasers (OBIS) LVBT Laser module 2nd generayion | COHERENT | ||
| Ultramicroscope II equipped with a sCMOS camera (Andor Neo) and a 4 × /0.3 objective lens (LVMI-Fluor WD6) | LaVision Biotec | ||
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 568 Donkey anti Rabbit | Thermo Fisher | A10042 | |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti goat | Jackson ImmunoResearch | 705-605-147 | |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | |
| Anti-LYVE1 polyclonal antibody | Angiobio | #11-034 | |
| Anti-PROX1 goat polyclonal IgG antibody | R&D systems | #AF2727 | |
| Buprenorphine Injection Ampoules (Buprecare solution, 0.3mg/ml) | Animalcare | Ampule 1ml | |
| Dibenzyl Ether 100% (DBE) | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Dichloromethane 100% (DCM) | Sigma Aldrich | 270997 | |
| Formic acid 99% | CARLO ERBA | 405793 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G.7126 | |
| Heparine sodium salt from porcine | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Hydrogen peroxide solution (H2O2 30%) | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Isoflurane (Iso-Vet 100%) | Piramal | NDC 66794-013-10 | |
| Methanol 100% | Sigma Aldrich | 322415 | |
| Ovalbumin Alexa Fluor 555 Conjugate | Invitrogen | 11549176 | |
| Phosphate Buffer Solution PBS (stock solution 10X) | Euromedex | ET330-A | |
| Sodium Pentobarbital (Euthasol 400mg/mL) | Dechra | 08718469445110 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 6132-04-3 | |
| Surgical tools and equipments | |||
| Anaesthesia system | Univentor | Univentor 410 Anaesthesia Unit | |
| Glass micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Heating pad | CMA Microdialysis AB | CMA 450 Temperature controller | |
| Microcapillaries (Glass Capillaries) | Harvard Apparatus | GC120-15 | |
| Microforceps, forceps,dissection scissors and Michel Suture Clips (7.5 × 1.75mm) | Fine Science Tool | 12040-01 | |
| Scalpel (sterile disposable scalpel 23) | Swann-Norton | 0510 | |
| Stereotaxic apparatus | KOPF | Model 940 | |
| Syringe Hamilton 10µl 701N | Hamilton | 28618-U | |
| Warm air System | Vet-Tech LTD | HE011 |
References
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