Summary
En protokoll presenteres som kombinerer vevsrydding med lysarkfluorescensmikroskopi (LSFM) for å oppnå tredimensjonale og cellulære oppløsningsbilder av lymfekar og lymfeknuter (LNer) som samler cerebrospinalvæsken (CSF) og spinal epiduralvæske.
Abstract
Lymfesystemet forbundet med sentralnervesystemet (CNS) inkluderer lymfemittulaturen som spinner rundt hjernen, ryggmargen og tilhørende LNer. Det CNS-tilknyttede lymfesystemet er involvert i drenering av CSF makromolekyler og meningeale immunceller mot CNS-drenering AV-LNer, og dermed regulere avfallsklaring og immunovervåking i CNS-vev. Presentert er en ny tilnærming for å få tredimensjonale (3D) og mobiloppløsningsbilder av CNS-tilknyttede lymfatiske samtidig som integriteten til kretsene deres bevares i omkringliggende vev. iDISCO+ protokollen brukes til immunolabel lymfatiske kar i avkalkede og ryddet hele mount preparater av vertebral kolonne som senere avbildes med lysark fluorescens mikroskopi (LSFM). Teknikken avslører 3D-strukturen i lymfenettverket som forbinder meningeale og epidurale rom rundt ryggmargen til ekstravertebrale lymfatiske kar. Forutsatt er 3D-bilder av dreneringskretsene til molekylære tracers som tidligere ble injisert i enten CSF via cisterna magna eller thoracolumbar spinal parenchyma. IDISCO+/LSFM-tilnærmingen gir enestående muligheter til å utforske strukturen og funksjonen til det CNS-tilknyttede lymfatiske systemet i nevrovaskulær biologi, nevroimmunologi, hjerne- og vertebralkreft, eller vertebral bein- og leddbiologi.
Introduction
CNS er omgitt av CSF og overlegging lag av meninges, epidural vev, og bein. Til sammen gir CSF fysisk beskyttelse mot den myke hjernen og ryggmargen. Det er hovedsakelig utskilles av choroid plexus og meningeal membraner (det vil si pia mater, arachnoid, og dura mater). CSF-meningeal komplekset etablerer også et funksjonelt grensesnitt mellom CNS vev og resten av kroppen, og dermed bidra til CNS homeostase. For det første trenger CSF inn i CNS-parenchyma gjennom CNS paraarterielle rom og samhandler dynamisk med interstitiell væske (ISF)1 via glymphatic (glia-lymfe) systemet, som består av paravaskulære rom og astrocytt endefønsermbraner rundt CNS fartøy2,3,4. Metabolsk avfall og overflødig væske blir deretter til slutt ryddet av intramural perikulær drenering direkte fra hjernen parenchyma mot systemisksirkulasjon 3, samt paravenøse mellomrom mot CSF og via hjernedrenerende lymfatiske kar, ifølge glymphatic modell2,4. CSF utstrømning er hovedsakelig via lymfesystemet, gjennom cribriform plate og tilhørende ekstrakranale lymfatiskekar 5,6,7, samt av meningeal lymfatiske kar, som konvergerer på hjernen-drenering LNs8,9,10,11,12 ( Figur1). En viktig, selv om sekundær, rolle i CSF utstrømning er tatt av kranial arachnoid villi, som trenger inn i lacuna av meningeal venøse bihuler13.
CFS dreneringskretser har blitt grundig undersøkt gjennom eksperimentelle tilnærminger basert på injeksjon av fargede / fluorescerende tracers i CNS eller CSF, etterfulgt av avbildning av tracers mønster inne i CNS og gjennom kroppens organer og vev på forskjellige tidspunkter etter injeksjon13. I lang tid ble utstrømningen av CSF ansett for å være utelukkende og direkte tatt med ansvar av blodsirkulasjonen, gjennom arachnoid villi som projiserer inn i dural venøse bihuler13. CSF-utstrømningen utføres imidlertid hovedsakelig av lymfemittulaturen, som nylig vist ved nær-infrarød (NIR) dynamisk avbildning av CSF-injisert tracer transport hos mus9,10. De CSF-drenerende lymfekarene returnerer deretter lymfe til blodet via høyre subklavvene. Komplementære approches har oppdaget både ekstrakranale6,7,,13 og intrakranielle9,10,11,12 lymfatiske utganger av CSF-injiserte tracers og foreslår at CSF absorberes av to lymfatiske veier, en ekstern og den andre internt i skallen og vertebralkolonnen. Hoveddelen av CSF drenering skjer raskt gjennom lymfekar som ligger rostrally, utenfor skallen i neseslimhinnen, gjennom kanaler av cribriform platen av ethmoid bein3,6,13 og, caudally, utenfor lumbosakral vertebrale bein gjennom dorsolaterale ruter som ennå ikke er fullt preget7,14. I tillegg, i meninges av skallen, lymfekaptiske kapillærene i dura mater directy absorbere CSF og meningeal immunceller mot dural lymfatiske samlere som krysser skallen bein og koble til CNS-drenering LNs12,14. Disse meningeale lymfatiske karene spiller viktige roller i CNS patofysiologi, fordi hjernemeningeal lymfatisk endres ved aldring og påvirker også utfallet av nevrologiske hjernesykdommer, inkludert nevrodegenerasjon, nevrobetennelse og hjernekreft15,16,17. Derfor kan CNS-tilknyttede lymfatiske vaskulatur (det vil si at durale og perifere lymfatiske kar som drenerer CSF) være et lovende nytt mål for å bekjempe CNS-sykdommer hos mennesker.
Konvergentstudier utført med immunohistologi og høyoppløselig magnetisk resonansavbildning viste at meningeal lymfatisk vaskulatur også eksisterer i primater, inkludert vanlige marmosetaper og mennesker7,11,,13. Videre er meningeal lymfatiske kar ikke begrenset til skallen, men strekker seg innenfor vertebralkolonnen til overflaten av spinal ganglia og rami13,18. Tredimensjonal (3D) avbildning av vertebral kolonne lymfatiske bevare den generelle anatomien av merkede vertebral og spinal prøver, inkludert overliggende bein, muskler, leddbånd, samt nærliggende visceral vev, ble nylig utført14. iDISCO+ protokoll 19,20 ble brukt til å immunolabel dekalsifiserte og ryddet preparater av hele vertebralkolonnen med lymfatiske-spesifikke antistoffer mot enten membranreseptoren LYVE121 eller transkripsjonsfaktoren PROX122. Bildeoppkjøp og analyse ble deretter utført med lysarkfluorescensmikroskopi (LSFM) og Imaris-programvaren. LSFM muliggjør rask og minimalt invasiv 3D-avbildning av store prøver ved aksial innesperring av belysning, noe som resulterer i redusert fotobleking og fototoksisitet23.
IDISCO+/LSFM-tilnærmingen tillater karakterisering av de distinkte lagene av durale og epidurale lymfatiske kar, og forbindelsen mellom denne vaskulaturen til de ekstraverte lymfatiske kretsene og LN-ene som nabo vertebralkolonnen. Protokollen ble brukt på vev som tidligere ble injisert med fluorescerende sporstoffer for å demonstrere vertebral kanaldrenering. Det nåværende papiret gir detaljer om iDISCO+ /LSFM-metodikken for å bilde vertebral lymfatisk vaskulatur og illustrerer dens relevans for CSF og epidural væskedreneringsundersøkelse.
Protocol
Alle in vivo prosedyrer som brukes i denne studien overholdt alle relevante etiske forskrifter for dyreforsøk og forskning, i samsvar med Det europeiske fellesskap for eksperimentelle retningslinjer for dyrs bruk (L358-86/609EEC). Studien fikk etisk godkjenning av inserm-komiteen (n°20161101111126651) og Institutional Animal Care and Use Committee of ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle épinière).
1. Forberedelse
- Forbered følgende disseksjonsverktøy for kirurgi: skalpell (1), mikroforceps (2), tang (1), disseksjonsaks og Michel-sugeklemmer. Forbered 26 G kanyler (0,45 mm x 13 mm), 1 ml sprøyte og 10 μL mikrosyring.
- Trekk mikrokapillærer med en etttrinnsprotokoll ved 67,5 °C med en mikropipettrekker i glass. Forbered to mikrokapillærer per injeksjon.
- Klargjør reagenser for avbildningslymfedrenasje (tabell 1): Ovalbumin Alexa Fluor 555 konjugat (OVA-A555,2 mg/ml i 1x fosfatbufret saltvann [PBS]) og anti-LYVE1 antistoff (1 mg/ml i 1x PBS).
- Forbered antistoffer( tabell 1) for iDISCO+. For primære antistoffer, bruk anti-LYVE1 kanin polyklonalt antistoff (1:1600) og anti-PROX1 geit polyklonalt IgG antistoff (1:2,000). For sekundære antistoffer, bruk Alexa Fluor esel anti-kanin-568, esel anti-kanin-647, og esel anti-geit-647 (1:2,000).
2. Kirurgi prosedyrer for intra-cisterna magna (ICM) og thoracolumbar (ThLb) injeksjoner
- Fremstilling av dyret for kirurgi
- Bruk voksne hann- og hunnmus C57BL6/J, 8–12 uker gamle.
- Injiser musen intraperitonealt (IP) med 0,015 mg/ml buprenorfinoppløsning fortynnet i 0,9 % natriumklorid ved 0,1 mg/kg, 15 min før operasjonen.
- Bedøve musen i en induksjonsboks med 2–3 % isoflurangass.
- Tilberedning av bedøvet dyr til tracer injeksjon
- Plasser den bedøvede musen og varmeputen på det stereotoksiske apparatet. Bruk ørestenger til å holde musens hode, og legg ned kroppen i en ~ 135 ° vinkel til hodet eller immobilisere ryggmargen på ThLb vertebral nivå (Th12-L1) med en spinal adapter. Klyp halen eller poten med kraften for å sjekke effektiviteten av anestesi.
- Injiser IP 200 μL på 0,9 % natriumklorid for musehydrering.
- Ved hjelp av et skalpellblad, gjør et hud snitt, enten i occipital regionen mot cervical regionen for ICM injeksjon, eller på ThLb vertebral nivå (Th10-L3) for injeksjon i ThLb spinal parenchyma.
- Tracer injeksjon
- Kast paracervikale og paraspinalmuskler som dekker nakken og kolonnen for å visualisere overflaten av duramateren, det ytterste laget av meningene.
- Punktat forsiktig det sentrale området av dura mater og underlegg arachnoid med en 26 G nål.
- Mikrokapillær implantasjon
- Klipp 2 mm av glasskapillærspissen (se trinn 1.2), og bruk deretter mikrokapillæren som er koblet til en kanyle knyttet til en 10 μL sprøyte for å aspirere 2−8 μL av OVA-A555 eller LYVE1 antistoff.
- Introdder mikrokapillæren i medialområdet av dura mater i en 30° vinkel for ICM injeksjoner eller 10 ° vinkel for ThLb spinal injeksjoner, og skyv den inn til 1,5 mm under dura mater.
MERK: Ligamentet er punktert, men ingen laminektomi utføres. - Tilsett 10 μL kirurgisk lim for å lukke snittet rundt glasskapillæren og vent til det tørker.
- Injiser den fluorescerende traceren langsomt ved 1 μL/min. Når injeksjonsvolumet er levert, må kapillæren på plass i 1 min. Trekk tilbake mikrokapillæren og tilsett kirurgisk lim for å lukke injeksjonshullet.
- Postinjeksjon, lukk hud snittene med sugeklemmer. Fjern musen fra det stereotoksiske apparatet og legg den i et postsurgery oppvarmingskammer ved 37 °C til den gjenoppretter.
3. Perfusjon og vevsdisseksjon
- Ved enten 15 min eller 45 min etter CSF tracer injeksjon, injisere IP en dødelig dose (100 μL) natrium pentobarbital. Klyp halen eller poten for å bekrefte at det ikke er noen refleks.
- Med disseksjonsaks, kutt huden og åpne det peritoneale laget fra underlivet mot thoraxburet. Åpne thoraxburet med saks for å få tilgang til hjertet.
- Sett inn 26 G nålen i venstre ventricule av hjertet og begynn å perfuse med 20 ml iskald 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS ved 2 ml / min. Bruk saks til raskt å kutte høyre atrium og frigjøre perfusjonsvæskestrømmen.
- Fjern huden helt med tang og kutt de fire beina med saks. Fjern alle indre organer, men vær forsiktig med å bevare LNs intakt.
MERK: Mandibulære LNer er overfladiske, så vær forsiktig så du ikke fjerner dem når du kutter av huden. Deep-cervical LNs (dcLNs) er plassert på hver side av luftrøret, i kontakt med den laterale overflaten av de indre halsårer og nær stereomastoid muskler. - Klipp ribbeina for å fjerne vertebralkolonnen med ryggmargen inne fra livmorhalsen til lumbale segmenter.
- Senk det dissekerte vevet i iskaldt 4 % PFA i 1x PBS i et 50 ml rør over natten (~18 h) ved 4 °C. Vask det faste vevet 3x i 50 ml 1x PBS i 5 min.
4. Fluorescensmakroskopi av et vertebralsegment
- Plasser prøven under fluorescens stereozoom mikroskopet med et kamera (Table of Materials). Ta en oversikt over eksemplet eller zoom på et bestemt område.
5. Prøveforberedelse for immunstaining av hele fjellet
- Ved hjelp av et mikrotomblad, kutt tverrgående hode-og-vertebralkolonnen på occipital og cervical nivåer.
MERK: Denne disseksjonen tillater isolering av hodet og livmorhvirvlområdet fra resten av vertebralkolonnen. - Med et mikrotomblad, kutt livmorhalsen, thoracolumbar og sakrale områder av vertebralkolonnen transversalt inn i segmenter på 2-4 ryggvirvler, ca 0,5 cm størrelse hver.
- Isoler hvert segment i den rekkefølgen det ble skilt fra vertebralaksen, langs hele lengden av livmorhals- og thoraxområdene i vertebralkolonnen. Bevar hver prøve i et rør på 2 ml 1x PBS.
6. iDISCO+ hel mount immunostaining av et vertebral segment
MERK: Den detaljerte beskrivelsen av iDISCO+ protokollen er tilgjengelig http://www.idisco.info.
- Dag 1: Vev dehydrering
- Dehydrere vertebrale vevsprøver (det vil si et vertebralsegment) ved påfølgende nedsenking i 20%, 40%, 60%, 80% og 100% metanol i 1x PBS for 1 time med agitasjon.
- Inkuber prøvene over natten i en løsning på 33 % metanol/66 % diklormetan (DCM) ved romtemperatur (RT) med agitasjon.
- Dag 2: Bleking av vev
- Vask prøver 2x med 100% metanol i 1 time ved RT. Inkuber prøvene i 5% H2O2 i metanol (30% H2O2 og metanol 1:5 v/v) ved 4 °C over natten.
- Dag 3: Avkalking og gjennombiliseringstrinn
- Rehydrere prøvene gradvis i 80%, 60%, 40%, 20% metanol, deretter i 1x PBS (1 time i hver løsning) ved RT med agitasjon.
- Dekalsifisere ryggvirvlene ved å inkubere prøver i Morses løsning (10% trisodium citrate og 45% maursyre 1:1 v / v) i 30 min ved RT for å bevare beinstrukturen.
- Skyll prøvene 2x med 1x PBS og inkuber 2x for 1 time i PTx2-oppløsning (0,2 % Triton X-100 i 1x PBS, forny for andre inkubasjon) ved RT med agitasjon. Inkuber deretter de forbehandlede prøvene i permeabiliseringsløsning (PTx2 med 20 % dimetylsulfoksid [DMSO] og 2,3 % w/v glysin) ved 37 °C i 24 timer.
- Dag 4: Blokkering trinn
- Inkuber prøver i blokkeringsløsning (PTx2 med 6 % eselserum og 10 % DMSO) ved 37 °C i 24 timer.
- Dag 5−16: Immunolabeling med hele fjellet
- Inkubereprøver i primærantistoff fortynnet i PTwH (1x PBS som inneholder 0,2 % Tween-20 og 0,1 % heparin ved 10 mg/ml i 1x PBS) med 5 % DMSO/3 % eselserum ved 37 °C i 6 dager. Vask prøvene 4-5x i PTwH ved RT med omrøring over natten.
- Inkuber prøver i sekundære antistofffortynninger i PTwH med 3 % eselserum ved 37 °C i 4 dager. Vask prøvene i PTwH 4-5x ved RT under omrøring over natten før rydding.
- Dag 17 og 18: iDISCO+ vevsrydding
- Dehydrere prøver gradvis ved påfølgende nedsenking i 1x PBS, deretter 20%, 40%, 60%, 80%, og 2x i 100% metanol (1 time i hver løsning). Inkuber hver prøve over natten i en løsning på 33 % metanol/66 % DCM.
- Vask 2x i 100% DCM i 15 min for å fjerne metanol. Inkuber i dibenzyl eter (DBE) uten å riste til ryddet (4 h) og deretter lagre i DBE ved RT før bildebehandling.
7. LSFM-bildebehandling
- Bilde ryddet prøver i et tverrgående plan med LSFM utstyrt med et 4x/0.3 mål.
- Bruk en ensidig tre arks belysningskonfigurasjon, fast x-posisjon (ingen dynamisk fokusering). Bruk LED lasere innstilt til 561 nm, 100 mW; og 639 nm, 70 mW. Sett det numeriske blenderåpningen på lysarket til 30 %.
- Bruk forskjellige utslippsfiltre: 595/40 for Alexa Fluor-568 eller -555, og -680/30 for Alexa Fluor-647.
- Fyll mikroskopkammeret med DBE.
- Aquire stabler med 2,5 μm z trinn og en 30 ms eksponeringstid per trinn med kameraet (Table of Materials). Bruk x2 optisk zoom for en effektiv forstørrelse av (x8), 0,8 μm / piksel, og utfør mosaikkoppkjøpene med en 10% overlapping på fullskjerm.
- Skaff deg bilder i .tif-format med oppkjøpsprogramvare og konverter dem til 3D-format med en filkonverteringsprogramvare.
- Rekonstruere mosaikk oppkjøp med stitcher programvare (Table of Materials). Åpne bildene og flytt manuelt for å rekonstituere hele mosaikkbildet, ved hjelp av 10% overlapping mellom bilder som en retningslinje.
- Bruk 3D-programvaren (Materials tabell) til å generere ortogonale projeksjoner av data, som vist i figur 1, figur 2, figur 3og figur 4, og legg til en fargekodeattributt til lymfekarene og de andre anatomiske strukturene som vises. Sett en gammakorreksjon på 1,47 til rådataene hentet fra LSFM i henhold til produsentens instruksjoner.
Representative Results
3D-avbildning av vertebral lymfatisk vaskulatur
Figur 1 presenterer trinnene i iDISCO + /LSFM-prosedyren og et LSFM-bilde av lymfatiske kretser inne i vertebralkanalen i iDISCO++-behandlet ThLb ryggvirvler. Kombinasjonen av iDISCO+ med LSFM bevarte vertebrale anatomi og fanget en visning av lymfetisk vaskulært nettverk (det vil si intravertebrale fartøyene forbundet med de ekstravertebrale karene som går ut av dorsalt og lateralt fra vertebralkroppen) i de omkringliggende bein, leddbånd, muskler og nerveganglia.
Fluorescens makroskopi avbildning av dcLN drenering
For å bilde makromolekyldrenering i CNS-assosiert lymfesystem, ble makromolekylære sporstoffer administrert in vivo ved injeksjon i enten CSF eller spinal parenchyma. En makromolekylær tracer kan lett leveres inn i CSF på cisterna magna. Cisterna magna ligger mellom lillehjernen og dorsal overflaten av medulla oblongata, over foramen magnum. Makromolekylær tracer kan også injiseres i spinal parenchyma ved stereotaktisk kirurgi på ulike nivåer langs vertebralkolonnen.
De makromolekylære tracers som brukes ble enten direkte merket med en fluorofor eller oppdaget postmortem av immunohistochemistry med spesifikke antistoffer. Figur 2A illustrerer den eksperimentelle planen for sporing av OVA-A555, en rød fluorescerende og liten molekylvekt tracer (rundt 45 kDa), som ble injisert i enten CSF (Figur 2B) eller ThLb-regionen i ryggmargen (figur 2C).
Ved 45 min etter den makromolekylære tracer injeksjonen ble musene ofret, perfundert med 4% PFA, og behandlet for å isolere dissekerte segmenter av hjernestammeområdet i hodet og vertebralkolonnen som ble dekalsifisert og avklart. Makromolekyldrenering ble deretter lett vurdert av fluorescens makroskopi avbildning av LN som samler CSF og epidural væsker. Som vist i figur 2resulterte OVA-A555 injeksjon i enten CSF (figur 2B) eller ThLb (figur 2C) i ryggmargen i OVA-A555 akkumulering i dcLNene ved 45 min etter injeksjon. Denne observasjonen indikerer opptak og drenering av fluorescerende tracer av lymfesystemet; Det er en forutsetning før du forfølger iDISCO+ /LSFM prosedyren for å bilde vertebral lymfedrenasje.
3D-avbildning av makromolekyldrenering i vertebrallymfesystemet
Basert på påvisning av OVA-A555 merking i dcLNer, kan iDISCO+/ LSFM-prosedyren brukes på dekalsifiserte og precleared vertebrale prøver isolert fra OVA-A555-injisert mus. Denne tilnærmingen tillot etablering av et 3D-kart over lymfedrenasje av CSF og spinal epiduralvæske på et bestemt tidspunkt etter tracer injeksjon. Denne 3D-kartleggingen kan utføres ved å avbilde påfølgende CNS-segmenter, på hvert nivå av vertebralkolonne, fra injeksjonspunktet.
Figur 3A viser eksperimentell design for OVA-A555 injeksjon i ThLb spinal parenchyma og det resulterende 3D-mønsteret av OVA-A555-fordeling i et cervical og et thorax vertebral segment, sammen med lymfemittulaturen. Ved 45 min etter OVA-A555 injeksjon ble OVA-A555 akkumulering påvist i ryggmargsvev og dcLN (hvite piler i figur 3B), i samsvar med mikroskopobservasjoner illustrert i figur 2. Det ble imidlertid ikke oppdaget i livmorhals- og thoraxlymfatisk vaskulatur merket med anti-LYVE1 antistoffer. Fraværet av CSF-injisert tracer i vertebrale lymfatiske kar kan skyldes enten en kort utholdenhetstid for tracer inne i lymfatiske kar eller mangel på opptak av tracer av lymfekarene (figur 3C).
For å teste den første hypotesen ble kaninanti-LYVE1-antistoffet brukt som et lymfatisk endotelcellemerke for å binde CNS-tilknyttede lymfatiske kar. Det injiserte kaninanti-LYVE1-antistoffet ble deretter påvist ved immunohistokjemi med et anti-kanin sekundært antistoff, mens lymfatiske endotelceller ble immunolabeled med anti-PROX1 antistoffer. Figur 4 representerer eksperimentell utforming av anti-LYVE1 injeksjon i ThLb spinal parenchyma (Figur 4A), og det resulterende 3D-distribusjonsmønsteret til LYVE1 antistoffer i et ThLb-segment nær injeksjonsstedet, med hensyn til PROX1+ lymfatiske (figur 4B). Både vertebrale lymfatiske og deres ekstraverte lymfatiske lymfeforbindelser ble merket ved injiserte anti-LYVE1 antistoffer, som underbygget tracer opptaket av vertebrale lymfatiske kar og lymfedrenasje mot det ekstraverte lymfatiske systemet. LNer manglet i ThLb-regionen, og kunne dermed ikke visualiseres i det avbildede segmentet. Videre reflekterte det seponerbare mønsteret av LYVE1-markøren observert langs lymfatiske kar sannsynligvis det seponerbare uttrykket av LYVE1 i lymfemittulaturen, som rapportert itidligere studier 14,21. Til sammen viste resultatene av den nåværende studien at, ved 45 min etter tracer injeksjon, LYVE1 antistoff, men ikke OVA-A555,tillot påvisning av lokale vertebrale lymfatiske opptak og var fortrinnsrett til OVA-A555 som en vedvarende markør for lokal vertebral lymfedrenasje.
Figur 1: Tredimensjonalt syn på vertebral lymfatisk vaskulatur. (A) Skjematisk representasjon av protokollen. (B) Planar projeksjon av en 3D-visning av ThLb vertebral lymfatisk vaskulatur fra et dorsofrontalt perspektiv. Lymfatiske kar ble immunolabeled med anti-PROX1 antistoff (grønn) ved hjelp av iDISCO+ protokollen og deretter avbildet av LSFM. Legg merke til det metameriske mønsteret av vaskulaturen i vertebralkanalen av tre påfølgende ryggvirvler (hvite pilspisser). I tillegg til halvsirkelformede ryggkar (hvite pilspisser), inkluderte hvert vertebrale nettverk ventrale grener (gule piler), bilaterale laterale utgangsveier langs spinalrami og ganglia (hvite piler), samt en ryggradsutgangsrute ved midtlinjen (hvit dobbel pil). Vertebrale nettverk ble forbundet med et langsgående fartøy (lilla piler). For en fullstendig beskrivelse, se Jacob L. et al.18 SC = ryggmargen; Stjerne = ventral vertebral kropp; D = dorsal; L = lateral; V = ventral; Skala barer = 300 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: dcLNer samlet OVA-A555-merket CSF Fluids. (A) Ordningen med eksperimentell design. OVA-A555 ble injisert i enten ICM eller ThLb spinal parenchyma, deretter mus ble ofret 45 min etter injeksjon. Prøvene ble ryddet og observert ved fluorescens makroskop imaging (B,C). Fluorescens makroskop bilder av cervival ryggvirvler fra ICM- (B) og ThLb- (C) injisert mus. Legg merke til at OVA-A555 akkumulert i dcLNs(B,C, hvite pilspisser), pial og paravaskulære mellomrom i cervical ryggmargen (B,C) og etter ICM injeksjon, i ventrolaterale utgangsruter, sannsynligvis langs cervical nerver (B, hvite piler). SC = ryggmargen. Stjerne = ventral vertebral kropp; D = dorsal; L = lateral; V = ventral; Skala stenger i B og C = 2 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Påvisning av OVA-A555-merkede CSF-væsker i vertebrallymfesystemet. (A) Ordningen med eksperimentell design. OVA-A555 ble injisert i ThLb spinal parenchyma, deretter mus ble ofret på 45 min etter injeksjon. Prøvene ble behandlet med iDISCO+ protokollen og avbildet med en LSFM. (B,C) Planar projeksjoner av LSFM-fanget frontal 3D visninger av cervical(B) og thorax(C) ryggraden segmenter. OVA-A555 akkumulering (rød) ble oppdaget i ryggmargsvev og dcLNer (B, hvit pil), som illustrert i figur 2, men ikke i livmorhals- og thoraxlymfemittulaturen immunolabeled her med anti-LYVE1 antistoffer (grønn). SC = ryggmargen; Stjerne = ventral vertebral kropp; D = dorsal; L = lateral; V = ventral; Vektstenger = 1 mm (B), 300 μm (C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Påvisning av vertebral lymfedrenasje etter intraspinal injeksjon av anti-LYVE1 antistoffer. (A) Ordningen med eksperimentell design. Anti-LYVE1 antistoffer ble injisert i ThLb spinal parenchyma, deretter mus ble ofret 45 min etter injeksjon. Prøvene ble behandlet med iDISCO+ protokollen og avbildet med en LSFM. (B). Planar projeksjoner av frontal 3D visninger av en ThLb(B) ryggraden segmentet, fanget med en LSFM. Anti-LYVE1 antistoffer ble påvist med antikaninantistoffer (lilla) og lymfemittulaturen med anti-PROX1 antistoffer (grønn). Hvite kar er PROX1+ lymfatiske sammen med anti-LYVE1 antistoffer (B); disse inkluderer vertebral (gule piler) og ekstravertebrale (doble gule piler) lymfatiske. SC = ryggmargen; Stjerne = ventral vertebral kropp; D = dorsal; L = lateral; V = ventral; Skaleringsstolper = 300 μm (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Reagenser | Målet | Figur | Protokoll trinn | Kommentar |
| OVA-A555 | CSF-sporing | Figur 2 og figur 3 | 2. ICM- eller ThLb-injeksjon 7. LSFM-bildebehandling. |
Vannløselig, lett å injisere og høy intens fluorescens |
| Anti-Lyve1 antistoff | Membran markør av LVs celler | Figur 3 | 6. iDISCO + hele mount immnunostaining. 7. LSFM-bildebehandling. |
Effektivt antistoff til hele fjellet immnunostaining |
| Tracer drenering av dural og epidural LVer | Figur 4 | 2. ICM- eller ThLb-injeksjon 6. iDISCO + hel mount immnunostaining 7. LSFM-bildebehandling |
||
| Antistoff mot Prox1 | Kjernefysisk markør for LVs celler | Figur 1 og Figur 4 | 6. iDISCO + hel mount immnunostaining 7. LSFM-bildebehandling |
Effektivt antistoff til hele fjellet immnunostaining |
Tabell 1: Antistoffer og sporstoffer som brukes i studien.
| Problem | Mulig grunn | Løsning | |
| Kirurgi for tracer injeksjon | Uønsket CNS vev lesjon | 1. Mangel på kontroll av glass kapillær innsetting 2. Feil dybde på glasskapillær innsetting |
1. Punktat med forsiktighet, men fullt ut, dura mater med en 26 G nål før glass kapillær innsetting. 2. Reduser dypheten i glasskapillær innsetting (<1,5 mm fra duramateren). 3. Reduser glasskapillærdiameteren. |
| Uønsket defilement av injisert tracer inn i epidural eller ekstra vertebrale områder | Feil injeksjon av tracer | 1. Kontroller om glassmikrokapillæren er godt satt inn i punktaten dura mater. 2. Tilsett kirurgisk lim mellom glassmikrokapillær og det omliggende vevet før du injiserer tracer. |
|
| Stort volum av injisert tracer | Reduser volumet av injisert tracer (<2 μL). | ||
| iDISCO+ immunstaining | Fravær, heterogenitet eller overdreven bakgrunn av merking i vevet | 1. Problemer med konsentrasjonen av det primære antistoffet 2. Utilstrekkelig permeabilisering 3. Utilstrekkelig vasking 4. Utilstrekkelig avregning |
Øk antallet og/eller inkubasjonstiden: permebilisering, whashing, primært antistoff og clearing. Se http://www.idisco.info (FAQ OG FEILSØKING). |
| Utilstrekkelig avkalking | Bruk en strengere avkalkingsbehandling av prøven med EDTA21 eller Morse løsning for hodevev spesielt. | ||
| iDISCO+ clearing | Prøvene er ugjennomsiktige eller brunfargede | Utilstrekkelig bleking | Bruk fersk H2O2-oppløsning, øk volum- og/eller inkubasjonstiden. |
| Tilstedeværelse av oksidasjon | Fyll røret helt for å unngå tilstedeværelse av luft. | ||
| Utilstrekkelig avregning | Øk volum- og/eller inkubasjonstiden. Se http://www.idisco.info (FAQ OG FEILSØKING). | ||
| Sporingsdeteksjon | Undetectable tracer | Feil kombinasjon av den valgte sporingsbryteren | Alexa 555, 594 og 647 fluorokromer er motstandsdyktige mot iDISCO +protokoll 5,,6,,7,,8,,9,,10. Dette er imidlertid ikke tilfelle for FITC, GFP, RFP fluorokromer. |
| Offer timepoint etter injeksjon | Foretrekker OVA-A555 for kortsiktig (15 min) dreneringsanalyse i lokale vertebrale lymfatiske. For lymfeknuter drenering analyse, OVA-A555 og Lyve1 antistoff kan brukes for lengre sikt (> 45 min) analyse. | ||
| Bildebehandling: fangst og analyse | Tatt bilder av lymfekretsen er ikke tilfredsstillende | Disseksjonsproblem (lymfeknuter mangler) | Inkluder forsiktig vertebral / hodeskalle nærliggende vev i din dissekert prøve, i henhold til lymfekretsen som du vil bilde. |
| Problem med bildebehandling | 1. Endre oppkjøpsparametrene til LSFM: laserintensitet, lysark numerisk blenderåpning, tykkelse på lysark, utstillingstid. 2. Plasser prøven i støtten for å redusere banen som er reist med lys gjennom vevet til målet. 3. Pass på at det ikke er bobler inne i vevsprøven under oppkjøpet. |
Tabell 2: Feilsøkingsråd for hvert trinn i protokollen, inkludert mulige problemer og løsninger.
Discussion
IDISCO+/LSFM-protokollen gir enestående 3D-visninger av det CNS-tilknyttede lymfatiske nettverket i det omkringliggende vevet på et mobiloppløsningsnivå. Denne protokollen er godt tilpasset eksempler på middels størrelse, ikke exeeding 1,5 cm3, på grunn av begrensningene i LSFM optisk system, redusert arbeidsavstand, og den store størrelsen på kommersielle objektive linser for høyoppløselig mikroskopi23. Denne begrensningen forhindrer å fange hele hjerne-assosiert lymfatisk system. Det er viktig å merke seg at undersøkelsesområdet må være forsiktig avgrenset og vevet rundt CNS må dissekeres nøye for å inkludere de ekstrakranale lymfatiske karene og LN-ene som bidrar til hele lymfekretsen (tabell 2).
I tillegg til størrelse og anatomiske hensyn varierer kompleksiteten i omkringliggende mesenchymale vev langs skallen og vertebralkolonnen, noe som krever tilpasning av dekalsifisering og preclearing behandling for å oppnå en homogen prøveavklaring og tillate lysstråleforplantning i et mykt isotropisk biologisk vev. I fravær av bein, LFSM avbildning av hjernen eller ryggmargsvevet ikke nødvendiggjør avkalking trinn, og den endelige oppløsningen av de fangede bildene er optimal19. Ovennevnte beskrevne protokoll, som inkluderer et mildt avkalkingstrinn med Morses løsning, er godt tilpasset LSFM-avbildning av vertebralkolonnen som illustrert i figur 1 og figur 4. I motsetning viser nakkeområdet en spesielt kompleks beinanatomi i tillegg til flere lag med muskler, fett og kjertelvev, noe som reduserer kvaliteten på fanget LSFM-bilder, som gjenspeiles i figur 3B. LSFM avbildning av nakke og cervical området kan dermed forbedres ved en strengere behandling av vev; for eksempel med EDTA, som tidligere rapportert24. Avkalkingstrinnet er derfor kritisk, og avkalkingsforholdene må testes tidligere for hvert antistoff som brukes før du starter hele iDISCO+ -protokollen (tabell 2).
Mens iDISCO + /LSFM-protokollen tillater generering av en 3D-visning av tilkoblingskretser mellom meningeale og epidurale rom og tilhørende LNer, den direkte kvantitative analysen av lymfatiske vaskulatur fra LSFM-fangede bilder er ikke mulig av følgende grunner: 1) avgrensning av lymfatiske karkretser er upålitelig på grunn av det usammenhengende mønsteret av lymfatisk markøruttrykk, fordi membranar LYVE1 er hereterogentfordelt 21 og PROX1 har et kjernefysisk uttrykksmønster22;+ 2) heterogen penetrasjon av antistoffer, samt anisotropi som kan vedvare i det biologiske vevet på grunn av ufullstendig og heterogen dekalering og preclearing. LSFM-bildebehandling må derfor utvides med verktøy for virtuell virkelighet som muliggjør interaktiv visualisering og dermed forenkler kvantifisering av lymfevaskulaturen (www.syglass.io). Det er også bemerkelsesverdig at den nøyaktige beskrivelsen av CNS-tilknyttede kretser krever sikkerhetskopiering av LSFM-informasjon med høyoppløselige konfokale data innhentet ved konvensjonell immunolabeling på tynn (5-10 μm) kryostat eller parafin-innebygde vevsseksjoner, spesielt for å nøyaktig lokalisere posisjonen til lymfatiske fartøy med hensyn til dura mater og CSF, som rapporterttidligere 11,14,18.
iDISCO+/LSFM-protokollen tillater tredimensjonal visualisering av makromolekylær drenering i det CNS-tilknyttede lymfatiske systemet, som illustrert i figur 3 og figur 4. Den funksjonelle vurderingen av lymfedrenasje krever imidlertid, i tillegg til anbefalingene på iDISCO+/LSFM-protokollen som er beskrevet ovenfor, etter en streng prosedyre, da det endelige utfallet avhenger av kvaliteten på injeksjonsoperasjonen, valget av leveringsstedet, typen og injisert volum av makromolekylmarkør som brukes, og offertidspunktet etter tracer administrasjon (tabell 2). På grunn av variasjoner av tracer mønsteret mellom injiserte dyr, karakterisering av lymfedrenasje kretser krever store eksperimentelle grupper (> 10 av injeksjon tilstand). I protokollen presentert, 1) dura mater må punkteres før injeksjon for å hindre uønskede lesjoner og penetrasjon i CNS vev; 2) injisert volum må være mindre enn 2 μL for å begrense uønsket diffusjon gjennom injeksjonshullet, langs injeksjonkapillæren, inn i epiduralrommet eller ekstravertebrale vev; 3) dypheten av injeksjon kapillær innsetting må begrenses til 2 mm under dura mater for å unngå CNS skade eller feilmåling i ICM og intraspinal injeksjoner, henholdsvis. Legg også merke til at en komplementær høyoppløsnings konfokal analyse av nærliggende vertebrale segmenter må utføres, som angitt ovenfor, for å vurdere tilstedeværelsen av injisert tracer inne i lymfekarene. Denne analysen krever etablering av intensitetsprofilplottene for tracer og lymfemarkøren på tverrsnitt av markørmerkede lymfatiske kar. Denne tilnærmingen har tidligere blitt brukt til å demonstrere OVA555 opptak av ThLb lymfatisk ved 15 min etter injeksjon (Supplerende figur 5F i Jacob et al.14). Det er imidlertid ikke illustrert for anti-LYVE1-traceren i den nåværende studien (figur 4).
Blant mulige CSF-sporstoffer er OVA-A555 et utmerket alternativ, da den er motstandsdyktig mot iDISCO+ protokollbehandlinger og opprettholder høy fluorescens for LSFM-bildebehandling. Vær imidlertid oppmerksom på at typen sporing må velges i samsvar med analysetidspunktet (tabell 1 og tabell 2). Som rapportert ovenfor observeres OVA-A555 merking av lokale vertebrale lymfatiske kar ved 15 min etter injeksjon14. OVA-A555 oppdages imidlertid ikke lenger i disse lokale lymfatiske kretsene ved 45 min etter injeksjon (figur 3) i motsetning til anti-LYVE1-antistoffet (figur 4).
For å konkludere er iDISCO+/LSFM-protokollen godt tilpasset for å undersøke 3D-strukturen og dreneringen av CNS-assosiert lymfesystem i fysiologiske og patologiske tilstander som CNS og vertebralkolonnekreft, eller vertebrale bein- og leddsykdommer. Selv om hele prosedyren er lang og krever metodisk rigor, gir den verdifull, unik informasjon når den brukes med komplementær analyse ved hjelp av virtual reality-verktøy og høyoppløselig konfokal avbildning.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, Agence Nationale Recherche (ANR-17-CE14-0005-03), Federation pour la Recherche sur le Cerveau (FRC 2017), Carnot Maturation (til L.J.), Universidade Federal de Rio de Janiero (UFRJ for J.B.), NIH (R01EB016629-01) og Yale School of Medicine. Vi anerkjenner ICM-plattformene: ICM-QUANT for cellulær avbildning og ICM-histomics for immunohistochemistry. Alt dyrearbeid ble utført ved PHENO-ICMice-anlegget. Kjernen støttes av 2 "Investissements d'avenir" (ANR-10- IAIHU-06 og ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS) og "Fondation pour la Recherche Médicale". Vi anerkjenner Nicolas Renier for metodisk rådgivning og manuskriptlesing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Centrifuge tubes: 0.2ml | Eppendorf | 30124359 | |
| Centrifuge tubes: 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
| Conical centrifuge tubes: 15ml | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tubes: 50ml | Falcon | 352070 | |
| Microtome blade 80mm | Microm Microtech France | F/MM35P | |
| Needles 26G (0.45x13 mm) | Terumo | AN*2613R1 | |
| Syringe 1ml | Terumo | SS+01H1 | |
| Microscopes and imaging softwares | |||
| AxioZoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope, equipped with an ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera (Hamamatsu Photonics) or an OptiMOS sCMOS camera | Zeiss | ||
| Imspector Microscope controller software, Version v144 (acquisiton software) | Abberior instruments | ||
| Imaris File Converter x64 9.2.0(file convertion software) , Imaris stitcher software 9.2.0 (stitcher software), Imaris x64 9.2.0 (3D software) | OXFORD instruments | ||
| LED lasers (OBIS) LVBT Laser module 2nd generayion | COHERENT | ||
| Ultramicroscope II equipped with a sCMOS camera (Andor Neo) and a 4 × /0.3 objective lens (LVMI-Fluor WD6) | LaVision Biotec | ||
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 568 Donkey anti Rabbit | Thermo Fisher | A10042 | |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti goat | Jackson ImmunoResearch | 705-605-147 | |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | |
| Anti-LYVE1 polyclonal antibody | Angiobio | #11-034 | |
| Anti-PROX1 goat polyclonal IgG antibody | R&D systems | #AF2727 | |
| Buprenorphine Injection Ampoules (Buprecare solution, 0.3mg/ml) | Animalcare | Ampule 1ml | |
| Dibenzyl Ether 100% (DBE) | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Dichloromethane 100% (DCM) | Sigma Aldrich | 270997 | |
| Formic acid 99% | CARLO ERBA | 405793 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G.7126 | |
| Heparine sodium salt from porcine | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Hydrogen peroxide solution (H2O2 30%) | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Isoflurane (Iso-Vet 100%) | Piramal | NDC 66794-013-10 | |
| Methanol 100% | Sigma Aldrich | 322415 | |
| Ovalbumin Alexa Fluor 555 Conjugate | Invitrogen | 11549176 | |
| Phosphate Buffer Solution PBS (stock solution 10X) | Euromedex | ET330-A | |
| Sodium Pentobarbital (Euthasol 400mg/mL) | Dechra | 08718469445110 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 6132-04-3 | |
| Surgical tools and equipments | |||
| Anaesthesia system | Univentor | Univentor 410 Anaesthesia Unit | |
| Glass micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Heating pad | CMA Microdialysis AB | CMA 450 Temperature controller | |
| Microcapillaries (Glass Capillaries) | Harvard Apparatus | GC120-15 | |
| Microforceps, forceps,dissection scissors and Michel Suture Clips (7.5 × 1.75mm) | Fine Science Tool | 12040-01 | |
| Scalpel (sterile disposable scalpel 23) | Swann-Norton | 0510 | |
| Stereotaxic apparatus | KOPF | Model 940 | |
| Syringe Hamilton 10µl 701N | Hamilton | 28618-U | |
| Warm air System | Vet-Tech LTD | HE011 |
References
- Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
- Iliff, J. J., Goldman, S. A., Nedergaard, M.
- Engelhardt, B., et al. Vascular, glial, and lymphatic immune gateways of the central nervous system. Acta Neuropathologica. 132, 317-338 (2016).
- Benveniste, H., et al. The Glymphatic System and Waste Clearance with Brain Aging: A Review. Gerontology. , 1-14 (2018).
- Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Lymphatics in Neurological Disorders: A Neuro-Lympho-Vascular Component of Multiple Sclerosis and Alzheimer's Disease. Neuron. 91 (5), 957-973 (2016).
- Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).
- Ma, Q., Decker, Y., Müller, A., Ineichen, B. V., Proulx, S. T. Clearance of cerebrospinal fluid from the sacral spine through lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 216 (11), 2492-2502 (2019).
- Louveau, A., et al. Understanding the functions and relationships of the glymphatic system and meningeal lymphatics. The Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3210-3219 (2017).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. The Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
- Antila, S., et al. Development and plasticity of meningeal lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3645-3667 (2017).
- Ahn, J. H., et al. Meningeal lymphatic vessels at the skull base drain cerebrospinal fluid. Nature. 572 (7767), 62-66 (2019).
- Pollay, M. The function and structure of the cerebrospinal fluid outflow system. Cerebrospinal Fluid Research. 7, 9 (2010).
- Jacob, L., et al. Anatomy and function of the vertebral column lymphatic network in mice. Nature Communications. 10 (1), 1-16 (2019).
- Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
- Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Song, E., et al. VEGF-C-driven lymphatic drainage enables immunosurveillance of brain tumours. Nature. 577 (7792), 689-694 (2020).
- Absinta, M., et al. Human and nonhuman primate meninges harbor lymphatic vessels that can be visualized noninvasively by MRI. eLife. 6, 29738 (2017).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Jackson, D. G., Prevo, R., Clasper, S., Banerji, S. LYVE-1, the lymphatic system and tumor lymphangiogenesis. Trends in Immunology. 22 (6), 317-321 (2001).
- Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
- Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P.
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
