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Biology

कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस में ऊतक-विशिष्ट प्रोटेओस्टेटिक गिरावट की मात्रा निर्धारित करना

Published: September 7, 2021 doi: 10.3791/61100
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center

Summary

प्रोटेओस्टेटिक गिरावट उम्र बढ़ने की एक बानगी है, जो न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों की शुरुआत को सुविधाजनक बनाता है। हम पॉलीग्लोटामाइन की विषम अभिव्यक्ति के माध्यम से दो अलग-अलग कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस ऊतकों में प्रोटेटोस्टेसिस को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करते हैं जो फ्लोरोसेंट रिपोर्टर से जुड़ा हुआ है। यह मॉडल प्रोटेओस्टेसिस के वीवो जेनेटिक विश्लेषण में तेजी से अनुमति देता है।

Abstract

सामान्य उम्र बढ़ने के दौरान प्रोटेम (प्रोटीन हो्योस्टेसिस) के उचित कार्य और तह को बनाए रखने की क्षमता में गिरावट आती है, जिससे उम्र से जुड़ी बीमारियों की बढ़ती संख्या की शुरुआत में मदद मिलती है। उदाहरण के लिए, पॉलीग्लूटामाइन विस्तार वाले प्रोटीन एकत्रीकरण के लिए प्रवण होते हैं, जैसा कि हंटिंगटन की बीमारी के हंटिंगटिन प्रोटीन और सहवर्ती शुरुआत के साथ उदाहरण है। प्रोटेम की उम्र से जुड़ी गिरावट का व्यापक रूप से ट्रांसजेनिक कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस के उपयोग के माध्यम से अध्ययन किया गया है जो पॉलीक्यू को पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) से जुड़ा हुआ दोहराता है। यह पॉलीक्यू:: वाईएफपी ट्रांसजेनिक पशु मॉडल फ्लोरोसेंट फोसी (यानी प्रोटीन समुच्चय) के प्रगतिशील गठन और लोकोमोशन दोषों की बाद की शुरुआत के माध्यम से प्रोटेम की उम्र से जुड़ी गिरावट की प्रत्यक्ष मात्रा की सुविधा प्रदान करता है जो प्रोटेम के पतन के परिणामस्वरूप विकसित होते हैं। इसके अलावा, पॉलीक्यू की अभिव्यक्ति:: वाईएफपी ट्रांसजीन ऊतक-विशिष्ट प्रमोटरों द्वारा संचालित किया जा सकता है, जिससे एक अक्षुण्ण बहुकोशिकीय जीव के संदर्भ में ऊतकों में प्रोटेओस्टेसिस का आकलन हो सकता है। यह मॉडल आनुवंशिक विश्लेषण के लिए अत्यधिक उत्तरदायी है, इस प्रकार उम्र बढ़ने की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है जो उम्र के परख के पूरक है। हम वर्णन कैसे सही polyQ उपाय करने के लिए:: YFP या तो न्यूरॉन्स या शरीर की दीवार की मांसपेशियों के भीतर उम्र बढ़ने के दौरान गठन, और व्यवहार दोषों के बाद की शुरुआत । इसके बाद, हम इस बात पर प्रकाश डालते हैं कि इन दृष्टिकोणों को उच्च थ्रूपुट के लिए कैसे अनुकूलित किया जा सकता है, और सी एलिगेंस आनुवंशिक विश्लेषण के लिए अन्य उभरती रणनीतियों का उपयोग करके संभावित भविष्य के अनुप्रयोग।

Introduction

प्रोटीन हो्योस्टोस्टेसिस (प्रोटेओस्टेसिस) को उचित कार्य और प्रोटेम के तह को बनाए रखने की सेलुलर क्षमता के रूप में परिभाषित किया गया है। प्रोटेओस्टेसिस के लिए अंतर्निहित चुनौती यह सुनिश्चित कर रही है कि सभी प्रोटीन को एक देशी संरचना में ठीक से जोड़ और बनाए रखा जाए, जो प्रोटीन आकार, अमीनो एसिड संरचना, संरचनात्मक संरचना, स्थिरता, टर्नओवर, अभिव्यक्ति, उप-सेलुलर कंपार्टाइजेशन और संशोधनों की विभिन्न प्रकृति से आगे परिलक्षित होता है1। प्रोटेओस्टेसिस को एक बड़े प्रोटेओस्टिटिक नेटवर्क की समन्वित कार्रवाई के माध्यम से बनाए रखा जाता है, जिसमें लगभग 2000 अद्वितीय प्रोटीन होते हैं, जो प्रोटेम2,3के भीतर उचित संश्लेषण, तह, तस्करी और गिरावट को विनियमित करते हैं। प्रोटेओस्टेटिक नेटवर्क के वर्कहॉर्स घटक आणविक चैपरोन्स4के नौ प्रमुख परिवार हैं। प्रत्येक ऊतक और कोशिका प्रकार अधिमानतः आणविक चैपरनेस के विशिष्ट सबसेट का उपयोग करता है, संभवतः अलग-अलग प्रोटेम5की अलग-अलग मांगों के साथ संरेखण में।

सामान्य ऑर्गेनम एजिंग की एक बानगी सेलुलर प्रोटेओस्टेसिस की प्रगतिशील गिरावट और पतन है, जिसे उम्र से जुड़ी बीमारियों की बढ़ती संख्या की शुरुआत और प्रगति के लिए एक अंतर्निहित आधार माना जाता है । उदाहरण के लिए, अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, हंटिंगटन रोग, और एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस) एक आम विशेषता साझा करते हैं: न्यूरोडिजिरेशन की प्रत्येक मामले में अभिव्यक्ति आनुवंशिक परिवर्तनों से प्रेरित होती है जो एकत्रीकरण (एमिलॉयड-β/ताऊ, α-सिन्यूक्लिन, एचटीटी, फ्यूएस/टीबीडी-43/एसओडी-1, क्रमशः)6,7,8,9,10 . उम्र बढ़ने के दौरान, प्रोटेओस्टिटिक नेटवर्क की अखंडता और अक्षमता में गिरावट आती है, जिसके परिणामस्वरूप प्रोटोटॉक्सिक समुच्चय का संचय होता है जिसके परिणामस्वरूप सेलुलर शिथिलता और न्यूरोडिजेनरेशन होता है। ध्यान दें, प्रोटीन अनुरूप रोग न्यूरॉन्स के लिए अद्वितीय नहीं हैं, और कई ऊतकों में होते हैं, जैसा कि टाइप II मधुमेह, मल्टीपल मायलोमा और सिस्टिक फाइब्रोसिस11, 12,13,14द्वारा हाइलाइट किया गया है। इसलिए, प्रोटेओस्टेसिस के संरक्षण में सक्षम तंत्र को स्पष्ट करने से रोग के उपचार के लिए लक्षित हस्तक्षेपों के विकास और स्वस्थ उम्र बढ़ने को बढ़ावा देने में आसानी होगी ।

छोटी मिट्टी नेमाटोड कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस (सी एलिगेंस)जीन की खोज करने और प्रोटेओस्टेसिस को बदलने वाले रास्तों को स्पष्ट करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। प्रोटेओस्टैस्टिक नेटवर्क के कई घटक और प्रोटेओस्टेसिस को विनियमित करने वाले सिग्नल ट्रांसडक्शन रास्ते विकासवादी रूप से संरक्षित हैं। इसके अलावा, सी elegans जटिलता और कशेरुकी प्रणालियों के सापेक्ष अतिरेक कम हो गया है, यह आनुवंशिक विश्लेषण और जीन की खोज के लिए और अधिक उत्तरदायी बना रही है । सी एलिगेंस के अतिरिक्त फायदे जिन्होंने इसे प्रोटेओस्टेसिस का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में व्यापक रूप से उपयोग किया जा रहा है, में शामिल हैं: शक्तिशाली आनुवंशिक और कार्यात्मक जीनोमिक्स, एक छोटा जीवन चक्र (3 दिन) और उम्र (3 सप्ताह), एक कॉम्पैक्ट और अच्छी तरह से एनोटेटेड जीनोम, आनुवंशिक म्यूटेंट के व्यापक वर्गीकरण की उपलब्धता, और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स का उपयोग करके सेल जीव विज्ञान में ऊतक-विशिष्ट परिवर्तनों की कल्पना करने में आसानी।

उम्र बढ़ने के दौरान प्रोटेओस्टेसिस के प्रगतिशील क्षय को सी एलिगेंस में आसानी से निर्धारित किया जा सकता है। मोरिमोटो प्रयोगशाला ने सबसे पहले यह दर्शाया कि 15 , 16,17,18वर्ष की उम्र के दौरान सी एलिगेंस में प्रोटेओस्टिटिक गिरावट की मात्रा निर्धारित करने के लिए पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन(पॉलीक्यू:: वाईएफपी)के लिए एक पॉलीग्लूटामाइन विस्तार का उपयोग किया जा सकता है । 35 ग्लूटामीन के लिए YFP संलयन दोहराता है या सेलुलर विकृति के संकेत के साथ फ्लोरोसेंट फोसी के उम्र से जुड़े गठन में अधिक परिणाम। ध्यान दें, ग्लूटामीन विस्तार की यह सीमा हंटिंगटिन प्रोटीन के पॉलीग्लूटामाइन पथ की लंबाई का दर्पण है जिस पर हंटिंगटन की रोग विकृति मनुष्यों में देखी जानी शुरू होती है (आमतौर पर >35 कैग दोहराता है)19। पॉलीक्यू की अभिव्यक्ति के साथ उपभेद: मांसपेशियों, आंतों या न्यूरोनल कोशिकाओं के भीतर वाईएफपी का उपयोग इस बात की पुष्टि करने के लिए किया गया है कि प्रोटेओस्टेसिस की उम्र से जुड़ी गिरावट विभिन्न कोशिकाओं और ऊतक प्रकारों में होती है। मांसपेशी विशिष्ट पॉलीक्यू:: वाईएफपी अभिव्यक्ति (यानी, यूएनसी-54p:: Q35::YFP)सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले ऊतक-विशिष्ट रिपोर्टर रहे हैं, क्योंकि फ्लोरोसेंट फोसी जमा करना वयस्कता के पहले कुछ दिनों में एक साधारण फ्लोरोसेंट विच्छेदन माइक्रोस्कोप(चित्रा 1ए-1B)का उपयोग करके निर्धारित करना आसान है। इसके अतिरिक्त, जानवरों के मध्य जीवन के दौरान रुक जाते हैं, के रूप में मांसपेशियों के भीतर प्रोटेम रिपोर्टर(चित्रा 1C)के प्रोटोटॉक्सिक प्रभाव के कारण गिर जाता है । इसी तरह, न्यूरोनल प्रोटेओस्टेसिस में उम्र से जुड़ी गिरावट का पालन किया जा सकता है(rgef-1p:Q40::YFP)सीधे फोसी/कुल गठन और आयु से जुड़े गिरावट को सीधे मात्रा में मात्रा के द्वारा समन्वित शरीर में गिरावट-झुकता है तरल में रखने के बाद(चित्रा 2)।

यहां, हम प्रोटीन कुल संचय की आयु-निर्भर प्रगति को मापने के बारे में एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और सी एलिगेंसमें न्यूरोनल और मांसपेशियों के ऊतकों के भीतर पॉलीग्लूटामाइन दोहराता की अभिव्यक्ति से प्रेरित संबंधित प्रोटोटॉक्सिकिटी। हम इन उपभेदों और तरीकों का उपयोग करके उत्पन्न विशिष्ट परिणामों के उदाहरण प्रदान करते हैं। इसके अलावा, हम दिखाते हैं कि हमने प्रोटेओस्टिटिक नेटवर्क के ट्रांसक्रिप्शनल नियमन का अध्ययन करने के लिए इन तरीकों का उपयोग कैसे किया है। हम अतिरिक्त तरीकों पर चर्चा इन संवाददाताओं को आसानी से अंय मौजूदा अभिकर्द लोगों के साथ एकीकृत किया जा सकता है या बड़ी स्क्रीन के लिए अनुकूलित ।

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Protocol

1. रिएजेंट्स की तैयारी

  1. फीडिंग-आधारित आरएनएआई के माध्यम से निष्क्रिय किए जाने के लिए रुचि के जीन का चयन करें। HT115 ई. कोलाई के स्टॉक की खरीद ब्याज20के आरएनएआई क्लोन युक्त । वैकल्पिक रूप से, L4440 प्लाज्मिड की बहुकीय साइट में ब्याज के जीन के सीडीएनए को उपकच्छा दें।
    नोट: बैक्टीरिया के भीतर dsRNA के क्षरण को रोकने के लिए, HT115 तनाव का उपयोग करें । यह आईपीटीजी-अकक्षीय T7 पॉलीमरेज गतिविधि के साथ एक RNase III-कमी ई. कोलाई तनाव है। प्रोटेओस्टेसिस अध्ययनों के लिए जो फीडिंग-आधारित आरएनएआई का उपयोग नहीं करते हैं, या तो एचटी 115 या OP50 ई. कोलाई मानक एनजीएम प्लेटों पर उपयोग किया जा सकता है।
  2. परीक्षण की स्थिति के अनुसार 5 x 6 सेमी प्लेटें तैयार करें। आरएनएआई का उपयोग करने वाले प्रयोगों के लिए, परिवर्तित HT115 ई. कोलाईमें डीएसआरएनए उत्पादन को प्रेरित करें। आरएनएआई के बिना अध्ययन के लिए, मानक एनजीएम प्लेटों पर OP50 ई. कोलाई का उपयोग किया जा सकता है (मानक एनजीएम और आरएनएआई प्लेट व्यंजनों के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें)।
    नोट: RNAi प्लेटों बैक्टीरिया के साथ बोने से पहले कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
  3. 220 आरपीएम पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर ई कोलाई रातोंरात (16-20 घंटे) की संस्कृतियों को बढ़ाएं। एम्पीसिलिन (50 μg/mL) के साथ लुरिया शोरबा (एलबी) में HT115 ई. कोलाई बढ़ो।
    नोट: मानक OP50 ई. कोलाई एंटीबायोटिक प्रतिरोधी नहीं है, लेकिन स्ट्रेप्टोमाइसिन प्रतिरोधी वेरिएंट भी उपलब्ध हैं ।
    1. एक बेंचटॉप अपकेंद्रित्र में 15-20 मिनट के लिए 2,400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा बैक्टीरिया को केंद्रित करें, सुपरनेट को एस्पिरेट करें, और 1/10 वें में गोली को फिर से निलंबित करें HT115 के लिए एम्पीसिलिन के साथ पौंड की शुरुआती मात्रा (यानी, 10x एकाग्रता) या मानक 50 के लिए एम्पीसिलिन के बिना एलबी।
    2. प्रत्येक प्लेट में केंद्रित 10x बैक्टीरिया के 200 माइक्रोन (3-4 प्रति परीक्षण स्थिति को दोहराता है, 2 अतिरिक्त बैकअप प्लेटों के साथ, संदूषण की स्थिति में उपयोग किया जाना है)।
    3. खुली प्लेटों को एक स्वच्छ वातावरण में सूखने की अनुमति दें जैसे कि सभी तरल को अवशोषित नहीं किया गया है या कवर प्लेटों को रात भर प्रयोगशाला बेंच पर सूखने की अनुमति न दें।
  4. वरीयता प्राप्त आरएनएआई प्लेटों के लिए एक हुड में सूख, कमरे के तापमान पर रात भर (24 घंटे तक) एक कृमि बॉक्स के भीतर सूखे प्लेटों को स्टोर करें। आरटी में 1 दिन के बाद, प्लेटों को सीलबंद बैग में 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है (प्लेटों को सूखने से रोकने के लिए)। उपयोग से पहले, 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत प्लेटों को जिप-लॉक बैग के भीतर कमरे के तापमान पर लौटने की अनुमति दें ताकि हवा में फंगल दूषित शुरू करने से संघनन को रोका जा सके।
    1. फीडिंग-आधारित आरएनएआई का उपयोग करते समय, सी एलिगेंस जोड़ने से कम से कम 12 घंटे पहले कमरे के तापमान पर आरएनएआई प्लेटों पर वरीयता प्राप्त HT115 बैक्टीरिया छोड़ दें। आरएनएआई प्लेटों में आईपीटीजी होता है, जो डीएसआरएनए उत्पादन को प्रेरित करता है। वैकल्पिक रूप से, आईपीटीजी को सीडिंग से 2 घंटे पहले चरण 1.3.1 के अंत में तरल संस्कृतियों में जोड़ा जा सकता है।
    2. आगर के खुर से बचने के लिए कमरे के तापमान पर वरीयता प्राप्त HT115 प्लेटों के दीर्घकालिक भंडारण से बचें जो सी एलिगेंस को आगर में बिल करने का कारण बनेगा।

2. सी एलिगेंस का सिंक्रोनाइजेशन

नोट: चुनें कि ग्रेविड वयस्कों या अंडे के क्षारीय हाइपोक्लोराइट उपचार द्वारा सी एलिगेंस को सिंक्रोनाइज़ करना है या नहीं।

  1. भ्रूणकीरिहाई को बढ़ावा देने के लिए ग्रेविड वयस्क जानवरों के हाइपोक्लोराइट उपचार द्वारा पशुओं को सिंक्रोनाइज़ करें ।
    1. हाइपोक्लोराइट उपचार के लिए, एम 9 बफर के साथ 2 बार ग्रेविड हर्मेफ्रोडाइट्स धोएं, फिर 5 एमएल हाइपोक्लोराइट समाधान (हाइपोक्लोराइट समाधान के 3.25 एमएल, एम 9 बफर की 1 एमसीएल और 5 एम नाओएच की 0.75 एमएल) में हर मिनट पुनर्निर्धारित जानवरों को हिलाते हुए। 5 मिनट के बाद, जानवरों को स्पिन करें और M9 बफर के साथ 3 बार धोएं।
      नोट: हाइपोक्लोराइट उपचार को प्रोटेओस्टेसिस21को प्रभावित करने के लिए प्रस्तुत किया गया है ।
    2. हाइपोक्लोराइट उपचार के बाद, भ्रूण को 20 डिग्री सेल्सियस पर रोटेशन के साथ M9 समाधान के 3 एमएल में रात भर हैच करने की अनुमति दें।
    3. L1 जानवरों के घनत्व की गणना (या वैकल्पिक रूप से, भ्रूण) प्रति μL एक 6 सेमी प्लेट पर L1 समाधान 3x के 10 μL छोड़ने और L1 जानवरों की संख्या की गिनती करने के लिए μL प्रति L1 जानवरों की औसत संख्या की गणना करने के लिए समय के साथ व्यवस्थित हो जाएगा । इसलिए, बसने से बचने के लिए समय-समय पर L1 समाधान मिलाएं।
    4. बीज प्रति प्लेट 50 L1 जानवरों, गिनती और वरीयता प्राप्त संख्या रिकॉर्ड, और एक 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के लिए प्लेटों ले जाते हैं। परख की शुरुआत में प्रत्येक प्लेट पर जानवरों की वास्तविक संख्या जानना महत्वपूर्ण है।
      नोट: M9 में रात भर हैचिंग द्वारा L1 जानवरों को सिंक्रोनाइज़ करना नियमित रूप से उपयोग किया जाता है क्योंकि यह जानवरों को भोजन पर रखने के बाद विकासात्मक विषमता को कम करता है। हालांकि, सिंक्रोनाइजेशन भुखमरी संकेतों के जवाब में विकासात्मक गिरफ्तारी के माध्यम से होता है, जो कुछ अध्ययनों से बचा जाना चाहिए (अतिरिक्त चर्चा के लिए23 देखें)। एक विकल्प के रूप में, मोटे तौर पर सिंक्रोनाइज्ड जानवरों को अंडे-रखना के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, 2.2 देखें।
    5. बचे हुए एल1 जानवरों को तरल नाइट्रोजन या -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में फ्रीज और स्टोर करें। इस तरह, प्रायोगिक सेटअप के समय प्रत्येक तनाव का एक नमूना संरक्षित किया जाता है, भविष्य के अध्ययनों के लिए एक मूल्यवान संसाधन बनाने और प्रजनन क्षमता में सुधार।
      नोट: हाइपोक्लोराइट और एम9 समाधान व्यंजनों के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें।
  2. अंडे के माध्यम से जानवरों को सिंक्रोनाइज करने के लिए, 4-6 घंटे के लिए प्रत्येक प्लेट पर 20 युवा ग्रेविड वयस्क जानवरों (वयस्कता के दिन 1) रखें, और उन्हें अंडे डालने की अनुमति दें जब तक कि प्रति प्लेट लगभग 50 अंडे न हों। सभी ग्रेविड वयस्कों को हटा दें और अंडे के साथ प्लेटों को 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ले जाएं।
    नोट: वयस्क जानवरों को वयस्कता के पहले दिन गुरुत्वाकर्षण किया जाना चाहिए। पुराने जानवर अंडे डाल सकते हैं जिन्हें गर्भाशय में बनाए रखा गया है, जिससे अंडे की रिहाई होती है जो अधिक उन्नत विकासात्मक चरण में होती है।

3. संतान उत्पादन

नोट: या तो संतान उत्पादन को रोकने के लिए या उनकी संतान से सिंक्रोनाइज्ड शुरू आबादी को अलग करने के लिए कदम उठाए जाने चाहिए । संतान उत्पादन को रोकने के लिए प्लेटों के लिए 5-फ्लोरो-2'-deoxyuridine (FUdR) के अलावा रासायनिक रूप से प्राप्त किया जा सकता है, जो यहां वर्णित है । कुछ अध्ययनों में बताया गया है कि एफयूडीआर प्रोटेओस्टेसिस24,25को बदल सकता है । संतान उत्पादन को रोकने के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोणों पर नीचे चर्चा की जाती है।

  1. अल्ट्रापुरे एच2ओ के 10 एमएल में 1 ग्राम एफडीआर को भंग करके एफयूडीआर का 1000x स्टॉक समाधान बनाएं । फिल्टर स्टरलाइज स्टॉक FUdR एक ०.२ μm फिल्टर और एक 10 मिलीएल सिरिंज के साथ । एक बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब में स्टॉक के 1 एमएल अलीकोट। फ्रीज और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. एल 4 चरण तक 20 डिग्री सेल्सियस पर जानवरों को बढ़ाएं। हाइपोक्लोराइट उपचार से सिंक्रोनाइज्ड एल1एस से उठाए गए एन 2 जानवरों को एल 4 तक पहुंचने के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 40 घंटे की वृद्धि की आवश्यकता होती है। अन्य उपभेदों के लिए विकास दर को प्रयोग से पहले अनुभवजन्य रूप से परीक्षण किया जाना चाहिए । सी एलिगेंस को सही तरीके से कैसे स्टेज किया जाए, इस बारे में जानकारी के लिए26देखें ।
    1. L4 जानवरों के साथ प्रत्येक 6 सेमी प्लेट में, 80x FUdR के 100 माइक्रोन जोड़ें। यह L4 चरण में FUdR जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  3. प्लेटों को एक कीड़ा बॉक्स में वापस करें और बॉक्स को ज़िप-लॉक बैग में रखें। उपयुक्त इनक्यूबेटर पर लौटें।

4. पॉलीग्लूटामाइन-व्यक्त जानवरों का उपयोग करके मांसपेशियों के ऊतकों में प्रोटेओस्टेसिस में गिरावट को मापना

नोट: मांसपेशियों की कोशिकाओं में प्रोटेओस्टेसिस गिरावट की पहचान करने के लिए दो तरीकों का उपयोग किया जा सकता है: उम्र बढ़ने के दौरान प्रोटीन समुच्चय के गठन की इमेजिंग (4.1) और प्रोटेओक्ॉक्सिकिटी को मापने के कारण ये उम्र के साथ पक्षाघात (4.2) की शुरुआत के माध्यम से होते हैं।

  1. उम्र बढ़ने के दौरान मांसपेशियों में इमेजिंग पॉलीग्लूटामाइन समग्र गठन
    नोट: मांसपेशियों की कोशिकाओं में प्रोटीन एकत्रीकरण की उम्र पर निर्भर प्रगति को पॉलीग्लूटामाइन (पॉलीक्यू) का उपयोग करके चित्रित किया जाता है जो पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) से जुड़ा होता है। यह प्रोटोकॉल तनाव AM140 rmIs132 [unc-54p:: Q35::YFP]के उपयोग की रूपरेखा है, लेकिन अन्य पॉलीग्लूटामाइन संस्करण उपभेदों का भी उपयोग किया जा सकता है। पॉलीक्यू:: वाईएफपी ट्रांसजीन को यूएनसी-54 मांसपेशियों-विशिष्ट प्रमोटर का उपयोग करके मांसपेशियों में व्यक्त किया जाता है। सिंक्रोनाइज्ड unc-54p::p olyQ:: YFP व्यक्त जानवरों वयस्कता के दिन 1, 2, 3 और 4 पर कल्पना कर रहे हैं । यूएनसी-54p की कल्पना करने के लिए: :p olyQ:: YFP समुच्चय, फ्लोरेसेंस या फ्लोरोसेंट विच्छेदन माइक्रोस्कोप के लिए सुसज्जित यौगिक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। AM140 कैनोरहैब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर (सीजीसी) से उपलब्ध है: https://cgc.umn.edu/strain/AM140।
    1. इमेजिंग दिनों (वयस्कता के दिन 1, 2, 3 और 4), 20 जानवरों को चुनें और 3% एगर उठे पैड के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड सेटअप पर माउंट करें और 10 mm सोडियम एज़ाइड (एम 9 बफर में पतला) की 5 माइक्रोन ड्रॉप करें।
    2. सभी जानवरों को सोडियम एजाइड (~ 5 मिनट) द्वारा स्थिर किए जाने के बाद, 10x आवर्धन लेंस(चित्रा 1A)का उपयोग करके जानवरों के पूरे शरीर की छवि बनाएं। इमेजिंग के लिए, एक फिटसी फिल्टर और हर जानवर के लिए एक ही जोखिम का उपयोग करें। इमेजिंग के बाद स्लाइड्स डिस्कार्ड करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, YFP foci भी प्लेटों पर सीधे मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, लेकिन आंदोलन प्लेट पर कार्बन डाइऑक्साइड की एक धारा लागू करने से हिचकते किया जाना चाहिए, जबकि स्कोरिंग । बड़ी संख्या में स्थितियों की स्क्रीनिंग करते समय यह वैकल्पिक विधि सबसे उपयुक्त है (अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें)।
    3. छवियों के अधिग्रहण के बाद, पूरे जानवर के शरीर की दीवार की मांसपेशियों में फोसी की संख्या गिनें। Foci उज्जवल विरामित संकेत है कि पृष्ठभूमि में मंद घुलनशील संकेत से विभेदित किया जा सकता है ।
    4. 1, 2, 3 और 4 दिनों से YFP foci संचय की प्रगति की साजिश। एक XY ग्राफ प्लॉट जहां एक्स वयस्कता के दिनों का प्रतिनिधित्व करता है और Y unc-54p की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है: :p olyQ:: YFP foci(चित्रा 1B)। प्रायोगिक स्थिति (जैसे, जीन डाउनरेगुलेशन या अतिव्यवसंपणता) में फोसी की संख्या जानवरों को नियंत्रित करने की तुलना में की जाती है। प्रत्येक परीक्षण के लिए मनाए गए प्रत्येक समय बिंदु पर समूहों के बीच सांख्यिकीय विश्लेषण करें।
      1. केवल दो स्थितियों के लिए फोसी की तुलना करते समय, प्रत्येक समय बिंदु पर एक स्वतंत्र नमूना टी-परीक्षण करें।
      2. दो से अधिक स्थितियों के लिए फोसी काउंट की तुलना करते समय, हर समय बिंदु के लिए एक सर्वग्राही वन-वे एनोवा विश्लेषण करें, जिसमें उस समय बिंदु पर सभी स्थितियों के लिए डेटा शामिल है। यदि सर्वग्राही ANOVA एक महत्वपूर्ण पी-वैल्यू (यानी, पी < ०.००५) की पैदावार करता है, तो विशिष्ट परिस्थितियों का निर्धारण करने के लिए जोड़ीवार स्वतंत्र नमूना टी-परीक्षणों के साथ एक पोस्ट-हॉक विश्लेषण करें, जिसके बीच foci में एक महत्वपूर्ण अंतर का पता चला (उदाहरण के लिए, समूहों के लिए ए, बी, और सी तुलना ए और बी, ए और सी, और बी और सी) ।
  2. मांसपेशियों की कोशिकाओं में पॉलीग्लूटामाइन विषाक्तता के लिए एक किराए के रूप में पशु पक्षाघात दरों को मापने
    नोट: मांसपेशियों में पॉलीक्यू समुच्चय की आयु-निर्भर वृद्धि मांसपेशियों के कार्य में गिरावट का कारण बनती है जो लोकोमोशन चलाती है। लोकोमोशन में इस दोष का निर्धारण पॉलीक्यू-व्यक्त करने वाले जानवरों में पक्षाघात की प्रगतिशील दर को मापकर किया जा सकता है । पक्षाघात परख के लिए, सिंक्रोनाइज्ड unc-54p: :p olyQ:: YFP व्यक्त जानवरों वयस्कता के दिन 3, 5, 7 और 9 पर रन बनाए हैं । स्कोरिंग रेंज का विस्तार करने के लिए आवश्यक अतिरिक्त समय अंक जोड़ें, जैसे कि आप आनुवंशिक क्षोभ के प्रभाव का आकलन कर सकते हैं।
    1. स्कोरिंग के दिनों (वयस्कता के दिन 3, 5, 7 और 9), 50 जानवरों वाली 6 सेमी प्लेटों को देखें और लकवाग्रस्त जानवरों की संख्या रिकॉर्ड करें। प्लेट से झोले के साथ जानवरों को हटा दें। यदि जानवरों की थाली से रेंगते हैं, या मर गए हैं, तो उन्हें सेंसर किया जाना चाहिए; घटना रिकॉर्ड तो यह विश्लेषण में के लिए हिसाब किया जा सकता है ।
      नोट: एक जानवर को लकवाग्रस्त माना जाता है जब उन्हें प्रकाश या कोमल स्पर्श उत्तेजनाओं को उजागर करने के बाद कोई आंदोलन नहीं देखा जाता है। Pharyngeal पंपिंग गतिविधि का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जाता है कि गैर-जानवर जीवित हैं या मृत हैं।
    2. प्रयोग के पूरा होने पर, प्रत्येक स्थिति के लिए पक्षाघात दर की गणना करें। उस समय उस स्थिति के लिए देखे गए जानवरों की कुल संख्या से लकवाग्रस्त जानवरों के अंश को विभाजित करके हर समय बिंदु पर ऐसा करें। यदि प्रति समय बिंदु (यानी, प्लेटों को दोहराने) प्रति स्थिति कई प्लेटों को देख रहे हैं, तो प्रत्येक दोहराने के लिए अलग से अनुपात की गणना करें।
    3. XY ग्राफ (स्कैटरप्लॉट) में पक्षाघात दर की प्रगति की साजिश करें। एक्स वयस्कता के दिनों का प्रतिनिधित्व करता है और वाई पक्षाघात दरों का प्रतिनिधित्व करता है। unc-54p की पक्षाघात दर: :p olyQ:: YFP जानवरों को नियंत्रित जानवरों(चित्रा 1C)की तुलना में है । समूहों के बीच सांख्यिकीय विश्लेषण करें; कई परीक्षणों के लिए, स्वतंत्र रूप से परीक्षणों का इलाज करें। कॉक्स आनुपातिक-खतरों प्रतिगमन और वाल्ड परीक्षण का प्रयोग करें । अधिकांश डेटा विश्लेषण उपकरण जो अस्तित्व विश्लेषण का समर्थन करते हैं, कॉक्स मॉडलिंग का भी समर्थन करते हैं।
      1. डेटा को बदलें: प्रत्येक स्थिति में दो कॉलम होने चाहिए, एक समय के लिए, और दूसरा "घटना" के लिए। हर समय बिंदु पर मनाया, प्रत्येक झोले के मारे हुए जानवर के लिए "0" के साथ एक पंक्ति जोड़ें, और प्रत्येक सेंसर जानवर के लिए एक "1" । पंक्तियों की कुल संख्या उस स्थिति के लिए प्लेट पर शुरू जानवरों की संख्या के बराबर होनी चाहिए।
      2. अपने सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर के निर्देशों के अनुसार, वाल्ड टेस्ट के बाद कॉक्स आनुपातिक-खतरों मॉडलिंग करें। एक एकवीय मॉडल विशिष्ट प्रयोग डिजाइनों के लिए उपयुक्त होगा। दो से अधिक स्थितियों के लिए, यदि सभी शर्तों के साथ एक परीक्षण एक महत्वपूर्ण परिणाम (यानी, पी < ०.००५) इंगित करता है, शर्तों के बीच जोड़ी के लिए परीक्षण शर्तों की विशिष्ट महत्वपूर्ण जोड़ी (एस) निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है ।
        नोट: कॉक्स मॉडल एक धारणा है कि परीक्षण की स्थिति (ओं) समय के साथ आनुपातिक रूप से एक घटना की संभावना मिलाना पर निर्भर करता है । इसका मतलब यह है, उदाहरण के लिए, कि कॉक्स मॉडल एक शर्त है जिसके तहत ज्यादातर जानवरों के दिन में 1 दिन में एक शर्त है जिसके तहत ज्यादातर जानवरों 9 दिन में झोले के साथ कर रहे है की तुलना के लिए उपयुक्त नहीं होगा । कॉक्स मॉडल के एक्सटेंशन, और हर समय बिंदु पर झोले के साथ अनुपात की तुलना के लिए अन्य दृष्टिकोण, उन मामलों के लिए उपलब्ध हैं जहां आनुपातिक खतरों की धारणा नहीं है,27, 28,29,30देखें।

5. जानवरों को अभिव्यक्त करने वाले पॉलीग्लूटामाइन का उपयोग करके न्यूरोनल ऊतक में प्रोटेओस्टेसिस में गिरावट को मापना।

नोट: दो पूरक विधियों का उपयोग न्यूरॉन्स (1) में प्रोटेओस्टेसिस गिरावट को मापने के लिए किया जाता है, जिसमें उम्र बढ़ने के दौरान प्रोटीन समुच्चय (फ्लोरोसेंट फोसी) के गठन की मात्रा निर्धारित की जाती है और (2) एक आंदोलन आधारित परख के माध्यम से न्यूरोनल प्रोटेम में उम्र से जुड़ी गिरावट को मापकर।

  1. उम्र बढ़ने के दौरान न्यूरॉन्स में इमेजिंग पॉलीग्लूटामाइन समग्र गठन
    नोट: मांसपेशियों के ऊतकों में पहले से ही चर्चा की परख के समान, न्यूरॉन्स में प्रोटीन एकत्रीकरण की आयु पर निर्भर प्रगति एक पॉलीक्यू व्यक्त करके छवि है:: YFP संलयन प्रोटीन पैन-न्यूरोनल ऊतक-rgef-1के विशिष्ट प्रमोटर द्वारा संचालित । विशेष रूप से हम AM101 का उपयोग करें: rmIs110 [rgef-1p:: Q40::YFP],YFP16के लिए एक ४० ग्लूटामाइन संलयन । rgef-1p कल्पना करने के लिए: :p olyQ:: YFP, एक यौगिक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें जो 40x आवर्धन लेंस के साथ फ्लोरेसेंस के लिए सुसज्जित है। AM101 सीजीसी से उपलब्ध है: https://cgc.umn.edu/strain/AM101।
    1. इमेजिंग दिनों (वयस्कता के दिन 4, 6, 8 और 10) पर, 20 जानवरों को चुनें और एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर माउंट करें जिसमें 10 एमएम सोडियम एजाइड (एम9 बफर में पतला) की 5 माइक्रोन ड्रॉप के साथ 3% एग्राडेड पैड होता है।
    2. सोडियम अज़ाइड (~ 5 मिनट) द्वारा सभी जानवरों को स्थिर करने के बाद, 40x आवर्धन लेंस(चित्रा 2 ए)का उपयोग करके जानवरों के सिर की जेड-स्टैक छवियां लें। इमेजिंग के बाद स्लाइड्स डिस्कार्ड करें।
    3. छवियों के अधिग्रहण के बाद, अधिकतम प्रक्षेपण प्राप्त करने के लिए जेड-स्टैक की प्रक्रिया करें और तंत्रिका रिंग क्षेत्र पर स्थित न्यूरॉन्स में फोसी की संख्या को निर्धारित करने के लिए उपयोग करें। Foci उज्जवल विरामित संकेत है कि पृष्ठभूमि में मंद घुलनशील संकेत से विभेदित किया जा सकता है ।
      नोट: हम विशेष रूप से तंत्रिका अंगूठी क्षेत्र का चयन करने के लिए rgef-1p: :p olyQ: YFP समुच्चय के बाद से यह क्षेत्र है जहां सबसे न्यूरॉन्स सिनैप्टिक कनेक्शन बनाने के लिए एकाग्र है । हालांकि, मोटर न्यूरॉन्स में कुल गठन के स्तर को मापने के लिए, आरजीईएफ-1 पी: :p ओलीक्यू:: पृष्ठीय या वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड पर स्थित वाईएफपी समुच्चय को मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।
    4. D4, D6, D8 और D10 से YFP foci संचय की प्रगति की साजिश। यह एक XY ग्राफ पर करें जहां एक्स वयस्कता के दिनों का प्रतिनिधित्व करता है और वाई rgef-1p की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है: :p olyQ:: YFP foci(चित्रा 2B)। प्रायोगिक स्थिति (जैसे, जीन डाउनरेगुलेशन या अतिव्यवसंपणता) में फोसी की संख्या जानवरों को नियंत्रित करने की तुलना में की जाती है। न्यूरॉन्स के लिए फोसी काउंट का सांख्यिकीय विश्लेषण मांसपेशियों पॉलीक्यू फोसी के समान तरीके से किया जाता है; चरण 4.1.4 और संबंधित नोट्स देखें।
  2. मापने शरीर न्यूरॉन्स में पॉलीग्लुटामाइन प्रोटेटोक्सिटी के एक किराए के उपाय के रूप में झुकता है।
    नोट: न्यूरोनल पॉलीक्यू के प्रगतिशील समग्र संचय से प्रेरित प्रोटोटॉक्सिक तनाव एक पिटाई परख के माध्यम से मोटर न्यूरॉन दोषों को देखकर निर्धारित होता है। M9 शारीरिक बफर(पूरक फ़ाइल 1)में निलंबित करते हुए 30 सेकंड की अवधि में शरीर झुकता की संख्या की मात्रा निर्धारित करें।
    1. वयस्कता के दिन 2 पर, एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर M9 बफर की 10 माइक्रोन ड्रॉप पर प्लेट और जगह से 10 सिंक्रोनाइज्ड जानवरों को चुनें। 40 या उससे अधिक जानवरों का नमूना लेने के लिए इस कदम को कम से कम चार बार दोहराएं।
    2. वीडियो रिकॉर्ड एक वीडियो सक्षम कैमरे के साथ एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप पर 30 एस की अवधि के लिए M9 बफर के 10 μL के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखा 10 जानवरों की आवाजाही । 40 की कुल नमूना संख्या के लिए इस चरण को 4 बार दोहराएं। ज़ूम और स्थिति को इस तरह समायोजित किया जाना चाहिए कि सभी जानवर पूरे 30 सेकंड के लिए फ्रेम में दिखाई दे रहे हैं।
    3. एक बार जब जानवरों का विश्लेषण करने के साथ सभी वीडियो रिकॉर्ड किए जाते हैं, तो वीडियो खेलें और प्रत्येक जानवर के शरीर को झुकता है। एक शरीर मोड़ के रूप में परिभाषित किया गया है जब जानवर की योनी एक तरफ से विपरीत और सभी तरह से वापस प्रारंभिक स्थिति में चला जाता है ।
      नोट: हम जंगली प्रकार के जानवरों को आम तौर पर 30 सेकंड में ४९ ± ०.७९ शरीर झुकता है लगता है ।
    4. एक कॉलम ग्राफ में प्रत्येक जानवर के लिए शरीर झुकता की संख्या प्लॉट जहां प्रत्येक डॉट एक्स अक्ष पर परीक्षण की गई विभिन्न स्थितियों के साथ 30 एस (वाई एक्सिस) में शरीर के झुकता की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है। unc-54p के शरीर झुकता की संख्या: :p olyQ:: YFP जानवरों को नियंत्रित जानवरों(चित्रा 2C)की तुलना में है । प्रत्येक परीक्षण के लिए स्वतंत्र रूप से समूहों के बीच सांख्यिकीय विश्लेषण करें; यदि परख कई बार बिंदुओं पर दोहराया जाता है, तो प्रत्येक समय बिंदु के लिए स्वतंत्र रूप से डेटा का विश्लेषण करें।
      1. केवल दो शर्तों पर विचार करते समय, एक स्वतंत्र-नमूना टी-परीक्षण करें।
      2. एक बार में दो से अधिक शर्तों पर विचार करते समय, पहले एक सर्वग्राही एक तरह से ANOVA विश्लेषण, उस समय परीक्षण में सभी शर्तों के लिए डेटा सहित प्रदर्शन/ यदि सर्वग्राही ANOVA एक महत्वपूर्ण पी मूल्य पैदावार (यानी, पी < ०.००५), जोड़ीवार स्वतंत्र नमूना टी परीक्षण के साथ एक के बाद तदर्थ विश्लेषण करने के लिए विशिष्ट शर्तों के बीच जो शरीर मोड़ गिनती में एक महत्वपूर्ण अंतर का पता चला था निर्धारित करने के लिए ।

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Representative Results

सी एलिगेंसमें, प्रोटेओस्टिटिक नेटवर्क को विनियमित करने वाले जीन की पहचान के लिए पॉलीग्लोटामाइन रिपीट मॉडल महत्वपूर्ण भूमिका निभाता रहा है। उदाहरण के लिए, हमने पहले दिखाया कि होमोडोजमेन इंटरैक्टिंग प्रोटीन काइनेज(एचपीके-1),एक ट्रांसक्रिप्शनल कोफैक्टर, ऑटोफैगी और आणविक चैपरीन्स31की अभिव्यक्ति को विनियमित करके उम्र बढ़ने के दौरान प्रोटेओस्टेसिस को प्रभावित करता है। हमने पाया कि एचपीके-1का नुकसान, या तो आरएनएआई चुप्पी से या एचपीके-1 (pk1393) नल उत्परिवर्ती जानवरों में, उम्र बढ़ने के दौरान जमा होने वाले Q35::YFP समुच्चय की संख्या बढ़ जाती है। दिन 2 वयस्क नियंत्रण जानवरों को प्रदर्शित 18.0 ± 2.7 समुच्चय जबकि एचपीके-1 (pk1393) नल उत्परिवर्ती और hpk-1 RNAi-इलाज Q35::YFP जानवरों का औसत 28 ± 5.3 और 26.0 ± 5.1 कुल, क्रमशः(चित्रा 3-डी)। इसी तरह, वयस्कता के दिन 8 तक, एचपीके-1 (आरएनएआई) और एचपीके-1 (पीके1393) जानवरों के 77-78% जानवरों को लकवा मार गया जबकि नियंत्रण Q35का 50%::वाईएफपी जानवरों को लकवा मार गया(चित्रा 3E)। इसके अलावा, एचपीके-1 प्रोटीन समग्र गठन को विनियमित करने के लिए पर्याप्त है क्योंकि एचपीके-1 के सर्वव्यापी अतिव्यक्तता मांसपेशियों के ऊतकों में Q35::YFP फोसी की संख्या को कम करता है और उम्र बढ़ने वाले जानवरों को Q35से बचाता है:: उम्र बढ़ने केदौरान वाईएफपीसे जुड़े पक्षाघात(चित्रा 3E)। सामूहिक रूप से, इन परिणामों से पता चलता है कि एचपीके-1 प्रोटेओस्टेसिस को नियंत्रित करता है और इस बात पर प्रकाश डालता है कि पॉलीक्यू:: वाईएफपी मॉडल का उपयोग उम्र बढ़ने के दौरान प्रोटेओस्टेसिस में परिवर्तनों के रिवर्स जेनेटिक विश्लेषण के लिए कैसे किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: पॉलीक्यू की अभिव्यक्ति:: सी एलिगेंस मांसपेशी के भीतर वाईएफपी के परिणामस्वरूप उम्र बढ़ने के दौरान प्रगतिशील फोसी संचय और पक्षाघात होता है। (A) C. elegans unc-54p:: Q35:: वयस्कता के 1 और 4 दिनों में YFP अभिव्यक्ति (ऊपरी और निचले पैनल, क्रमशः) । तीर प्रतिनिधि फोसी का संकेत देते हैं। (ख)वयस्कता के पहले 4 दिनों में फ्लोरोसेंट फोसी का मात्राकरण । फोसी एफआरएपी15,32,33केप्रतिरोधी हैं, जो एक अघुलनशील प्रोटीन कुल के अनुरूप हैं। त्रुटि सलाखों के मतलब (SEM)(सी) unc-54p:: Q35:: YFP जानवरों उम्र बढ़ने के दौरान झोले के साथ हो के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं । त्रुटि सलाखों के अनुपात की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं । पूरक तालिका 1में(बी-सी)के लिए कच्चे डेटा प्रदान किए जाते हैं। स्केल बार सभी पैनलों में 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: पॉलीक्यू की अभिव्यक्ति:: सी एलिगेंस न्यूरॉन्स के भीतर वाईएफपी के परिणामस्वरूप प्रगतिशील फोसी संचय और सामान्य शरीर के व्यवधान में बाधा होती है। (ए, टॉप) सी एलिगेंस पूर्ववर्ती की डीआईसी छवि। फरीनेक्स जानवर के सिर में एक द्वि-लॉब्ड संरचना है, जो तंत्रिका अंगूठी से घिरा हुआ है, जो 180 न्यूरॉन्स का एक इंटरकनेक्टेड क्लस्टर है। लाल कोष्ठक सिर न्यूरॉन्स के भीतर फोसी के लिए स्कोर करने के लिए क्षेत्र का संकेत देते हैं। (A, मध्य) rgefp-1:Q40::YFP फ्लोरेसेंस दिन 2 वयस्कता पर । ध्यान दें कि YFP अभिव्यक्ति काफी हद तक फैलाना है, एक सामयिक कुल (तीर) के अपवाद के साथ । (A, नीचे) rgefp-1:Q40:: YFP फ्लोरेसेंस दिन में 10 वयस्कता । फोसी/एग्रीगेट्स (लाल तीर) दर्शाए जाते हैं। (ख)वयस्कता के पहले 10 दिनों में फ्लोरोसेंट फोसी का मात्राकरण । फोसी एफआरएपी15,32,33केप्रतिरोधी हैं, जो एक अघुलनशील प्रोटीन कुल के अनुरूप हैं। त्रुटि सलाखों के मतलब के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व(C) जंगली प्रकार के शरीर झुकता है और rgef-1p की विशिष्ट आवृत्ति:: Q40:: YFP जानवरों खाली वेक्टर RNAi (L4440) पर 20 डिग्री सेल्सियस खिला पर बनाए रखा 2 वयस्कता दिन । ग्लूटामीन विस्तार में वृद्धि15आंदोलन दोषों से संबंधित है । त्रुटि सलाखों के मतलब के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं । पूरक तालिका 1में(बी-सी)के लिए कच्चे डेटा प्रदान किए जाते हैं। स्केल बार सभी पैनलों में 20 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एचपीके-1 प्रोटेओस्टेसिस को बढ़ावा देता है। (ए-सी) एचपीके-1 गतिविधि मांसपेशियों की कोशिकाओं में Q35::YFP फोसी के संचय को प्रभावित करती है। पुन्क-54::p olyQ के प्रतिनिधि चित्र हैं:: YFP जानवरों के साथ इलाज किया(ए)नियंत्रण RNAi या(B) hpk-1 RNAAi, और(सी)ट्रांसजेनिक पशु hpk-1 (Psur-5::HPK-1:CFP) overexpressing । (घ)पॉलीक्यू का समय पाठ्यक्रम:: वाईएफपी फोसी संचय के साथ संयोजन के रूप में: नियंत्रण आरएनएआई (काले घेरे), एचपीके-1 आरएनएआई (सफेद घेरे), एचपीके-1 (पीके1393) (सफेद वर्ग), या एचपीके-1 अतिउपंख (खुले त्रिकोण) के साथ उपचार। डेटा अंक जैविक दोहराने के प्रति कम से कम 15 जानवरों के मानक विचलन (एसडी) के ± मतलब प्रदर्शित करते हैं; कम से कम 5 स्वतंत्र प्रयोग किए गए। (ई) Punc-54::p olyQ के पक्षाघात का समय पाठ्यक्रम:: YFP जानवरों के साथ संयोजन के रूप में: नियंत्रण RNAi (काले हलकों), hpk-1 RNAAi (सफेद हलकों), hpk-1 (pk1393) (सफेद वर्ग), या hpk-1 overexpression (खुले त्रिकोण) के साथ उपचार । प्लॉट किए गए डेटा एक ही प्रतिनिधि परीक्षण के लिए परिणाम प्रदर्शित करते हैं। यह आंकड़ा एक क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन (सीसी BY) लाइसेंस के माध्यम से अनुमति के साथ संदर्भ31 से फिर से मुद्रित किया जाता है । स्केल बार सभी पैनलों में 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक तालिका 1: परिणामों के कच्चे डेटा। तालिका में चित्रा 2 और चित्रा 3से फोसी, पक्षाघात और बॉडी बेंड डेटा शामिल हैं। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: नियमित सी एलिगेंस काम के लिए आम अभिकर्मक। आम अभिकर् पों में विभिन्न प्रकार की प्लेटें और बफ़र्स तैयार करने के लिए व्यंजन शामिल हैं। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एजिंग की विशेषता प्रोटेओस्टेसिस में धीरे-धीरे गिरावट आती है। प्रोटीन फोल्डिंग, गिरावट और अनुवाद के समन्वित, गतिशील, तनाव-उत्तरदायी नियंत्रण के लिए प्रोटेओस्टेसिस को एक जटिल प्रणाली, प्रोटेओस्टेटिक नेटवर्क द्वारा बनाए रखा जाता है। उम्र बढ़ने के दौरान प्रोटेओस्टेसिस क्यों विफल रहता है, इसे खराब ढंग से समझा जाता है, लेकिन एक खस्ताहाल एपिगेनोम, तनाव प्रतिक्रियाओं की अपरिवर्तनीयता में गिरावट, और प्रतिपूरक क्रॉसटॉक की हानि सभी इस टूटने के साथ मेल खाते हैं। सी एलिगेंस में, तनाव की प्रतिक्रिया के कई रूपों की प्रतिलेखनात्मक अक्रियाशीलता तनाव लोकी 2 ,34, 35पर दमनकारी क्रोमेटिन के निशान के गठन के कारण प्रजनन की शुरुआत के कुछघंटोंके भीतर तेजी से गिरावट आती है। प्रोटेओस्टेसिस पतन एक बड़े पैमाने पर नैदानिक समस्या है क्योंकि यह प्रोटीन गलत गुना रोगों के विकास को रेखांकित करता है। इस प्रकार, वीवो में सेलुलर प्रोटेओस्टेसिस की मात्रा निर्धारित करने के लिए आनुवंशिक विश्लेषण के लिए उपयुक्त विधि होना आवश्यक है कि जीव प्रोटेम के उचित तह और कार्य को कैसे बनाए रखते हैं, इस बारे में गहरी यंत्रवादी अंतर्दृष्टि प्राप्त करें।

पॉलीग्लूटामाइन फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की ऊतक-विशिष्ट अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक सी एलिगेंस प्रोटेओस्टेसिस की उम्र पर निर्भर गिरावट का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी और मजबूत तरीका है। पॉलीग्लूटामाइन मॉडल के दो सबसे प्रमुख लाभ हैं: (1) शक्तिशाली आनुवंशिकी और कार्यात्मक जीनोमिक्स के साथ संयुक्त ऊतक-विशिष्ट अभिव्यक्ति एक अक्षुण्ण बहुकोशिकीय जीव के संदर्भ में प्रोटेओस्टेसिस नियामकों की खोज और लक्षण वर्णन की अनुमति देती है, और (2) फोसी संरचनाओं का वियोनीकरण वीवो में उम्र से जुड़े प्रोटेओस्टिटिक गिरावट के प्रत्यक्ष मात्राकरण की अनुमति देता है . जबकि कई मामलों में एक सहसंबंध समग्र संचय और बढ़ी हुई प्रोटोटॉक्सिकिटी के बीच मौजूद है, कुछ उदाहरणों में, ये दो फेनोटाइप नकारात्मक रूप से सहसंबद्ध हैं। उदाहरण के लिए, कम इंसुलिन सिग्नलिंग उम्र और तनाव प्रतिरोध को बढ़ाता है: डीएएफ-2 उत्परिवर्ती जानवर (इंसुलिन/इंसुलिन जैसे विकास कारक 1 रिसेप्टर में कार्य का एक हाइपोमोर्फिक नुकसान), एक सुरक्षात्मक तंत्र के उपनियम द्वारा प्रोटेओस्टेसिस क्षमता में सुधार करते हुए एक बढ़ा हुआ कुल भार दिखाते हैं जो विषाक्त कुल प्रजातियों33,36, 37,38,39 के गठन को रोकता है . इस प्रकार, कुछ मामलों में कुल गठन प्रोटेम के बाकी हिस्सों से हानिकारक प्रोटीन प्रजातियों को अलग करके सुरक्षात्मक है। चूंकि सेलुलर प्रोटोटॉक्सिकता के रीडआउट का आकलन समग्र गठन के साथ किया जा सकता है, इसलिए सुरक्षात्मक ज़ब्ती तंत्र में शामिल आनुवंशिक बातचीत की पहचान करने के लिए विपरीत सहसंबंधों के लिए परीक्षण कर सकते हैं। अंत में, पॉलीग्लोटामाइन फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स को ऊतक विशिष्ट नॉकडाउन (उदाहरण के लिए, ऊतक विशिष्ट आरएनएआई या आरएनए हेयरपिन अभिव्यक्ति के माध्यम से शास्त्रीय) के साथ जोड़ा जा सकता है, और हाल ही में ऊतक-विशिष्ट प्रोटीन क्षरण के माध्यम से, जैसे कि Tir1-auxin प्रणाली40- या ऊतक-विशिष्ट संवाददाताओं का उपयोग करके ब्याज के जीन के ऊतक-विशिष्ट अतिव्यक्ति के साथ, जिससे कोशिकाओं और ऊतकों के भीतर प्रोटेस्टोस्टेसिस के विनियमन में अंतर्दृष्टि प्राप्त हो सके।

उम्र बढ़ने के दौरान प्रोटेओस्टेसिस में परिवर्तन को मापने के तरीकों के लिए कालक्रम से मिलान किए गए जानवरों की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, या तो संतान के उत्पादन को रोकने या शुरू जानवरों को अलग करने के लिए आवश्यक है। प्रोटोकॉल में, हम यह रेखांकित करते हैं कि संतान उत्पादन को रोकने के लिए फ्यूडीआर का उपयोग कैसे किया जाए, लेकिन कुछ अध्ययनों ने बताया है कि फ्यूयूडीआर प्रोटेओस्टेसिस24, 25को बदल सकता है। वैकल्पिक रूप से, नारीकृत आनुवंशिक पृष्ठभूमि का उपयोग किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, फेर-15 (बी26); फेम-1 (एचसी 17)41)। अंत में, वयस्क जानवरों को संतति से दूर ताजा RNAi प्लेटों में ले जाया जा सकता है । यह थ्रूपुट की कीमत पर पृष्ठभूमि विचारों को सरल बनाता है। समय-समय पर जानवरों को ताजा भोजन में ले जाने से डीएसआरएनए के संपर्क में आने और संभावित भुखमरी को रोकने के अतिरिक्त फायदे होते हैं।

क्योंकि फ्लोरोसेंट फोसी दृश्य अवलोकन के माध्यम से मात्रा निर्धारित कर रहे हैं, एक सटीक और foci की पहचान में संगत होना चाहिए । C. Elegans polyQ:: YFP foci प्रयोगात्मक रूप से फोटोब्लैचिंग (FRAP)15,३२, ३३के बाद फ्लोरेसेंस वसूली के माध्यम से वीवो प्रोटीन समुच्चय में होने के लिए सत्यापित किया गया है । प्रोटीन एकत्रीकरण42का आकलन करने के लिए अतिरिक्त जैव रासायनिक दृष्टिकोणों का उपयोग किया जा सकता है । यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि दिन 3 वयस्कता के अनुसार, प्रारंभिक फोसी बड़ा हो जाता है और उपग्रह फोसी (एक ग्रह के चारों ओर चंद्रमाओं के अनुरूप) के रूप में दिखाई देने के लिए जमा करना शुरू कर देता है। यह शुरू करने से पहले तय करना आवश्यक है कि इन उपग्रह foci को अलग समुच्चय के रूप में गिना जाए या अधिक रूढ़िवादी होना चाहिए और सामूहिक क्षेत्र को एक समग्र के रूप में विचार करना है, और फिर सभी प्रयोगों में स्कोरिंग करते समय सुसंगत बने रहना है। हम बाद पसंद करते हैं; यह गतिशील सीमा का विस्तार करता है जिसके दौरान फोसी गठन का आकलन किया जा सकता है, लेकिन इन अधिक रूढ़िवादी अनुमानों के साथ भी, दिन 4 -5 तक एक स्पष्ट पठार प्रभाव है। वास्तविकता में प्रोटेओस्टेसिस में गिरावट जारी है, लेकिन foci इतने सारे है यह अब आंख से सही संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए संभव है । जैविक परीक्षणों में, व्यक्तियों के बीच, और प्रयोगशालाओं के बीच प्रजनन क्षमता में सुधार करने के लिए, यह परिभाषित करना महत्वपूर्ण है कि फोसी के रूप में क्या किया जा रहा है।

जबकि हम यूएनसी-54p का उपयोग करके प्रोटेओस्टेसिस में परिवर्तन के लिए शर्तों के सीमित सेट का परीक्षण करने के लिए सरल रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोणों के लिए विस्तार से तरीके:: Q35::YFP रिपोर्टर, हमने उच्च थ्रूपुट के साथ तरीके विकसित किए हैं जहां प्रोटेओस्टेसिस में परिवर्तन को एक साथ 100 स्थितियों (जैसे, आरएनएआई क्लोन) तक के लिए निर्धारित किया जा सकता है। इस विधि में प्रतिकृति सेट का उपयोग शामिल है, जिसे हमने आनुवंशिक क्षोभ के बाद उम्र में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए बड़े पैमाने पर उपयोग किया है। संक्षेप में, एक बड़ी आइसोजेनिक आबादी से प्राप्त स्वतंत्र नमूनों को समय के साथ एक ही नमूने के बजाय प्रत्येक समय बिंदु पर बनाए जाते हैं। यह दृष्टिकोण आसानी से उम्र से जुड़े प्रोटेरोक्सिक परिवर्तनों का आकलन करने के लिए अनुकूलित किया जाता है, जैसे पक्षाघात (मांसपेशी प्रमोटर के साथ पॉली-क्यू:: वाईएफपी का उपयोग करना) या शरीर झुकता (न्यूरोनल प्रमोटर के माध्यम से)। प्रतिकृति इस तरह से स्कोरिंग सेट एक बहु अच्छी तरह से थाली है, जो सी elegans को स्थानांतरित करने के लिए उत्तेजित करता है के कुओं में तरल जोड़ने पर जोर देता है । मांसपेशियों की कोशिकाओं के भीतर फोसी गठन के लिए एक अनुरूप दृष्टिकोण आसानी से लागू किया जा सकता है। पहले, हम एक सामांय (जंगली प्रकार) उम्र या कम इंसुलिन की वृद्धि हुई उम्र के लिए आवश्यक १५९ जीन की पहचान की/ इनमें से 103 जीन निष्क्रियता के परिणामस्वरूप प्रोजेरिक फेनोटाइप होता है, जिसमें जानवरों को समय से पहले उम्र बढ़ने के एक या अधिक संकेत दिखाई देते हैं43. एक माध्यमिक स्क्रीन में unc-54p का उपयोग कर:: Q35::YFP रिपोर्टर और एक प्रतिकृति स्कोरिंग दृष्टिकोण सेट, हम लगभग 50 प्रोजेरिक जीन निष्क्रियताओं की पहचान करने में सक्षम थे जो त्वरित फोसी गठन (ए.वी.एस. अप्रकाशित परिणाम) का उत्पादन करते थे, जिसने बाद में केंद्रित मशीनी अध्ययनों को सुविधाजनक बनाया, जहां हमने प्रतिलेखन कारकों के Myc नेटवर्क और प्रतिलेखन सह-कारक एचपीके-1 दोनों के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका की पहचान की, प्रोटेस्टोस्टेसिस31, 44. प्रतिकृति निर्धारित विधि का विस्तृत विवरण23में पाया जा सकता है ।

शर्तों में पॉलीक्यू फोसी के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए यहां वर्णित तरीके प्रत्येक बार बिंदु के भीतर स्थितियों की तुलना करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं, हालांकि ऐसे मामले हो सकते हैं जहां समय भर की प्रवृत्ति एक बिंदु पर तुलना से अधिक रुचि है। यदि समय के साथ व्यक्तिगत जानवरों को ट्रैक करना संभव है, जैसे कि यदि जानवरों को बहु-अच्छी प्लेटों या माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के कुओं में अकेले हैं, तो अपेक्षाकृत सरल बार-बार उपाय ANOVA उचित होगा। हालांकि, अक्सर जानवरों को पेट्री प्लेटों पर थोक में रखा जाता है, जिससे इस तरह के व्यक्तिगत ट्रैकिंग अव्यवहार्य होते हैं, और इस प्रकार विभिन्न तरीकों की आवश्यकता होती है। पॉलीक्यू कुल गणना डेटा को समय बिंदुओं के बीच स्वचालित होने की उम्मीद है (उदाहरण के लिए, फोसी काउंट केवल बढ़ाना चाहिए, किसी दिए गए स्थिति के लिए अवलोकन करना समय बिंदुओं के बीच स्वतंत्र नहीं है), एक सांख्यिकीय विश्लेषण दृष्टिकोण की आवश्यकता है जो उचित रूप से सहसंबद्ध त्रुटि को संभाल सकता है, जैसे ARIMA।

फोसी गठन और आंदोलन दोष दोनों ही उम्र बढ़ने की अच्छी तरह से परिभाषित और मात्रात्मक आणविक पहचान हैं जो आनुवंशिक और/या कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण के लिए पथिक हैं । उदाहरण के लिए, Q35 व्यक्त सी एलिगेंस का उपयोग करके एक फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन:: मांसपेशियों की कोशिकाओं के भीतर वाईएफपी ने यूएनसी-30के नुकसान के बाद बढ़ी हुई एकत्रीकरण की पहचान की, एक न्यूरॉन-विशिष्ट प्रतिलेखन कारक जो निरोधात्मक न्यूरोट्रांसमीटर गमा-अमीनोबुटिरिक एसिड (गाबा)32के संश्लेषण को नियंत्रित करता है। सी एलिगेंस में फीडिंग-आधारित आरएनएआई के विकास ने प्रोटेओस्टेसिस में जीन खोज की अवधि का भी नेतृत्व किया: क्यू 35 को व्यक्त करने वाले सी एलिगेंस की जीनोम-वाइड आरएनएआई स्क्रीन: वाईएफपी ने लगभग 340 आनुवंशिक संशोधकों की पहचान की जो या तो प्रोटेओस्टेटिक नेटवर्क को बढ़ाते हैं या रोकते हैं और इस प्रकार पॉलीक्यू एकत्रीकरण39,42में वृद्धि या कमी करते हैं।

जबकि सीधी कार्यात्मक जीनोमिक स्क्रीन ने एक कोर प्रोटेओस्टैटिक नेटवर्क का पता चला, ये उपभेद एक अमूल्य फेनोटाइपिक संसाधन बने हुए हैं। कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस में पॉलीग्लूटामाइन फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स की ऊतक-विशिष्ट अभिव्यक्ति एक आदर्श प्रणाली है जिसमें उपन्यास आनुवंशिक बातचीत45, 46की पहचान करने के लिए एन्हांसर, दमन या सिंथेटिक स्क्रीन के माध्यम सेस्थापितआनुवंशिक और कार्यात्मक जीनोमिक उपकरण लागू किए जा सकते हैं। सेलुलर प्रोटेओस्टेसिस, और असंख्य शारीरिक प्रणालियां जो समग्र प्रोटीन होमोस्टेसिस को संरक्षित करने या चुनौती देने के लिए काम करती हैं, एक जटिल सेल जैविक और एंडोक्राइन चित्र के रूप में उभर रही हैं। प्रोटेओस्टेसिस का प्रतिनिधित्व एक जैविक मार्ग, प्रोटीन कॉम्प्लेक्स या ऑर्गेनेल द्वारा नहीं किया जाता है। इसके बजाय, प्रोटेओस्टेसिस कई जटिल और परस्पर निर्भर जैविक रास्तों, मशीनों और प्रणालियों की सामूहिक कार्रवाई का उत्पाद है, और असंख्य पर्यावरणीय तनावों द्वारा चुनौती दी जाती है। पॉलीक्यू का उपयोग करने वाले भविष्य के अध्ययन:: वाईएफपी मॉडल इस जटिलता को जानने के लिए आवश्यक होगा कि कोशिकाएं प्रोटेम के उचित कार्य और तह को कैसे बनाए रखती हैं।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम सैमुअल्सन प्रयोगशाला के अतीत और वर्तमान सदस्यों को इस विधि के शोधन में उनकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं और/या चर्चा है कि इस पांडुलिपि के विकास में सहायता की । इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या आरएफ1एजी062593 और R21AG064519 के तहत स्वास्थ्य संस्थान की उम्र बढ़ने पर समर्थन दिया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करता है । फंडर्स की अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने या पांडुलिपि तैयार करने के निर्णय में कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 Well Culture Plates Greiner Bio-One #662102
2 mL 96-well plates Greiner Bio-One #780286
600 µL 96-well plates Greiner Bio-One #786261
96-pin plate replicator Nunc 250520
Air-permeable plate seal VWR 60941-086
bacteriological agar Affymetrix/USB 10906
bacto-peptone VWR 90000-368
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer Source Bioscience C. elegans RNAi Collection (Ahringer) See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal Source Bioscience C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) Alfa Aesar L16497
Glass microscope cover slips VWR 48404-455
Glass microscope slides VWR 160004-422
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) Gold Bio 12481C100
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm Thermo-Fisher 242811
Sodium Azide, CAS #26628-22-8 Sigma-Aldrich S2002
Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software Zeiss unknown
Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope Zeiss unknown

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जीव विज्ञान अंक 175 प्रोटेस्टोटासिस पॉलीग्लूटामाइन पॉलीक्यू:: वाईपीसी, सी एलिगेंस,एजिंग बायोमार्कर प्रोटीन होमोस्टेसिस जेनेटिक एनालिसिस फंक्शनल जीनोमिक्स
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Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., … More

Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (175), e61100, doi:10.3791/61100 (2021).

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