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Biology

Quantificando o declínio proteostático específico do tecido em elegans caenorhabditis

Published: September 7, 2021 doi: 10.3791/61100
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center

Summary

O declínio proteostático é uma marca do envelhecimento, facilitando o aparecimento de doenças neurodegenerativas. Delineamos um protocolo para medir quantificadamente a proteostase em dois tecidos elegans caenorhabditis diferentes através da expressão heteróloga de repetições de poliglutamina fundidas a um repórter fluorescente. Este modelo permite uma rápida análise genética in vivo da proteostase.

Abstract

A capacidade de manter a função adequada e o dobrável do proteome (proteína homeostase) diminui durante o envelhecimento normal, facilitando o aparecimento de um número crescente de doenças associadas à idade. Por exemplo, proteínas com expansões de poliglutamina são propensas à agregação, como exemplificado com a proteína de huntingtina e o aparecimento concomitante da doença de Huntington. A deterioração associada à idade do proteome tem sido amplamente estudada através do uso de caenorhabditis elegans transgênicos expressando repetições de polq fundidas a uma proteína fluorescente amarela (YFP). Este modelo animal transgênico poliQ::YFP facilita a quantificação direta do declínio associado à idade do proteome através da imagem da formação progressiva de focos fluorescentes (ou seja, agregados proteicos) e subsequente aparecimento de defeitos de locomoção que se desenvolvem como resultado do colapso do proteome. Além disso, a expressão do transgênico polyQ::YFP pode ser impulsionada por promotores específicos do tecido, permitindo a avaliação da proteostase entre tecidos no contexto de um organismo multicelular intacto. Este modelo é altamente receptivo à análise genética, proporcionando assim uma abordagem para quantificar o envelhecimento que é complementar aos ensaios de vida útil. Descrevemos como medir com precisão a formação de focos de polq::YFP dentro de neurônios ou músculos da parede corporal durante o envelhecimento, e o subsequente aparecimento de defeitos comportamentais. Em seguida, destacamos como essas abordagens podem ser adaptadas para maior rendimento e potenciais aplicações futuras usando outras estratégias emergentes para a análise genética de C. elegans.

Introduction

A homeostase proteica (proteostase) é definida como a capacidade celular de manter a função adequada e a dobra do proteome. O desafio inerente à proteostase é garantir que todas as proteínas sejam devidamente dobradas e mantidas em uma conformação nativa, que é ainda mais amplificada pela natureza variada do tamanho da proteína, composição de aminoácidos, conformação estrutural, estabilidade, rotatividade, expressão, compartimentação subcelular e modificações1. A proteostase é mantida através da ação coordenada de uma grande rede proteostática, composta por aproximadamente 2000 proteínas únicas, que regulam a síntese adequada, dobramento, tráfico e degradação dentro do proteome2,3. Os componentes do cavalo de trabalho da rede proteostática são nove grandes famílias de acompanhantes moleculares4. Cada tipo de tecido e célula utiliza preferencialmente subconjuntos específicos de acompanhantes moleculares, presumivelmente em alinhamento com as diferentes demandas de proteomes distintos5.

Uma marca registrada do envelhecimento organismo normal é o declínio progressivo e o colapso da proteostase celular, que é considerada uma base subjacente para o início e progressão de um número crescente de doenças associadas à idade. Por exemplo, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, e a Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) compartilham uma característica comum: em cada caso, a manifestação da neurodegeneração é impulsionada por alterações genéticas que predispõem uma proteína mutante à agregação (amilóide-β/Tau, α-sinucleína, HTT, FUS/TBD-43/SOD-1,respectivamente) 6,7,8, 8,9,10 . Durante o envelhecimento, a integridade e induibilidade da rede proteostática diminui, o que resulta no acúmulo de agregados proteotóxicos que resultam em disfunção celular e neurodegeneração. Note-se que as doenças conformais proteicas não são exclusivas dos neurônios, e ocorrem em múltiplos tecidos, como destacado pelo diabetes tipo II, mieloma múltiplo e fibrose cística11,12,13,14. Portanto, a elucidação de mecanismos capazes de preservar a proteostase facilitará o desenvolvimento de intervenções direcionadas para o tratamento da doença e promoverá o envelhecimento saudável.

O pequeno nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) tem sido fundamental na descoberta de genes e caminhos elucidadores que alteram a proteostase. Muitos componentes da rede proteostática e as vias de transdução de sinal que regulam a proteostase são evolutivamente conservados. Além disso, C. elegans reduziu a complexidade e a redundância em relação aos sistemas de vertebrados, tornando-o mais agradável à análise genética e à descoberta genética. Outras vantagens de C. elegans que o levaram a ser amplamente utilizado como um sistema modelo para estudar proteostase incluem: genômica genética e funcional poderosa, um ciclo de vida curto (3 dias) e vida útil (3 semanas), um genoma compacto e bem anotado, a disponibilidade de uma ampla variedade de mutantes genéticos, e a facilidade de visualizar mudanças específicas de tecido na biologia celular usando repórteres fluorescentes.

A decadência progressiva da proteostase durante o envelhecimento pode ser facilmente quantificada em C. elegans. O laboratório de Morimoto demonstrou pela primeira vez que uma expansão de poliglutamina fundida à proteína fluorescente amarela(polyQ::YFP) poderia ser usada para quantificar o declínio proteostático em C. elegans durante o envelhecimento15,16,17,18. As fusões de YFP a 35 repetições de glutamina ou mais resultam em uma formação associada à idade de focos fluorescentes, juntamente com sinais de patologia celular. Note-se que esta gama de expansão da glutamina reflete o comprimento do trato de poliglutamina da proteína Huntingtin na qual a patologia da Doença de Huntington começa a ser observada em humanos (tipicamente >35 CAG repete)19. Cepas com expressão de polq::YFP dentro de células musculares, intestinais ou neuronais têm sido utilizadas para confirmar que o declínio associado à idade da proteostase ocorre em diferentes tipos de células e tecidos. PoliQ específico para músculos::YFP expressão (i.e., unc-54p::Q35::YFP) tem sido o repórter mais amplamente utilizado como tecido específico, pois os focos fluorescentes acumulados são fáceis de quantificar nos primeiros dias da vida adulta usando um simples microscópio de dissecação fluorescente(Figura 1A-1B). Além disso, os animais ficam paralisados durante a meia-idade, pois o proteome dentro do músculo entra em colapso devido ao efeito proteotóxico do repórter(Figura 1C). Da mesma forma, o declínio associado à idade na proteostase neuronal pode ser seguido(rgef-1p::Q40::YFP) quantificando diretamente a formação de focos/agregados e declínios associados à idade em curvas corporais coordenadas após a colocação de animais em líquido(Figura 2).

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado sobre como medir a progressão dependente da idade do acúmulo agregado de proteínas e a proteotoxicidade associada induzida pela expressão de poliglutamina repetida dentro do tecido neuronal e muscular em C. elegans. Fornecemos exemplos de resultados típicos gerados usando essas cepas e métodos. Além disso, mostramos como utilizamos esses métodos para estudar a regulação transcricional da rede proteostática. Discutimos maneiras adicionais de esses repórteres serem facilmente integrados com outros reagentes existentes ou adaptados para telas maiores.

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Protocol

1. Preparação de reagentes

  1. Selecione genes de interesse para serem inativados através de RNAi baseados em alimentação. Comprar ações da HT115 E. coli contendo o clone RNAi de interesse20. Alternativamente, subclone o cDNA do gene de interesse no local multicloning do plasmídeo L4440.
    NOTA: Para evitar a degradação do dsRNA dentro da bactéria, use a cepa HT115. Esta é uma cepa E. coli deficiente RNase III com atividade de polimerase T7 indutível pelo IPTG. Para estudos de proteostase que não utilizam RNAi à base de alimentação, podem ser utilizados HT115 ou OP50 E. coli em placas padrão de GNM.
  2. Prepare placas de 5 x 6 cm por condição de teste. Para experimentos usando RNAi, induza a produção de dsRNA em HT115 E. colitransformado . Para estudos sem RNAi, op50 E. coli em placas padrão de GNM podem ser usados (Consulte Arquivo Suplementar 1 para receitas padrão de placas NGM e RNAi).
    NOTA: As placas RNAi podem ser armazenadas a 4 °C por vários meses antes de semear com bactérias.
  3. Cultivar culturas de E. coli durante a noite (16-20 h) a 37 °C em uma incubadora de agitação a 220 rpm. Cresça HT115 E. coli em Luria Broth (LB) com ampicilina (50 μg/mL).
    NOTA: O padrão OP50 E. coli não é resistente a antibióticos, mas variantes resistentes à estreptomicina também estão disponíveis.
    1. Concentre as bactérias por centrifugação a 2.400 x g por 15-20 min em uma centrífuga de bancada, aspire o supernasciante e suspenda a pelota em 1/10 do volume inicial (ou seja, concentração de 10x) de LB com ampicilina para HT115, ou LB sem ampicilina para op50 padrão.
    2. Alíquota de 200 μL de bactérias concentradas de 10x em cada placa (3-4 réplicas por condição de teste, com 2 placas extras de backup, a serem usadas em caso de contaminação).
    3. Deixe as placas abertas secarem em um ambiente limpo, como um banco de fluxo laminar até que todo o líquido tenha sido absorvido ou permita que as placas cobertas sequem em um banco de laboratório durante a noite.
  4. Para placas RNAi semeadas secas em um capô, armazene placas secas dentro de uma caixa de vermes durante a noite (até 24 horas) em temperatura ambiente. Após 1 dia na RT, as placas podem ser armazenadas a 4 °C por até 2 semanas em um saco selado (para evitar que as placas sequem). Antes de usar, permita que as placas armazenadas a 4 °C retornem à temperatura ambiente dentro do saco zip-lock para evitar que a condensação introduza contaminações fúngicas no ar.
    1. Ao usar RNAi à base de alimentação, deixe bactérias HT115 semeadas em placas RNAi à temperatura ambiente por pelo menos 12 horas antes de adicionar C. elegans. As placas RNAi contêm IPTG, que induz a produção de dsRNA. Alternativamente, o IPTG pode ser adicionado às culturas líquidas ao final da etapa 1.3.1, 2 horas antes da semeadura.
    2. Evite o armazenamento a longo prazo de placas HT115 semeadas à temperatura ambiente (maior que alguns dias) para evitar a rachadura do ágar que fará com que os C. elegans se enterrem em ágar.

2. Sincronização de C. elegans

NOTA: Escolha se sincronizar C. elegans por tratamento alcalino hipoclorito de adultos gravid ou ovo leigo.

  1. Sincronizar animais por hipoclorito tratamento de animais adultos gravid para promover a liberação de embriões22.
    1. Para tratamento hipoclorito, lave hermafroditas 2 vezes com tampão M9, depois ressuspend em solução hipoclorito de 5 mL (3,25 mL de solução hipoclorito, 1 mL de tampão M9 e 0,75 mL de 5 M NaOH) para 5 min, agitando animais resususpados a cada minuto. Depois de 5 minutos, gire os animais e lave 3 vezes com tampão M9.
      NOTA: O tratamento de hipoclorito foi postulado para afetar a proteostase21.
    2. Após o tratamento de hipoclorito, permita que os embriões eclodam durante a noite em 3 mL de solução M9 com rotação a 20 °C.
    3. Calcule a densidade de animais L1 (ou, alternativamente, embriões) por μL, soltando 10 μL de solução L1 3x em uma placa de 6 cm e contando o número de animais L1 para calcular o número médio de animais L1 por μL. Os animais L1 se estabelecerão ao longo do tempo. Portanto, misture periodicamente soluções L1 para evitar a liquidação.
    4. Semente 50 animais L1 por placa, conte e regise o número semeado, e mova placas para uma incubadora de 20 °C. É importante saber o número real de animais em cada placa no início do ensaio.
      NOTA: Sincronizar animais L1 durante a noite em M9 é rotineiramente usado, pois minimiza a heterogeneidade do desenvolvimento depois de colocar animais em alimentos. No entanto, a sincronização ocorre por meio de prisão por desenvolvimento em resposta a sinais de fome, que para alguns estudos devem ser evitados (ver23 para discussão adicional). Como alternativa, animais aproximadamente sincronizados podem ser obtidos através de um ovo-lay, ver 2.2.
    5. Congele e armazene os restos de animais L1 em nitrogênio líquido ou um congelador de -80 °C. Dessa forma, uma amostra de cada cepa no momento da configuração experimental é preservada, criando um recurso valioso para estudos futuros e melhorando a reprodutibilidade.
      NOTA: Consulte o arquivo suplementar 1 para receitas de solução hipoclorito e M9.
  2. Para sincronizar os animais através de ovos, coloque 20 animais adultos jovens gravid (dia 1 da idade adulta) em cada prato por 4-6 horas, e permita que eles coloquem ovos até que haja aproximadamente 50 ovos por prato. Remova todos os adultos gravid e mova pratos com ovos para uma incubadora de 20 °C.
    NOTA: Os animais adultos gravid devem ser sincronizados no primeiro dia da vida adulta. Animais mais velhos podem colocar ovos que foram retidos no útero, causando a liberação de ovos que estão em um estágio de desenvolvimento mais avançado.

3. Produção de progênero

NOTA: Devem ser tomadas medidas para evitar a produção de descendentes ou para separar a população inicial sincronizada de sua descendência. A prevenção da produção de progêneres pode ser alcançada quimicamente com a adição de 5-Fluoro-2'-desoxyuridina (FUdR) às placas, que é descrita aqui. Alguns estudos relataram que o RF pode alterar a proteostase24,25. Abordagens alternativas para evitar a produção de descendentes são discutidas abaixo.

  1. Faça uma solução de estoque de 1000x de FUdR dissolvendo 1 g de FUdR em 10 mL de ultrapure H2O. Filtro esterilizar estoque FUdR com um filtro de 0,2 μm e uma seringa de 10 mL. Alíquota de 1 mL de estoque em um tubo estéril de 1,5 mL. Congele e armazene a -20 °C.
  2. Cresça animais a 20 °C até a etapa L4. Os animais N2 criados a partir de L1s sincronizados do tratamento de hipoclorito requerem aproximadamente 40 horas de crescimento a 20 °C para chegar a L4. As taxas de crescimento para outras cepas devem ser testadas empiricamente antes da experimentação. Para obter detalhes sobre como fazer o estágio C. elegans com precisão, consulte26.
    1. A cada placa de 6 cm com animais L4, adicione 100 μL de 80x FUdR. É fundamental adicionar FUdR na fase L4.
  3. Devolva as placas para uma caixa de vermes e coloque a caixa em um saco de zip-lock. Retorne à incubadora apropriada.

4. Medir o declínio da proteostase no tecido muscular usando animais que expressam poliglutamina

NOTA: Dois métodos podem ser usados para identificar o declínio da proteostase nas células musculares: a imagem da formação de agregados proteicos durante o envelhecimento (4.1) e a medição da proteotoxicidade que esses agregados causam com a idade através do início da paralisia (4.2).

  1. Formação agregada de poliglutamina de imagem no músculo durante o envelhecimento
    NOTA: A progressão dependente da idade da agregação de proteínas nas células musculares é imageada usando poliglutamina (polyQ) repete fundido a uma proteína fluorescente amarela (YFP). Este protocolo descreve o uso de cepa AM140 rmIs132[unc-54p:::Q35::YFP], mas outras cepas variantes de poliglutamina também podem ser usadas. O poliQ::YFP transgene é expresso no músculo usando o promotor específico do músculo unc-54. Os animais sincronizados unc-54p::p olyQ::YFP expressando animais são visualizados nos dias 1, 2, 3 e 4 da idade adulta. Para visualizar unc-54p::p olyQ::YFP agregados, use um microscópio composto equipado para fluorescência ou um microscópio de dissecação fluorescente. O AM140 está disponível no Centro de Genética da Caenorhabditis (CGC) em: https://cgc.umn.edu/strain/AM140.
    1. Nos dias de imagem (Dias 1, 2, 3 e 4 da idade adulta), escolha 20 animais e monte em uma configuração de slides de microscópio com uma almofada de 3% de agarose e uma queda de 5 μL de azida de sódio de 10 mM (diluída em tampão M9).
    2. Depois que todos os animais são imobilizados por azida de sódio (~ 5 minutos), imagine todos os corpos dos animais usando uma lente de ampliação de 10x(Figura 1A). Para a imagem, use um filtro FITC e a mesma exposição para cada animal. Descarte slides após a imagem.
      NOTA: Alternativamente, os focos YFP também podem ser quantificados diretamente nas placas, mas o movimento deve ser inibido aplicando um fluxo de dióxido de carbono na placa durante a pontuação. Este método alternativo é mais apropriado ao analisar um grande número de condições (consulte discussão para mais detalhes).
    3. Após a aquisição de imagens, conte o número de focos nos músculos da parede corporal de todo o animal. Os focos são sinais pontuados mais brilhantes que podem ser diferenciados do sinal solúvel de dimmer no fundo.
    4. Traçar a progressão do acúmulo de focos YFP dos dias 1, 2, 3 e 4. Plote um gráfico XY onde X representa dias de vida adulta e Y representa número de unc-54p::p olyQ::YFP foci(Figura 1B). O número de focos na condição experimental (por exemplo, a queda genética ou a superexpressão) é comparado com os animais de controle. Realizar análise estatística entre os grupos em cada ponto de tempo observado para cada ensaio.
      1. Ao comparar os focos, em apenas duas condições, realize um teste t amostral independente em cada ponto de tempo.
      2. Ao comparar os focos, com mais de duas condições, realize uma análise omnibus de uma só forma de ANOVA para cada ponto de tempo, incluindo os dados para todas as condições naquele momento. Se o omnibus ANOVA produzir um valor p significativo (ou seja, p < 0,005), realize uma análise pós-hoc com t-testes de amostra independentes para determinar as condições específicas entre as quais foi detectada uma diferença significativa nos focos (por exemplo, para os grupos A, B e C compareM A & B, A & C e B & C).
  2. Medir as taxas de paralisia animal como substituto da toxicidade da poliglutamina nas células musculares
    NOTA: O aumento dependente da idade dos agregados de polq no músculo causa o declínio da função muscular que impulsiona a locomoção. Este defeito na locomoção pode ser determinado medindo a taxa progressiva de paralisia em animais que expressam polq. Para o ensaio de paralisia, os animais sincronizados unc-54p::p olyQ::YFP expressando animais são pontuados nos dias 3, 5, 7 e 9 da idade adulta. Adicione pontos de tempo adicionais, conforme necessário para ampliar o alcance de pontuação, de forma que você possa avaliar o efeito da perturbação genética.
    1. Nos dias de pontuação (Dias 3, 5, 7 e 9 da idade adulta), veja as placas de 6 cm contendo 50 animais e registe o número de animais paralisados. Remova animais paralisados da placa. Se os animais rastejaram para fora do prato, ou morreram, eles devem ser censurados; registrar o evento para que possa ser contabilizado na análise.
      NOTA: Considera-se que um animal fica paralisado quando nenhum movimento é observado após expô-los a estímulos leves ou suaves de toque. A atividade de bombeamento faringeal é usada para determinar se animais não-que se movem estão vivos ou mortos.
    2. Ao final do experimento, calcule a taxa de paralisia de cada condição. Faça isso em cada momento dividindo a fração de animais paralisados pelo número total de animais observados para essa condição naquele momento. Se observar várias placas por condição por ponto de tempo (ou seja, replicar placas), calcule a razão separadamente para cada réplica.
    3. Plote a progressão da taxa de paralisia em um gráfico XY (dispersão). X representa dias de idade adulta e Y representa taxas de paralisia. A taxa de paralisia de animais unc-54p::p olyQ::YFP é comparada com animais de controle(Figura 1C). Realizar análise estatística entre os grupos; para múltiplos ensaios, tratar ensaios independentemente. Use a Regressão de Riscos Proporcionais de Cox e o teste de Wald. A maioria das ferramentas de análise de dados que suportam análise de sobrevivência também apoiam a modelagem de Cox.
      1. Transforme os dados: cada condição deve ter duas colunas, uma para o tempo e outra para "evento". A cada ponto observado, adicione uma linha com "0" para cada animal paralisado, e um "1" para cada animal censurado. O número total de linhas deve ser igual ao número de animais iniciantes na placa para essa condição.
      2. Execute a modelagem Cox Proporcional-Hazards, seguida do teste Wald, de acordo com as instruções para o seu software estatístico. Um modelo univariado será apropriado para designs típicos de experimentos. Para mais de duas condições, se um teste com todas as condições incluídas indicar um resultado significativo (ou seja, p < 0,005), podem ser realizados testes pares entre as condições para determinar as condições específicas de pares significativos.
        NOTA: O modelo Cox baseia-se em uma suposição de que as condições de teste modulam a probabilidade de um evento proporcionalmente ao longo do tempo. Isso significa, por exemplo, que o modelo Cox não seria apropriado para comparar uma condição em que a maioria dos animais está paralisada no primeiro dia a uma condição na qual a maioria dos animais está paralisada no dia 9. Extensões do modelo Cox, e outras abordagens para comparação de proporções paralisadas em cada ponto de tempo, estão disponíveis para os casos em que a suposição de riscos proporcionais não se mantém, ver27,28,29,30.

5. Medir o declínio da proteostase no tecido neuronal usando animais expressos de poliglutamina.

NOTA: Dois métodos complementares são usados para avaliar o declínio da proteostase nos neurônios (1) quantificando a formação de agregados proteicos (focos fluorescentes) durante o envelhecimento e (2) medindo o declínio associado à idade no proteome neuronal através de um ensaio baseado em movimento.

  1. Formação agregada de poliglutamina de imagem nos neurônios durante o envelhecimento
    NOTA: Semelhante ao ensaio já discutido no tecido muscular, a progressão dependente da idade da agregação de proteínas nos neurônios é imageada expressando uma proteína de fusão de polq::YFP impulsionada pelo promotor pan-neuronal específico do tecido da RGEF-1. Especificamente usamos AM101: rmIs110 [rgef-1p::Q40::YFP], uma fusão de quarenta glutaminas para YFP16. Para visualizar rgef-1p::p olyQ::YFP, use um microscópio composto equipado para fluorescência com uma lente de ampliação de 40x. AM101 está disponível no CGC em: https://cgc.umn.edu/strain/AM101.
    1. Nos dias de imagem (Dias 4, 6, 8 e 10 da idade adulta), escolha 20 animais e monte em um slide de microscópio contendo uma almofada de 3% de agarose com uma queda de 5 μL de azida de sódio de 10 mM (diluída em tampão M9).
    2. Depois que todos os animais são imobilizados por azida de sódio (~ 5 minutos), pegue imagens de pilha de z da cabeça dos animais usando uma lente de ampliação de 40x(Figura 2A). Descarte slides após a imagem.
    3. Após a aquisição de imagens, processe z-stacks para obter a projeção máxima e usar para quantificar o número de focos em neurônios localizados na área do anel nervoso. Os focos são sinais pontuados mais brilhantes que podem ser diferenciados do sinal solúvel de dimmer no fundo.
      NOTA: Selecionamos especificamente a área do anel nervoso para quantificar os agregados rgef-1p::p olyQ::YFP, uma vez que esta é a região onde a maioria dos neurônios convergem para fazer conexões sinápticas. No entanto, a fim de medir os níveis de formação agregada em neurônios motores, rgef-1p::p olyQ::YFP agregados localizados no fio nervoso dorsal ou ventral podem ser quantificados.
    4. Plote a progressão do acúmulo de focos YFP de D4, D6, D8 e D10. Faça isso em um gráfico XY onde X representa dias de vida adulta e Y representa número de rgef-1p::p olyQ::YFP foci(Figura 2B). O número de focos na condição experimental (por exemplo, a queda genética ou a superexpressão) é comparado com os animais de controle. A análise estatística da contagem de focos para neurônios é feita da mesma forma que para focos de poliQ muscular; ver as etapas 4.1.4 e as notas associadas.
  2. Medindo as curvas corporais como uma medida substituta da proteotoxicidade da poliglutamina nos neurônios.
    NOTA: O estresse proteotóxico induzido pelo acúmulo agregado progressivo do políq neuronal é determinado olhando para defeitos do neurônio motor através de um ensaio de espancamento. Quantifique o número de dobras corporais em um período de 30 segundos enquanto suspenso no tampão fisiológico M9(Arquivo Suplementar 1).
    1. No dia 2 da vida adulta, escolha 10 animais sincronizados da placa e coloque em uma gota de 10 μL de tampão M9 em um slide de microscópio. Repita esta etapa pelo menos quatro vezes para obter uma amostra de 40 ou mais animais.
    2. O vídeo registra o movimento dos 10 animais colocados no slide do microscópio com 10 μL de tampão M9 por um período de 30 s em um estereomicroscópio com uma câmera capaz de vídeo. Repita esta etapa 4 vezes para um número amostral total de 40. O zoom e a posição devem ser ajustados de forma que todos os animais estejam visíveis no quadro durante os 30 segundos completos.
    3. Uma vez que todos os vídeos com os animais a serem analisados são gravados, reprodumente o vídeo e marque as curvas do corpo de cada animal. Uma curva corporal é definida como quando a vulva do animal vai de um lado para o oposto e todo o caminho de volta para a posição inicial.
      NOTA: Nós encontramos animais do tipo selvagem normalmente têm 49 ± 0,79 curvas corporais em 30 segundos.
    4. Plote o número de curvas corporais para cada animal em um gráfico de coluna onde cada ponto representa o número de curvas corporais em 30 s (eixo Y) com as diferentes condições testadas no eixo X. O número de dobras corporais de animais unc-54p::p olyQ::YFP é comparado com animais de controle(Figura 2C). Realizar análise estatística entre os grupos independentemente para cada ensaio; se o ensaio for repetido em vários pontos de tempo, analise os dados independentemente para cada ponto de tempo.
      1. Ao considerar apenas duas condições, realize um teste t de amostra independente.
      2. Ao considerar mais de duas condições ao mesmo tempo, primeiro realize uma análise omnibus ANOVA unidirecional, incluindo os dados para todas as condições naquele momento de teste/ponto de tempo. Se o omnibus ANOVA produzir um valor p significativo (ou seja, p < 0,005), realize uma análise pós-hoc com testes t de amostra independentes para determinar as condições específicas entre as quais foi detectada uma diferença significativa na contagem de dobras corporais.

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Representative Results

Em C. elegans,o modelo de repetição de poliglutamina tem sido fundamental para a identificação de genes que regulam a rede proteostática. Por exemplo, mostramos anteriormente que a quinase proteica interativa de homeodomina (hpk-1),um cofator transcricional, influencia a proteostase durante o envelhecimento, regulando a expressão da autofagia e dos acompanhantes moleculares31. Descobrimos que a perda de hpk-1, seja por silenciamento RNAi ou em animais mutantes nulos hpk-1(pk1393), aumenta o número de agregados Q35::YFP que se acumulam durante o envelhecimento. Dia 2 animais de controle adulto exibem 18,0 ± 2,7 agregados, enquanto os animais de controle nulo hpk-1(pk1393) e hpk-1 RNAi tratado q35::YFP animais média 28 ± 5,3 e 26,0 ± 5,1 agregados, respectivamente (Figura 3A-D). Da mesma forma, no dia 8 da idade adulta, 77-78% dos animais hpk-1 (RNAi) e hpk-1(pk1393) foram paralisados enquanto 50% do controle Q35:: AnimaisYFP foram paralisados(Figura 3E). Além disso, o HPK-1 é suficiente para regular a formação de agregados proteicos, uma vez que a superexpressão onipresente do hpk-1 reduz o número de focos Q35::YFP no tecido muscular e protege animais envelhecidos do Q35:: Paralisia associada aoYFPdurante o envelhecimento(Figura 3E). Coletivamente, esses resultados demonstram que o HPK-1 regula a proteostase e destaca como o modelo de poliQ::YFP pode ser utilizado para análise genética reversa das alterações na proteostase durante o envelhecimento.

Figure 1
Figura 1: Expressão do polq::YFP dentro do músculo C. elegans resulta em acúmulo de focos progressivos e paralisia durante o envelhecimento. (A) C. elegans unc-54p::Q35::YFP expressão nos dias 1 e 4 da idade adulta (painel superior e inferior, respectivamente). As setas indicam focos representativos. (B) Quantificação de focos fluorescentes nos primeiros 4 dias da vida adulta. Os focos são resistentes ao FRAP15,32,33, consistente com um agregado proteico insolúvel. As barras de erro representam erro padrão da média (SEM) (C) unc-54p::Q35::YFP os animais ficam paralisados durante o envelhecimento. As barras de erro representam erro de proporção padrão. Os dados brutos para (B-C) são fornecidos na Tabela Suplementar 1. A barra de escala representa 100 μm em todos os painéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Expressão de polq::YFP dentro de neurônios de C. elegans resulta em acúmulo progressivo de focos e interrupção de curvas normais do corpo. (A, superior) imagem DIC do C. elegans anterior. A faringe é uma estrutura bi-lobed na cabeça do animal, que é cercada pelo anel nervoso, um aglomerado interconectado de 180 neurônios. Suportes vermelhos indicam região para pontuação de focos dentro dos neurônios da cabeça. (A, meio) rgefp-1::Q40::YFP fluorescência no dia 2 adulto. Observe que a expressão YFP é em grande parte difusa, com exceção de um agregado ocasional (seta). (A, inferior) rgefp-1::Q40::YFP fluorescência no dia 10 adulto. Focos/agregados são indicados (seta vermelha). (B) Quantificação de focos fluorescentes nos primeiros 10 dias da vida adulta. Os focos são resistentes ao FRAP15,32,33, consistente com um agregado proteico insolúvel. As barras de erro representam erro padrão da média (C) Frequência típica de dobras corporais de tipo selvagem e rgef-1p::Q40::YFP animais mantidos a 20°C alimentando-se de vetor vazio RNAi (L4440) nos dias 2 da idade adulta. O aumento da expansão da glutamina correlaciona-se com defeitos de movimento15. As barras de erro representam erro padrão da média. Os dados brutos para (B-C) são fornecidos na Tabela Suplementar 1. A barra de escala representa 20 μm em todos os painéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: HPK-1 promove proteostase. (A-C) a atividade hpk-1 afeta o acúmulo de focos Q35::YFP em células musculares. São mostradas imagens representativas de animais transgênicos Punc-54::p olyQ::YFP tratados com (A) controle RNAi ou (B) hpk-1 RNAi, e(C) animais transgênicos superexpressando hpk-1 (Psur-5::HPK-1::CFP). (D) Curso de tempo de acúmulo de focos de policq::YFP em conjunto com: tratamento com controle RNAi (círculos pretos), hpk-1 RNAi (círculos brancos), hpk-1(pk1393) (quadrados brancos) ou superexpressão hpk-1 (triângulos abertos). Os pontos de dados mostram a média ± desvio padrão (SD) de pelo menos 15 animais por réplica biológica; pelo menos 5 experimentos independentes foram realizados. (E) Curso de tempo de paralisia de Animais Punc-54::p olyQ:::YFP em conjunto com: tratamento com controle RNAi (círculos pretos), hpk-1 RNAi (círculos brancos), hpk-1 (pk1393) (quadrados brancos) ou superexpressão hpk-1 (triângulos abertos). Os dados plotados exibem os resultados para um único teste representativo. Este valor é reimpresso da referência31 com permissão através de uma licença Creative Commons Attribution (CC BY). A barra de escala representa 100 μm em todos os painéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela Suplementar 1: Dados brutos dos resultados. A tabela inclui focos, paralisia e dados de dobra corporal da Figura 2 e Figura 3. Clique aqui para baixar esta tabela.

Arquivo Suplementar 1: Reagentes comuns para o trabalho de rotina C. elegans. Os reagentes comuns incluem receitas para o preparo de vários tipos de pratos e tampões. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

O envelhecimento é caracterizado por um declínio gradual da proteostase. A proteostase é mantida por um sistema complexo, a rede proteostática, para o controle coordenado, dinâmico e responsivo do estresse do dobrável, degradação e tradução de proteínas. Por que a proteostase falha no curso do envelhecimento é mal compreendida, mas um epigenome em decomposição, a induibilidade em declínio das respostas ao estresse e a perda de conversa cruzada compensatória coincidem com esse colapso. Em C. elegans, a indução transcricional de múltiplas formas de resposta ao estresse diminui rapidamente dentro de poucas horas após o início da reprodução devido à formação de marcas de cromatina repressiva no estresse loci2,34,35. O colapso da proteostase é um problema clínico massivo, pois está por trás do desenvolvimento de doenças de dobra de proteínas. Assim, ter um método adequado à análise genética para quantificar a proteostase celular in vivo é essencial para obter uma visão mecanicista mais profunda sobre como os organismos mantêm a dobra adequada e a função do proteome.

C. elegans transgênicos com expressão específica do tecido de um repórter fluorescente de poliglutamina são um método eficaz e robusto para estudar o declínio dependente da idade da proteostase. Os dois benefícios mais proeminentes do modelo de poliglutamina são: (1) expressão específica do tecido combinada com genética poderosa e genômica funcional permite a descoberta e caracterização de reguladores de proteostase no contexto de um organismo multicelular intacto, e (2) a visualização da formação de focos permite quantificação direta do declínio proteostático associado à idade in vivo . Embora em muitos casos exista uma correlação entre o acúmulo agregado e o aumento da proteotoxicidade, em alguns casos, esses dois fenótipos estão negativamente correlacionados. Por exemplo, a diminuição da sinalização de insulina aumenta a vida útil e a resistência ao estresse: animais mutantes daf-2 (uma perda hipomórfica de função no receptor do fator de crescimento semelhante à insulina/insulina 1), mostram uma carga agregada aumentada enquanto melhoram a capacidade de proteostase pela regulação de um mecanismo protetor que impede a formação de espécies agregadas tóxicas33,36,37,38,39 . Assim, em alguns casos a formação agregada é protetora pelo sequestro de espécies de proteínas nocivas do resto do proteome. Uma vez que as leituras da proteotoxicidade celular podem ser avaliadas em conjunto com a formação agregada, pode-se testar correlações inversas para identificar interações genéticas envolvidas em mecanismos de sequestro protetor. Por fim, repórteres fluorescentes de poliglutamina podem ser combinados com um knockdown específico do tecido (por exemplo, classicamente através de tecido específico RNAi ou expressão de RNA), e mais recentemente através da degradação proteica específica do tecido, como o sistema Tir1-auxin40- ou com superexpressão específica do tecido de um gene de interesse usando repórteres específicos de tecido, ganhando assim uma visão sobre a regulação da proteostase dentro e em todas as células e tecidos.

Métodos para medir mudanças na proteostase durante o envelhecimento requerem animais cronologicamente combinados. Assim, é necessário prevenir a produção de filhotes ou separar animais iniciantes. No protocolo, descrevemos como usar o FUdR para evitar a produção de progêneres, mas alguns estudos relataram que o RF pode alterar a proteostase24,25. Alternativamente, podem ser utilizadas origens genéticas feminizadas (por exemplo, fer-15(b26);fem-1(hc17)41). Por fim, animais adultos podem ser movidos para placas RNAi frescas longe da prole. Isso simplifica as considerações de fundo em detrimento do throughput. A mudança periódica de animais para alimentos frescos tem as vantagens adicionais de renovar a exposição ao dsRNA e prevenir possíveis fomes.

Como os focos fluorescentes são quantificados através da observação visual, deve-se ser preciso e consistente na identificação de focos. C. elegans polyQ::YFP focos foram verificados experimentalmente como agregados de proteína in vivo através da recuperação de fluorescência após fotobleaching (FRAP)15,32,33. Abordagens bioquímicas adicionais podem ser usadas para avaliar a agregação de proteínas42. É importante notar que até o dia 3 adulto, os focos precoces se tornam maiores e começam a acumular o que aparecem como focos de satélite (análogos às luas ao redor de um planeta). É essencial decidir antes de começar se deve contar esses focos de satélite como agregados separados, ou ser mais conservador e considerar a área coletiva como um único agregado, e depois permanecer consistente ao marcar em todos os experimentos. Preferimos o último; amplia o alcance dinâmico durante o qual a formação de focos pode ser avaliada, mas mesmo com essas estimativas mais conservadoras, até o dia 4 – 5 há um efeito platô aparente. Na realidade, a proteostase continua a diminuir, mas os focos são tão numerosos que não é mais possível quantificar o número com precisão por olho. Para melhorar a reprodutibilidade entre ensaios biológicos, entre indivíduos e entre laboratórios, é fundamental definir o que está sendo pontuado como focos.

Embora detalhemos métodos para abordagens genéticas reversas simples para testar um conjunto limitado de condições para alterações na proteostase usando o repórter unc-54p::Q35::YFP, desenvolvemos métodos com maior rendimento onde mudanças na proteostase podem ser quantificadas para até 100 condições (por exemplo, clones RNAi) simultaneamente. Este método envolve o uso de conjuntos de réplicas, que temos usado extensivamente para quantificar mudanças na vida útil após perturbação genética. Resumidamente, amostras independentes derivadas de uma grande população isogênica são pontuadas em cada ponto de tempo, em vez de uma única amostra ao longo do tempo. Esta abordagem é facilmente adaptada para avaliar alterações proteotóxias associadas à idade, como paralisia (usando o poli-Q::YFP com o promotor muscular) ou dobras corporais (via promotor neuronal). A pontuação do conjunto de réplicas desta maneira implica adicionar líquido aos poços de uma placa multi-poço, o que estimula c. elegans a se mover. Uma abordagem análoga pode ser facilmente aplicada à formação de focos dentro das células musculares. Anteriormente, identificamos 159 genes necessários para uma vida útil normal (tipo selvagem) ou o aumento da vida útil de animais mutantes receptores de insulina/IGF1, e mudanças quantificadas na vida útil e na vida útil. Destas, 103 inativações genéticas resultam em um fenótipo progénico, com animais apresentando um ou mais sinais de envelhecimento precoce43. Em uma tela secundária usando o unc-54p::Q35::YFP reporter e uma abordagem de pontuação de conjunto de réplicas, foimos capazes de identificar aproximadamente 50 inativações genéticas progénicas que produziram formação acelerada de focos (resultados inéditos da A.V.S),o que posteriormente facilitou estudos mecanicísticos focados onde identificamos um papel crítico tanto para a rede Myc de fatores de transcrição quanto para o cofator transcricional HPK-1 na manutenção da proteostase31, 44. Uma descrição detalhada do método de conjunto de réplicas pode ser encontrada em23.

Os métodos descritos aqui para análise estatística de focos de poliQ em todas as condições se concentram na comparação de condições dentro de cada ponto de tempo, no entanto, pode haver casos em que a tendência ao longo do tempo é mais interessante do que uma comparação em um único ponto. Se for possível rastrear animais individuais ao longo do tempo, como se os animais forem localizados em poços de placas multi-poços ou dispositivos microfluidos, uma ANOVA de medidas repetidas relativamente simples seria apropriada. No entanto, na maioria das vezes os animais são mantidos a granel em placas de petri, tornando esse rastreamento individual inviável, e, portanto, diferentes métodos são necessários. Espera-se que os dados de contagem de agregados de poliq sejam autocorrelatados entre os pontos de tempo (por exemplo, a contagem de focos só deve aumentar, fazendo observações para uma determinada condição não independente entre os pontos de tempo), necessitando de uma abordagem de análise estatística que possa lidar adequadamente com erros correlacionados, como a ARIMA.

Tanto os defeitos de formação de focos quanto os defeitos de movimento são marcas moleculares bem definidas e quantificáveis do envelhecimento que são tratáveis à análise genômica genética e/ou funcional. Por exemplo, uma tela genética para a frente usando C. elegans expressando Q35::YFP dentro de células musculares identificou agregação aprimorada após perda de unc-30, um fator de transcrição específico do neurônio que regula a síntese do neurotransmissor inibidor gamma-aminobutyric acid (GABA)32. O desenvolvimento de RNAi baseado em alimentação em C. elegans também levou a um período de descoberta genética na proteostase: uma tela RNAi em todo o genoma de C. elegans expressando Q35::YFP identificou aproximadamente 340 modificadores genéticos que melhoram ou inibem a rede proteostática e, portanto, aumentam ou diminuem a agregação de polq39,42.

Embora telas genômicas funcionais simples revelasse uma rede proteostática central, essas cepas permanecem um recurso fenotípico inestimável. A expressão específica de tecido de repórteres fluorescentes de poliglutamina em Caenorhabditis elegans é um sistema ideal no qual ferramentas genômicas genéticas e funcionais estabelecidas podem ser aplicadas através de telas melhorador, supressora ou sintética para identificar novas interações genéticas45,46. A proteostase celular, e os inúmeros sistemas fisiológicos que operam tanto para preservar quanto para desafiar a homeostase da proteína global, está emergindo como um quadro biológico e endócrino celular complicado. A proteostase não é representada por uma única via biológica, complexo proteico ou organela. Em vez disso, a proteostase é o produto da ação em massa de múltiplas vias biológicas intrincadas e interdependentes, máquinas e sistemas, e é desafiada por uma miríade de estressores ambientais. Estudos futuros utilizando o modelo de polQ::YFP serão essenciais para desvendar a complexidade de como as células mantêm a função adequada e a dobra do proteome.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer aos membros passados e presentes do laboratório Samuelson por sua assistência no refinamento deste método e/ou discussão que auxiliou no desenvolvimento deste manuscrito. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Envelhecimento dos Institutos Nacionais de Saúde sob os Números de Premiação RF1AG062593 e R21AG064519. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 Well Culture Plates Greiner Bio-One #662102
2 mL 96-well plates Greiner Bio-One #780286
600 µL 96-well plates Greiner Bio-One #786261
96-pin plate replicator Nunc 250520
Air-permeable plate seal VWR 60941-086
bacteriological agar Affymetrix/USB 10906
bacto-peptone VWR 90000-368
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer Source Bioscience C. elegans RNAi Collection (Ahringer) See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal Source Bioscience C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) Alfa Aesar L16497
Glass microscope cover slips VWR 48404-455
Glass microscope slides VWR 160004-422
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) Gold Bio 12481C100
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm Thermo-Fisher 242811
Sodium Azide, CAS #26628-22-8 Sigma-Aldrich S2002
Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software Zeiss unknown
Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope Zeiss unknown

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Biologia Questão 175 proteostase poliglutamina polq::YPC C. elegans envelhecimento biomarcador homeostase proteica análise genética genômica funcional
Quantificando o declínio proteostático específico do tecido em <em>elegans caenorhabditis</em>
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