Summary
نقدم بروتوكولًا لعزل الخلايا الأندية والانهوائية التاجية من قلوب الفئران من خلال هضم الأنسجة بالتتابع في عازل للهضم وجمع الخلايا من دورات الطرد المركزي المتكررة وتنقية الخلايا باستخدام الميكروبات CD31 المضادة للفئران.
Abstract
وقد تبين أن الخلايا الانبهية الدابيدية (EECs) والخلايا الانهوائية التاجية (CECs) تختلف في الأصل والتنمية والعلامات والوظائف. وبالتالي، تلعب هاتان المجموعتان الخلويتان أدوارًا فريدة في أمراض القلب. الدراسات الحالية التي تنطوي على خلايا الانهويلية المعزولة التحقيق في مجموعات الخلايا التي تتكون من كل من EECs وCECs. يوضح هذا البروتوكول أسلوب عزل هذه الخلايا بشكل مستقل للتوصيف الخاص بالخلية. بعد جمع الجدار الحر البطيني الأيسر والأيمن، يتم تحرير الخلايا البطانة من السطح الخارجي والسطح الداخلي بشكل منفصل باستخدام محلول عازلة الهضم. احتفظ الهضم التسلسلي للسطح الخارجي وطبقة endocardial الداخلية بفصل مجموعتين من خلايا بطانة الأرض. ويجري التحقق من العزلة المنفصلة للبلدان الاقتصادية الخالصة والبلدان الاقتصادية لأوروبا من خلال تحديد علامات خاصة بكل مجموعة من السكان. استنادا إلى خلية واحدة نشرت سابقا RNA التنميط في قلب الماوس، وNpr3، Hapln1، والتعبير الجيني Cdh11 هي فريدة من نوعها لEECs؛ في حين Fabp4، Mgll، والتعبير الجيني Cd36 هي فريدة من نوعها لCECs. وكشفت بيانات qPCR عن تعبير مثري عن هذه العلامات المميزة في عيناتكل منها، مما يشير إلى عزل الجماعة الاقتصادية الأوروبية وCEC الناجح، فضلا ً عن الحفاظ على النمط الظاهري للخلية، مما يتيح إجراء المزيد من التحليل الوظيفي الخاص بالخلايا.
Introduction
توفر هذه المقالة بروتوكولًا مفصلًا (معدلًا من Gladka et al.1)للتشريح والعزل اللاحق للخلايا المنفثة المنفدية (EECs) والخلايا الانثيلية التاجية (CECs) من قلوب الفئران. ومن شأن القدرة على التحقيق في هذه الخلايا بشكل مستقل أن تمكن من استكشاف آليات خاصة بنوع الخلية تقوم عليها مجموعة متنوعة من أمراض القلب التي يمكن أن تكون بمثابة أهداف علاجية محتملة. ومع ذلك، لم يتم بعد نشر طريقة ناجحة لجمع مجموعات الخلايا هذه بشكل مستقل.
CECs تختلف عن EECs فيما يتعلق بأصلها، وعلامات، ووظائف أثناء نمو القلب والمرض11،2،,3،,4،,5،,6،,7. EECs تنبع من السطح البطني من mesoderm القلب3. أنها تنشأ من Flk1+ الخلايا السلف ردا على VEGF وHIF الإشارات وتشكيل الطبقة الأعمق من المناطق الثلاثة منفصلة من القلب النامية: الأذين، البطين، والوريد الجيوب الأنفية3،6. يشير تتبع النسب الوراثي إلى أن الخلايا الإندية المتعددة القدرات للورينوس الجيوب الأنفية تستمد خلايا وبوئية، تهاجر لتشكل الطبقة تحت الملحمية3. في وقت لاحق ، تميز الطبقة تحت الملحمة في الشرايين التاجية والأوردة ، بما في ذلك CECs ، والتي لا تزال عبر الجدار الحر البطيني الطرفي3،4. يتم تنظيم هذا المسار المنفدي إلى الإندوثيل من قبل VEGFC ، ELA / APJ ، وSOX17 يشيرإلى 3،4 ،66،8،9., يستمد التغاف البطيني أقل CECs من الحاجز التدخلي بواسطة آلية غير معروفة3. في وقت لاحق، يقترح التمايز المترجمة بين EECs و CECs بواسطة علامات محددة لهذه الخلايا اثنين من السكان، بما في ذلك Mgll، Fabp4، والتعبير Cd36 في CECs، أو Npr3، Cdh11، والتعبير Hapln1 في EECs3،,5،,10.
تلعب EECs و CECs أدوارًا مختلفة في وظيفة القلب. Endocardial إلى التحول mesenchymal، وتشكيل صمام، نضوج الغرفة، وتنظيم تدفق المسالك، وتطوير قناة atrioventricular هي مشروطة EECs6. بدلا من ذلك، CECs المساهمة في لهجة vasomotor والتهاب الشرايين التاجية11. هذه الفروق في وظيفة يؤدي إلى أدوار فردية في تطور المرض4,12. على سبيل المثال، تشير الأدلة إلى أن خلل EECs قد يؤدي إلى مرض الصمام الخلقي6،noncompaction عضلة القلب6،تأثير الحاجز الأذيني6،تليف يفيلي بطانة الرحم13،متلازمة القلب الأيسر hypoplastic13،نقص التنسج البطيني13،وتضخم القلب12. وبالمثل، وجدت الدراسات أن CECs غير طبيعية تسهم في مرض الشريان التاجي14 والتجلط11.
إن العزلة الناجحة للمراكز الاقتصادية لأوروبا والمراكز الاقتصادية لأوروبا ضرورية لتحقيق معرفة شاملة بهذين المجموعتين من الخلايا، والتي يمكن استخدامها في كل من البيئات البحثية والسريرية. ومن شأن تحديد عوامل النمو والتمايز لهذه الخلايا أن يوفر مرجعاً للتمايز بين الأنواع الفرعية الانبوثيلية من الخلايا الجذعية المستحثة المتعددة القدرات. وعلاوة على ذلك، فإن التحديد الكامل للتباينات في تطوير وتنظيم ووظيفة الشركات الاقتصادية والاجتماعية لأوروبا ووظيفتها أمر حيوي لفهم العوامل الجينومية والبيجينية المسؤولة عن العديد من أمراض القلب بطريقة خاصة بالخلية. توضح هذه المقالة الخطوات اللازمة للجمع الناجح للـ EECs و CECs بشكل مستقل، وتقدم أدلة على الفصل من خلال تقييم مستويات التعبير الجيني للعلامات الخاصة بنوع الخلية.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل الفريق الإداري المعني برعاية الحيوانات المختبرية (APLAC31608) في جامعة ستانفورد.
1- إعداد المخازن المؤقتة
- إعداد المخزن المؤقت الهضم باستخدام الكواشف المدرجة في الجدول 1.
- إعداد حل الأسهم DNase الأول: حل DNase I في المياه خالية من RNase لحل الأوراق المالية من 2000 وحدة / مل (1 ملغ / مل). Aliquot وتخزين حل الأسهم في -20 درجة مئوية.
- إعداد حل liberase: حل liberase مع المياه الخالية من RNase لحل الأوراق المالية من 5 ملغ / مل. قم بتدويره على بنك دوار عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
- إعداد عازلة الفرز عن طريق تخفيف 0.5 M حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) و 10٪ الزل في مصل البقري albumin (BSA) محلول الأوراق المالية مع 1x الفوسفات العازلة المالحة (PBS) لتركيز النهائي من 2 mM من EDTA و 0.5٪ من BSA.
2. جمع القلب
ملاحظة: تم استخدام ستة فئران سبراغ داولي تزن 50-100 غرام في هذا البروتوكول. ولم يلاحظ أي اختلاف بين الجنسين.
- القتل الرحيم للفأر مع CO2 ووضعه في موقف supine على منصة تشريح. دبوس الأطراف أسفل وتعقيم كل من البطن والصدر مع الإيثانول 70٪.
- فتح البطن مع مقص وإدراج إبرة 21 G في الجزء الخلفي من الوريد الوريد الخلفي الموجود وراء الأمعاء. سحب المكبس حقنة مرة أخرى، وسحب الدم من الوريد حتى الكبد يبدو أخف وزنا في اللون ولا يمكن سحب المزيد من الدم، مما يشير إلى إزالة الدم بما فيه الكفاية.
- باستخدام مقص، وفتح الصدر بعناية لتجنب إتلاف الرئة والقلب. ارفع قوس الشريان الأورطا/الأذين مع الملقط واقطع الشريان الأورطا والشريان الرئوي والأوردة الرئوية والوريد الفينا لتحرير القلب وإزالته.
- اغسل القلب بـ 50 مل من محلول الملح المتوازن 1x Hanks (HBSS) العازل 3x لإزالة الدم المفرط.
- تحت المجهر المجهري، قم بإزالة الجدار الحر البطيني الأيمن إلى أنبوب 5 مل يحتوي على متوسط النسر المعدل في دولبككو (DMEM)(الشكل 1A،B).
- وضع القلب على تملقه، والوجه الخلفي لتحديد الجانب الأيسر والأيمن.
- حدد موقع الشريان الرئوي، وهو أكثر الشرايين والأوردة والشرايين المتفرعة من أعلى القلب وتقطع الشريان الرئوي وصولاً إلى غرفة البطين الأيمن. على الوجه الرعنى للقلب، قطع على طول الحاجز حتى تصل إلى القمة. مواصلة القطع من قمة أعلى الجانب الخلفي من القلب على طول الحاجز حتى الشريان الرئوي ونقطة تقاطع غرفة البطين الأيمن(الشكل 1A).
- بدءا من الشريان الرئوي ونقطة تقاطع البطين الأيمن، وقطع كل من الجانب الأمامي والخلفي من القلب عمودي إلى تشريح السابقة وبعيدا عن الحاجز، حتى يتم تحرير الجدار الحر البطين يمنى من بقية القلب(الشكل 1B).
- تحت المجهر المجهري، قم بإزالة الجدار الحر البطيني الأيسر إلى أنبوب 5 مل يحتوي على DMEM(الشكل 1C،D).
- حدد موقع الشريان الأورطا، المتفرع من أعلى القلب خلف الشريان الرئوي، وكرر الطريقة الموضحة في الخطوة 2.5 لقطع الجدار الحر البطيني الأيسر.
3. الجماعة الاقتصادية الأوروبية الهضم
- وضع كل من اليمين واليسار أنسجة الجدار الحر البطيني في طبق ثقافة 60 سم مع السطح الداخلي الكذب شقة، التي تواجه إلى أسفل(الشكل 2).
ملاحظة: السطح الداخلي هو الوجه الداخلي للبطين على شكل مقعر قليلا كما هو مبين في الشكل 2A،C. - أضف 0.5-1 مل من عازل الهضم إلى الطبق ، ووضع طرف الماصة مباشرة تحت الأنسجة. استمر حتى يتم غمر السطح الداخلي فقط.
- احتضان الطبق في 5٪ CO2،37 درجة مئوية حاضنة لمدة 5 دقيقة.
- إضافة EC المتوسطة إلى طبق الثقافة لوقف الهضم.
ملاحظة: الحفاظ على كمية الهضم المخزن المؤقت إلى متوسط EC كنسبة 1:5. - استخدام ماصة 1 مل لتدفق السطح الداخلي للالبطينين مع المتوسطة EC ونقل الجريان السطحي إلى أنبوب جمع 50 مل من خلال مصفاة 40 ملم(الشكل 2E). احتفظ بالمجموعات على الجليد لتنقية المصب.
4. CEC الهضم
- قطع على طول السطح الخارجي للبطين الأيسر دون تلوث من الطبقة الداخلية(الشكل 2B،D)ووضع كل في أنبوب منفصل 5 مل تحتوي على 1 مل من المخزن المؤقت الهضم.
ملاحظة: يمكن تحديد البطين الأيسر على أنه البطين السميك، ويمكن تحديد السطح الخارجي كوجه خارجي للبطين المقعر قليلاً. - باستخدام مقص تشريح، مفروم الجدار البطيني إلى قطع صغيرة، 1 مم3.
- احتضان الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة.
- Pipette 4 مل من EC المتوسطة في أنبوب 5 مل لإنهاء الهضم.
- نقل الحل مع ماصة سيرولوجي 5 مل في أنبوب 50 مل من خلال مصفاة 40 ملم(الشكل 2E). احتفظ بالمجموعات على الجليد لتنقية المصب.
5. جمع الخلية
- طرد الأنابيب في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) ثم يستنشق supernatant.
- إذا ظهرت بيليه الأحمر، إعادة تعليق بيليه في 1-2 مل من 1x خلايا الدم الحمراء (RBC) العازلة التبل(الشكل 2F).
ملاحظة: إذا لم يكن هناك RBCs، انتقل إلى الخطوة 6. - احتضان الأنابيب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة.
- Pipette 10 مل من برنامج تلفزيوني في أنابيب 50 مل لوقف الانزل.
- طرد مركزي الأنابيب في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في RT، ومن ثم يستنشق supernatant.
6- فرز الجماعة الأوروبية
- أضف 90 ميكرولتر من عازل الفرز و10 ميكرولتر من الأجسام المضادة المضادة لـ CD31 PE إلى أنابيب 50 مل.
- دوامة الأنابيب ومن ثم احتضانها لمدة 10 دقيقة في ثلاجة 4 درجات مئوية.
- أضف 10 مل من عازل الفرز إلى الأنابيب، واخلط جيداً، ثم قم بالطرد المركزي عند 300 × غرام لمدة 10 دقيقة في RT.
- يُقرّر الفوقناتان وإعادة تعليق الكريات في 80 ميكرولتر من عازل الفرز و20 ميكرولتر من الميكروبات المضادة للـ PE.
- دوامة الأنابيب واحتضان في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- اغسل الخلايا بإضافة 10 مل من عازل الفرز إلى الأنابيب، واخلطجيداً، ثم طردها من بعد 300 × غرام لمدة 10 دقيقة في RT.
- يُقرّر الفوقناتان وإعادة تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من عازل الفرز.
- ضع عمودًا يحتوي على المجالات المغناطيسية الفائقة في فاصل مغناطيسي وشطف العمود بـ 3 مل من عازل الفرز.
- بعد العمود هي "توقف التدفق"، ماصة 500 μL من تعليق الخلية في الأعمدة ومن ثم غسل الأعمدة مع عازلة الفرز. كرر غسل 3x، مع كل 3 مل من الفرز المخزن المؤقت(الشكل 2G).
- قم بإزالة الأعمدة من الفاصل ووضعها فوق أنبوب مجموعة جديد بـ 15 مل.
- مع ماصة، إضافة 5 مل من متوسط EC إلى الأعمدة، ودفع الحل من خلال استخدام المكبس العمود.
- طرد مركزي أنابيب جمع في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في RT ومن ثم تستنشق supernatant.
- استخراج الحمض النووي الريبي من بيليه الخلية من عينات الجماعة الاقتصادية الأوروبية وCEC باستخدام عدة، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يمكن الحصول على ما لا يقل عن 500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي.
ملاحظة: بعد استخراج الحمض النووي الريبي، يمكن تخزين العينة عند -80 درجة مئوية. - عكس نسخ 500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي للحصول على cDNA باستخدام التمهيدي عشوائي ة ومجموعة، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- تنفيذ PCR الكمية للتحقق من صحة السكان endocardial وendothelial(الشكل 2H). يتم سرد تسلسلات التمهيدي في الجدول 2.
- أضف 5 ميكرولتر من EEC أو CEC cDNA (1 نانوغرام/ميكرولتر) إلى آبار لوحة 384 qPCR. إضافة الجماعة الاقتصادية الأوروبية أو CC cDNA في ما يكفي من الآبار بحيث يكون هناك ثلاثة آبار لكل عدد من التمهيديات.
- مزيج 6 μL من 2x qPCR SYBR العازلة الخضراء مع 0.5 ميكرولتر من كل التمهيدي 10 ميكرون، بما في ذلك كل التمهيديات إلى الأمام وعكس، وإضافتها إلى بئر واحد المقابلة لكل جين مرشح.
- ختم لوحة مع فيلم من البلاستيك والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 300 × ز في RT.
- ضع اللوحة في جهاز qPCR ثم ابدأ البرنامج في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقيقة ، تليها 95 درجة مئوية لمدة 15 ق ، ثم 55 درجة مئوية لمدة 60 ق. كرر الخطوتين اللاحقة لمدة 45 دورة.
Representative Results
ويرد وصف لعملية عزل الجماعة الاقتصادية الأوروبية ولجنة القضاء على جميع أشكال العزلة في الشكل 2. وتم تحديد العزلة الناجحة للبلدان الاقتصادية الخالصة والبلدان الاقتصادية لأوروبا من خلال تقييم وجود علامات الخلايا الانهويلية، وكذلك تلك الخلايا المتميزة للفئتين الفرعيتين. كما هو متوقع ، كشف qPCR أنه بالنسبة لα-actin، أعربت EECs عن مستويات أعلى من علامات endocardial Npr3، Hapln1 ، و Cdh11 مقارنة بـ CECs(الشكل 3A). وبالمثل، أعربت CECs مستويات أعلى من علامات الشريان التاجي Fabp4، Mgll، و Cd36 مقارنة EECs(الشكل 3B). بالإضافة إلى ذلك ، أعرب كل من EECs و CECs عن جين علامة عموم EC Cdh5، مع مستويات أعلى قليلا في CEC(الشكل 3C).
الشكل 1: رسم بياني لتشريح القلب. (أ)أول قطع المحرز لفصل الجدار الأيمن الحرة البطين من الحاجز. (ب)قطع الثاني المحرز لتحرير البطين الأيمن تماما. (C)أول قطع المحرز لفصل جدار خالية من البطين الأيسر من الحاجز. (D) قطع الثاني المحرز لتحرير البطين الأيسر تماما. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: رسم بياني لإعداد الهضم لـ CECs و EECs والترتيب التالي لفرز الخلايا. (أ)الجدران البطينية الحرة الأعمق و(B)الجدار الحرة البطينية الخارجية كانت(C)مغمورة في عازلة الهضم أو (D)هضمها في عازلة الهضم على التوالي. (E)جمع وترشيح حلول الخلايا تليها(F)خلايا الدم الحمراء (RBC) حل الخلايا و(G)المغناطيسي تنشيط فرز الخلايا (MACS) باستخدام الأجسام المضادة CD31. (ح)تمت معالجة اللجان المنقىة للتحقق من التعبير الجيني باستخدام qPCR. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: بيانات qPCR التي تتحقق من عزل لجان CECs وEECs. (أ)تم قياس مستويات التعبير الجيني لعلامات الجماعة الاقتصادية الأوروبية Npr3و Cdh11 وHapln1 في EECs و CECs بواسطة PCR في الوقت الحقيقي. (ب)تم قياس مستويات التعبير الجيني لعلامات CEC Mgllو Fabp4و Cd36 في EECs و CECs بواسطة PCR في الوقت الحقيقي. (C)تم قياس علامة عموم EC Cdh5 في EECs وCECs بواسطة PCR في الوقت الحقيقي. (ن = 3 في كل مجموعة). تمثل القضبان متوسط ± SEM. * p & 0.05 ، ** p < 0.01 مقابل EEC ، اختبار t غير مقترن. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الجدول 1 - ما إذا كانت هناك الهضم المخزن المؤقت (1.5ml) | |||
| الأسهم كون. | (كون) النهائي | حجم | |
| ليمحو TM | 5 ملغ/مل | 0.5 ملغ/مل | 150 ul |
| الحمض النووي الأول | 1 ملغ/مل | 20 ميكروغرام/مل | 30 ul |
| HEPES | 1 متر | 10 mM | 15 ul |
| DMEM | - | - | 1305 ul |
الجدول 1: وصفة للعازلة الهضم.
| الجدول 2 - ما إذا كانت هناك تسلسل التمهيدي | ||
| اسم الجينات | الي الامام | عكس |
| Npr3 | TCCTTGCAAATATGTGGCCTA | GGAATCTTCCCGCAGCTCTC |
| Cdh11 | GTGAATGGGACTGACTACTGG | GTAATTTCTGGGC |
| هابلن1 | CCAGCTAAGTGGGACTCGAAG | GGGCCATTTCAGCTTGGG |
| Mgll | CCCGGGGCCCAAAGAC | GAAGATGAGGGCCTGGGTG |
| Fabp4 | AGAAGGGGTTGGCTTCG | ACTCTCTGACCGGATGACGA |
| Cd36 | GCAAAaCGACTGCAGGTCAA | CCCGGTCACTTGGTTCTGA |
| Cdh5 | CCATTGAGACAGACCCCGAC | TGTGGAACGTGTACTGCTGG |
| B-أكتين | TCTGTGTGGGGGGGGGCTC | CGGACTCATCGTACTCCTGC |
الجدول 2: تسلسل اتّصال البراير
Discussion
وتختلف مراكز CECs وEECs من حيث المنشأ والعلامات والوظائف، وبالتالي يمكن أن تلعب أدوارًا فريدة في التنمية والمرض. وتقتصر البروتوكولات القائمة لعزل الخلايا الانهوفية على الأنسجة الوعائية الكلية، مما يهمل جمع اللجان الاقتصادية لأوروبا، مما يحد من دراسة الوظائف الخاصة باللجنة الاقتصادية لأوروبا والجماعة الاقتصادية الأوروبية. ومن الضروري عزل ودراسة هاتين المجموعتين بشكل مستقل، لأن هذه المعرفة ستوفر مرجعاً للتمايز بين مراكز الرعاية الصحية المتكاملة في مراكز التقييم والمراكز الاقتصادية لأوروبا لأغراض الدراسات المستقبلية، وتيسر فحص هذه الخلايا للحصول على أهداف علاجية محتملة لمختلف أمراض القلب. يحدد هذا البروتوكول الجديد طريقة لعزل EECs عن السطح الداخلي وCECs عن السطح الخارجي للجدار الحر البطيني للفئران البالغة.
ومن الأهمية بمكان التحكم في توقيت كل خطوة بدقة شديدة في هذا البروتوكول. لأن عدد EECs محدود جدا في أنسجة قلب الفئران، قللنا من وقت الهضم للطبقة الداخلية للقلب لمنع الضرر الخلوي والأهم من ذلك، التلوث CEC. إضافة فورية من الحل المتوسط EC لإنهاء رد الفعل الأنزيمي هو أيضا مهم جدا للحفاظ على صلاحية الخلية عالية. تشير الكريات الحمراء التالية للخلايا إلى وجود عدد كبير من RBCs. اعتماداً على كمية التلوث RBC، يمكن إضافة 1-2 مل من المخزن المؤقت تحلل RBC لتدهور RBCs. يجب توقيت الحضانة بعناية لتجنب تلف كبير للخلايا، ويتم إضافة PBS على الفور لإنهاء رد الفعل. باستخدام البروتوكول الحالي، تمكنا من عزل 105 EECs من ستة قلوب الفئران. ويمكن أن تكون هذه الخلايا المصنفة على طبق ثقافة الخلية لمزيد من التوسع والتوصيف.
عند إعداد الأنسجة لجمع الجدار مجانا، تم غسل القلب مع HBSS لإزالة غالبية RBCs المتبقية. HBSS هو المتوسطة الموصى بها بسبب مظهره واضح، والتي تمكن من تصور خلايا الدم، على النقيض من DMED التي تحتوي على أحمر الفينول. تكوين المخزن المؤقت الهضم يضمن تحرير كاف من الخلايا الانهوثيلية، حيث إنزيم الهضم liberase يجرد أنسجة الخلايا المكشوفة، DNase الأول يزيل الحمض النووي من الخلايا الميتة لتعزيز انفصال الخلايا التي قد تمنعها نوعية لاصقة الحمض النووي، العازلة HEPES يوازن درجة الحموضة، وDMEM هو متوسط القاعدية المعدلة مع تركيز أعلى من الأحماض الأمينية والفيتامينات لتحسين صيانة الخلايا ويحتوي على الكالسيوم اللازمة لتنشيط
وفقا لتسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة (scRNA-seq) التي تم الحصول عليها من كل من الإنسان15 والماوس القلب10، تم الإبلاغ عن عدة علامات تعزى إلى مجموعات محددة من الجماعة الأوروبية. اخترنا بعض الجينات الأكثر ثراء لفحص نقاء EECs معزولة (أي Npr3، Cdh11، وHapln1)وEECs (أي Mgll، Fabp4، و Cd36). بالنسبة إلى α-Actinو Npr3و Cdh11وعلامات Hapln1 أظهرت زيادة التعبير في EECs مقارنة بـ CECs. وبالمثل، كان التعبير عن علامات Mgllو Fabp4و Cd36 أكبر في مراكز CECs مقارنة بالشركات الاقتصادية والاجتماعية. وتتفق العلامات المعبر عنها بشكل فريد لكل عينة مع علامات مميزة للبلدان الاقتصادية الخالصة والبلدان الاقتصادية لأوروبا على التوالي، مما يشير إلى العزلة الناجحة.
ومع ذلك ، فإن البروتوكول الحالي لا يستبعد التلوث المتبادل بين مجموعتين من الجماعة الأوروبية أثناء العزلة ، حتى مع عمليات الهضم التسلسلية التي يتم التحكم فيها بعناية. لذلك ، يمكن تطبيق بعض علامات سطح الخلية لمزيد من التنقية. على سبيل المثال، NPR3 عموما تسميات الديدوكارديوم10، في حين يمكن تتبع APJ غالبية CECs16. نظرًا لأنه يتم التعبير عن هاتين العلامتين على سطح الخلية ، يمكن استخدامهما لفرز الخلايا المنشطة (FACS) ، والأجسام المضادة المستخدمة لزيادة تنقية مجموعات EC المتميزة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للبشري15 والماوس10 القلب scRNA - seq تأكيد إثراء Npr3 في EECs ، ويمكن استخدام Cd36 المحتمل لتنقية CEC.
وفي الختام، يحدد البروتوكول المقدم العزلة المستقلة لللجان الاقتصادية والاجتماعية لأوروبا والبلدان الاقتصادية لأوروبا عن قلب الجرذان. يمكن استخدام التحديد الشامل للخصائص الخلوية ، الذي تم تمكينه عن طريق عزل الخلايا ، لتطبيقات المصب الهامة.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يقدر المؤلفان كثيراً الدكتورة لينغلي وانغ لمساعدتها في البروتوكول الحيواني، وقسم طب الأطفال في جامعة ستانفورد لدعم البنية التحتية. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة / NHLBI K99 HL135258 (إلى M.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | 1M |
| 15ml Tubes | Eppendorf | 0030122151 | |
| 50ml Tubes | Nunc | 339652 | |
| 5ml Tubes | Eppendorf | 30119401 | |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Anti-CD31 PE | Miltenyi Biotec | 130-115-505 | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | 10% |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 1855485 | For qPCR |
| DNAse I | Worthington | LK 003172 | 1 mg/mL in water |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 10313021 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | EC Medium |
| Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) X1 | Gibco | 14025092 | |
| Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white | Bio-rad | HSP3805 | For qPCR |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| Liberase TM | Sigma Aldrich | 5401119001 | 5 mg/mL |
| MACS LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | For EC isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | For EC isolation |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-rad | MSB1001 | For qPCR |
| Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | For heart harvest |
| Nylon Sterile Strainer | Falcon | 352340 | 40 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) X1 | Gibco | 1001023 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | For qPCR |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1050 | For RNA extraction |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips | F.S.T | 00632-11 | For heart harvest |
| Strabismus Scissors - Tungsten Carbide | F.S.T | 14574-11 | For heart harvest |
| Vannas Spring Scissors - Microserrated | F.S.T | 15007-08 | For heart harvest |
References
- Gladka, M. M., et al. Single-Cell Sequencing of the Healthy and Diseased Heart Reveals Cytoskeleton-Associated Protein 4 as a New Modulator of Fibroblasts Activation. Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).
- Koren, C. W., Sveinbjornsson, B., Smedsrod, B. Isolation and culture of endocardial endothelial cells from Atlantic salmon (Salmo salar) and Atlantic cod (Gadus morhua). Cell and Tissue Research. 290 (1), 89-99 (1997).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases. Nature Reviews in Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).
- Zhang, H., Lui, K. O., Zhou, B. Endocardial Cell Plasticity in Cardiac Development, Diseases and Regeneration. Circulation Research. 122 (5), 774-789 (2018).
- Yu, S. Y., et al. Isolation and characterization of human coronary artery-derived endothelial cells in vivo from patients undergoing percutaneous coronary interventions. Journal of Vascular Research. 46 (5), 487-494 (2009).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Kamimura, T., Yamagishi, T., Nakajima, Y. Avian coronary endothelium is a mosaic of sinus venosus- and ventricle-derived endothelial cells in a region-specific manner. Development, Growth and Differentiation. 60 (2), 97-111 (2018).
- Zhang, H., et al. Endocardium Minimally Contributes to Coronary Endothelium in the Embryonic Ventricular Free Walls. Circulation Research. 118 (12), 1880-1893 (2016).
- Kinlay, S., Libby, P., Ganz, P. Endothelial function and coronary artery disease. Current Opinion in Lipidology. 12 (4), 383-389 (2001).
- Jacques, D., Bkaily, G. Endocardial endothelial cell hypertrophy takes place during the development of hereditary cardiomyopathy. Molecular and Cell Biochemistry. 453 (1-2), 157-161 (2019).
- Grossfeld, P., Nie, S., Lin, L., Wang, L., Anderson, R. H. Hypoplastic Left Heart Syndrome: A New Paradigm for an Old Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 6 (1), (2019).
- Li, Y., et al. Down-regulated RGS5 by genetic variants impairs endothelial cell function and contributes to coronary artery disease. Cardiovascular Research. , (2019).
- Miao, Y., et al. Single-Cell RNA-Seq Reveals Endocardial Defect in Hypoplastic Left Heart Syndrome. bioRxiv. , (2019).
- Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).
