Доксорубицин-индуцированная мышиная модель дилатационной кардиомиопатии In Vivo

Summary

Описан протокол для установления модели доксорубицин-индуцированной дилатационной кардиомиопатии (DCM) у мышей с помощью долгосрочной внутрибрюшинной инъекции доксорубицина.

Abstract

Дилатационная кардиомиопатия (DCM) относится к спектру гетерогенных расстройств миокарда, характеризующихся расширением желудочков и подавленной сердечной деятельностью при отсутствии гипертонии, клапанных, врожденных или ишемических заболеваний сердца, и которые могут быть связаны с инфекцией, аутоиммунными или метаболическими аномалиями или семейным наследством. Он может прогрессировать в застойную сердечную недостаточность с плохим прогнозом. Доксорубицин (Dox) широко используется в качестве химиотерапевтического препарата, но его использование ограничено, поскольку он вызывает DCM-подобные изменения миокарда. Его токсичность для миокарда объясняется окислительным стрессом, хроническим воспалением и апоптозом кардиомиоцитов. Модель DCM, использующая эти симптомы DCM, вызванные Dox, не была установлена.

Introduction

Одна из наиболее распространенных причин сердечной недостаточности, DCM характеризуется желудочковой дилатацией и снижением сердечной функции и является наиболее распространенной причиной трансплантации сердца во всем мире^1. Для дальнейшего изучения его патогенеза и поиска эффективных методов лечения особенно важен доступ к зрелым животным моделям. Целью описанных экспериментов является создание стабильной мышиной модели DCM, напоминающей человеческий DCM.

Из-за сложного патогенеза DCM существует множество различных методов для создания соответствующих животных моделей. Модели Спонтанного DCM² относительно стабильны, но они дороги и не так легко доступны. Генетически модифицированные модели животных³ не являются устоявшимися и требуют более экспериментального использования. Животные модели DCM, индуцированные вирусной инфекцией⁴ или аутоиммунными дефектами^5, легко получить, но они не являются полностью репрезентативными для DCM. Модели, связанные с токсичностью миокарда, включают модели DCM, индуцированные алкоголем, и животные модели DCM, индуцированные Dox.

Модель dox-индуцированной кардиомиопатии получена путем внутрибрюшинной инъекции Dox^6. Модель использует наиболее тяжелый хронический побочный эффект Dox: после воздействия Dox у пациентов развиваются симптомы DCM с поздним началом с клиническим единообразием^7. Вызванный доксом окислительный стресс⁸ и повреждение митохондрий^9,которые приводят к апоптозу кардиомиоцитов, являются симптомами патогенеза DCM. Существуют модели лечения острого и хронического Докса: одна высокая доза Докса (15 мг / кг) индуцирует краткосрочную модель кардиомиопатии^10,в то время как повторяющиеся инъекции низких доз Докса (шесть недель, 3 мг / кг) индуцируют долгосрочную модель кардиомиопатии^11. Основываясь на представленном исследовании, мыши дикого типа, вводимые внутрибрюшинно один раз в неделю в течение месяца в дозе 5 мг/кг, демонстрируют морфологию и гистологию сердца в соответствии с характеристиками DCM к концу лечения, обеспечивая идеальный способ создания модели DCM.

Protocol

Эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) больницы Nanjing Drum Tower.

1. Подготовка реагентов и животных

1. Растворите доксорубицина гидрохлорид (Pfizer, США) в стерилизованной воде. Вихрь для получения раствора Докса 1 мг/мл и держат при 4 °C.
2. Используйте мышей C57BL/6 (8–10 недель; вес 25–30 г). Для этого исследования мыши были приобретены в Центре исследований образцов животных Нанкинского университета и содержались в комнате для животных больницы Nanjing Drum Tower.
3. Клетки мыши без патогенов поддерживали в течение 12-часового цикла свет/темнота при постоянной температуре 23 °C. Все животные питались обычной диетой чау-чау и получали пищу и воду ad libitum.

2. Создание животной модели DCM

1. Рандомизируйте мышей в нормальную (n = 5) группу и Dox (n = 5) группу.
2. Вводите раствор Dox внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг, используя стерилизованный шприц 1 мл 1 раз в неделю для группы Dox. Обработайте контрольных мышей таким же образом тем же количеством физиологического раствора.
3. Измеряйте массу тела двух групп еженедельно. Соответственно, корректируют дозу инъекции исходя из массы тела еженедельно в общей сложности 4 недели, с кумулятивной дозой 20 мг/кг(рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Период времени в 4 недели был выбран, потому что эхокардиография через 4 недели показала значительную разницу в сердечной функции между двумя группами.

3. Эхокардиографическое исследование

1. В конце четвертой недели проводят эхокардиографическое исследование мышей.
2. Обезболивают мышей 2% изофлураном интраназально. Если мыши не реагируют на защемление кожи зубчатым пинцетом или стимуляцией пальцев ног и хвостов, продолжайте протокол.
3. Поместите мышь на платформу для обработки животных в лежачем положении. Для поддержания анестезии накройте нос и рот животного носовым конусом и доставьте 2% изофлурана.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для ИП-анестезии вводят 4% хлоралгидрата в дозе 0,2 мл/20 г.
4. Аккуратно удалите мех на груди с помощью электробритвы. Оценить сердечную функцию in vivo с помощью трансторакальной эхокардиографии.
5. Выполнение эхокардиограммы ЛЖ как на парастернальных длинноосевых, так и на короткоосевых видах с частотой кадров 233 Гц. Конечно-систолическое и конечное диастолическое измерения были определены как фазы, соответствующие волне ЭКГ Т и волне R соответственно.
6. На трассировках M-режима измерьте средний диаметр конечной систолии РН (LVIDd), диаметр конца диастолии РН (LVIDs), толщину межжелудочковой перегородки (IVS) и толщину задней стенки LV (LVPW) от 3 до 5 ударов сердца. Также рассчитайте фракцию выброса (EF) и укорочение фракции (FS) на основе эхокардиографии.

4. Гистологическое окрашивание

1. После эхокардиографического анализа жертвуют мышей внутрижелудочковой инъекцией 10% хлористого калия.
2. Перфузируйте сердце примерно 30 мл физиологического раствора после рассечения, пока печень и легкие не станут бледными.
3. Иссекните сердце и тщательно промыть его в фосфатном буферном растворе для выдавливания крови.
4. Зафиксируйте сердце в 4% формалине при комнатной температуре в течение 24 ч и обработайте ткань в парафиновой коробке так, чтобы парафиновый воск остыл и затвердел.
5. Нарежьте сердечки на срезы толщиной 5 мкм для патологического окрашивания.
6. Депарафин и регидратируют участки, содержащие сосочковые мышцы.
   1. Инкубировать горки при 55 °C в течение 30 мин. Затем инкубируют в ксилоле 2х в течение 2 мин каждый; 100% этанол 2х в течение 2 мин каждый; 95% этанол 2x в течение 2 мин каждый; 80% этанол в течение 2 мин; 75% этанол в течение 2 мин; и 50% этанол в течение 2 мин.
7. Окрашивание с использованием гематоксилина и эозина (H &E), а также пятна Массона.

Representative Results

Сердечная функция
Дилатационная кардиомиопатия характеризуется прогрессирующей желудочковой дилатацией и сократительной дисфункцией. На рисунке 2 показаны репрезентативные эхокардиографические изображения двух групп. Мыши, получавшие лечение Доксом, показали заметное снижение фракции выброса левого желудочка и фракционное укорочение левого желудочка(рисунок 3A,B). Диаметр РН также увеличивался как в диастолической, так и в систолической фазах(рисунок 3C,D). Это показало, что у мышей, получавших Докс, была нарушена сердечная функция.

Гистологическое окрашивание
Патологическое окрашивание проводили для наблюдения патологических изменений у мышей, получавших физиологический раствор, и мышей, получавших Докс. Волокна миокарда мышей в контрольной группе были аккуратно расположены, без инфильтрации лейкоцитов. В группе Dox миофобы миокарда были неупорядочены и сломаны, а кардиомиоциты были меньше и тоньше(рисунок 4A). Окрашивание Массона показало, что мыши, обработанные Доксом, имели больше интерстициального фиброза(рисунок 4B).

Рисунок 1: Принципиальная схема дилатационной кардиомиопатии, вызванной Dox. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Эхокардиография двух групп. (A)Контрольная группа; (B) Группа Докса. Слева — длинноосевая секция, а справа — короткоосевая секция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Переменные сердечной функции между группами. (A)EF; (B)ФС; (C)LVEDd; (D) LVEDs. *P < 0,05, T-тестстудента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Гистологическое окрашивание. (A)Окрашивание H&E; (B) Окрашивание Массона. Слева — контрольная группа, а справа — группа Dox. Верхняя стрелка показывает, что кардиомиоциты, обработанные Доксом, были меньше и тоньше, а миофибры были неупорядочены и сломаны. Нижняя стрелка обозначает наличие интерстициального фиброза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5

Discussion

Докс является неспецифическим периодическим противоопухолевым химиотерапевтическим препаратом, обычно используемым в клинической практике^12. Основным его побочным эффектом является кардиотоксичность, характеризующаяся кардиомиопатией и последующей сердечной недостаточностью^13. Основной механизм включает повреждение перекисного окисления липидов миокарда, ингибирование активности саркоплазматического ретикулума миокарда Ca²⁺-АТФазы и активацию местной ренин-ангиотензиновой системы миокарда, что приводит к увеличению продукции AT II и внутриклеточной перегрузке кальцием^14. Из-за летального эффекта большой дозы внутрибрюшинной инъекции Докса в этом протоколе использовался альтернативный способ установления надежной модели.

Модель DCM, установленная этим методом, очень похожа на патогенез DCM человека. В дополнение к сердечной недостаточности, наиболее распространенному осложнению Dox, асцит наблюдался у мышей DCM. Поэтому при разработке модели следует уделять внимание стерильной работе и своевременной замене шприцев. Кроме того, для дозы Dox сравнивались два способа введения: длительный курс лечения с использованием малой дозы и кратковременное лечение высокой дозой. Результаты показывают, что непрерывная инъекция Dox в 5 мг / кг в течение четырех недель может привести к точной модели DCM, снижению смертности мышей и более короткому времени для создания модели.

Таким образом, стабильная, надежная и экономичная мышиная модель DCM на животных может быть успешно установлена путем внутрибрюшинной инъекции Dox. Это исследование обеспечивает идеальную модель для изучения DCM. Это будет способствовать выявлению патогенеза дилатационной кардиомиопатии или хронической сердечной недостаточности и изучению новых лекарств или методов лечения для будущих клинических применений.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	servicebio	CAS30525-89-4
C57BL/6 mice	Model Animal Research Center of Nanjing University	\
Doxorubicin hydrochloride	Pfizer	CAS25316-40-9
echocardiography	Visualsonics	\
Hematoxylin and Eosin staining kit	Solarbio	G1120
Masson staining kit	Solarbio	G1343
phosphate buffer solution	Sigma	P5368
potassium chloride	Sigma	CAS7447-40-7
sterilized syringe	Millipore	SLGP033RB