Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

نموذج مورين الناجم عن Doxorubicin لاعتلال عضلة القلب المتوسع في فيفو

Published: May 16, 2020 doi: 10.3791/61158
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cardiology, Nanjing Drum Tower Hospital, Clinical College of Nanjing Medical University

ERRATUM NOTICE

Summary

وصف هو بروتوكول لإنشاء Doxorubicin الناجمة عن اعتلال عضلة القلب المتوسعة (DCM) نموذج في الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق على المدى الطويل من Doxorubicin.

Abstract

يشير اعتلال عضلة القلب المتوسع (DCM) إلى طيف من اضطرابات عضلة القلب غير المتجانسة التي تتميز بتمدد البطين والأداء القلبي الاكتئابي في غياب أمراض القلب ارتفاع ضغط الدم أو الصمامية أو الخلقية أو الإقفارية ، والتي قد تكون مرتبطة بالعدوى أو المناعة الذاتية أو تشوهات التمثيل الغذائي أو الميراث العائلي. يمكن أن تتقدم إلى فشل القلب الاحتقاني مع سوء التكهن. يستخدم الدوكسوروبيسين (Dox) على نطاق واسع كدواء كيميائي ، ولكن استخدامه محدود لأنه يسبب تغييرات تشبه DCM في عضلة القلب. وتعزى سميته عضلة القلب إلى الإجهاد التأكسدي, التهاب مزمن, و المبرمج القلبية. لم يتم تأسيس نموذج DCM استغلال هذه الأعراض DCM الناجمة عن Dox.

Introduction

واحدة من الأسباب الأكثر شيوعا لفشل القلب، يتميز DCM من قبل التمدد البطيني وانخفاض وظيفة القلب وهو السبب الأكثر شيوعا لزرع القلب في جميع أنحاء العالم1. من أجل مواصلة التحقيق في مسببات الأمراض والعثور على علاجات فعالة ، فإن الوصول إلى نماذج الحيوانات الناضجة مهم بشكل خاص. الغرض من التجارب الموصوفة هو إنشاء نموذج الماوس مستقرة من DCM التي تشبه DCM الإنسان.

بسبب الإمراض المعقدة من DCM ، هناك العديد من الطرق المختلفة لصنع نماذج حيوانية مناظرة. نماذج DCMعفوية 2 مستقرة نسبيا، لكنها مكلفة وغير متوفرة بسهولة. النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا3 ليست راسخة وتتطلب المزيد من الاستخدام التجريبي. نماذج الحيوانات DCM الناجمة عن العدوى الفيروسية4 أو عيوب المناعة الذاتية 5 من السهلالحصول عليها، لكنها ليست ممثلة تماما من DCM. وتشمل النماذج المرتبطة سمية عضلة القلب نماذج DCM الناجمة عن الكحول والنماذج الحيوانية DCM الناجمة عن Dox.

يتم الحصول على نموذج اعتلال عضلة القلب الناجم عن دوكس عن طريق الحقن داخل الصفاق من Dox6. النموذج يستغل الآثار الجانبية المزمنة الأكثر حدة من دوكس: بعد التعرض دوكس, المرضى تطوير أعراض DCM بداية متأخرة مع التوحيد السريري7. الإجهاد التأكسدي الناجم عن الدوكس8 وتلف الميتوكوندريا9، والتي تؤدي إلى موت الخلايا المبرمج القلبية ، هي أعراض في الإمراض من DCM. هناك نماذج علاج الدوكس الحادة والمزمنة: جرعة واحدة عالية من دوكس (15 ملغ / كغ) يحفز نموذج قصير الأجل لاعتلال عضلة القلب10، في حين أن حقن دوكس المتكررة منخفضة الجرعة (ستة أسبوعيا ، 3 ملغ / كجم) تحفز نموذجا طويل الأجل لاعتلال عضلة القلب11. استنادا إلى الدراسة المقدمة، الفئران البرية نوع حقن intraperitoneally مرة واحدة في الأسبوع لمدة شهر بجرعة 5 ملغ / كغ عرض مورفولوجيا وأنسجة القلب بما يتفق مع خصائص DCM بحلول نهاية العلاج، وتوفير وسيلة مثالية لإنشاء نموذج DCM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في مستشفى نانجينغ درام تاور.

1. إعداد الكواشف والحيوانات

  1. حل هيدروكلوريد الدوكسوروبيسين (فايزر، الولايات المتحدة الأمريكية) في الماء المعقم. دوامة للحصول على حل دوكس من 1 ملغم / مل والحفاظ على 4 درجة مئوية.
  2. استخدم فئران C57BL/6 (عمرها 8-10 أسابيع؛ وزن 25-30 جرام). لهذه الدراسة ، تم شراء الفئران من مركز أبحاث الحيوان النموذجي في جامعة نانجينغ والاحتفاظ بها في غرفة الحيوانات في مستشفى نانجينغ درام تاور.
  3. تم الحفاظ على أقفاص الفئران الخالية من مسببات الأمراض تحت دورة خفيفة / داكنة 12 ساعة عند درجة حرارة ثابتة 23 درجة مئوية. تم تغذية جميع الحيوانات على نظام غذائي طعام طبيعي وحصلت على الغذاء والماء الإعلانية libitum.

2. إنشاء نموذج DCM

  1. قم بتدشة الفئران في مجموعة عادية (n = 5) ومجموعة Dox (n = 5).
  2. إدارة محلول دوكس intraperitoneally بجرعة 5 ملغ / كغ باستخدام حقنة معقمة 1 مل 1x في الأسبوع لمجموعة دوكس. علاج الفئران التحكم بنفس الطريقة مع نفس الكمية من محلول ملحي.
  3. قياس وزن الجسم للمجموعتين أسبوعيا. وبناء على ذلك، ضبط جرعة الحقن على أساس وزن الجسم أسبوعيا لمدة 4 أسابيع، مع جرعة تراكمية من 20 ملغم/كغ(الشكل 1).
    ملاحظة: تم اختيار فترة زمنية مدتها 4 أسابيع لأن تخطيط صدى القلب في 4 أسابيع أظهر فرقا كبيرا في وظيفة القلب بين المجموعتين.

3. فحص صدى القلب

  1. في نهاية الأسبوع الرابع، إجراء فحص صدى القلب للفئران.
  2. تخدير الفئران مع 2٪ isoflurane داخل الفم. إذا لم تستجب الفئران لقرصة من الجلد بملاقط مسنن أو تحفيز أصابع وذيول ، فاستمر في البروتوكول.
  3. ضع الماوس على منصة مناولة الحيوانات في موضع السطانة. للحفاظ على التخدير، قم بتغطية أنف الحيوان وفمه بمخروط الأنف وتقديم 2٪ isoflurane.
    ملاحظة: للتخدير IP، حقن 4٪ هيدرات الكلورال بجرعة 0.2 مل/20 غرام.
  4. إزالة فرو الصدر بعناية مع ماكينة حلاقة كهربائية. تقييم وظيفة القلب في الجسم الحي باستخدام تخطيط صدى القلب عبر الصدر.
  5. إجراء مخطط صدى القلب LV في كل من طرق العرض شبه النجمية ذات المحور الطويل والمحور القصير بمعدل إطار يبلغ 233 هرتز.
  6. على تتبع الوضع M، قم بقياس متوسط قطر نهاية الانقباضي (LVIDd)، وقطر LV الانبساطي النهائي (LVIDs)، وسماكة الحاجز الفاصل (IVS)، وسماكة الجدار الخلفي LV (LVPW) من 3-5 دقات القلب. أيضا حساب كسر طرد (EF) وتقصير الكسور (FS) على أساس تخطيط صدى القلب.

4. تلطيخ الهسطة

  1. بعد التحليل صدى القلب، التضحية الفئران عن طريق الحقن داخل البطين من كلوريد البوتاسيوم 10٪.
  2. يشوش القلب بحوالي 30 مل من المالحة بعد تشريحه حتى يصبح الكبد والرئة شاحبين.
  3. استئصال القلب وغسله جيدا في محلول عازلة الفوسفات لقذف الدم.
  4. إصلاح القلب في 4٪ الفورماتين في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة وعلاج الأنسجة في مربع البارافين بحيث يبرد الشمع البارافين ويقوي.
  5. قطع القلوب إلى شرائح سميكة 5 ميكرومتر لتلطيخ المرضية.
  6. أقسام ديوااكس وإعادة الترطيب التي تحتوي على العضلات الحليمية.
    1. احتضان الشرائح في 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم، احتضان في xylene 2x لمدة 2 دقيقة لكل منهما. 100٪ الإيثانول 2x لمدة 2 دقيقة لكل منهما؛ 95٪ الإيثانول 2x لمدة 2 دقيقة لكل منهما؛ 80٪ الإيثانول لمدة 2 دقيقة. 75٪ إيثانول لمدة دقيقتين؛ و 50٪ إيثانول لمدة 2 دقيقة.
  7. وصمة عار باستخدام الهيماتوكسيلين واليوزين (H &؛ E) وكذلك وصمة عار ماسون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وظيفة القلب
يتميز اعتلال عضلة القلب المتوسع بالتمدد البطيني التدريجي وضعف الانتصاب. ويبين الشكل 2 صورا تمثيلية للكأصدى للكأس في المجموعتين. وأظهرت الفئران المعالجة بدوكس انخفاض ملحوظ في كسر طرد البطين الأيسر وتقصير الكسر البطيني الأيسر(الشكل 3A، B). زاد قطر LV أيضا في كل من المرحلتين الانبساطية والانقباضية (الشكل 3C، D). وكشف هذا أن الفئران المعالجة بدوكس كان لديها ضعف في وظيفة القلب.

تلطيخ النسيجية
تم إجراء تلطيخ مرضي لمراقبة التغيرات المرضية للفئران المعالجة بالملح والفئران المعالجة بدوكس. تم ترتيب ألياف عضلة القلب للفئران في مجموعة التحكم بدقة ، دون اختراق الكريات البيض. في مجموعة Dox ، كانت ألياف عضلة القلب مضطربة ومكسورة ، وكانت خلايا القلب أصغر وأرق(الشكل 4A). وأظهرت تلطيخ ماسون أن الفئران المعالجة بدوكس كان لديها المزيد من التليف الخلالي(الشكل 4B).

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لاعتلال عضلة القلب المتوسع الناجم عن Dox. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تخطيط صدى القلب للمجموعتين. (أ) مجموعة التحكم؛ (ب) مجموعة دوكس. اليسار هو مقطع المحور الطويل، واليمين هو مقطع المحور القصير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: متغيرات وظيفة القلب بين المجموعات. (أ)EF; (ب)FS; (ج) LVEDd; (د)LVEDs. * P < 0.05 ، الطالب تياختبار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تلطيخ الهسطة. (أ) تلطيخ H & E; (ب) تلطيخ ماسون. اليسار هو مجموعة التحكم والحق هو مجموعة Dox. يظهر السهم العلوي أن خلايا القلب المعالجة بدوكس كانت أصغر وأرق وكانت الألياف العضلية مضطربة ومكسورة. السهم السفلي يدل على وجود التليف الخلالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dox هو دواء العلاج الكيميائي الدوري غير المحدد المضاد للورم الذي يستخدم عادة في الممارسة السريرية12. الآثار الجانبية الرئيسية له هو السمية القلبية, تتميز اعتلال عضلة القلب وفشل القلباللاحقة 13. وتشمل الآلية الأساسية تلف تكيس الدهون عضلة القلب، وتثبيط عضلة القلب الساركوبلازمي reticulum Ca2+- ATPase النشاط، وتفعيل عضلة القلب المحلية رينين أنجيوتنسين النظام، مما أدى إلى زيادة إنتاج AT II والكالسيوم الزائد داخل الخلايا14. نظرا للتأثير القاتل لجرعة كبيرة من الحقن داخل الصفاق من دوكس ، تم استخدام طريقة بديلة لإنشاء نموذج موثوق به في هذا البروتوكول.

نموذج DCM التي أنشأتها هذه الطريقة هي مشابهة جدا لمسببات الأمراض من DCM الإنسان. بالإضافة إلى قصور القلب ، والمضاعفات الأكثر شيوعا من دوكس ، لوحظت استسقاء في الفئران DCM. ولذلك، ينبغي إيلاء الاهتمام أثناء تطوير النموذج إلى التشغيل العقيم واستبدال المحاقن في الوقت المناسب. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة لجرعة Dox ، تمت مقارنة طريقتين للإدارة: دورة طويلة من العلاج باستخدام جرعة صغيرة ، والعلاج قصير الأجل بجرعة عالية. تظهر النتائج أن الحقن المستمر للدوكس في 5 ملغ / كغ لمدة أربعة أسابيع يمكن أن يؤدي إلى نموذج دقيق ل DCM ، وانخفاض وفيات الفئران ، ووقت أقصر لإنشاء النموذج.

باختصار، يمكن تأسيس نموذج DCM مستقر وموثوق واقتصادي للفأرة بنجاح عن طريق الحقن داخل الصفاق من Dox. يوفر هذا البحث نموذجا مثاليا لدراسة DCM. وسوف تسهم في الكشف عن مسببات الأمراض من اعتلال عضلة القلب المتوسعة أو فشل القلب المزمن واستكشاف أدوية جديدة أو علاجات للتطبيقات السريرية في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل مؤسسة تطوير العلوم الطبية والتكنولوجيا في مشروع رئيسي، إدارة الصحة في نانجينغ (No.YKK16098).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% paraformaldehyde servicebio CAS30525-89-4
C57BL/6 mice Model Animal Research Center of Nanjing University \
Doxorubicin hydrochloride Pfizer CAS25316-40-9
echocardiography Visualsonics \
Hematoxylin and Eosin staining kit Solarbio G1120
Masson staining kit Solarbio G1343
phosphate buffer solution Sigma P5368
potassium chloride Sigma CAS7447-40-7
sterilized syringe Millipore SLGP033RB

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weintraub, R. G., Semsarian, C., MacDonald, P. Dilated cardiomyopathy. Lancet. 390 (10092), 400-414 (2017).
  2. Ichihara, S., et al. Attenuation of oxidative stress and cardiac dysfunction by bisoprolol in an animal model of dilated cardiomyopathy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 350 (1), 105-113 (2006).
  3. Fountoulakis, M., et al. Alterations in the heart mitochondrial proteome in a desmin null heart failure model. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 38 (3), 461-474 (2005).
  4. Fairweather, D., Rose, N. R. Coxsackievirus-induced myocarditis in mice: a model of autoimmune disease for studying immunotoxicity. Methods. 41 (1), 118-122 (2007).
  5. Wang, Z. H., et al. A therapeutic anti-CD4 monoclonal antibody inhibits T cell receptor signal transduction in mouse autoimmune cardiomyopathy. Chinese Medical Journal. 120 (15), 1319-1325 (2007).
  6. Riad, A., et al. Toll-like receptor-4 deficiency attenuates doxorubicin-induced cardiomyopathy in mice. European Journal of Heart Failure. 10 (3), 233-243 (2008).
  7. Kankeu, C., Clarke, K., Passante, E., Huber, H. J. Doxorubicin-induced chronic dilated cardiomyopathy-the apoptosis hypothesis revisited. Journal of Molecular Medicine. 95 (3), 239-248 (2017).
  8. Zhao, L., et al. MicroRNA-140-5p aggravates doxorubicin-induced cardiotoxicity by promoting myocardial oxidative stress via targeting Nrf2 and Sirt2. Redox Biology. 15, 284-296 (2018).
  9. O'Connell, J. L., et al. Short-term and long-term models of doxorubicin-induced cardiomyopathy in rats: A comparison of functional and histopathological changes. Experimental and Toxicologic Pathology. 69 (4), 213-219 (2017).
  10. Yuan, Y. P., et al. CTRP3 protected against doxorubicin-induced cardiac dysfunction, inflammation and cell death via activation of Sirt1. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 38-47 (2018).
  11. Sun, Z., et al. The TGF-beta pathway mediates doxorubicin effects on cardiac endothelial cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 90, 129-138 (2016).
  12. Minotti, G., Menna, P., Salvatorelli, E., Cairo, G., Gianni, L. Anthracyclines: molecular advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity. Pharmacological Reviews. 56 (2), 185-229 (2004).
  13. Vejpongsa, P., Yeh, E. T. Prevention of anthracycline-induced cardiotoxicity: challenges and opportunities. Journal of The American College of Cardiology. 64 (9), 938-945 (2014).
  14. Renu, K., V, G. A., P, B. T., Arunachalam, S. Molecular mechanism of doxorubicin-induced cardiomyopathy - An update. European Journal of Pharmacology. 818, 241-253 (2018).

Tags

الطب، العدد 159، دوكسوروبيسين، سمية القلب، اعتلال عضلة القلب المتوسع، فشل القلب، نموذج الحيوان، الأورام وأمراض القلب

Erratum

Formal Correction: Erratum: A Doxorubicin-Induced Murine Model of Dilated Cardiomyopathy In Vivo
Posted by JoVE Editors on 11/04/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: A Doxorubicin-Induced Murine Model of Dilated Cardiomyopathy In Vivo. A figure was updated.

Figure 1 was updated from:

Figure 1
Figure 1: Schematic diagram of a Dox-induced dilated cardiomyopathy. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 1
Figure 1: Schematic diagram of a Dox-induced dilated cardiomyopathy. Please click here to view a larger version of this figure.

نموذج مورين الناجم عن Doxorubicin لاعتلال عضلة القلب المتوسع في فيفو
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Y., Zhang, W., Hu, T., Ni, J.,… More

Liu, Y., Zhang, W., Hu, T., Ni, J., Xu, B., Huang, W. A Doxorubicin-Induced Murine Model of Dilated Cardiomyopathy In Vivo. J. Vis. Exp. (159), e61158, doi:10.3791/61158 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter