阿霉素诱导的体内扩张型心肌病小鼠模型

Summary

描述是通过长期腹膜内注射阿霉素在小鼠中建立阿霉素诱导的扩张型心肌病（DCM）模型的方案。

Abstract

扩张型心肌病 （DCM） 是指一系列异质性心肌疾病，其特征在于在没有高血压、瓣膜、先天性或缺血性心脏病的情况下出现心室扩张和心脏功能低下，并且可能与感染、自身免疫或代谢异常或家族遗传有关。它可以进展为充血性心力衰竭，预后不良。阿霉素（Dox）被广泛用作化疗药物，但其使用受到限制，因为它会导致心肌的DCM样变化。其心肌毒性归因于氧化应激、慢性炎症和心肌细胞凋亡。利用这些DOX诱导的DCM症状的DCM模型尚未建立。

Introduction

DCM是心力衰竭的最常见原因之一，其特征是心室扩张和心功能下降，是全球心脏移植的最常见原因¹。为了进一步研究其发病机制并找到有效的治疗方法，获得成熟的动物模型尤为重要。所述实验的目的是建立类似于人类DCM的稳定的DCM小鼠模型。

由于DCM的发病机制复杂，有许多不同的方法来制作相应的动物模型。自发 DCM 型号² 相对稳定，但它们价格昂贵且不易获得。转基因动物模型³ 尚未得到很好的建立，需要更多的实验性使用。由病毒感染⁴ 或自身免疫缺陷⁵ 诱导的DCM动物模型很容易获得，但它们并不完全代表DCM。与心肌毒性相关的模型包括酒精诱导的 DCM 模型和 Dox 诱导的 DCM 动物模型。

Dox诱导的心肌病模型是通过腹膜内注射Dox⁶获得的。该模型利用了Dox最严重的慢性副作用：Dox暴露后，患者出现具有临床均匀性的晚发性DCM症状^7。Dox诱导的氧化应激⁸ 和线粒体损伤^9，导致心肌细胞凋亡，是DCM发病机制的症状。有急性和慢性Dox治疗模型：单次高剂量的Dox（15mg / kg）诱导心肌病¹⁰的短期模型，而重复的低剂量Dox注射（每周六次，3mg / kg）诱导心肌病的长期模型^11。根据所提出的研究，野生型小鼠腹膜内注射一次，剂量为5mg / kg，为期一个月，在治疗结束时显示出与DCM特征一致的心脏形态和组织学，为建立DCM模型提供了理想的方法。

Protocol

动物实验获得南京鼓楼医院机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 试剂和动物的制备

1. 将盐酸阿霉素（辉瑞，美国）溶解在灭菌水中。涡旋以获得1mg / mL的Dox溶液并保持在4°C。
2. 使用C57BL / 6小鼠（8-10周大;25-30克体重）。本研究从南京大学模型动物研究中心购买小鼠，饲养在南京鼓楼医院动物房。
3. 将无病原体的小鼠笼保持在23°C恒温下12 h光/暗循环下。 所有动物都以正常的饮食为食，并随意获得食物和水。

2. DCM动物模型的建立

1. 将小鼠随机分为正常（n = 5）组和Dox（n = 5）组。
2. 对于Dox组，使用1mL灭菌注射器以5mg / kg的剂量腹膜内施用Dox溶液，每周1次。用相同量的盐水溶液以相同的方式处理对照小鼠。
3. 每周测量两组的体重。因此，每周根据体重调整注射剂量，共4周，累积剂量为20mg / kg（图1）。
   注意：选择4周的时间段，因为4周时的超声心动图显示两组之间的心功能有显着差异。

3. 超声心动图检查

1. 在第四周结束时，对小鼠进行超声心动图检查。
2. 用2%异氟醚鼻内麻醉小鼠。如果小鼠对用齿镊子捏皮肤没有反应或刺激脚趾和尾巴，请继续使用该协议。
3. 将鼠标放在动物处理平台上，以仰卧姿势。为了维持麻醉，用鼻锥覆盖动物的鼻子和嘴巴，并提供2%的异氟醚。
   注意：对于IP麻醉，以0.2 mL / 20g的剂量注射4%水合氯醛。
4. 用电动剃须刀小心地去除胸毛。使用经胸超声心动图评估体内心脏功能。
5. 以 233 Hz 的帧速率在胸骨旁长轴和短轴视图中执行左心电图，收缩末期和舒张末期尺寸分别定义为对应于 ECG T 波和 R 波的相位。
6. 在 M 型示踪中，测量 3-5 次心跳的平均左心室收缩末期直径 （LVIDDd）、左心室舒张末直径 （LVID）、室间隔厚度 （IVS） 和左心室后壁厚度 （LVPW）。还要根据超声心动图计算射血分数（EF）和分数缩短（FS）。

4. 组织学染色

1. 超声心动图分析后，通过脑室内注射10%氯化钾来处死小鼠。
2. 解剖后用约30 mL生理盐水灌注心脏，直到肝脏和肺部变得苍白。
3. 切除心脏，并在磷酸盐缓冲溶液中彻底清洗以挤出血液。
4. 在室温下将心脏固定在4%福尔马林中24小时，并在石蜡盒中处理组织，使石蜡冷却并凝固。
5. 将心切成5μm厚的切片进行病理染色。
6. 脱蜡和补充水分部分含有状肌肉。
   1. 将载玻片在55°C孵育30分钟。然后，在二甲苯2x中孵育2分钟;100%乙醇2x，每次2分钟;95%乙醇2x，每次2分钟;80%乙醇2分钟;75%乙醇2分钟;和50%乙醇2分钟。
7. 使用苏木精和曙红（H&E）以及Masson染色剂染色。

Representative Results

心脏功能
扩张型心肌病的特征是进行性心室扩张和收缩功能障碍。 图2 显示了两组的代表性超声心动图图像。Dox治疗的小鼠显示出显着降低的左心室射血分数和左心室分数缩短（图3A，B）。舒张期和收缩期的左心室直径也随之增加（图3C，D）。这表明Dox治疗的小鼠心脏功能受损。

组织学染色
进行病理染色以观察盐水处理小鼠和Dox处理小鼠的病理变化。对照组小鼠心肌纤维整齐排列，不浸润白细胞。在Dox组中，心肌肌纤维紊乱和断裂，心肌细胞更小更薄（图4A）。Masson染色显示，Dox处理的小鼠有更多的间质纤维化（图4B）。

图1：Dox诱导的扩张型心肌病示意图。请点击此处查看此图的放大版本。

图2：两组的超声心动图。（A） 对照组;（B） Dox 组。左边是长轴部分，右边是短轴部分。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3：组间心脏功能变量。（A） 英孚;（B） FS;（C） LVEDD;（D） LVEDs.*P < 0.05，学生 的t-测试。 请点击此处查看此图的放大版本。

图4：组织学染色。（A） H&E染色;（B） 马森染色。左边是对照组，右边是 Dox 组。上面的箭头显示Dox处理的心肌细胞更小更薄，肌纤维紊乱和断裂。下箭头表示存在间质纤维化。 请点击此处查看此图的放大版本。

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Discussion

Dox是临床实践中常用的非特异性周期性抗肿瘤化疗药物^12。其主要副作用是心脏毒性，其特征是心肌病和随后的心力衰竭¹³。潜在的机制包括心肌脂质过氧化的损伤，心肌结节网Ca^{2 +}- ATP酶活性的抑制以及心肌局部肾素 - 血管紧张素系统的激活，导致AT II产生增加和细胞内钙超负荷^14。由于大剂量腹膜内注射Dox的致死作用，该协议中使用了建立可靠模型的另一种方法。

通过该方法建立的DCM模型与人类DCM的发病机制非常相似。除了心力衰竭，Dox最常见的并发症，在DCM小鼠中观察到腹水。因此，在模型开发过程中，应注意无菌操作和及时更换注射器。此外，对于Dox剂量，比较了两种给药方法：使用小剂量的长疗程和高剂量的短期治疗。结果表明，以5mg / kg连续注射Dox四周可以产生准确的DCM模型，降低小鼠死亡率，并缩短模型建立时间。

综上所述，通过腹膜内注射Dox可以成功建立稳定，可靠和经济的小鼠DCM动物模型。这项研究为研究DCM提供了一个理想的模型。它将有助于揭示扩张型心肌病或慢性心力衰竭的发病机制，并为未来的临床应用探索新的药物或治疗方法。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	servicebio	CAS30525-89-4
C57BL/6 mice	Model Animal Research Center of Nanjing University	\
Doxorubicin hydrochloride	Pfizer	CAS25316-40-9
echocardiography	Visualsonics	\
Hematoxylin and Eosin staining kit	Solarbio	G1120
Masson staining kit	Solarbio	G1343
phosphate buffer solution	Sigma	P5368
potassium chloride	Sigma	CAS7447-40-7
sterilized syringe	Millipore	SLGP033RB