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Summary
वर्णित डॉक्सोरुबिकिन के दीर्घकालिक इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से चूहों में डॉक्सोरुबिक-प्रेरित डिलेटेड कार्डियोमायोपैथी (डीसीएम) मॉडल स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल है।
Abstract
डिलेटेड कार्डियोमायोपैथी (डीसीएम) उच्च रक्तचाप, वाल्वुलर, जन्मजात, या इस्कीमिक हृदय रोगों के अभाव में वेंट्रिकुलर फैलाव और उदास हृदय प्रदर्शन की विशेषता वाले विषम मायोकार्डियल विकारों के स्पेक्ट्रम को संदर्भित करता है, और जो संक्रमण, ऑटोइम्यून या मेटाबोलिक असामान्यताओं, या पारिवारिक विरासत से संबंधित हो सकता है। यह एक गरीब पूर्वानुमान के साथ भीड़भाड़ दिल की विफलता में प्रगति कर सकते हैं । Doxorubicin (Dox) व्यापक रूप से एक कीमोथैरेप्टिक दवा के रूप में कार्यरत है, लेकिन इसका उपयोग सीमित है क्योंकि यह मायोकार्डियम के डीसीएम जैसे परिवर्तन का कारण बनता है। इसकी मायोकार्डियल विषाक्तता को ऑक्सीडेटिव तनाव, पुरानी सूजन और कार्डियोमायोसाइट एपोप्टोसिस के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। इन डॉक्स-प्रेरित डीसीएम लक्षणों का शोषण करने वाले डीसीएम का एक मॉडल स्थापित नहीं किया गया है।
Introduction
दिल की विफलता के सबसे आम कारणों में से एक, डीसीएम वेंट्रिकुलर फैलाव की विशेषता है और हृदय समारोह में कमी आई है और दुनिया भर में हृदय प्रत्यारोपण के लिए सबसे आम कारण है1। आदेश में आगे अपने रोगजनकता की जांच और प्रभावी उपचार खोजने के लिए, परिपक्व पशु मॉडल के लिए उपयोग विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । वर्णित प्रयोगों का उद्देश्य डीसीएम का एक स्थिर माउस मॉडल स्थापित करना है जो मानव डीसीएम जैसा दिखता है।
डीसीएम के जटिल रोगजनकता के कारण, संबंधित पशु मॉडल बनाने के लिए कई अलग-अलग तरीके हैं। सहज डीसीएम मॉडल2 अपेक्षाकृत स्थिर हैं, लेकिन वे महंगे हैं और आसानी से उपलब्ध नहीं हैं। आनुवंशिक रूप से संशोधित पशु मॉडल 3 अच्छी तरह सेस्थापित नहीं हैं और अधिक प्रायोगिक उपयोग की आवश्यकता होती है। वायरल इंफेक्शन4 या ऑटोइम्यून दोष से प्रेरित डीसीएम एनिमल मॉडल5 को प्राप्त करना आसान है, लेकिन वे डीसीएम के पूर्ण प्रतिनिधि नहीं हैं। मायोकार्डियल विषाक्तता से जुड़े मॉडलों में अल्कोहल-प्रेरित डीसीएम मॉडल और डॉक्स-प्रेरित डीसीएम पशु मॉडल शामिल हैं।
डॉक्स-प्रेरित कार्डियोमायोपैथी मॉडल डॉक्स 6 के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा प्राप्त कियाजाताहै। मॉडल डॉक्स के सबसे गंभीर पुराने दुष्प्रभाव का शोषण करता है: डॉक्स एक्सपोजर के बाद, रोगियों को नैदानिक एकरूपता7के साथ देर से शुरुआत डीसीएम लक्षण विकसित होते हैं। डॉक्स-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव8 और माइटोकॉन्ड्रियलडैमेज 9,जो कार्डियोमायोसाइट एपोप्टोसिस का कारण बनता है, डीसीएम के रोगजनन में लक्षण हैं। तीव्र और क्रोनिक डॉक्स उपचार मॉडल हैं: डॉक्स (15 मिलीग्राम/किलो) की एक उच्च खुराक कार्डियोमायोपैथी10के लिए एक अल्पकालिक मॉडल लाती है, जबकि दोहराव वाले कम खुराक वाले डॉक्स इंजेक्शन (छह साप्ताहिक, 3 मिलीग्राम/किलो) कार्डियोमायोपैथी11के लिए दीर्घकालिक मॉडल को प्रेरित करते हैं। प्रस्तुत अध्ययन के आधार पर, जंगली प्रकार चूहों को उपचार के अंत तक डीसीएम की विशेषताओं के अनुरूप 5 मिलीग्राम/किलोग्राम डिस्प्ले आकृति विज्ञान और दिल की हिस्टोलॉजी की खुराक पर एक महीने के लिए सप्ताह में एक बार इंजेक्शन दिया जाता है, जो डीसीएम मॉडल स्थापित करने का एक आदर्श तरीका प्रदान करता है ।
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Protocol
नानजिंग ड्रम टॉवर अस्पताल की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा पशु प्रयोगों को मंजूरी दी गई थी ।
1. अभिकर् ता और जानवरों की तैयारी
- निष्फल पानी में डॉक्सोरुबिन हाइड्रोक्लोराइड (फाइजर, यूएसए) को भंग करें। भंवर 1 मिलीग्राम/एमएल का डॉक्स समाधान प्राप्त करने के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए।
- C57BL/6 चूहों (8-10 सप्ताह पुराने; 25-30 ग्राम वजन) का उपयोग करें । इस अध्ययन के लिए, चूहों को नानजिंग विश्वविद्यालय के मॉडल पशु अनुसंधान केंद्र से खरीदा गया था और नानजिंग ड्रम टॉवर अस्पताल के पशु कक्ष में रखा गया था।
- रोगजनक मुक्त माउस पिंजरों को 23 डिग्री सेल्सियस के निरंतर तापमान पर 12 घंटे के प्रकाश/अंधेरे चक्र के तहत बनाए रखा गया था । सभी जानवरों को एक सामान्य चाउ आहार पर खिलाया गया और भोजन और पानी विज्ञापन लिबिटम मिला।
2. डीसीएम पशु मॉडल की स्थापना
- चूहों को एक सामान्य (एन = 5) समूह और डॉक्स (एन = 5) समूह में यादृच्छिक करें।
- डॉक्स समूह के लिए एक सप्ताह में 1 एमएल निष्फल सिरिंज 1x का उपयोग करके 5 मिलीग्राम/किलो की खुराक पर डॉक्स समाधान को अवतरित करें। नियंत्रण चूहों को उसी तरह नमकीन समाधान की मात्रा के साथ इलाज करें।
- साप्ताहिक रूप से दो समूहों के शरीर के वजन को मापें। तदनुसार, 20 मिलीग्राम/किलो(चित्रा 1)की संचयी खुराक के साथ, कुल 4 सप्ताह के लिए साप्ताहिक शरीर के वजन के आधार पर इंजेक्शन की खुराक को समायोजित करें ।
नोट: 4 सप्ताह की एक समय अवधि चुना गया था क्योंकि 4 सप्ताह में इकोकार्डियोग्राफी दोनों समूहों के बीच हृदय समारोह में एक महत्वपूर्ण अंतर दिखाया ।
3. इकोकार्डियोग्राफिक परीक्षा
- चौथे सप्ताह के अंत में, चूहों की इकोकार्डियोग्राफिक परीक्षा आयोजित करें।
- चूहों को 2% आइसोफ्लुनान इंट्रानासैलाई के साथ एनेस्थेटाइज करें। यदि चूहे दांतेदार चिमटी के साथ त्वचा की एक चुटकी का जवाब नहीं देते हैं या उंगलियों और पूंछ को उत्तेजित करते हैं, तो प्रोटोकॉल जारी रखें।
- रीढ़ की स्थिति में एक पशु हैंडलिंग मंच पर माउस रखें। संज्ञाहरण को बनाए रखने के लिए, जानवर की नाक और मुंह को नाक शंकु से ढकें और 2% आइसोफ्लुनाणे वितरित करें।
नोट: आईपी संज्ञाहरण के लिए, 0.2 एमएल/20 ग्राम की खुराक पर 4% क्लोरल हाइड्रेट इंजेक्ट करें। - एक इलेक्ट्रिक शेवर के साथ छाती फर को ध्यान से हटा दें। ट्रांसथोरेसिक इकोकार्डियोग्राफी का उपयोग करके वीवो में कार्डियक फ़ंक्शन का आकलन करें।
- 233 हर्ट्ज की फ्रेम दर पर पैरास्टेरल लॉन्ग-एक्सिस और शॉर्ट-एक्सिस दोनों दृश्यों में एलवी इकोकार्डियोग्राम करें। एंड-सिस्टोलिक और एंड-डायस्टोलिक आयामों को ईसीजी टी वेव और आर वेव के अनुरूप चरणों के रूप में परिभाषित किया गया था।
- एम-मोड ट्रेसिंग पर, औसत एलवी एंड-सिस्टोलिक व्यास (एलवीआईडीडी), एलवी एंड-डायस्टोलिक व्यास (एलवीआईडी), इंटरस्ट्रिकुलर सेप्टल मोटाई (आईवीएस), और एलवी पीछे की दीवार की मोटाई (एलवीपीडब्ल्यू) को 3-5 दिल की धड़कन से मापें। इकोकार्डियोग्राफी के आधार पर रिजेक्शन अंश (ईएफ) और अंश छोटा (एफएस) की गणना करें।
4. हिस्टोलॉजिकल धुंधला
- इकोकार्डियोग्राफिक विश्लेषण के बाद, 10% पोटेशियम क्लोराइड के इंट्रावेंट्रिकुलर इंजेक्शन द्वारा चूहों का बलिदान करें।
- विच्छेदन के बाद खारा के बारे में 30 एमएल के साथ दिल perfuse जब तक जिगर और फेफड़े पीला हो जाते हैं ।
- हार्ट को एक्सर्साइज करें और ब्लड को एक्सट्रूड करने के लिए फॉस्फेट बफर सॉल्यूशन में अच्छी तरह धो लें।
- 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 4% फॉर्मलिन में दिल को ठीक करें और एक पैराफिन बॉक्स में ऊतक का इलाज करें ताकि पैराफिन मोम ठंडा हो और जम जाए।
- रोग धुंधला के लिए 5 μm मोटी स्लाइस में दिल काटें।
- पेपिलरी मांसपेशी वाले डेवेक्स और रीहाइड्रेट सेक्शन।
- 30 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट स्लाइड। फिर, 2 मिनट प्रत्येक के लिए जाइलीन 2x में इनक्यूबेट; प्रत्येक 2 मिनट के लिए 100% इथेनॉल 2x; प्रत्येक 2 मिनट के लिए 95% इथेनॉल 2x; 2 मिनट के लिए 80% इथेनॉल; 2 मिनट के लिए 75% इथेनॉल; और 2 मिनट के लिए 50% इथेनॉल।
- हेमेटॉक्सीलिन और इओसिन (एचएंडई) के साथ-साथ मैसन के दाग का इस्तेमाल करते हुए दाग।
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Representative Results
कार्डियक फ़ंक्शन
डिलेटेड कार्डियोमायोपैथी प्रगतिशील वेंट्रिकुलर फैलाव और संकुचन दोष की विशेषता है। चित्रा 2 दो समूहों के प्रतिनिधि इकोकार्डियोग्राफिक छवियों को दिखाता है। डॉक्स-इलाज चूहों ने स्पष्ट रूप से बाएं वेंट्रिकुलर रिजेक्शन अंश को कम किया और बाएं वेंट्रिकुलर आंशिक छोटा(चित्र 3ए, बी)। एलवी व्यास भी डायस्टोलिक और सिस्टोलिक दोनों चरणों(चित्रा 3सी, डी)में वृद्धि हुई । इससे पता चला कि डॉक्स-इलाज चूहों में एक बिगड़ा हृदय समारोह था ।
हिस्टोलॉजिकल धुंधला
नमकीन-इलाज चूहों और डॉक्स-इलाज चूहों के रोग परिवर्तनों का निरीक्षण करने के लिए पैथोलॉजिकल धुंधला किया गया था। नियंत्रण समूह में चूहों के मायोकार्डियल फाइबर को ल्यूकोसाइट्स में घुसपैठ किए बिना बड़े करीने से व्यवस्थित किया गया था। डॉक्स समूह में, मायोकार्डियल मायोफिबरर अव्यवस्थित और टूटे हुए थे, और कार्डियोमायोसाइट्स छोटे और पतले थे(चित्रा 4A)। मैसन धुंधला से पता चला है कि डॉक्स-इलाज चूहों में अधिक इंटरस्टिटियल फाइब्रोसिस(चित्रा 4B)था।
चित्रा 1: डॉक्स-प्रेरित डिलेटेड कार्डियोमायोपैथी का योजनाबद्ध आरेख। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: दो समूहों की इकोकार्डियोग्राफी। (A)नियंत्रण समूह; (ख)डॉक्स ग्रुप । बाएं लंबे-अक्ष अनुभाग है और दाएं शॉर्ट-एक्सिस सेक्शन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: समूहों के बीच कार्डियक फ़ंक्शन चर। (A)ईएफ; (ख)एफएस; (C)LVEDd; (घ)एलवीडी। * पी < 0.05, छात्र टी-टेस्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 4: हिस्टोलॉजिकल धुंधला। (A)एचएंडई धुंधला; (ख)मैसन धुंधला । बाएं नियंत्रण समूह है और सही Dox समूह है । ऊपरी तीर से पता चलता है कि डॉक्स-इलाज कार्डियोमायोसाइट्स छोटे और पतले थे और मायोफीबर अव्यवस्थित और टूटे हुए थे। निचला तीर इंटरस्टिटियल फाइब्रोसिस की उपस्थिति को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
डॉक्स एक गैर - विशिष्ट आवधिक एंटीट्यूमर कीमोथेरेपी दवा है जो आमतौर पर नैदानिक अभ्यास12में उपयोग की जाती है। इसका मुख्य दुष्प्रभाव कार्डियोटॉक्सीसिटी है, जो कार्डियोमायोपैथी और बाद में दिल की विफलता13की विशेषता है। अंतर्निहित तंत्र में मायोकार्डियल लिपिड पेरोक्सिडेशन की क्षति, मायोकार्डियल सरकोप्लाज्मिक रेटिकुलम सीए2 +-एटीपैस गतिविधि का निषेध, और मायोकार्डियल स्थानीय रेनिन-एंजियोटेनसिन प्रणाली की सक्रियता शामिल है, जिसके परिणामस्वरूप II उत्पादन और इंट्रासेलुलर कैल्शियम अधिभार14में वृद्धि हुई है। डॉक्स के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन की एक बड़ी खुराक के घातक प्रभाव के कारण, इस प्रोटोकॉल में एक विश्वसनीय मॉडल स्थापित करने का एक वैकल्पिक तरीका इस्तेमाल किया गया था।
इस विधि द्वारा स्थापित डीसीएम मॉडल मानव डीसीएम के रोगजनकों के समान है। दिल की विफलता के अलावा, डीसीएम चूहों में डॉक्स, एसाइट्स की सबसे आम जटिलता देखी गई। इसलिए, मॉडल विकास के दौरान, बाँझ ऑपरेशन और सीरिंज को समय पर बदलने पर ध्यान दिया जाना चाहिए। इसके अलावा, डॉक्स खुराक के लिए, प्रशासन के दो तरीकों की तुलना की गई: एक छोटी खुराक का उपयोग करके उपचार का एक लंबा कोर्स, और उच्च खुराक के साथ अल्पकालिक उपचार। परिणाम बताते है कि चार सप्ताह के लिए 5 मिलीग्राम/किलो पर Dox के निरंतर इंजेक्शन डीसीएम, कम चूहों मृत्यु दर का एक सटीक मॉडल में परिणाम कर सकते हैं, और मॉडल स्थापना के लिए एक कम समय ।
संक्षेप में, एक स्थिर, विश्वसनीय और किफायती माउस डीसीएम पशु मॉडल को डॉक्स के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा सफलतापूर्वक स्थापित किया जा सकता है। यह शोध डीसीएम का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल प्रदान करता है। यह फैली हुई कार्डियोमायोपैथी या क्रोनिक हार्ट फेलियर के रोगजनन को प्रकट करने और भविष्य के नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए नई दवाओं या उपचारों का पता लगाने में योगदान देगा।
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Disclosures
हितों का कोई टकराव घोषित नहीं किया गया ।
Acknowledgments
इस काम को प्रमुख परियोजना चिकित्सा विज्ञान और प्रौद्योगिकी विकास फाउंडेशन, नानजिंग स्वास्थ्य विभाग (No.YKK16098) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | servicebio | CAS30525-89-4 | |
| C57BL/6 mice | Model Animal Research Center of Nanjing University | \ | |
| Doxorubicin hydrochloride | Pfizer | CAS25316-40-9 | |
| echocardiography | Visualsonics | \ | |
| Hematoxylin and Eosin staining kit | Solarbio | G1120 | |
| Masson staining kit | Solarbio | G1343 | |
| phosphate buffer solution | Sigma | P5368 | |
| potassium chloride | Sigma | CAS7447-40-7 | |
| sterilized syringe | Millipore | SLGP033RB |
References
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मेडिसिन अंक 159 डॉक्सोरुबिकिन कार्डियोटॉक्सीसिटी डिलेटेड कार्डियोमायोपैथी हार्ट फेलियर एनिमल मॉडल ऑन्कोलॉजी-कार्डियोलॉजीErratum
Formal Correction: Erratum: A Doxorubicin-Induced Murine Model of Dilated Cardiomyopathy In Vivo
Posted by JoVE Editors on 11/04/2021.
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