En Doxorubicin-inducerad Murine modell av dilaterad kardiomyopati in vivo

Summary

Beskrivs är ett protokoll för att upprätta en Doxorubicin-inducerad dilaterad kardiomyopati (DCM) modell hos möss via långsiktiga intraperitoneal injektion av Doxorubicin.

Abstract

Dilaterad kardiomyopati (DCM) avser ett spektrum av heterogena hjärtmuskel störningar som kännetecknas av ventrikulärt dilation och deprimerad hjärt prestanda i avsaknad av högt blodtryck, valvular, medfödda eller skandinaviska hjärtsjukdomar, och som kan vara relaterade till infektion, autoimmuna eller metabola avvikelser eller familjen arv. Det kan utvecklas till kronisk hjärtsvikt med en dålig prognos. Doxorubicin (Dox) används ofta som en kemoterapeutisk drog, men dess användning är begränsad eftersom det orsakar DCM-liknande förändringar av myokardiet. Dess myokardiell toxicitet tillskrivs oxidativ stress, kronisk inflammation och kardiomyocyt apoptos. En modell av DCM utnyttja dessa Dox-inducerad DCM symtom har inte fastställts.

Introduction

En av de vanligaste orsakerna till hjärtsvikt, DCM kännetecknas av ventrikulär utvidgning och minskad hjärtfunktion och är den vanligaste orsaken till hjärttransplantation över hela världen¹. För att ytterligare undersöka dess patogenes och hitta effektiva behandlingar är tillgång till mogna djurmodeller särskilt viktigt. Syftet med de beskrivna experimenten är att upprätta en stabil musmodell av DCM som liknar mänsklig DCM.

På grund av den komplexa patogenesen hos DCM finns det många olika metoder för att göra motsvarande djurmodeller. Spontana DCM-modeller² är relativt stabila, men de är dyra och inte lättillgängliga. Genetiskt modifierade djurmodeller³ är inte väletablerade och kräver mer experimentell användning. DCM djurmodeller induceras av virusinfektion⁴ eller autoimmuna defekter⁵ är lätta att få, men de är inte helt representativa för DCM. Modeller associerade med myokardiell toxicitet inkluderar alkoholinducerade DCM-modeller och Dox-inducerade DCM djurmodeller.

Den Dox-inducerade kardiomyopatimodellen erhålls genom intraperitoneal injektion av Dox⁶. Modellen utnyttjar den allvarligaste kroniska biverkningen av Dox: Efter Dox-exponering utvecklar patienter sena DCM-symtom med klinisk enhetlighet⁷. Dox-inducerad oxidativ stress⁸ och mitokondriell skada⁹, som leder till kardiomyocyt apoptos, är symtom i patogenesen vid DCM. Det finns akuta och kroniska Dox-behandlingsmodeller: en enda hög dos Dox (15 mg/kg) inducerar en kortsiktig modell för kardiomyopati¹⁰, medan repetitiva doxinjektioner med låg dos (sex veckor, 3 mg/kg) inducerar en långsiktig modell för kardiomyopati¹¹. Baserat på den presenterade studien injiceras möss av vild typ intraperitoneally en gång i veckan i en månad i en dos av 5 mg/kg displaymorfologi och hjärtats histologi som överensstämmer med egenskaperna hos DCM i slutet av behandlingen, vilket ger ett idealiskt sätt att upprätta en DCM-modell.

Protocol

Djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Nanjing Drum Tower Hospital.

1. Beredning av reagenser och djur

1. Lös upp doxorubicinhydroklorid (Pfizer, USA) i steriliserat vatten. Vortex för att erhålla en Dox-lösning på 1 mg/ml och hålla vid 4 °C.
2. Använd C57BL/6 möss (8–10 veckor gamla; 25–30 g vikt). För denna studie köptes möss från Model Animal Research Center vid Nanjing University och hölls i djurrummet på Nanjing Drum Tower Hospital.
3. Patogenfria mus burar hölls under en 12 h ljus/mörk cykel vid en konstant temperatur av 23 °C. Alla djur matades på en normal chow diet och fick mat och vatten ad libitum.

2. Upprättande av DCM djurmodell

1. Randomisera möss till en normal grupp (n = 5) och Dox (n = 5).
2. Administrera Dox-lösningen intraperitoneally med en dos på 5 mg/kg med en steriliserad spruta på 1 ml i veckan för Dox-gruppen. Behandla kontrollmössen på samma sätt med samma mängd saltlösning.
3. Mät kroppsvikten för de två grupperna varje vecka. Justera därför injektionsdosen baserat på kroppsvikt varje vecka i totalt 4 veckor, med en kumulativ dos på 20 mg/kg (figur 1).
   OBS: En tidsperiod på 4 veckor valdes eftersom ekokardiografi vid 4 veckor visade en signifikant skillnad i hjärtfunktion mellan de två grupperna.

3. Ekokardiografisk undersökning

1. I slutet av den fjärde veckan, utför en ekokardiografisk undersökning av mössen.
2. Bedöva mössen med 2% isofluran intranasally. Om mössen inte svarar på en nypa av huden med en tandad pincett eller stimulerar tårna och svansarna, fortsätt med protokollet.
3. Placera musen på en djurhanteringsplattform i det bakre läget. För att upprätthålla anestesin, täck djurets näsa och mun med en näskon och leverera 2% isofluran.
   OBS: För IP-anestesi, injicera 4% klorhydrat med en dos av 0,2 ml/20 g.
4. Ta försiktigt bort bröstpälsen med en elektrisk rakapparat. Utvärdera hjärtfunktionen in vivo med hjälp av transthoracic ekokardiografi.
5. Utför LV ekokardiogram i både parasternal lång axel och kort-axel vyer med en bildhastighet på 233 Hz. End-systolic och end-diastolic dimensioner definierades som de faser som motsvarar EKG T vågen respektive R vågen.
6. På M-lägesspårningarna mäter du den genomsnittliga LV-ändsystoliska diametern (LVIDd), LV-end-diastolisk diameter (LVIDs), interventricular septal tjocklek (IVS) och LV bakre väggtjocklek (LVPW) från 3-5 hjärtslag. Beräkna också utmatningsfraktionen (EF) och fraktionförkortningen (FS) baserat på ekokardiografi.

4. Histologisk färgning

1. Efter den ekokardiografiska analysen offra mössen genom intravenrikulär injektion av 10% kaliumklorid.
2. Perfusera hjärtat med ca 30 ml saltlösning efter dissekering tills lever och lunga blir bleka.
3. Ta bort hjärtat och tvätta det noggrant i fosfatbuffertlösning för att extrudera blod.
4. Fixera hjärtat i 4% formalin vid rumstemperatur i 24 timmar och behandla vävnaden i en paraffinlåda så att paraffinvaxet svalnar och stelnar.
5. Skär hjärtan i 5 μm tjocka skivor för patologisk färgning.
6. Dewax och rehydrera sektioner som innehåller papillary muskel.
   1. Inkubera diabilder vid 55 °C i 30 min. Inkubera sedan i xylen 2x i 2 min vardera; 100% etanol 2x i 2 min vardera; 95% etanol 2x i 2 min vardera; 80% etanol i 2 min; 75% etanol i 2 min; och 50% etanol i 2 min.
7. Fläck med hematoxylin och eosin (H&E) samt Massons fläck.

Representative Results

Hjärtfunktion
Dilaterad kardiomyopati kännetecknas av progressiva Ventrikulärt dilatation och kontraktil dysfunktion. Figur 2 visar representativa ekokardiografiska bilder av de två grupperna. Dox-behandlade möss visade markant minskad vänster ventrikulär utmatningsfraktion och vänster ventrikulär fraktionerad förkortning (figur 3A,B). LV-diametern ökade också i både diastoliska och systoliska faser (figur 3C,D). Detta visade att Dox-behandlade möss hade en nedsatt hjärt funktion.

Histologisk färgning
Patologisk färgning utfördes för att observera de patologiska förändringarna av saltlösning-behandlade möss och Dox-behandlade möss. Myokardiella fibrer av mössen i kontrollgruppen var snyggt ordnade, utan att infiltrera leukocyter. I Dox-gruppen var myokardiska myofibrer oordnade och trasiga, och kardiomyocyter var mindre och tunnare (figur 4A). Massonfärgning visade att Dox-behandlade möss hade mer interstitiell fibros (figur 4B).

Figur 1: Schematiskt diagram över en Dox-inducerad dilaterad kardiomyopati. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 2: De två gruppernas ekokardiografi. a)Kontrollgrupp. b)Dox-gruppen. Vänster är den långa axelsektionen och höger är den korta axelsektionen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Bild 3: Hjärtfunktionsvariablerna mellan grupperna. A)EF; b)FS. c)LVEDd. d)LVEDs. *P < 0,05, Studentens t-test. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 4: Histologisk färgning. A)H&E-färgning. b)Massonfärgning. Vänster är kontrollgruppen och höger är Dox-gruppen. Den övre pilen visar att Dox-behandlade kardiomyocyter var mindre och tunnare och myofibers var oordnade och trasiga. Den nedre pilen betecknar närvaron av interstitiell fibros. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

5

Discussion

Dox är ett ospecificerat periodiskt antitumörkemoterapiläkemedel som vanligen används i klinisk praxis¹². Dess huvudsakliga bieffekt är kardiotoxicitet, kännetecknad av kardiomyopati och efterföljande hjärtsvikt¹³. Den underliggande mekanismen inkluderar skador på myokardiell lipidperoxidation, hämning av myokardiell sarkoplasmiskt retikulum Ca²⁺-ATPase-aktivitet och aktivering av det myokardiella lokala renin-angiotensinsystemet, vilket resulterar i ökad AT II-produktion och intracellulär kalciumöverbelastning¹⁴. På grund av den dödliga effekten av en stor dos intraperitoneal injektion av Dox, ett alternativt sätt att upprätta en tillförlitlig modell användes i detta protokoll.

DCM-modellen som fastställs med denna metod är mycket lik patogenesen hos human dCM. Förutom hjärtsvikt observerades den vanligaste komplikationen av Dox, ascites hos DCM-möss. Därför bör uppmärksamhet ägnas åt steril drift och tidig ersättning av sprutor under modellutveckling. För Dox-dosen jämfördes dessutom två administreringsmetoder: en lång behandling med en liten dos och korttidsbehandling med hög dos. Resultaten visar att kontinuerlig injektion av Dox vid 5 mg/kg i fyra veckor kan resultera i en exakt modell av DCM, lägre möss dödlighet och kortare tid för modell etablering.

Sammanfattningsvis, en stabil, pålitlig och ekonomisk mus DCM djurmodell kan framgångsrikt fastställas genom intraperitoneal injektion av Dox. Denna forskning ger en idealisk modell för att studera DCM. Det kommer att bidra till att avslöja patogenesen vid dilaterad kardiomyopati eller kronisk hjärtsvikt och utforska nya läkemedel eller behandlingar för framtida kliniska tillämpningar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	servicebio	CAS30525-89-4
C57BL/6 mice	Model Animal Research Center of Nanjing University	\
Doxorubicin hydrochloride	Pfizer	CAS25316-40-9
echocardiography	Visualsonics	\
Hematoxylin and Eosin staining kit	Solarbio	G1120
Masson staining kit	Solarbio	G1343
phosphate buffer solution	Sigma	P5368
potassium chloride	Sigma	CAS7447-40-7
sterilized syringe	Millipore	SLGP033RB