Ein Doxorubicin-induziertes Murinmodell der dilatativen Kardiomyopathie in vivo

Summary

Beschrieben ist ein Protokoll zur Etablierung eines Doxorubicin-induzierten dilatativen Kardiomyopathie-Modells (DCM) bei Mäusen durch intraperitoneale Langzeitinjektion von Doxorubicin.

Abstract

Dilatative Kardiomyopathie (DCM) bezieht sich auf ein Spektrum heterogener Myokarderkrankungen, die durch ventrikuläre Dilatation und verminderte Herzleistung in Abwesenheit von Bluthochdruck, valvulären, angeborenen oder ischämischen Herzerkrankungen gekennzeichnet sind und die mit Infektionen, Autoimmun- oder Stoffwechselanomalien oder familiärer Vererbung zusammenhängen können. Es kann zu kongestiver Herzinsuffizienz mit einer schlechten Prognose fortschreiten. Doxorubicin (Dox) wird häufig als Chemotherapeutikum eingesetzt, aber seine Verwendung ist begrenzt, da es DCM-ähnliche Veränderungen des Myokards verursacht. Seine myokardiale Toxizität wird oxidativem Stress, chronischen Entzündungen und Kardiomyozyten-Apoptose zugeschrieben. Ein Modell von DCM, das diese Dox-induzierten DCM-Symptome ausnutzt, wurde nicht etabliert.

Introduction

Eine der häufigsten Ursachen für Herzinsuffizienz, DCM, ist gekennzeichnet durch ventrikuläre Dilatation und verminderte Herzfunktion und ist der häufigste Grund für Herztransplantationen weltweit¹. Um seine Pathogenese weiter zu untersuchen und wirksame Behandlungen zu finden, ist der Zugang zu reifen Tiermodellen besonders wichtig. Der Zweck der beschriebenen Experimente ist es, ein stabiles Mausmodell von DCM zu etablieren, das menschlichem DCM ähnelt.

Aufgrund der komplexen Pathogenese von DCM gibt es viele verschiedene Methoden, um entsprechende Tiermodelle herzustellen. Spontane DCM-Modelle² sind relativ stabil, aber sie sind teuer und nicht leicht verfügbar. Gentechnisch veränderte Tiermodelle³ sind nicht gut etabliert und erfordern eine experimentellere Verwendung. DCM-Tiermodelle, die durch Virusinfektion⁴ oder Autoimmundefekte⁵ induziert werden, sind leicht zu erhalten, aber sie sind nicht vollständig repräsentativ für DCM. Zu den Modellen, die mit myokardialer Toxizität assoziiert sind, gehören alkoholinduzierte DCM-Modelle und Dox-induzierte DCM-Tiermodelle.

Das Dox-induzierte Kardiomyopathie-Modell wird durch intraperitoneale Injektion von Dox⁶erhalten. Das Modell nutzt die schwerste chronische Nebenwirkung von Dox: Nach der Dox-Exposition entwickeln Patienten spät einsetzende DCM-Symptome mit klinischer Uniformität⁷. Dox-induzierter oxidativer Stress⁸ und mitochondriale^{Schäden 9,}die zur Kardiomyozyten-Apoptose führen, sind Symptome in der Pathogenese von DCM. Es gibt akute und chronische Dox-Behandlungsmodelle: Eine einzelne hohe Dosis dox (15 mg/kg) induziert ein kurzfristiges Modell für kardiomyopathie¹⁰, während repetitive niedrig dosierte Dox-Injektionen (sechs wöchentlich, 3 mg/kg) ein Langzeitmodell für Kardiomyopathie induzieren¹¹. Basierend auf der vorgestellten Studie zeigen Wildtypmäuse, die einmal pro Woche für einen Monat intraperitoneal in einer Dosis von 5 mg/kg injiziert wurden, am Ende der Behandlung morphologie und Histologie des Herzens, die mit den Eigenschaften von DCM übereinstimmen, was eine ideale Möglichkeit zur Etablierung eines DCM-Modells darstellt.

Protocol

Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Nanjing Drum Tower Hospital genehmigt.

1. Vorbereitung der Reagenzien und Tiere

1. Doxorubicinhydrochlorid (Pfizer, USA) in sterilisiertem Wasser auflösen. Vortex, um eine Dox-Lösung von 1 mg/ml zu erhalten und bei 4 °C zu halten.
2. Verwenden Sie C57BL/6 Mäuse (8–10 Wochen alt; 25–30 g Gewicht). Für diese Studie wurden Mäuse vom Model Animal Research Center der Nanjing University gekauft und im Tierzimmer des Nanjing Drum Tower Hospital gehalten.
3. Pathogenfreie Mauskäfige wurden unter einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei einer konstanten Temperatur von 23 °C gehalten. Alle Tiere wurden mit einer normalen Chow-Diät gefüttert und bekamen Nahrung und Wasser ad libitum.

2. Etablierung des DCM-Tiermodells

1. Randomisieren Sie Mäuse in eine normale (n = 5) Gruppe und Dox (n = 5) Gruppe.
2. Verabreichen Sie die Dox-Lösung intraperitoneal in einer Dosis von 5 mg/kg unter Verwendung einer 1 ml sterilisierten Spritze 1x wöchentlich für die Dox-Gruppe. Behandeln Sie die Kontrollmäuse auf die gleiche Weise mit der gleichen Menge Kochsalzlösung.
3. Messen Sie wöchentlich das Körpergewicht der beiden Gruppen. Dementsprechend ist die Injektionsdosis basierend auf dem Körpergewicht wöchentlich für insgesamt 4 Wochen mit einer kumulativen Dosis von 20 mg/kg anzupassen (Abbildung 1).
   HINWEIS: Es wurde ein Zeitraum von 4 Wochen gewählt, da die Echokardiographie nach 4 Wochen einen signifikanten Unterschied in der Herzfunktion zwischen den beiden Gruppen zeigte.

3. Echokardiographische Untersuchung

1. Am Ende der vierten Woche führen Sie eine echokardiographische Untersuchung der Mäuse durch.
2. Betäuben Sie die Mäuse intranasal mit 2% Isofluran. Wenn die Mäuse nicht auf eine Prise der Haut mit einer gezähnten Pinzette reagieren oder die Zehen und Schwänze stimulieren, fahren Sie mit dem Protokoll fort.
3. Legen Sie die Maus auf eine Plattform für die Handhabung von Tieren in Rückenlage. Um die Anästhesie aufrechtzuerhalten, bedecken Sie Nase und Mund des Tieres mit einem Nasenkegel und geben Sie 2% Isofluran ab.
   HINWEIS: Für die IP-Anästhesie 4% Chloralhydrat in einer Dosis von 0,2 ml/20 g injizieren.
4. Entfernen Sie das Brustfell vorsichtig mit einem Elektrorasierer. Beurteilung der Herzfunktion in vivo mittels transthoraler Echokardiographie.
5. Führen Sie das LV-Echokardiogramm sowohl in der parasternalen Langachsen- als auch in der Kurzachsenansicht mit einer Bildrate von 233 Hz durch. Endsystolische und enddiastolische Dimensionen wurden als die Phasen definiert, die der EKG-T-Welle bzw. der R-Welle entsprechen.
6. Messen Sie auf den M-Mode-Tracings den durchschnittlichen LV-Endsystolischen Durchmesser (LVIDd), den LV-Enddiastolischen Durchmesser (LVIDs), die interventrikuläre Septumdicke (IVS) und die LV-Hinterwanddicke (LVPW) von 3-5 Herzschlägen. Berechnen Sie auch die Auswurffraktion (EF) und die Fraktionsverkürzung (FS) basierend auf der Echokardiographie.

4. Histologische Färbung

1. Nach der echokardiographischen Analyse opfern die Mäuse durch intraventrikuläre Injektion von 10% Kaliumchlorid.
2. Perfundieren Sie das Herz nach der Dissektion mit etwa 30 ml Kochsalzlösung, bis Leber und Lunge blass werden.
3. Schneiden Sie das Herz aus und waschen Sie es gründlich in Phosphatpufferlösung, um Blut zu extrudieren.
4. Fixieren Sie das Herz in 4% Formalin bei Raumtemperatur für 24 h und behandeln Sie das Gewebe in einer Paraffinbox, so dass das Paraffinwachs abkühlt und erstarrt.
5. Schneiden Sie die Herzen in 5 μm dicke Scheiben für pathologische Flecken.
6. Entwachsen und rehydrieren Sie Abschnitte, die Papillarmuskeln enthalten.
   1. Inkubieren Sie Rutschen bei 55 °C für 30 min. Dann in Xylol 2x für jeweils 2 min inkubieren; 100% Ethanol 2x für je 2 min; 95% Ethanol 2x für je 2 min; 80% Ethanol für 2 min; 75% Ethanol für 2 min; und 50% Ethanol für 2 min.
7. Färben Sie mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) sowie Massons Färbung.

Representative Results

Herzfunktion
Die dilatative Kardiomyopathie ist durch progressive ventrikuläre Dilatation und kontraktile Dysfunktion gekennzeichnet. Abbildung 2 zeigt repräsentative echokardiographische Bilder der beiden Gruppen. Dox-behandelte Mäuse zeigten eine deutlich reduzierte linksventrikuläre Ejektionsfraktion und linksventrikuläre fraktionierte Verkürzung (Abbildung 3A, B). Der LV-Durchmesser nahm sowohl in der diastolischen als auch in der systolischen Phase zu (Abbildung 3C,D). Dies zeigte, dass Dox-behandelte Mäuse eine beeinträchtigte Herzfunktion hatten.

Histologische Färbung
Pathologische Färbungen wurden durchgeführt, um die pathologischen Veränderungen von mit Kochsalzlösung behandelten Mäusen und Dox-behandelten Mäusen zu beobachten. Myokardfasern der Mäuse in der Kontrollgruppe waren ordentlich angeordnet, ohne Leukozyten zu infiltrieren. In der Dox-Gruppe waren Myokardmyofasern gestört und gebrochen, und Kardiomyozyten waren kleiner und dünner(Abbildung 4A). Die Masson-Färbung zeigte, dass dox-behandelte Mäuse mehr interstitielle Fibrose aufwiesen (Abbildung 4B).

Abbildung 1: Schematische Darstellung einer Dox-induzierten dilatativen Kardiomyopathie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Die Echokardiographie der beiden Gruppen. ( A) Kontrollgruppe; (B) Dox-Gruppe. Links ist der Langachsenabschnitt und rechts der Kurzachsenabschnitt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Die Kardialfunktionsvariablen zwischen den Gruppen. A) EF; B) FS; C) LVEDd; ( D) LVEDs. *P < 0,05, Student's t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Histologische Färbung. (A) H & E-Färbung; (B) Masson-Färbung. Links ist die Kontrollgruppe und rechts ist die Dox-Gruppe. Der obere Pfeil zeigt, dass dox-behandelte Kardiomyozyten kleiner und dünner waren und die Myofiber ungeordnet und gebrochen waren. Der untere Pfeil kennzeichnet das Vorhandensein einer interstitiellen Fibrose. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Dox ist ein unspezifisches periodisches Antitumor-Chemotherapeutikum, das häufig in der klinischen Praxis verwendet wird¹². Seine Hauptnebenwirkung ist Kardiotoxizität, gekennzeichnet durch Kardiomyopathie und nachfolgende Herzinsuffizienz¹³. Der zugrunde liegende Mechanismus umfasst die Schädigung der myokardialen Lipidperoxidation, die Hemmung der myokardialen sarkoplasmatischen Retikulum Ca²⁺-ATPase-Aktivität und die Aktivierung des myokardialen lokalen Renin-Angiotensin-Systems, was zu einer erhöhten AT II-Produktion und einer intrazellulären Calciumüberlastung führt¹⁴. Aufgrund der tödlichen Wirkung einer großen Dosis intraperitonealer Injektion von Dox wurde in diesem Protokoll ein alternativer Weg zur Etablierung eines zuverlässigen Modells verwendet.

Das mit dieser Methode etablierte DCM-Modell ist der Pathogenese des menschlichen DCM sehr ähnlich. Neben Herzinsuffizienz, der häufigsten Komplikation von Dox, wurde Aszites bei DCM-Mäusen beobachtet. Daher sollte bei der Modellentwicklung auf den sterilen Betrieb und den rechtzeitigen Austausch der Spritzen geachtet werden. Darüber hinaus wurden für die Dox-Dosis zwei Verabreichungsmethoden verglichen: ein langer Behandlungsverlauf mit einer kleinen Dosis und eine Kurzzeitbehandlung mit einer hohen Dosis. Die Ergebnisse zeigen, dass eine kontinuierliche Injektion von Dox bei 5 mg/kg über vier Wochen zu einem genauen DCM-Modell, einer geringeren Mäusemortalität und einer kürzeren Zeit für die Modellerstellung führen kann.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein stabiles, zuverlässiges und wirtschaftliches Maus-DCM-Tiermodell durch intraperitoneale Injektion von Dox erfolgreich etabliert werden kann. Diese Forschung bietet ein ideales Modell für das Studium von DCM. Es wird dazu beitragen, die Pathogenese der dilatativen Kardiomyopathie oder chronischen Herzinsuffizienz aufzudecken und neue Medikamente oder Behandlungen für zukünftige klinische Anwendungen zu erforschen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	servicebio	CAS30525-89-4
C57BL/6 mice	Model Animal Research Center of Nanjing University	\
Doxorubicin hydrochloride	Pfizer	CAS25316-40-9
echocardiography	Visualsonics	\
Hematoxylin and Eosin staining kit	Solarbio	G1120
Masson staining kit	Solarbio	G1343
phosphate buffer solution	Sigma	P5368
potassium chloride	Sigma	CAS7447-40-7
sterilized syringe	Millipore	SLGP033RB