Summary
Dieses Protokoll beschreibt den Nachweis der CCL5-vermittelten periostalen Skelettstammzellmigration in Echtzeit mittels lebender tierexperimenteller Mikroskopie.
Abstract
Periostale Skelettstammzellen (P-SSCs) sind für die lebenslange Knochenerhaltung und -reparatur unerlässlich und damit ein idealer Schwerpunkt für die Entwicklung von Therapien zur Verbesserung der Frakturheilung. Periostzellen wandern schnell zu einer Verletzung, um neue Chondrozyten und Osteoblasten für die Frakturheilung zu liefern. Traditionell wurde die Wirksamkeit eines Zytokins zur Induktion der Zellmigration nur in vitro durch die Durchführung eines Transwell- oder Scratch-Assays durchgeführt. Mit Fortschritten in der intravitalen Mikroskopie unter Verwendung der Multiphotonenerregung wurde kürzlich entdeckt, dass 1) P-SSCs das Migrationsgen CCR5 exprimieren und 2) die Behandlung mit dem CCR5-Liganden, der als CCL5 bekannt ist, die Frakturheilung und die Migration von P-SSCs als Reaktion auf CCL5 verbessert. Diese Ergebnisse wurden in Echtzeit erfasst. Hier beschrieben ist ein Protokoll zur Visualisierung der P-SSC-Migration aus der kalvarialen Naht-Skelettstammzell-Nische (SSC) zu einer Verletzung nach der Behandlung mit CCL5. Das Protokoll beschreibt die Konstruktion einer Mausfessel und einer bildgebenden Halterung, die chirurgische Vorbereitung der Mauskalvarie, die Induktion eines Calvaria-Defekts und die Erfassung der Zeitrafferbildgebung.
Introduction
Die Frakturreparatur ist ein dynamischer, mehrzelliger Prozess, der sich von der embryonalen Skelettentwicklung und dem Umbau unterscheidet. Während dieses Prozesses folgt auf die Induktion von Verletzungssignalen aus geschädigtem Gewebe die schnelle Rekrutierung, Proliferation und anschließende Differenzierung von Skelettstamm- / Vorläuferzellen, die alle für die Gesamtstabilität und Fixierung von Frakturen entscheidend sind1. Insbesondere erfordern frühe Stadien der Frakturheilung eine weiche Kallusbildung, die hauptsächlich auf periostale residente Zellen zurückgeführt wird2. Wenn Knochen verletzt werden, reagiert eine Untergruppe von Periostzellen schnell und trägt zu neu differenzierten Knorpelzwischenprodukten und Osteoblasten innerhalb des Kallus3 bei, was das Vorhandensein einer ausgeprägten Skelettstamm- / Vorläuferzellpopulation im Periost impliziert. Daher stellen die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung der periostresidenten Skelettstammzellen (SSCs) einen vielversprechenden Therapieansatz für degenerative Knochenerkrankungen und Knochendefekte dar4.
Es wird angenommen, dass sich SSCs an mehreren Gewebestandorten befinden, einschließlich des Knochenmarks. Ähnlich wie im Knochenmark wurden auch osteogene/chondrogene SSCs im Periost identifiziert4,5,6. Diese periostalen SSCs (P-SSCs) können während der fetalen Knochenentwicklung mit frühen mesenchymalen Lineage-Markern (d. h. Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 und Axin2-CreER8) markiert werden4,7,8,9,10. Eine wesentliche Einschränkung dieser Modelle zur Verfolgung einzelner genetischer Abstammungslinien besteht darin, dass innerhalb der markierten Zellpopulationen eine erhebliche Heterogenität besteht. Darüber hinaus können sie markierte SSCs in vivo nicht von ihren Nachkommen unterscheiden. Um diese Einschränkung zu beheben, haben wir kürzlich eine Dual-Reporter-Maus (Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) entwickelt, um P-SSCs aus Knochenmark-SSCs (BM-SSCs)11 deutlich sichtbar zu machen. Mit diesem Modell wurde festgestellt, dass P-SSCs durch Mx1+αSMA+-Doppelmarkierung gekennzeichnet sind, während sich differenziertere Mx1+-Zellen im Knochenmark, in endostalen und periostalen Oberflächen sowie in kortikalen und trabekulären Knochen befinden11,12.
Es ist bekannt, dass mehrere Zytokine und Wachstumsfaktoren den Knochenumbau und die Knochenreparatur regulieren und wurden auf die Verbesserung der Skelettreparatur bei kritischen Segmentdefekten getestet1,13. Aufgrund der zellulären Komplexität von Verletzungsmodellen, die durch die Störung der physikalischen Barriere des Knochenkompartiments entstehen, sind die direkten Auswirkungen dieser Moleküle auf die endogene P-SSC-Migration und -Aktivierung während der Heilung jedoch unklar. Die funktionellen Eigenschaften und die Migrationsdynamik von SSCs werden häufig in vitro durch die Durchführung eines Transwell- oder Scratch-Assays in Kombination mit Zytokinen oder Wachstumsfaktoren bewertet, von denen bekannt ist, dass sie die Migration in anderen Zellpopulationen induzieren. Daher ist die Interpretation der Ergebnisse dieser In-vitro-Experimente für die Anwendung in den entsprechenden in vivo-Systemen eine Herausforderung. Derzeit wird die In-vivo-Bewertung der Skelettstamm-/Vorläuferzellmigration in der Regel nicht in Echtzeit beobachtet; Vielmehr wird es zu festen Zeitpunkten nach der Fraktur gemessen5,7,14,15,16.
Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass die Migration nicht auf Einzelzellebene bewertet wird; Vielmehr wird es über Veränderungen der Zellpopulationen gemessen. Aufgrund der jüngsten Fortschritte in der intravitalen Mikroskopie lebender Tiere und der Erzeugung zusätzlicher Reportermäuse ist nun eine In-vivo-Verfolgung einzelner Zellen möglich. Unter Verwendung der intravitalen Mikroskopie von Lebendtieren beobachteten wir die deutliche Migration von P-SSCs aus der Calvaria-Nahtnnische zu einer Knochenverletzung innerhalb von 24-48 h nach der Verletzung bei Mx1/Tomato/αSMA-GFP-Mäusen.
CCL5/CCR5 wurde kürzlich als Regulierungsmechanismus identifiziert, der die Rekrutierung und Aktivierung von P-SSCs während des frühen Verletzungsreaktionsverhaltens beeinflusst. Interessanterweise wurde keine signifikante P-SSC-Migration als Reaktion auf eine Verletzung in Echtzeit festgestellt. Die Behandlung einer Verletzung mit CCL5 führt jedoch zu einer robusten, richtungsdifferierten Migration von P-SSCs, die in Echtzeit erfasst werden kann. Daher ist es das Ziel dieses Protokolls, eine detaillierte Methodik für die Aufzeichnung der In-vivo-Migration von P-SSCs in Echtzeit nach der Behandlung mit CCL5 bereitzustellen.
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Protocol
Alle Mäuse wurden unter pathogenfreien Bedingungen gehalten und alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Baylor College of Medicine genehmigt.
1. Mausvorbereitung
- Kreuzen Sie Mx1-Cre17 und Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 Mäuse (gekauft vom Jackson Laboratory) mit αSMA-GFP-Mäusen (hier von Dr. Ivo Kalajzic und Dr. Henry Kronenberg zur Verfügung gestellt), um Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) Reportermäuse zu erzeugen (Abbildung 2A).
- Für die Mx1-Cre-Induktion werden Mäuse 10 Tage lang jeden zweiten Tag mit 25 mg/kg pIpC injiziert.
- Bestrahlung von Mäusen mit 9,5 Gy 1 Tag vor der intravenösen Transplantation von 1 x 106 mononukleären Zellen des gesamten Knochenmarks von Wildtyp-C57BL/6-Mäusen (WT-BMT)19.
- Nach 6 bis 8 Wochen Genesung unterziehen mäuse der unten beschriebenen In-vivo-Bildgebung des periostalen Zellmigrationsprotokolls.
HINWEIS: Bestrahlung und WT-BMT von Mx1-Cre-Mäusen sind notwendig, um endogen Mx1-markierte hämatopoetische Zellen zu eliminieren, die auf eine Verletzung reagieren können. Sechs bis acht Wochen nach der Bestrahlung liegt die hämatopoetische Zellzahl des Wirts bei <5% und damit bereit für die Bildgebung19.
2. Mausfessel und Bildhalterung
- Erstellen Sie eine Mausfessel mit einem konischen 50-ml-Rohr (Abbildung 1A).
- Stochern Sie mit einer spitzen Schere ein Loch durch den Boden des Koniks. Schneiden Sie vom unteren Loch bis zur Oberseite des konischen Lochs (die Schnittseite ist die Oberseite der Rückhaltevorrichtung).
- Machen Sie einen Schnitt von etwa 4-5 cm Länge parallel zum vorherigen Schnitt und auf halbem Weg nach unten (~ 2 cm) von der Oberseite der Rückhaltevorrichtung. Entfernen Sie diesen Abschnitt des konischen und glätten Sie die Kanten waren notwendig.
- Konstruieren Sie eine konische Rohrbildhalterung mit einer verstellbaren Winkelplatte, einem optischen 0,5-Zoll-Pfosten und einer rechtwinkligen Klemme für den 0,5-Zoll-Pfosten, 0,1875-Zoll-Sechskant (Abbildung 1B und Tabelle der Materialien).
- Stellen Sie die Winkelplatte auf einen Winkel von 35° ein. Schrauben Sie auf der linken Seite der Winkelplatte den optischen Pfosten von der Rückseite der Platte in das zweite Loch.
- Führen Sie auf der rechten Seite der verstellbaren Platte eine federbelastete 0,1875" Sechskantverriegelung 0,25" Rändelschraube von vorne in das zweite Loch und die letzten Löcher auf der Platte ein. Die rechtwinklige Klemme wird mit dem optischen Pfosten verwendet, um die konische Maushalterung an Ort und Stelle zu befestigen.
3. Präoperativer chirurgischer Eingriff
- Mausanästhesie
- Zur Schmerzbehandlung subkutan wird der Maus 30–60 min vor der Operation Buprenorphin (1 mg/kg KG) mit verzögerter Freisetzung injiziert.
- Anästhesieren Sie Mäuse mit einer Nagetier-III-CCM-Kombinationsanästhesie (Combo III), die 37,5 mg / ml Ketamin, 1,9 mg / ml Xylazin und 0,37 mg / ml Acepromazin enthält. Die geeignete Dosierung für Mäuse beträgt 0,75–1,50 ml pro 1 kg Körpergewicht. Die Dosis dauert 30–45 Min.
- Sobald die Maus betäubt ist, tragen Sie mit einem sterilen Wattestäbchen eine Augensalbe auf die Augen auf, um eine Austrocknung der Augen zu verhindern.
- Für die Langzeitbildgebung (>45 min) erneut eine Anästhesie verabreichen, um die richtige Anästhesietiefe wie folgt aufrechtzuerhalten.
- Bereiten Sie eine 1-ml-Spritze mit einer ausreichenden Menge an Combo III vor, um die Anästhesie für die geplante Bildgebungsdauer aufrechtzuerhalten (0,75 ml/kg KG pro 30 Min zusätzlicher Sedierung). Befestigen Sie ein 25 G Schmetterlingsnadel-Infusionsset mit 12"-Schlauch an der Spritze und drücken Sie das Anästhetikum durch den Schlauch und die Nadel.
- Führen Sie die Schmetterlingsnadel intraperitoneal ein und kleben Sie die Nadel dann an Ort und Stelle.
HINWEIS: Auf diese Weise wird die zusätzliche Combo III während der Bildgebung verabreicht, so dass das Tier nicht bewegt oder die Sichtebene gestört werden muss.
- Bieten Sie thermische Unterstützung mit einem Heizkissen, das während des gesamten Verfahrens bei 37 ° C gehalten wird. Bei längerer Bildgebung (>1 Stunde) ist eine zusätzliche Flüssigkeitsunterstützung erforderlich. Zusätzliche Flüssigkeiten können I.P. mit zusätzlichem Combo III während der Bildgebung oder 33 ml/kg Kochsalzlösung (0,9 NaCl) subkutan bereitgestellt werden.
- Mausfesselung und Vorbereitung der Operationsstelle
- Verwenden Sie eine Haarschneidemaschine, um so viele Haare wie möglich von der Oberseite des Kopfes zu entfernen. Tragen Sie die Enthaarungscreme auf den rasierten Bereich auf, um verbleibende Haare an der Operationsstelle zu entfernen.
- Stellen Sie sicher, dass die Maus durch mangelnde Reaktion auf Zehendrücken vollständig betäubt ist. Wenn die Maus nicht vollständig betäubt ist, verabreichen Sie nach 15 Minuten eine zweite kleinere Dosis von Combo III (<0,75 ml/kg KG).
- Legen Sie die Maus zuerst in die Rückhaltevorrichtung und schieben Sie sie weit genug nach hinten, so dass die Nase leicht über dem Rand des Konikums hängt.
- Kleben Sie die Vorderpfoten mit medizinischem Klebeband auf die Unterseite des konischen Rohrs.
- Legen Sie das konische Rohr mit der Maus auf eine Bildhalterung, die in einem Winkel von 35° eingestellt ist, und sichern Sie sie mit der rechtwinkligen Klemme (Abbildung 1C).
- Sobald die Maus in der bildgebenden Halterung sicher ist, reinigen Sie die Operationsstelle 3x mit abwechselnden Peelings aus Betadine-Peeling und 70% Isopropylalkohol. Überprüfen Sie erneut, ob das Tier vollständig sediert ist.
- Bewegen Sie die Maus zu einem sauberen saugfähigen Pad und legen Sie einen Vorhang über die Maus, um ein großes steriles Feld zu erzeugen.
4. Chirurgischer Eingriff
- Öffnungsschnitt
- Nehmen Sie die Haut mit einer feinen Pinzette sofort medial zum rechten Ohr auf. Schneiden Sie mit einer Mikrodissektionsschere die Haut ab, die von der Pinzette gehalten wird.
HINWEIS: Die Einleitung der Inzision mit der oben beschriebenen Methode erzeugt einen abgerundeten Schnitt, der nach dem Eingriff besser zum Nähen geeignet ist. - Machen Sie einen Querschnitt beginnend mit dem ersten Schnitt zum linken Ohr (<1 cm). Machen Sie einen weiteren Schnitt, beginnend mit dem ersten Schnitt, in Richtung der Nase des Tieres (~ 2-3 mm hinter dem rechten Auge).
- Trennen Sie die Haut vom Periost mit der Pinzette und der Schere, um das Bindegewebe sanft zu durchschneiden und die Haut von Calvaria periost zu trennen.
- Tragen Sie mit einem sterilen Wattestäbchen etwas Augensalbe auf die Oberseite des Hautlappens auf. Heben Sie den Hautlappen vorsichtig auf und falten Sie ihn über das linke Auge. Der Schnittpunkt der sagittalen und koronalen Nähte sollte deutlich freigelegt werden (Abbildung 1E).
HINWEIS: Die Augensalbe wird verwendet, um den Hautlappen an Ort und Stelle zu halten. - Spülen Sie die offene Oberfläche mit sterilem PBS, um den Bereich von Blut und Resthaaren zu reinigen.
HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf eine Pinzette mit feiner Spitze, um Haare zu entfernen, die nach dem Spülen verbleiben, aber achten Sie darauf, das Periost nicht zu beschädigen.
- Nehmen Sie die Haut mit einer feinen Pinzette sofort medial zum rechten Ohr auf. Schneiden Sie mit einer Mikrodissektionsschere die Haut ab, die von der Pinzette gehalten wird.
- Mikrofrakturierung
- Um Mikrofrakturen an der Kalvarie zu erzeugen, entfernen Sie den Kolben einer 29 G Insulinspritze und schneiden Sie das hintere Ende der Spritze um die 300-400 μl Markierungen.
HINWEIS: Dieser Schritt erleichtert das Manövrieren unter einem Sezierbereich, wenn die Verletzung verursacht wird. - Platzieren Sie die Spitze einer Fase (ein bis zwei Nadelbreiten) von der koronalen Naht und ein bis zwei Nadelbreiten rechts von der sagittalen Naht in Richtung Nase (Abbildung 1E).
- Drehen Sie die Spritze vorsichtig im Uhrzeigersinn und dann mehrmals gegen den Uhrzeigersinn.
HINWEIS: Bei jungen Mäusen ist eine sehr geringe Menge an Abwärtsdruck erforderlich, um eine kreisförmige Mikrofrakturierung zu erzeugen. Achten Sie darauf, die Nadel nicht in das Gehirn eindringen zu lassen, da dies zu Blutungen führt und die Bildgebung beeinträchtigt. - Verwenden Sie eine 27 G Nadel, um die Mikrofrakturierung auf ~ 0,4 mm zu erweitern. Wenn Knochenfragmente in der Mikrofrakturierung verbleiben, spülen Sie den Bereich mit PBS. Wenn Knochenfragmente noch in der Mikrofrakturierung verbleiben, verwenden Sie die 29 G-Nadel, um sie vorsichtig herauszuschöpfen.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.2.1 bis 4.2.4, um eine Verletzung auf der linken Seite der sagittalen Naht zu verursachen.
HINWEIS: An dieser Stelle gibt es zwei Möglichkeiten: 1) sofort mit der CCL5-Behandlung (Abschnitt 4.3) und der Bildgebung (Abschnitt 5) fortfahren; oder 2) die Operationsstelle nach den postoperativen Eingriffen in Abschnitt 6 zu schließen. Betäuben Sie die Maus 24 Stunden später erneut, öffnen Sie das chirurgische Visier erneut, behandeln Sie die Verletzung mit CCL5 (Abschnitt 4.3) und führen Sie intravitale Bildgebung (Abschnitt 5) und postoperative Versorgung (Abschnitt 6) durch.
- Um Mikrofrakturen an der Kalvarie zu erzeugen, entfernen Sie den Kolben einer 29 G Insulinspritze und schneiden Sie das hintere Ende der Spritze um die 300-400 μl Markierungen.
- CCL5 Behandlung
- Stellen Sie aus einem Vorrat an RANTES (100 ng / ml) eine Lösung von 10 ng / ml unter Verwendung einer Kellermembranmatrix her (Materialtabelle). Halten Sie diese Lösung auf Eis, um die Matrix in flüssiger Form zu halten.
- Behandeln Sie jede Verletzung mit 2 μL CCL5 (10 ng / μL) mit einer 2-20 μL Pipette (diese Pipettenspitze hat einen größeren Durchmesser, was bei Verwendung einer viskosen Flüssigkeit effektiver ist). Lassen Sie die Matrix erstarren.
- Sobald die Matrix erstarrt ist, bedecken Sie die Kalvarie vorsichtig mit dem Hautlappen, um sicherzustellen, dass das Gewebe nicht dehydriert wird. Inkubieren Sie 1 Stunde vor der Bildgebung.
5. Intravitale Bildgebung
- Mikroskop-Einstellungen
- Schalten Sie den Multiphotonenlaser (Femtosekunden-Titan-Saphir-Laser) ein. Stellen Sie die Wellenlänge auf 880 nm ein und passen Sie die Leistung für die Bildgebung des Knochens der zweiten harmonischen Generation (SHG) (440 nm) an.
- Schalten Sie die 488 nm und 561 nm Festkörperlaser zur Anregung von GFP- bzw. tdTomato-exprimierenden Zellen ein.
- Schalten Sie PMT-Detektoren (Photomultiplier tube) für Signale der zweiten harmonischen Generation (405–455 nm Detektion) und GFP (505–550 nm Detektion) ein. Schalten Sie den HyD 3-Detektor für das Tomatensignal (590–620 nm Erkennung) ein.
- Montage
- Bevor Sie die Maus zum Zielfernrohr bewegen, überprüfen Sie die Visuelle Ebene der Calvaria, indem Sie vorsichtig den Hinterkopf der Maus drücken. Wenn die Ebene nicht eben ist, passen Sie die Position an, indem Sie die Mausstütze vorsichtig nach links oder rechts drehen.
HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt, um eine ausreichende Bildqualität zu gewährleisten. - Sterile 2% Methylcellulose in Wasser (w/v) auftragen, um die gesamte Calvaria und den Hautlappen abzudecken und ein Austrocknen des Gewebes zu verhindern.
- Setzen Sie die Maus auf das motorisierte Mikroskoptisch der XYZ-Achse (Abbildung 1G). Richten Sie die Maus mit dem epifluoreszierenden Licht so aus, dass 1) sie dem Mikroskop zugewandt ist und 2) der Schnittpunkt der koronalen und sagittalen Nähte der zentrierte Bezugspunkt der Stufe ist.
- Legen Sie die Glasabdeckung auf den Bildbereich, und überprüfen Sie die Ausrichtung (Abbildung 1H).
- Bevor Sie die Maus zum Zielfernrohr bewegen, überprüfen Sie die Visuelle Ebene der Calvaria, indem Sie vorsichtig den Hinterkopf der Maus drücken. Wenn die Ebene nicht eben ist, passen Sie die Position an, indem Sie die Mausstütze vorsichtig nach links oder rechts drehen.
- Zeitraffer-Bildgebung
- Verwenden Sie eine Linse mit geringer Vergrößerung (25-faches Wasserimmersionsobjektiv mit NA = 0,95), um die Kalvarie zu scannen. Erfassen Sie ein Referenzbild der sagittalen und koronalen Nahtkreuzung.
- Lokalisieren Sie mithilfe der SHG- und Fluoreszenzsignale der Zellen jeden Verletzungssichtpunkt und zeichnen Sie die XYZ-Koordinaten sowie die Entfernungen von den sagittalen und koronalen Nähten auf (Abbildung 2B).
- Wählen Sie eine Position auf den koronalen oder sagittalen Nähten für die Langzeitbildgebung. Nehmen Sie während der Bildgebung ein detailliertes Z-Stack-Bild dieses Bereichs aus der Referenz auf.
HINWEIS: Da die Nähte eine bekannte P-SSC-Nische darstellen, werden die Zellen als Reaktion auf die Calvaria-Verletzung von hier aus wandern. - Verwenden Sie die Einstellungen der Zeitraffer-Software, um mindestens 1 Stunde lang alle 1 Minute ein Bild aufzunehmen. Vergleichen Sie in der Zeit zwischen den Schnappschüssen das aktuelle Sichtfeld mit dem anfänglichen Sichtfeld. Wenn sie unterschiedlich sind, verwenden Sie das Z-Stack-Bild, um zu bestimmen, in welche Richtung das Sichtfeld angepasst werden muss.
6. Postoperative Tierpflege
- Nach der Bildgebung spülen Sie die exponierte Calvaria mit sterilem PBS ab, um die Methylcellulose zu entfernen.
- Um den Schnitt zu schließen, legen Sie den Hautlappen vorsichtig über die Kalvarie. Verwenden Sie sterile Wattestäbchen, um Reste der Augensalbe zu entfernen und die Inzisionsstelle zu trocknen.
- Mit monofilen Nylon 5-0 größe nicht resorbierbaren Nähten mit einer angebrachten C-1 Reverse Cutting Nadel, schließen Sie die Operationsstelle. Verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen, um eine dreifache antibiotische Salbe auf den geschlossenen Schnitt aufzutragen.
HINWEIS: Narbenbildung wird durch hochwertige Nahttechniken und minimale Blutungen reduziert. - Legen Sie die Maus in einen sauberen Käfig auf einer warmen Oberfläche und überprüfen Sie alle 15 Minuten, bis das Sternalreservieren erreicht ist.
- Verabreichen Sie eine zweite Dosis Buprenorphin mit verzögerter Freisetzung 72 h nach der Operation.
- Überwachen Sie täglich das Häuschungsverhalten, das gekräuselte Fell und / oder den Mangel an Gehfähigkeit, bis die Nähte entfernt werden (~ 1 Woche).
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Representative Results
Es wurde vorgeschlagen, dass Skelettvorläufer ein Migrations- oder Kreislaufpotenzial haben20. Kürzlich wurden Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) Reportermäuse erzeugt, bei denen P-SSCs durch Mx1+α SMA+ Doppelmarkierung gekennzeichnet sind (Abbildung 2A,B). Innerhalb von 24–48 h nach der Verletzung fand eine erhebliche Migration von Mx1+α SMA+ P-SSCs aus dem Nahtmesenchym statt11. Ebenfalls getestet wurde die Möglichkeit, in vivo P-SSC Migration in Echtzeit 24 h nach einem Calvaria-Defekt nachzuweisen. Innerhalb von 1 h nach der Bildgebung wurde eine geringe bis gar keine Migration von Mx1+αSMA+ P-SSCs beobachtet (Abbildung 2C).
Mx1+α SMA+ P-SSCs exprimieren auf einzigartige Weise den CCL5-Rezeptor CCR511. So induzierte die Behandlung eines Calvaria-Defekts 24 h nach der Verletzung mit CCL5 eine richtungsweisende Migration weg von der koronalen Naht und in Richtung des Verletzungssichts (Abbildung 2D,E). Innerhalb von 1 h nach der Bildgebung wanderte einer der Mx1+αSMA+ P-SSCs etwa 50 μm in Richtung der Verletzung (Abbildung 2E). Andere Mx1+αSMA+ P-SSCs wurden ebenfalls beobachtet, wie sie als Reaktion auf die CCL5-Behandlung migrierten, jedoch in geringerem Maße.
Abbildung 1: Aufbau für die In-vivo-Bildgebung von Mauskalvarien. Repräsentative Bilder der Mausfessel (A) und der Bildgebungshalterung (B), die während der Live-Bildgebung verwendet werden. (C) Maus in der Rückhalteeinrichtung und an der Bildhalterung befestigt. (D) Schematische Darstellung der Calvaria-Struktur der Maus, Identifizierung der frontalen (FS), koronalen (CS), sagittalen (SS) und lambdoiden (LS) Nähte. (E) Repräsentative Platzierung von Calvaria-Mikrofrakturverletzungen. (F) Postoperative chirurgische Nahtplatzierung für optimale Heilung und zukünftige Bildgebung. Repräsentative Bilder der Montageplatzierung auf dem Mikroskoptisch (G) und der Deckglasplatzierung (H). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Echtzeit-In-vivo-Bildgebung der Mx1+αSMA+ P-SSC-Migration. (A) Schematische Darstellung der Mx1/Tomato/αSMA-GFP Dual Reporter Mäuse Zubereitung. Den Mäusen wurde intraperitoneal 10 Tage lang jeden zweiten Tag 25 mg/kg pIpC injiziert (1). Mx1/Tomato/αSMA-GFP-Mäuse wurden 1 Tag vor intravenöser Transplantation von 1 x 106 mononukleären Zellen des gesamten Knochenmarks aus WT C57BL/6-Mäusen tödlich mit 9,5 Gy (2) bestrahlt (3). Nach 6-8 Wochen Genesung (wenn die hämatopoetischen Zellen des Wirts weniger als 5% betrugen), wurden Mäuse Knochenverletzungsexperimenten unterzogen. Mx1+ (Tomato+), αSMA+ (GFP+), Mx1+α SMA+ (Tomate+GFP+) und Knochen (blau). (B) Maximale Z-Projektion einer repräsentativen Calvaria-Verletzung (weißer Kreis) und bildgebende (weißes Quadrat) Positionen in Bezug auf sagittale (SS) und koronale (CS) Nähte von Mx1/Tomato/αSMA-GFP-Maus. Gepunktete Linien stellen Calvaria-Nähte dar. (C) In-vivo-Bildgebung von Mx1+α SMA+ P-SSCs Reaktion 24 Stunden nach der Verletzung. Maßstabsleiste = 25 μm. (D) 24 h nach der Verletzung wurde CCL5 bei der Verletzungssicht verabreicht, und die In-vivo-Bildgebung wurde 1 h später in Bezug auf die koronale Naht (CS) durchgeführt. Weißes Quadrat stellt die Position der Zellmigrationsbilder dar, die in (E) gezeigt werden. Maßstabsleiste = 75 μm. (E) Migration von Mx1+α SMA+ P-SSCs auf der Knochenoberfläche (blau) in Richtung des Verletzungsvisiers (oben rechts). Maßstabsleiste = 25 μm. In (C,D,E) geben die Zahlen den Zeitpunkt der Bildgebung an. Der gelbe Pfeil zeigt die Richtung des Verletzungsortes an. Ein Sternchen kennzeichnet den Migrationspfad von Mx1+α SMA+ P-SSC. Das Bild ist repräsentativ für die Ergebnisse von drei bis fünf Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Während der Knochenheilung sind Periostzellen die Hauptquelle für neu differenzierte Chondrozyten und Osteoblasten innerhalb einer Verletzungskalus3. Ähnlich wie im Knochenmark wurden auch osteogene/chondrogene SSCs im Periost identifiziert4,5,6. Die Bewertung der endogenen P-SSC-Funktionsmerkmale ist technisch anspruchsvoll. Oft wird die Migrationsdynamik von SSCs in vitro bewertet, was die Interpretation ihrer entsprechenden In-vivo-Systeme schwierig macht. Aufgrund der jüngsten Fortschritte in der intravitalen Mikroskopie lebender Tiere und der Erzeugung zusätzlicher Reportermäuse (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) ist nun eine In-vivo-Verfolgung einzelner Zellen möglich. Somit ermöglicht diese Methode die In-vivo-Aufzeichnung der CCL5-induzierten P-SSCs-Migration in Echtzeit.
Es gibt mehrere technische Herausforderungen, die mit dieser Methode verbunden sind, die die Konsistenz der Bildgebung beeinflussen können. Eine große technische Herausforderung bei dieser Methode ist die Aufrechterhaltung der Z-Achsen-Sichtebene. Die Z-Achsendrift (Z-Drift) ist ein häufiges Problem bei der Langzeitbildgebung von festen und lebenden Proben und wird weitgehend auf Temperaturänderungen in der Bildgebungsumgebung zurückgeführt. Obwohl diesem Artefakt nicht vollständig entgegengewirkt werden kann, hilft die Abdeckung der Bühne, der Objektivlinsen und der Stützstrukturen, die Z-Drift21 zu reduzieren.
Darüber hinaus wird durch das Abrufen einer Z-Stack-Serie des Bildgebungsorts vor der Zeitraffer-Bildgebung eine Referenz der Z-Achse hergestellt, auf die zwischen den Bildaufnahmen Verwiesen werden kann (d. h. Bilder werden typischerweise alle 30-60 s aufgenommen, was bei Bedarf Zeit für Anpassungen an der Z-Achse ermöglicht). Eine weitere technische Herausforderung besteht darin, eine konsistente Mikrofrakturierung herzustellen, die die gleiche Größe, Form und Entfernung von den Calvaria-Nähten hat. Der Abstand zu den koronalen und sagittalen Nähten ist kritisch, da die Calvaria-Nähte eine Nische für ruhende SSCs10 sind. Die beste Methode, um die Variabilität der Mikrofrakturierung zu reduzieren, besteht darin, diese Technik bei Mäusen zu üben, die nicht in die endgültige Analyse einbezogen werden.
Trotz der Einschränkungen bietet diese Methode ein einzigartiges System zur Beurteilung der individuellen zellulären Reaktion in vivo auf eine Knochenverletzung. Da die Frakturreparatur ein hochkomplexer Prozess ist, an dem mehrere Zelltypen beteiligt sind, gibt es mehrere Aspekte, die nicht vollständig verstanden sind. Eine davon beinhaltet die frühe Migrationsreaktion von P-SSCs auf eine Verletzung. Während CCR5/CCL5 ein einzigartiger Mechanismus ist, durch den P-SSCs für eine Verletzung rekrutiert werden, ist es möglich, dass zusätzliche Zytokine und Wachstumsfaktoren eine wichtige Rolle bei der Frakturheilung spielen. Bisher hat die Behandlung von Frakturen mit verschiedenen Zytokinen und Wachstumsfaktoren zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen in der gesamten Frakturheilung geführt22. Diese bildgebungsweise Methode bietet eine einzigartige Plattform, um die physiologischen Auswirkungen potenzieller Arzneimittel-/Zytokin-/Wachstumsfaktortherapien auf individuelle zelluläre Reaktionen zu bestimmen. Schließlich liefert es in vivo mechanistische Daten, die die Verbesserung der Frakturheilung durch eine bestimmte Therapie unterstützen können.
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Disclosures
L.C.O. und D.P. legen ein angemeldetes Patent mit dem Titel "Periosteal Skeletal Stem Cells in Bone Repair" (BAYM. P0264US. P1). Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch den Bone Disease Program of Texas Award, den Caroline Wiess Law Fund Award und das NIAMS der National Institutes of Health unter den Award-Nummern R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 bis D.P. unterstützt. Wir danken M.E. Dickinson und T.J. Vadakkan im BCM Optical Imaging and Vital Microscopy Core und den BCM Advanced Technology Cores mit Mitteln von NIH (AI036211, CA125123 und DK056338).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ½” optical post | ThorLabs | TR2 | For imaging mount |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 27G needle | BD PercisionGlide | 305111 | |
| 29G insulin syringe | McKesson | 102-SN05C905P | |
| 50 mL conicol tube | Falcon | 352098 | For mouse restraint |
| Adjustable angle plate | Renishaw | R-PCA-5023-50-20 | For imaging mount |
| Alcohol wipes | Coviden | 6818 | |
| betadine surgical scrub | Henry Schen | 67618-151-16 | |
| Buprenorphine SR-LAB | ZooPharm | 1mg/mL Sustained Release | |
| Combo III | Obtained from staff veterinarian | N/A | 37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine |
| Coverslip | Fisher | 12-545-87 | 24 x 40 premium superslip |
| Fine tip forcepts | FST | 11254-20 | |
| Ketamine | KetaVed | 50989-161-06 | 100 mg/mL |
| Leica TCS SP8MP with DM6000CFS | Leica Microsystems | N/A | |
| Matrigel | R & D Systems | 344500101 | |
| Medical tape | McKesson | 100199 | 3" x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m) |
| Methocellulose | Electron Microscopy Sciences | 19560 | |
| Microdissection scissors | FST | 1456-12 | |
| Motorized stage | Anaheim automation | N/A | |
| Needle holder | FST | 12500-12 | |
| Nonabsorbable sutures | McKesson | S913BX | monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle |
| Opthalmic ointment | Rugby | 0536-1086-91 | |
| RANTES | Biolegend | 594202 | 10 µg/50 µL |
| Right-angle clamp for ½” post, 3/16” Hex | ThorLabs | RA90 | For imaging mount |
| Spring-loaded 3/16” Hex-locking ¼” thumbscrew | ThorLabs | TS25H | For imaging mount |
| Sterile cotton swabs | Henry Schen | 100-9249 | |
| Sterile DPBS (1x) | Corning | 21-030-CV | |
| Sterile drapes | McKessen | 25-517 | |
| Surgical gloves | McKessen | 3158VA | |
| Triple antibiotic ointment | Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc. | 51672-2120-2 | |
| Vacutainer blood collection set | BD | REF 367298 | 25G butterfly needle infusion set with 12" tubing |
References
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