Summary
Este protocolo descreve a detecção da migração de células-tronco periósteis periósteis mediadas pelo CCL5 em tempo real usando microscopia intravital animal viva.
Abstract
As células-tronco esqueléticas periosteais (P-SSCs) são essenciais para a manutenção e reparação óssea ao longo da vida, tornando-as um foco ideal para o desenvolvimento de terapias para melhorar a cicatrização da fratura. As células periosteais migram rapidamente para uma lesão para fornecer novos condrócitos e osteoblastos para cicatrização de fraturas. Tradicionalmente, a eficácia de uma citocina para induzir a migração celular só tem sido conduzida in vitro realizando um ensaio transwell ou scratch. Com os avanços na microscopia intravital utilizando excitação multifotífica, descobriu-se recentemente que 1) P-SSCs expressam o gene migratório CCR5 e 2) tratamento com o ligante CCR5 conhecido como CCL5 melhora a cicatrização da fratura e a migração de P-SSCs em resposta ao CCL5. Estes resultados foram capturados em tempo real. Descrito aqui é um protocolo para visualizar a migração P-SSC do nicho de células-tronco esqueléticas de sutura calvarial (SSC) para uma lesão após o tratamento com CCL5. O protocolo detalha a construção de um suporte de contenção e imagem do rato, preparação cirúrgica do rato calvaria, indução de um defeito de calvaria e aquisição de imagens de lapso de tempo.
Introduction
O reparo da fratura é um processo dinâmico e multicelular distinto do desenvolvimento e remodelação esquelético embrionário. Durante esse processo, a indução de sinais de lesão do tecido danificado é seguida pelo rápido recrutamento, proliferação e subsequente diferenciação das células esqueléticas de tronco/progenitor, que são todas fundamentais para a estabilidade geral e fixação de fraturas1. Em particular, os estágios iniciais da cicatrização da fratura requerem a formação de calo macio, que é atribuída principalmente às células residentes periosteis2. Quando os ossos são feridos, um subconjunto de células periosteais responde rapidamente e contribui para intermediários de cartilagem e osteoblastos recém-diferenciados dentro do calo3, implicando a presença de uma distinta população de células-tronco/progenitoras esqueléticas dentro do peristeum. Portanto, a identificação e caracterização funcional das células-tronco esqueléticas residentes no periosteum (SSCs) constituem uma abordagem terapêutica promissora para doenças ósseas degenerativas e defeitos ósseos4.
Acredita-se que os SSCs residam em vários locais de tecido, incluindo a medula óssea. Semelhante à medula óssea, os SSCs osteogênicos/condrogênicos também foram identificados no periosteum4,5,6. Estes SSCs periosteais (P-SSCs) podem ser rotulados com marcadores de linhagem mesenquimal precoces (ou seja, Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 e Axin2-CreER8) durante o desenvolvimento do osso fetal4,7,8,9,10. Uma limitação significativa desses modelos de rastreamento de linhagem genética única é que há heterogeneidade substancial dentro de populações celulares rotuladas. Além disso, eles não podem distinguir SSCs rotulados de seus descendentes in vivo. Para lidar com essa limitação, desenvolvemos recentemente um mouse repórter duplo (Mx1-Cre+Rosa26-Tomate+α SMA-GFP+) para visualizar distintamente P-SSCs de SSCs de medula óssea (BM-SSCs)11. Com este modelo, foi determinado que os P-SSCs são marcados pela rotulagem dupla Mx1+αSMA+, enquanto as células Mx1+ mais diferenciadas residem nas superfícies de medula óssea, endosteal e periosteal, e ossos cortical e trabecular11,12.
Várias citocinas e fatores de crescimento são conhecidos por regular a remodelação e reparação óssea e foram testados para o aprimoramento da reparação esquelética em defeitos críticos do segmento1,13. No entanto, devido à complexidade celular dos modelos de lesões gerados pela ruptura da barreira física do compartimento ósseo, os efeitos diretos dessas moléculas na migração e ativação endógena P-SSC durante a cicatrização não são claros. As características funcionais e a dinâmica migratória dos SSCs são frequentemente avaliadas in vitro pela realização de um ensaio transwell ou scratch, em combinação com citocinas ou fatores de crescimento conhecidos por induzir migração em outras populações celulares. Assim, a interpretação dos resultados desses experimentos in vitro para aplicação em seus sistemas in vivo correspondentes é desafiadora. Atualmente, a avaliação in vivo da migração de células-tronco/progenitor esqueléticos não é normalmente observada em tempo real; em vez disso, é medido em pontos de tempo fixos após a fratura5,7,14,15,16.
Uma limitação desse método é que a migração não é avaliada em um nível unicelular; em vez disso, é medido através de mudanças nas populações celulares. Devido aos recentes avanços na microscopia intravital animal vivo e à geração de ratos repórteres adicionais, o rastreamento in vivo de células individuais agora é possível. Utilizando microscopia intravital animal viva, observamos a migração distinta de P-SSCs do nicho de sutura da calvaria para uma lesão óssea dentro de 24-48 h pós-lesão em camundongos Mx1/Tomate/αSMA-GFP.
O CCL5/CCR5 foi recentemente identificado como um mecanismo regulatório que influenciou os P-SSCs de recrutamento e ativação durante a resposta precoce de lesões. Curiosamente, não houve detecção de migração P-SSC substancial em resposta a uma lesão em tempo real. No entanto, o tratamento de uma lesão com CCL5 produz uma migração robusta e direcionalmente distinta de P-SSCs, que pode ser capturada em tempo real. Portanto, o objetivo deste protocolo é fornecer uma metodologia detalhada para o registro da migração in vivo de P-SSCs em tempo real após o tratamento com CCL5.
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Protocol
Todos os camundongos foram mantidos em condições livres de patógenos, e todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Baylor College of Medicine.
1. Preparação do rato
- Cross Mx1-Cre17 e Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 ratos (comprados do Laboratório Jackson) com camundongos αSMA-GFP (fornecidos aqui pelos Drs. Ivo Kalajzic e Henry Kronenberg) para gerar ratos repórteres Mx1-Cre+Rosa26-Tomate+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomate/αSMA-GFP) (Figura 2A).
- Para indução Mx1-Cre, injete camundongos com 25 mg/kg pIpC a cada dois dias durante 10 dias.
- Camundongos irradiados com 9,5 Gy 1 dia antes do transplante intravenoso de 1 x 106 células mononucleares de medula óssea inteiras de camundongos tipo selvagem C57BL/6 (WT-BMT)19.
- Após 6 a 8 semanas de recuperação, sujeitos a camundongos a imagem in vivo do protocolo de migração celular periosteal descrito abaixo.
NOTA: Irradiação e WT-BMT de camundongos Mx1-Cre são necessários para eliminar células hematopoiéticas endógenas rotuladas por Mx1 que podem responder a uma lesão. De seis a oito semanas após a irradiação, a contagem de células hematopoiéticas do hospedeiro está em <5% e, portanto, pronta para imagens19.
2. Contenção do rato e montagem de imagem
- Crie uma contenção do mouse com um tubo cônico de 50 mL (Figura 1A).
- Usando uma tesoura pontiaguda, faça um buraco na parte inferior do cônico. Corte do orifício inferior até o topo do cônico (o lado cortado será o topo da contenção).
- Faça um corte de aproximadamente 4-5 cm de comprimento paralelo ao corte anterior e metade abaixo (~2 cm) do topo da contenção. Remova esta seção do cônico e liso as bordas foram necessárias.
- Construa um suporte de imagem de tubo cônico usando uma placa angular ajustável, um poste óptico de 0,5" e um grampo de ângulo reto para o poste de 0,5", Hex de 0,1875" (Figura 1B e Tabela de Materiais).
- Ajuste a placa angular para um ângulo de 35°. No lado esquerdo da placa angular, enrosque o poste óptico no segundo orifício da parte de trás da placa.
- No lado direito da placa ajustável, insira um parafuso de 0,1875" hexarifado de 0,25" na segunda furo da frente e último furo na placa. O grampo de ângulo reto será usado com o poste óptico para fixar a contenção cônica do mouse no lugar.
3. Procedimento cirúrgico pré-operatório
- Anestesia do rato
- Para o tratamento da dor, injete subcutâneamente o camundongo com buprenorfina de liberação sustentada (1 mg/kg BW) 30-60 min antes da cirurgia.
- Camundongos anestesiadores usando a combinação de roedor III CCM (combo III) anestésia contendo 37,5 mg/mL de cetamina, 1,9 mg/mL de xilazina e acepromazina de 0,37 mg/mL. A dosagem apropriada para camundongos é de 0,75-1,50 mL por 1 kg de peso corporal. A dose durará de 30 a 45 min.
- Uma vez que o rato seja anestesiado, aplique pomada oftálmica nos olhos com um cotonete estéril para evitar a desidratação dos olhos.
- Para imagens de longo prazo (>45 min), administre novamente a anestesia para manter a profundidade anestésica adequada da seguinte forma.
- Prepare uma seringa de 1 mL com uma quantidade suficiente de combo III para manter a anestesia para a duração da imagem planejada (0,75 mL/kg BW por 30 min de sedação adicional). Conecte um conjunto de infusão de agulha de borboleta de 25 G com tubos de 12" à seringa e empurre o anestésico através da tubulação e agulha.
- Insira a agulha borboleta intraperitoneally e, em seguida, grave a agulha no lugar.
NOTA: É assim que o combo III adicional será administrado durante a imagem de tal forma que não há necessidade de mover o animal ou interromper o plano de visão.
- Forneça suporte térmico com uma almofada de aquecimento mantida a 37°C durante todo o procedimento. Para uma imagem prolongada (>1hr) será necessário suporte adicional de fluido. Os fluidos suplementares podem ser fornecidos I.P. com combo III adicional durante a imagem ou 33 mL/kg salino (0,9 NaCl) subcutânea.
- Contenção do rato e preparação do local cirúrgico
- Use cortadores para remover o máximo de cabelo possível da parte superior da cabeça. Aplique creme depilatório na área raspada para remover qualquer cabelo restante no local cirúrgico.
- Certifique-se de que o mouse está totalmente anestesiado pela falta de resposta às pitadas dos dedos dos dedos. Após 15 min, se o mouse não estiver totalmente anestesiado, administre uma segunda dose menor de combo III (<0,75 mL/kg BW).
- Coloque o mouse na tampa da cauda primeiro, deslizando-o para trás o suficiente para trás, de tal forma que o nariz paira ligeiramente sobre a borda do cônico.
- Grave as patas dianteiras na parte inferior do tubo cônico usando fita médica.
- Coloque o tubo cônico com o mouse em uma montagem de imagem que é definida em um ângulo de 35° e fixe usando o grampo de ângulo reto (Figura 1C).
- Uma vez que o rato esteja seguro no suporte de imagem, limpe o local cirúrgico 3x com esfoliantes alternados de esfoliação betadina e 70% de álcool isopropílico. Novamente, verifique se o animal está totalmente sedado.
- Mova o mouse para uma almofada absorvente limpa e coloque uma cortina sobre o mouse para criar um grande campo estéril.
4. Procedimento cirúrgico
- Abertura incisão
- Usando fórceps finos, pegue a pele imediatamente medial para a orelha direita. Com uma tesoura de microdisseção, corte a pele que está sendo mantida pelos fórceps.
NOTA: Iniciar a incisão utilizando o método descrito acima cria uma incisão arredondada mais adequada para sutura após o procedimento. - Faça uma incisão transversal a partir da incisão inicial em direção à orelha esquerda (<1 cm). Faça outra incisão, a partir da incisão inicial, em direção ao nariz do animal (~2-3 mm além do olho direito).
- Separe a pele do periósteo usando as fórceps e a tesoura para cortar suavemente o tecido conjuntivo que separa a pele do periosteum calvaria.
- Usando um cotonete estéril, aplique alguma pomada oftálmica no topo da aba da pele. Pegue suavemente a aba da pele e dobre-a sobre o olho esquerdo. A intersecção das suturas sagiais e coronais deve ser claramente exposta (Figura 1E).
NOTA: A pomada oftalmômica é usada para manter a aba da pele no lugar. - Lave a superfície aberta com PBS estéril para limpar a área de qualquer sangue e cabelo residual.
NOTA: Se necessário, use fórceps finos para remover os cabelos que permanecem após a descarga, mas tenha cuidado para não danificar o periósteo.
- Usando fórceps finos, pegue a pele imediatamente medial para a orelha direita. Com uma tesoura de microdisseção, corte a pele que está sendo mantida pelos fórceps.
- Microfratura
- Para gerar microfraturas na calvária, remova o êmbolo de uma seringa de insulina de 29 G e corte a parte de trás da seringa, em torno das marcas de 300-400 uL.
NOTA: Esta etapa facilita a manobra sob um escopo de dissecção ao produzir a lesão. - Coloque a ponta de um bisel (uma a duas larguras de agulha) em direção ao nariz a partir da sutura coronal e de uma a duas larguras de agulha à direita da sutura sagital (Figura 1E).
- Gire suavemente a seringa no sentido horário, depois no sentido anti-horário várias vezes.
NOTA: Em camundongos jovens, uma quantidade muito pequena de pressão descendente é necessária para criar uma microfratura circular. Tenha cuidado para não deixar a agulha penetrar no cérebro, pois isso causará sangramento e interferirá com a imagem. - Use uma agulha de 27 G para ampliar a microfratura para ~0,4 mm. Se os fragmentos ósseos permanecerem na microfratura, lave a área com PBS. Se os fragmentos ósseos ainda permanecerem na microfratura, use a agulha de 29 G para retirá-los suavemente.
- Repita os passos 4.2.1-4.2.4 para criar uma lesão no lado esquerdo da sutura sagital.
NOTA: Neste ponto, há duas opções: 1) seguir imediatamente para o tratamento CCL5 (seção 4.3) e imagem (seção 5); ou 2) fechar o local cirúrgico seguindo os procedimentos pós-operatórios na seção 6. Às 24 horas depois, anestesiar novamente o camundongo, reabrir a visão cirúrgica, tratar a lesão com CCL5 (seção 4.3) e realizar imagens intravitais (seção 5) e cuidados pós-operatórios (seção 6).
- Para gerar microfraturas na calvária, remova o êmbolo de uma seringa de insulina de 29 G e corte a parte de trás da seringa, em torno das marcas de 300-400 uL.
- Tratamento CCL5
- A partir de um estoque de RANTES (100 ng/mL), faça uma solução de 10 ng/mL usando matriz de membrana de porão (Tabela de Materiais). Mantenha esta solução no gelo para manter a matriz em forma líquida.
- Trate cada lesão com 2 μL de CCL5 (10 ng/μL) usando uma pipeta de 2-20 μL (esta ponta de pipeta tem um diâmetro maior, que é mais eficaz ao usar um líquido viscoso). Permita que a matriz se solidifique.
- Uma vez que a matriz se solidificou, cubra suavemente a calvaria com a aba da pele para garantir que o tecido não fique desidratado. Incubar por 1h antes da imagem.
5. Imagem intravital
- Configurações de microscópio
- Ligue o laser multifotônio (laser de femtosegundo de titânio-safira). Ajuste o comprimento de onda para 880 nm e ajuste a potência para a segunda imagem de geração harmônica (SHG) (440 nm) do osso.
- Ligue os lasers de estado sólido de 488 nm e 561 nm para excitação de células de voz de GFP e tdTomato, respectivamente.
- Ligue os detectores PMT (tubo fotomultiplier) para sinais de segunda geração harmônica (detecção de 405 a 455 nm) e GFP (detecção de 505-550 nm). Ligue o detector HyD 3 para o sinal de tomate (detecção de 590-620 nm).
- Montagem
- Antes de mover o mouse para o escopo, verifique o plano visual da calvaria pressionando suavemente a parte de trás da cabeça do mouse. Se o plano não estiver nivelado, ajuste a posição girando suavemente a contenção do mouse para a esquerda ou para a direita.
NOTA: Esta é uma etapa crítica para garantir qualidade de imagem suficiente. - Aplique 2% de metilcelulose estéril na água (c/v) para cobrir toda a panturrilha e retalho da pele e evitar a secagem do tecido.
- Coloque o mouse no estágio do microscópio motorizado do eixo XYZ (Figura 1G). Utilizando a luz epifluorescente, alinhe o mouse de modo que 1) ele está voltado para o microscópio e 2) a intersecção das suturas coronais e sagita é o ponto de referência central do palco.
- Coloque a tampa de vidro na área de imagem e verifique novamente o alinhamento (Figura 1H).
- Antes de mover o mouse para o escopo, verifique o plano visual da calvaria pressionando suavemente a parte de trás da cabeça do mouse. Se o plano não estiver nivelado, ajuste a posição girando suavemente a contenção do mouse para a esquerda ou para a direita.
- Imagem de lapso de tempo
- Use uma lente de baixa ampliação (objetivo de imersão em água de 25x com NA = 0,95) para escanear a calvaria. Adquirir uma imagem de referência da intersecção sagital e coronal de sutura.
- Usando os sinais SHG e fluorescentes das células, localize cada visão de lesão e registre as coordenadas XYZ, bem como as distâncias das suturas sagita e coronal (Figura 2B).
- Escolha um local nas suturas coronais ou sagitas para imagens de longo prazo. Tire uma imagem detalhada da pilha Z desta área a partir da referência durante a imagem.
NOTA: Como as suturas representam um nicho P-SSC conhecido, é de onde as células migrarão em resposta à lesão da calvária. - Use as configurações do software time-lapse para gravar uma imagem a cada 1 minuto por pelo menos 1 h. No tempo entre instantâneos, compare o campo de visão atual com o campo de visão inicial. Se forem diferentes, use a imagem da pilha Z para determinar em que direção o campo de visão precisa ser ajustado.
6. Cuidados com animais pós-operatórios
- Após a imagem, enxágue a calvária exposta com PBS estéril para remover o metilcelulose.
- Para fechar a incisão, coloque suavemente a aba da pele sobre a calvaria. Use cotonetes estéreis para remover a pomada oftalmómica residual e secar o local da incisão.
- Utilizando suturas nãoabsorbáveis de nylon de monofilamento 5-0 com uma agulha de corte reversa C-1 anexada, feche o local cirúrgico. Use um cotonete estéril para aplicar pomada antibiótico tripla à incisão fechada.
NOTA: As cicatrizes são reduzidas com técnicas de sutura de alta qualidade e sangramento mínimo. - Coloque o mouse em uma gaiola limpa em uma superfície quente e verifique a cada 15 minutos até que a recumedência severa seja alcançada.
- Administre uma segunda dose de buprenorfina de liberação sustentada 72 h após a cirurgia.
- Monitore diariamente o comportamento amontoado, a pele de babados e/ou a falta de ambulação até que as suturas sejam removidas (~1 semana).
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Representative Results
Progenitores esqueléticos foram propostos para ter potencial migratório ou circulatório20. Recentemente, foram gerados ratos repórteres Mx1-Cre+Rosa26-Tomate+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomate/αSMA-GFP), nos quais os P-SSCs são marcados por rotulagem dupla Mx1+α SMA+ (Figura 2A,B). A migração substancial de Mx1+α SMA+ P-SSCs ocorreu fora da sutura mesenchyme dentro de 24-48 h pós-lesão11. Também foi testada a possibilidade de detectar a migração in vivo P-SSC em tempo real 24 h após um defeito de calvaria. Pouco ou nenhum migração de P-SSCs Mx1+αSMA+ foi observada dentro de 1 h de imagem (Figura 2C).
Mx1+α SMA+ P-SSCs expressam exclusivamente o receptor CCL5 conhecido como CCR511. Assim, o tratamento de um defeito de calvária 24 h pós-lesão com CCL5 induziu a migração direcionalmente distinta para longe da sutura coronal e para a visão da lesão (Figura 2D,E). Dentro de 1 h de imagem, um dos P-SSCs Mx1+αSMA+ migraram aproximadamente 50 μm em direção à lesão (Figura 2E). Outros P-SSCs Mx1+αSMA+ também foram observados migrando em resposta ao tratamento CCL5, mas em menor grau.
Figura 1: Configuração para imagens in vivo de calvaria de rato. Imagens representativas da contenção do mouse (A) e do suporte de imagem (B) utilizadas durante a imagem ao vivo. (C) Mouse na contenção e fixado à montagem de imagem. (D) Representação esquemática da estrutura da calvária do rato, identificando as suturas frontal (FS), coronal (CS), sagital (SS) e lambdoid (LS). (E) Colocação representativa de lesões de microfratura calvaria. (F) Colocação de sutura cirúrgica pós-operatória para cura ideal e imagem futura. Imagens representativas da colocação da montagem no estágio do microscópio (G) e na colocação do deslizamento de cobertura (H). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem in vivo em tempo real da migração P-SSC Mx1+αSMA+. (A) Esquemático de Mx1/Tomate/αSMA-GFP preparação de ratos de repórter duplo. Os camundongos foram injetados intraperitonealmente com 25 mg/kg pIpC a cada dois dias durante 10 dias (1). Os camundongos Mx1/Tomate/αSMA-GFP foram letalmente irradiados com 9,5 Gy (2) 1 dia antes do transplante intravenoso de 1 x 106 células mononucleares de medula óssea inteiras de camundongos WT C57BL/6 (3). Após 6-8 semanas de recuperação (quando as células hematopoiéticas do hospedeiro wer menos de 5%), os camundongos foram submetidos a experimentos de lesão óssea. Mx1+ (Tomate+), αSMA+ (GFP+), Mx1+α SMA+ (Tomate+GFP+) e osso (azul). (B) Projeção máxima de Z de uma lesão de calvária representativa (círculo branco) e imagens (quadrado branco) em relação às suturas sagital (SS) e coronal (CS) do mouse Mx1/Tomate/αSMA-GFP. Linhas pontilhadas representam suturas de calvaria. (C) Imagem in vivo de Mx1+α SMA+ Resposta P-SSCs 24 horas após a lesão. Barra de escala = 25 μm. (D) 24 h pós-lesão, CCL5 foi administrado à vista da lesão, e a imagem in vivo foi realizada 1h depois em relação à sutura coronal (SC). O quadrado branco representa a localização das imagens de migração celular mostradas em (E). Barra de escala = 75 μm. (E) Migração de P-SSCs Mx1+α SMA+ na superfície óssea (azul) em direção à visão da lesão (superior direita). Barra de escala = 25 μm. Em (C,D,E), os números indicam o tempo da imagem. A seta amarela indica a direção da localização da lesão. O Asterisco indica o caminho migratório do Mx1+α SMA+ P-SSC. A imagem é representativa dos resultados de três a cinco ratos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Durante a cicatrização óssea, as células periosteais são a principal fonte de condrócitos e osteoblastos recém-diferenciados dentro de um calo de lesão3. Semelhante à medula óssea, os SSCs osteogênicos/condrogênicos também foram identificados no periosteum4,5,6. Avaliar características funcionais P-SSC endógenas é tecnicamente desafiador. Muitas vezes, a dinâmica migratória dos SSCs é avaliada in vitro, tornando a interpretação de seus sistemas in vivo correspondentes desafiadora. Devido aos recentes avanços na microscopia intravital animal vivo e à geração de ratos repórteres adicionais (Mx1/Tomate/αSMA-GFP), o rastreamento in vivo de células individuais é agora possível. Assim, este método permite a gravação in vivo da migração de P-SSCs induzidos por CCL5 em tempo real.
Existem vários desafios técnicos associados a este método que podem influenciar a consistência da imagem. Um grande desafio técnico com este método é manter o plano de visão do eixo Z. A deriva do eixo Z (Z-drift) é um problema comum em imagens de longo prazo de amostras fixas e vivas, e é em grande parte atribuída às mudanças de temperatura no ambiente de imagem. Embora este artefato não possa ser completamente neutralizado, cobrir o palco, lentes objetivas e estruturas de suporte ajudam a reduzir o Z-drift21.
Além disso, a obtenção de uma série Z-stack do local de imagem antes da imagem de lapso de tempo estabelecerá uma referência do eixo Z que pode ser referida entre aquisições de imagem (ou seja, imagens são tipicamente tiradas a cada 30-60 s, o que permite tempo para ajustes no eixo Z, se necessário). Outro desafio técnico é fazer uma microfratura consistente que seja do mesmo tamanho, forma e distância das suturas de calvária. A distância das suturas coronais e sagiais é crítica, pois as suturas de calvaria são um nicho para SSCs quiescentes10. O melhor método para reduzir a variabilidade da microfratura é praticar essa técnica em camundongos que não estão incluídos na análise final.
Apesar das limitações, este método fornece um sistema único para avaliar a resposta celular individual in vivo a uma lesão óssea. Uma vez que o reparo da fratura é um processo altamente complexo envolvendo múltiplos tipos de células, existem vários aspectos que não são totalmente compreendidos. Uma delas inclui a resposta migratória precoce dos P-SSCs em direção a uma lesão. Embora o CCR5/CCL5 seja um mecanismo único pelo qual os P-SSCs são recrutados para uma lesão, é possível que citocinas adicionais e fatores de crescimento desempenham um papel importante na cicatrização de fraturas. Anteriormente, o tratamento de fraturas com várias citocinas e fatores de crescimento resultou em desfechos altamente variáveis na cicatrização geral da fratura22. Este método de imagem fornece uma plataforma única para determinar os efeitos fisiológicos de terapias potenciais de drogas/citocinas/fator de crescimento em respostas celulares individuais. Por fim, fornece dados mecanicistas in vivo que podem suportar o aprimoramento de uma terapia específica da cicatrização da fratura.
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Disclosures
L.C.O. e D.P. divulgam uma patente pendente intitulada "Células-Tronco Esqueléticas Periosteais em Reparação Óssea" (BAYM. P0264Us. P1). Os demais autores não declaram interesses concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Doenças Ósseas do Texas Award, o Caroline Wiess Law Fund Award, e o NIAMS dos Institutos Nacionais de Saúde sob os números de premiação R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 para D.P. Agradecemos a M.E. Dickinson e T.J. Vadakkan no BCM Optical Imaging and Vital Microscopy Core e nos BCM Advanced Technology Cores com financiamento do NIH (AI036211, CA125123 e DK056338).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ½” optical post | ThorLabs | TR2 | For imaging mount |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 27G needle | BD PercisionGlide | 305111 | |
| 29G insulin syringe | McKesson | 102-SN05C905P | |
| 50 mL conicol tube | Falcon | 352098 | For mouse restraint |
| Adjustable angle plate | Renishaw | R-PCA-5023-50-20 | For imaging mount |
| Alcohol wipes | Coviden | 6818 | |
| betadine surgical scrub | Henry Schen | 67618-151-16 | |
| Buprenorphine SR-LAB | ZooPharm | 1mg/mL Sustained Release | |
| Combo III | Obtained from staff veterinarian | N/A | 37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine |
| Coverslip | Fisher | 12-545-87 | 24 x 40 premium superslip |
| Fine tip forcepts | FST | 11254-20 | |
| Ketamine | KetaVed | 50989-161-06 | 100 mg/mL |
| Leica TCS SP8MP with DM6000CFS | Leica Microsystems | N/A | |
| Matrigel | R & D Systems | 344500101 | |
| Medical tape | McKesson | 100199 | 3" x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m) |
| Methocellulose | Electron Microscopy Sciences | 19560 | |
| Microdissection scissors | FST | 1456-12 | |
| Motorized stage | Anaheim automation | N/A | |
| Needle holder | FST | 12500-12 | |
| Nonabsorbable sutures | McKesson | S913BX | monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle |
| Opthalmic ointment | Rugby | 0536-1086-91 | |
| RANTES | Biolegend | 594202 | 10 µg/50 µL |
| Right-angle clamp for ½” post, 3/16” Hex | ThorLabs | RA90 | For imaging mount |
| Spring-loaded 3/16” Hex-locking ¼” thumbscrew | ThorLabs | TS25H | For imaging mount |
| Sterile cotton swabs | Henry Schen | 100-9249 | |
| Sterile DPBS (1x) | Corning | 21-030-CV | |
| Sterile drapes | McKessen | 25-517 | |
| Surgical gloves | McKessen | 3158VA | |
| Triple antibiotic ointment | Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc. | 51672-2120-2 | |
| Vacutainer blood collection set | BD | REF 367298 | 25G butterfly needle infusion set with 12" tubing |
References
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).
- Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).
- Roberts, S. J., van Gastel, N., Carmeliet, G., Luyten, F. P. Uncovering the periosteum for skeletal regeneration: the stem cell that lies beneath. Bone. 70, 10-18 (2015).
- Duchamp de Lageneste, O., et al. Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin. Nature Communications. 9 (1), 773 (2018).
- Olivos-Meza, A., et al. Pretreatment of periosteum with TGF-beta1 in situ enhances the quality of osteochondral tissue regenerated from transplanted periosteal grafts in adult rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 18 (9), 1183-1191 (2010).
- Debnath, S., et al. Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation. Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).
- Ransom, R. C., et al. Axin2-expressing cells execute regeneration after skeletal injury. Scientific Reports. 6, 36524 (2016).
- Ouyang, Z., et al. Prx1 and 3.2kb Col1a1 promoters target distinct bone cell populations in transgenic mice. Bone. 58, 136-145 (2013).
- Wilk, K., et al. Postnatal Calvarial Skeletal Stem Cells Expressing PRX1 Reside Exclusively in the Calvarial Sutures and Are Required for Bone Regeneration. Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).
- Ortinau, L. C., et al. Identification of Functionally Distinct Mx1+alphaSMA+ Periosteal Skeletal Stem Cells. Cell Stem Cell. 25 (6), 784-796 (2019).
- Deveza, L., Ortinau, L., Lei, K., Park, D. Comparative analysis of gene expression identifies distinct molecular signatures of bone marrow- and periosteal-skeletal stem/progenitor cells. PLoS One. 13 (1), 0190909 (2018).
- Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Seminars in Cell and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).
- Shi, Y., et al. Gli1 identifies osteogenic progenitors for bone formation and fracture repair. Cell Stem Cell. 15 (2), 782-796 (2017).
- Zhou, B. O., Yue, R., Murphy, M. M., Peyer, J. G., Morrison, S. J. Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow. Cell Stem Cell. 15 (2), 154-168 (2014).
- Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K.
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
- Park, D., et al. Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 10 (3), 259-272 (2012).
- Nitzsche, F., et al. Concise Review: MSC Adhesion Cascade-Insights into Homing and Transendothelial Migration. Stem Cells. 35 (6), 1446-1460 (2017).
- Adler, J., Pagakis, S. N. Reducing image distortions due to temperature-related microscope stage drift. Journal of Microscopy. 210, Pt 2 131-137 (2003).
- Roberts, S. J., Ke, H. Z. Anabolic Strategies to Augment Bone Fracture Healing. Current Osteoporosis Reports. 16 (3), 289-298 (2018).
