Summary
Qui, introduciamo e descriviamo un metodo nonradioattivo e non invasivo per valutare la sintesi proteica de novo in vivo, utilizzando il nematode Caenorhabditis elegans e il recupero della fluorescenza dopo il fotobleaching (FRAP). Questo metodo può essere combinato con schermi genetici e/o farmacologici per identificare nuovi modulatori della sintesi proteica.
Abstract
Mantenere un proteoma sano è essenziale per l'omeostasi cellulare e organismosa. La perturbazione dell'equilibrio tra il controllo traslazione proteica e la degradazione istiga una moltitudine di malattie legate all'età. Il declino dei meccanismi di controllo della qualità della proteostasi è un segno distintivo dell'invecchiamento. I metodi biochimici per rilevare la sintesi proteica de novo sono ancora limitati, presentano diversi svantaggi e non possono essere eseguiti in cellule o animali vivi. Caenorhabditis elegans, essendo trasparente e facilmente geneticamente modificato, è un ottimo modello per monitorare i tassi di sintesi delle proteine utilizzando tecniche di imaging. Qui, introduciamo e descriviamo un metodo per misurare la sintesi proteica de novo in vivo utilizzando il recupero della fluorescenza dopo il fotobleaching (FRAP). Gli animali transgenici che esprimono proteine fluorescenti in cellule o tessuti specifici sono irradiati da una potente fonte di luce con conseguente fotobleaching della fluorescenza. A sua volta, la valutazione del recupero della fluorescenza significa nuova sintesi proteica nelle cellule e/o nei tessuti di interesse. Pertanto, la combinazione di nematodi transgenici, interventi genetici e/o farmacologici insieme all'imaging dal vivo dei tassi di sintesi proteica può far luce sui meccanismi che mediano il collasso della proteostasi dipendente dall'età.
Introduction
La sintesi e la degradazione delle proteine sono essenziali per l'omeostasi dell'organismo. Una moltitudine di malattie legate all'età sono istigate dalla produzione di proteinedifettose 1,2. Al fine di misurare i tassi di traduzione globale delle proteine, esistono tecniche biochimiche come la profilazione ribosomica, che prevede il sequenziamento profondo dei frammenti di mRNA protetti da riboso per monitorare l'espressione e la sintesi delle proteine3. Questo metodo, oltre ad essere una lettura indiretta dei tassi di traslazione, poiché una maggiore associazione dell'RNA ai ribosomi non significa necessariamente una maggiore traduzione, presenta svantaggi tecnici, come l'alto costo e il requisito di una grande quantità di materiale iniziale. D'altra parte, i metodi basati sulla proteomica consentono la quantificazione diretta delle proteine mediante profilazione metabolica dell'impulso seguita dall'analisi della spettrometriadi massa 4,5. Tuttavia, si tratta di un approccio semi-quantitativo con risoluzione temporale limitata che non può essere facilmente utilizzato in vivo. Inoltre, l'etichettatura della proteina può essere distribuita in modo ineguale nell'animale/tessuto di interesse. È importante sottolineare che entrambi questi metodi possono nascondere variazioni specifiche del tessuto o delle cellule nei tassi di conversione delle proteine rispettivamente in animali o tessuti interi.
Caenorhabditis elegans è un organismo modello facile da usare che può essere coltivato in grandi numeri6. Inoltre, la sua capacità genetica e la trasparenza consentono l'imaging dal vivo in vivo. Questo protocollo descrive la metodologia per rilevare i tassi di sintesi proteica utilizzando il recupero della fluorescenza dopo il fotobleaching (FRAP). Approfittiamo dell'espressione transgenica delle proteine fluorescenti, sia nell'intero organismo che in tessuti/cellule specifici. Gli animali transgenici possono esprimere GFP usando il promotore di un gene, che è ampiamente/globalmente espresso o un promotore specifico del tessuto per colpire tipi di cellule specifiche. Questa tecnica può essere estesa a un promotore specifico per esaminare i tassi di sintesi proteica di una proteina specifica.
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Protocol
NOTA: Sia le fusioni trascrizionali che trassuali in fluorofori possono essere utilizzate per valutare la traslazione delle proteine de novo in diversi tessuti. I tassi di sintesi proteica possono essere valutati per più famiglie di proteine localizzate in diversi compartimenti cellulari, tra cui citoplasma, mitocondri e nucleo7. I seguenti ceppi sono utilizzati per monitorare i tassi di sintesi proteica globale e neuronale, N2; Ex[pife-2GFP, pRF4], ife-2(ok306); Ex[pife-2GFP, pRF4], N2; Ex[punc-119GFP, pRF4], edc-3(ok1427); Ex[punc-119GFP, pRF4], N2; Ex[psod-3GFP; pRF4]
1. Manutenzione, sincronizzazione e preparazione di nematodi transgenici per il monitoraggio della sintesi proteica de novo
- Utilizzare uno stereomicroscopio sezionante per valutare le fasi di sviluppo e la crescita di tipo selvaggio (wt) e nematodi transgenici mutanti.
- Giorno 1: Utilizzare un getto di verme per selezionare e trasferire 10 larve L4 di animali transgenici wt e mutanti che trasportano il reporter fluorescente desiderato su piastre Nematode Growth Media (NGM) semitette con Escherichia coli (OP50) (Tabella 1).
- Fare un prelievo di verme attaccando un filo di platino nell'estremità affusolata di una pipetta Pasteur di vetro fondendo il vetro nel sito di contatto su un bruciatore Bunsen. Quindi, appiattire l'estremità del filo di platino in una forma spatola utilizzando qualsiasi strumento (ad esempio, pincer o martello leggero).
- Inoculare una singola colonia di batteri E. coli (OP50) in una fiaschetta contenente 50 mL di mezzo liquido Luria-Bertani (LB) e crescere per 10 ore a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di agitazione (200 giri/min; Tabella 1. Poi, semina piastre NGM con 200 L di coltura batterica. Incubare le piastre di semi a temperatura ambiente durante la notte per consentire la crescita del prato batterico.
- Incubare e far crescere i nematodi alla temperatura standard di 20 gradi centigradi.
- Giorno 5: Le piastre contengono una popolazione mista di vermi transgenici. Selezionare e trasferire 15 larve L4 di ogni ceppo su piastre OP50-NGM appena semite.
- Giorno 6: Eseguire il test FRAP e monitorare il tasso di sintesi proteica nel primo giorno dell'età adulta.
- Preparare e utilizzare cicloheximide contenente piastre NGM come controllo positivo:
NOTA: Preparare una soluzione di stock di cicloheximide diluindo in acqua ad una concentrazione di 10 mg/mL. Mantenere la soluzione di magazzino a 4 gradi centigradi.- Uccidere i batteri esponendo le piastre NGM semi per 15 minuti con la luce UV (intensità 222W/cm2).
- Aggiungere la cicloheximide sopra le piastre batteriche a 500 g/mL concentrazione finale nel volume dell'agar.
- Lasciare asciugare le piastre a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Trasferire nematodi transgenici che esprimono psod-3GFP su piastre contenenti veicoli e cicloheximide.
- Incubare gli animali per 2 h alla temperatura standard di 20 gradi centigradi.
2. Analisi FRAP con animali transgenici che esprimono giornalisti di tessuti somatici pife-2GFP e psod-3GFP
NOTA: monitorare il tasso di sintesi proteica globale in tutto il corpo animale. Questi reporter trascrizionali presentano diversi livelli di espressione e sono onnipresenti espressi in più tessuti somatici, tra cui l'intestino, pharynx e muscoli della parete del corpo.
- Raccogliere e trasferire animali transgenici adulti di 1 giorno a singole piastre NGM con una goccia di 20 L OP50 al centro.
- Rimuovere il coperchio e posizionare ogni piastra sotto una lente obiettivo 20x di un microscopio epifluorescenza.
- Mettere a fuoco e acquisire un'immagine di riferimento prima della fotobleaching (pre-bleach).
- Fotobleach ogni campione per 10 minuti.
NOTA: Interrompere il fotobleaching quando il segnale fluorescente viene spento al 30 – 50% di intensità rispetto all'immagine pre-sbiancante. L'intensità della luce e la durata del periodo di sbiancamento devono essere regolate di conseguenza per il fluorforo specifico, lo stadio animale e la cellula o il tessuto in esame. Deve essere determinata sperimentalmente la durata appropriata dell'irradiazione necessaria per raggiungere un'adeguata estensione del fotobleaching, per i diversi campioni. - Acquisire un'immagine dopo la fotobiancatura (candeggina).
- Tenere gli animali in singole piastre NGM e lasciarli recuperare.
- Immagine e registrazione del recupero di ogni reporter fluorescente ogni 1 ora per almeno 6 ore in uno stereomicroscopio a fluorescenza.
- In alternativa, eseguire la valutazione del recupero fluorescente utilizzando un microscopio epifluorescenza (ad esempio, AxioImager n. 2).
- Valutare attentamente la salute degli animali per animale monitorando la loro locomozione, la sensibilità al tatto, la capacità riproduttiva e la sopravvivenza nei prossimi 3 giorni. I nematodi che mostrano segni di danni dopo il fotobleaching sono stati esclusi da ulteriori analisi.
3. Montare i campioni ed eseguire il test FRAP utilizzando nematodi transgenici che esprimono GFP pan-neuronally citoplasmic, punc-119GFP
NOTA: Monitorare la sintesi delle proteine pan-neuronali mediante fotobleaching mirato nella regione della testa, dove si trova l'anello nervoso.
- Preparare 2% pastiglie di agarose.
- Aggiungere una goccia di 10 L di buffer M9 al centro del pad di agarose.
- Trasferire 5 nematodi transgenici che esprimono GFP pan-neuronamica citoplasmica in una goccia di buffer M9.
- Utilizzare una ciglia per diffondere il liquido.
NOTA: Gli animali mostrano movimenti ridotti entro 2 minuti a causa dell'assorbimento M9 nell'agar. - Modificare la posizione del nematode per evitare la sovrapposizione utilizzando un prelievo "occhio".
- Posizionare il campione sotto una lente obiettivo 40x di un microscopio epifluorescenza.
NOTA: non utilizzare un coverslip. - Mettere a fuoco e acquisire un'immagine di riferimento (pre-candeggina).
- Fotobleach l'area di interesse mirata per 90 secondi.
NOTA: Interrompere il fotobleaching quando il segnale fluorescente viene spento al 30 – 50% di intensità rispetto all'immagine pre-sbiancante. L'intensità della luce e la durata del periodo di sbiancamento devono essere regolate di conseguenza per il fluorforo specifico, lo stadio animale e la cellula o il tessuto in esame. Deve essere determinata sperimentalmente la durata appropriata dell'irradiazione necessaria per raggiungere un'adeguata estensione del fotobleaching, per i diversi campioni. - Acquisire un'immagine dopo la fotobiancatura (candeggina).
- Aggiungere una goccia di 10 L di buffer M9 sui nematodi fotobleached.
- Lasciare che gli animali si riprendano per 5 minuti.
- Utilizzare il pick "eyelash" o una pipetta per trasferire i nematodi alle singole piastre NGM semitette con 20 L OP50 goccia al centro.
- Cattura un'immagine di ogni campione ogni 1 ora sotto uno stereomicroscopio di epifluorescenza.
NOTA: contare il t-0 per il tempo di recupero dopo la fotobleaching.
4. Analisi dei dati di cattura delle immagini durante l'analisi del FRAP
- Analizzare le immagini acquisite utilizzando un software (ad esempio, Fiji).
- Aprire le immagini con il software.
- Selezionare il comando Dividi canali tramite il menu a discesa Immagine e colore.
NOTA: mantenere l'immagine del canale verde. - Utilizzare lo strumento Selezione a mano libera per impostare manualmente la regione fluorescente di interesse (ad esempio, tutto il corpo, la testa, l'intestino).
- Selezionate il comando Misurazione dal menu a discesa Analizza per misurare l'intensità media dei pixel dell'area di interesse per ogni punto di tempo.
NOTA: la percentuale di recupero della fluorescenza viene calcolata utilizzando le immagini di riferimento acquisite dopo la fotobleaching.
5. Segnalare l'analisi statistica
- Utilizzare almeno 20 – 25 nematodi di ogni ceppo e/o condizione.
NOTA: devono essere eseguite tre repliche biologiche. - Eseguire il test t-degli studenti (confronto tra due gruppi) o ANOVA (confronto tra più gruppi) per l'analisi statistica con P < 0.05 come significativo utilizzando software di analisi statistica.
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Representative Results
Utilizzando la procedura qui presentata, i nematodi transgenici di tipo selvaggio e mutante che esprimono i seguenti reporter somatici, pife-2GFP, psod-3GFP e punc-119GFP, sono stati utilizzati per valutare i tassi di sintesi delle proteine in base ai rispettivi protocolli. In particolare, i vermi mutanti di tipo selvaggio e ife-2 che esprimono GFP citoplasmico in tutti i loro tessuti somatici utilizzando il promotore ife-2 sono stati confrontati prima, subito dopo il fotobleaching e 5 ore dopo il recupero. Le immagini rappresentative e la quantificazione mostrano che gli animali selvatici si riprendono completamente, mentre i mutanti ife-2 hanno ridotto la capacità di recupero (Figura 1A). Così, i vermi di tipo selvatico avviano la biosintesi delle proteine de novo dopo il fotobleaching, mentre i vermi privi del fattore di iniziazione della traduzione dell'mRNA IFE-2 non sono in grado di farlo, indicando che il tasso di recupero della fluorescenza illustra il tasso di sintesi proteica in vivo7. Inoltre, il cicloheximide, uno specifico inibitore della traduzione dell'mRNA, può essere utilizzato come controllo positivo per l'inibizione della traduzione delle proteine. Infatti, gli animali transgenici trattati con cicloheximide che esprimono GFP citoplasmico sotto il promotore della sod-3, non recuperano la loro fluorescenza al momento del fotobleaching (Figura 1B).
Abbiamo anche applicato questo metodo per rilevare come i corpi di lavorazione dell'mRNA (corpi P) influenzano il tasso di traslazione delleproteine 8. I nematodi mutanti di tipo selvaggio ed edc-3 (ok1427) che esprimono GFP pan-neuronaally sono stati esaminati per la loro capacità di recupero su fotobleaching mirato nella regione della testa. Il recupero della fluorescenza è molto più lento negli animali carenti EDC-3 rispetto al tipo selvaggio (Figura 1C). Ciò indica che il turnover dell'mRNA mediato da EDC-3 ostacola la sintesi delle nuove proteine e, in ultima analisi, sopprime l'iniziazione della traduzionedelle proteine 9.
Figura 1: Valutazione in vivo della sintesi proteica de novo in C. elegans. (A) Analisi FRAP sia di tipo selvaggio che di nematodi carenti IFE-2 che esprimono GFP citoplasmico sotto il promotore di ife-2. Gli animali transgenici sono sottoposti a fotobleaching di animali interi. Il segnale GFP è ridotto al 30-50% dell'intensità iniziale. La fluorescenza viene registrata prima del fotobleaching (pre-candeggina), dopo la fine del periodo di fotobleaching (10 min; candeggina) e 5 ore dopo il recupero. (B) Il trattamento della cicloheximide inibisce il recupero della fluorescenza degli animali transgenici che esprimono GFP citoplasmico sotto il promotore della sod-3. Gli animali transgenici sono sottoposti a fotobleaching di animali interi. Il segnale GFP è ridotto al 30-50% dell'intensità iniziale. La fluorescenza viene registrata prima del fotobleaching (pre-candeggina), dopo la fine del periodo di fotobiancatura (10 min; candeggina) e 5 ore dopo il recupero (A, B: microscopio AxioImager n. 2; obiettivo obiettivo: 20x, apertura numerica 0,8; sorgente luminosa ad alta potenza, HBO 100; lampada ad arco di mercurio da 100 Watt; set di filtri di eccitazione/emissione, set di emissioni 38 Endow GFP senza turno). Barre di scala, 500 m. (C) I nematodi carenti di EDC-3 mostrano una diminuzione dei tassi di sintesi delle proteine de novo nelle cellule neuronali. Il segnale di fluorescenza sia di tipo selvaggio che di edc-3 (ok1427) animali che esprimono GFP pan-neuronally citoplasmico viene misurato prima della fotobleaching (pre-bleach) e segue il periodo di fotobleaching (90sec; candeggina). Gli animali transgenici sono sottoposti a fotobleaching nella regione della testa (anello nervoso). Il segnale GFP è ridotto al 30-50% dell'intensità iniziale (AxioImager n. 2; obiettivo obiettivo: 40x, apertura numerica 0,75; 30% di potenza luminescente della sorgente di illuminazione fluorescente (FI illumination System X-Cite 120 XL FL PC, lampada alogegenide metallica 120W) e iris completamente aperto). L'intensità media in pixel del recupero della fluorescenza viene misurata a intervalli di tempo di un'ora. 20 animali sono stati quantificati per ceppo in ciascuno dei tre esperimenti indipendenti. I dati rappresentano la media S.E.M., P < 0.05, t -test non accoppiato. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Reagente | Ricetta | |
| 2% pastiglie Agarose | 1. Pesare 0,5 g o fagarose in un becher cilindrico in vetro | |
| 2. Aggiungere 25 mL di buffer M9 | ||
| 3. Riscaldare in un forno a microonde fino a chiudere a ebollizione. Togliere, mescolare con una punta di pipetta e far bollire di nuovo. Ripetere fino a quando l'agarose è sciolto. | ||
| 4. Posizionare un scorresco vuoto al microscopio sulla panca. | ||
| 5. Mettere una goccia di soluzione fresca del 2% di agarose al centro dello scivolo. | ||
| 6. Prendere un secondo scivolo al microscopio e posizionarlo sulla parte superiore della goccia di agarose. Premere delicatamente verso il basso per appiattire la goccia. | ||
| 7. Lasciare che l'agarose indurire per 30 secondi e rimuovere delicatamente il faro superiore del microscopio. | ||
| 8. Procedere immediatamente con la preparazione del campione, poiché le pastiglie di agarose inizieranno ad asciugarsi entro circa 5 minuti. | ||
| Suggerimento: Lasciare il bordo superiore del microscopio come copertura per preservare l'umidità più a lungo (1 ora). Così, diversi cuscinetti di agarose possono essere preparati e utilizzati rapidamente durante gli esperimenti. | ||
| Mezzo liquido LB | 1. Sciogliere 10 g di Bactotryptone, 5 g di Estratto di lievito di Bacto, 5 g di NaCl in 1 L di acqua distillata e autoclave. | |
| Buffer M9 | 1. Sciogliere 3 g di KH2PO4, 6 g di Na2HPO4e 5 g NaCl in 1 L acqua distillata e autoclave. | |
| 2. Lasciate raffreddare e aggiungere 1 mL di 1 M MgSO4 (sterile). | ||
| 3. Memorizzare il buffer M9 a 4 gradi centigradi. | ||
| Piastre di agar medie di crescita nematode (NGM) | 1. Mescolare 3 g di NaCl, 2,5 g di bactopeptone, 0,2 g di streptomicina, 17 g di agar e aggiungere 900 mL di acqua distillata. Autoclave. | |
| 2. Lasciare raffreddare a 55-60 gradi centigradi. | ||
| 3. Aggiungere 1 mL di soluzione di stock di colesterolo, 1 mL di 1 M CaCl2, 1 mL di 1 M MgSO4, 1 mL di soluzione di stock di nystatin, 25 mL di tampone di fosfato sterile 1 M, pH 6.0 e acqua sterile distillata fino a 1 L. | ||
| 4. Pipette 10 mL di media per piatto Petri e lasciare solidificare. | ||
| 5. Conservare le piastre a 4 gradi centigradi fino all'uso. | ||
Tabella 1: Ricette consigliate per i reagenti utilizzati. Tutte le ricette dei reagenti utilizzati nel protocollo presentato sono descritte qui.
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Discussion
La modulazione della sintesi proteica è essenziale per l'omeostasi organismosa. Durante l'invecchiamento, la sintesi proteica globale e specifica è perturbata. Recenti studi rivelano che l'equilibrio della traduzione delle proteine controlla direttamente la senescenza e l'invecchiamento non è solo un sottoprodotto del processo di invecchiamento. In particolare, componenti fondamentali del macchinario di traduzione come il fattore di iniziazione eucariotica 4E (eIF4E), che facilita il limite dell'mRNA durante l'iniziazione della traduzione, e quindi il tasso di traduzione delle proteine dipendenti dal tappo, induce lo stress ossidativo e accelera il processo diinvecchiamento 1. Inoltre, L'EDC-3 specifico del neurone, che interagisce con i corpi di lavorazione dell'mRNA, i corpi P e aumenta il tasso di decapping dell'mRNA, accelera anche il processo diinvecchiamento 8. In particolare, la soppressione EDC-3 consente il sequestro IFE-2 nei corpi P, riducendo in ultima analisi i livelli di traslazione delle proteine, ritardando l'invecchiamentoneuronale 9.
FRAP è una tecnica inizialmente sviluppata per studiare la dinamica delle proteine, la localizzazione, le interazioni e l'attività con l'etichettatura fluorescente non invasiva utilizzando l'imaging dal vivo in vivo, rendendolo un potente strumento per studiare i tassi di sintesi proteica intempo reale 8,10. Tuttavia, esistono alcuni passaggi critici che richiedono attenzione e risoluzione dei problemi. Forniamo soluzioni alternative a questi potenziali ostacoli o limitazioni riscontrate durante la procedura sperimentale.
Un problema riguarda il movimento del verme in quanto il verme può sfuggire alla fonte di luce durante il fotobleaching. Questo problema può essere parzialmente superato utilizzando animali transgenici che esprimono l'allele rol-6(su1006), che fa sì che gli animali si muovano in modo sinusoiale. In questo modo, il fotobleaching animale può essere eseguito continuamente. Inoltre, lo sperimentatore può seguire il movimento del verme che si muove al di fuori del piano di vista molto più lentamente. Tuttavia, le pastiglie di agar possono anche essere utilizzate come alternativa per immobilizzare completamente gli animali.
La durata ottimale del fotobleaching è un ulteriore fattore critico che deve essere determinato e mantenuto stabile durante gli esperimenti. È possibile riscontrare un fotobleaching insufficiente a causa di fotobleaching non mirata o di breve durata. Questo può essere superato aumentando (a) l'obiettivo di ingrandimento e l'apertura numerica, (b) l'intensità della luce e/o (c) la durata del fotobleaching.
Se non viene rilevato alcun recupero significativo della fluorescenza, ci sono potenziali parametri che possono essere modificati. Se la fotosaccatura è eccessiva, ridurre la durata della fotobleaching in quanto si è verificato un danno al campione. I danni al verme possono essere valutati osservando tratti di vita come la sensibilità al tocco, la locomozione, la deposizione delle uova, il pompaggio della faing e la capacità riproduttiva. Se la cinetica del recupero della traduzione delle proteine è lenta, consentire un periodo di recupero più lungo. Il recupero della sintesi proteica varia tra le diverse famiglie proteiche e dipende dalla lunghezza delle fusioni del reporter7.
L'attività promotrice potrebbe influenzare la cinetica della sintesi proteica. Se il promotore è inattivo durante il recupero, modificare il promotore utilizzato. L'attività del promotore potrebbe essere modificata in caso di condizioni di stress, come il fotodamage. Utilizzare promotori di attività stabili per monitorare sia globale (ad esempio let-858, ife-2, sod-3) o tessuto-specifico (ad esempio i muscoli della parete del corpo; mio-3, unc-54; pharynx: myo-2; pan-neuronale: unc-119, rab-3; neuroni meccanosensoriali: mec-4; intestino: vha-6, ges-1) tassi di traduzione delle proteine.
Se si verifica un'inadeguata inibizione della traduzione delle proteine da cicloheximide, l'aumento dei tempi di pre-incubazione dei nematodi supererebbe questo problema. Un avvertimento che dovrebbe essere preso in considerazione è l'uso di vermi transgenici che sovraesprimono proteine. L'utilizzo di nematodi transgenici generati da CRISPR/Cas9 che esprimono le proteine fluorescenti di interesse a livelli fisiologici fornirà un quadro più preciso della cinetica e del turnover delle proteine.
I livelli totali di proteine rilevati sono il risultato della loro degradazione delle proteine e dei tassi di sintesi. La degradazione delle proteine si verifica invariabilmente a livelli basali in tutte le cellule eucariotiche. Pertanto, i tassi di recupero della fluorescenza proteica, misurati in questo protocollo, non sono assoluti ma rispetto alle condizioni confrontate. In sostanza, viene misurato il recupero della fluorescenza in presenza di degradazione delle proteine. Pertanto, si presume che tutte le condizioni abbiano tassi di degradazione delle proteine uguali dopo il fotobleaching. Al fine di misurare i tassi assoluti di traslazione delle proteine, dovrebbero essere utilizzati ceppi di verme mutanti carenti di degradazione delle proteine. In particolare, le mutazioni in geni come rpn-10 del proteasome o lgg-2 per l'autofagia possono essere utilizzate comecontrollo 11. In alternativa, è possibile eseguire il knockdown RNAi delle proteine proteasomiche e autofagiche. Inoltre, substrati autofagici come SQST-1::GFP possono essere utilizzati per rilevare il contributo della degradazione autofagica nelle condizioni sperimentali selezionate12.
In entrambi i momenti sperimentali, questa tecnica FRAP non è radioattiva, non invasiva, che rileva i tassi di sintesi delle proteine de novo in vivo in diversi tessuti in C. elegans. Permette immagini dal vivo prima e durante il fotobleaching in un ambiente in vivo e il successivo monitoraggio degli animali per tutta la vita. La perturbazione dell'iniziazione alla traduzione rallenta l'invecchiamento, quindi la misurazione dei tassi di sintesi proteica globale da parte della FRAP potrebbe essere utilizzata come lettura diretta del processo di invecchiamento. Questo protocollo può essere ottimizzato e utilizzato su larga scala per lo screening di geni e/o sostanze chimiche correlate al processo di invecchiamento o alla malattia legata all'età. In alternativa, i tassi di degradazione proteica totali o specifici possono essere misurati fotobleaching in diversi contesti genetici utilizzando lo stesso protocollo in combinazione con il cicloheximide. Poiché la traduzione delle proteine è inibita dal cicloheximide, verrà rilevato il tasso di degradazione delle proteine. Questo protocollo aiuterà a comprendere meglio le vie di degradazione delle proteine nei modelli genetici delle malattie di aggregazione delleproteine 13.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun interesse concorrente.
Acknowledgments
Ringraziamo Chaniotakis M. e Kounakis K. per la registrazione e l'editing video. K.P. è finanziato da una sovvenzione della Fondazione ellenica per la ricerca e l'innovazione (HFRI) e del Segretariato generale per la ricerca e la tecnologia (GSRT). N.T. è finanziato da sovvenzioni del Consiglio europeo della ricerca (CER – GA695190 – MANNA), dei programmi quadro della Commissione europea e del Ministero greco dell'istruzione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
References
- Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
- Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing. Ageing Research Reviews. 23, Pt A 75-89 (2015).
- Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
- Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space. Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N.
- Parker, R., Sheth, U. P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).
- Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).
- Keith, S. A., et al. Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway. PLoS Genetics. 12 (2), 1005823 (2016).
- Kumsta, C., et al. The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy. Nature Communications. 10 (1), 5648 (2019).
- Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease. Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).
