Summary
هنا، نحن بالتفصيل كيفية مزامنة دروسوفيلا إلى يوم circadian. هذه هي الخطوة الأولى والأهم من ذلك لدراسة الإيقاعات البيولوجية وعلم الكرونوبيولوجيا.
Abstract
تقريبا عالمية بين الكائنات الحية، إيقاعات circadian تنسيق النشاط البيولوجي لمدار الأرض حول الشمس. لتحديد العوامل التي تخلق هذا الإيقاع وفهم المخرجات الناتجة ، مطلوب entrainment من الكائنات الحية النموذجية إلى نقاط زمنية circadian محددة. هنا نحن بالتفصيل إجراء لentrain العديد من Drosophila إلى إيقاع circadian محددة. وعلاوة على ذلك، نحن تفاصيل ما بعد entrainment الخطوات لإعداد عينات من الفلورالين المناعية، وحمض نووي، أو تحليل البروتين القائم على استخراج.
Introduction
تقريبا جميع الكائنات الحية على الأرض، من أكبر وصولا إلى خلية واحدة، لديها ساعة البيولوجية الداخلية مع دورة من حوالي يوم واحد. وهذا يعرف باسم إيقاع Circadian (صاغ في عام 1953 من قبل فرانز هالبرغ من العبارات اللاتينية حوالي = حول / تقريبا و "يموت" = يوم)1. على الرغم من أن مكونات الساعة الأساسية معروفة وآلياتها البدائية للوظيفة مفهومة ، لا يزال هناك الكثير لفهم كيفية الحفاظ على الإيقاعات البيولوجية في جميع أنحاء الجسم. الأهم من ذلك، يرتبط سوء تنظيم الإيقاعات البيولوجية مع النتائج الصحية السيئة بما في ذلك ضعف تكوين الذاكرة، واضطرابات النوم، واضطراب التأثير الموسمي، والاكتئاب، والاضطراب ثنائي القطب، والسكري، والسمنة، والتنكس العصبي، والسرطان2،3،4،5.
دروسيليا هو نموذج راسخ للتحقيق في البيولوجيا circadian. وراثيا وكيميائيا، يتم تدريب أعداد كبيرة بسهولة (كما سيظهر). في الواقع، جميع المنشورات السبعة المذكورة كمطبوعات رئيسية للدعم في منح جائزة نوبل لاكتشاف إيقاعات circadian الاستفادة من هذه القوة من نموذج Drosophila6،7،8،9،10،11،12.
بالإضافة إلى ذلك، نعرض استراتيجيات فعالة لجمع الذباب المُتَجَنَّع لأغراض إما من الفلورا المناعية، أو الحمض النووي، أو التحليل القائم على استخراج البروتين. وباستخدام هذه الاستراتيجيات، يمكن للمرء أن يعالج ويخزن كميات أكبر من العينات لتحليلها في المستقبل. هذه الأساليب مفيدة جداً في أنها قابلة للتكرار ويمكن أن تسفر عن مئات من الذباب entrained التي يمكن أن تكون جزءاً من تجمع بيانات كبيرة.
Protocol
1. يطير إنتاج الغذاء
- لكل 1 لتر من الماء، إعداد الطعام ذبابة تتكون من 4.69 غرام من دبس الدم المجفف، 19.70 غرام من الخميرة النشطة الجافة، 87.22 غرام من وجبة الذرة و 7.83 غرام من أجار.
- الجمع بين المحتويات المذكورة أعلاه في crockpot وتحويل الحرارة إلى 250 درجة فهرنهايت. اخلطي جيدا كما يتم إضافة المكونات.
- الحفاظ على غطاء على crockpot كما يطير الغذاء هو التدفئة في حين خلط أيضا محتويات كل 10 دقيقة حتى تصل إلى الغليان المتداول. السماح للغلي المتداول على الاستمرار لمدة 20 دقيقة قبل إيقاف الحرارة.
- إضافة 83.60 مل من الماء والحفاظ على غطاء من crockpot قبالة كما يبرد الطعام.
- اخلطي درجة حرارة الطعام كل 10 دقائق مع ميزان حرارة زجاجي. تجنب السماح لطبقة من الفيلم يستقر على رأس الطعام.
- مرة واحدة في الغذاء قد بردت إلى 60 درجة مئوية، إضافة 10.44 مل من Tegosept و 5.51 مل من حمض البرروبيونيك لكل لتر من الماء المضافة (انظر الخطوة 1.1).
- تخلط جيدا وتدفئة تصل إلى 60 درجة مئوية لمنع الطعام من أن تصبح باردة جدا.
- ضخ الطعام ذبابة حسب الحاجة باستخدام Droso حشو.
- بالنسبة للقنينات الضيقة، قم بضخ 10 مل و 6 زجاجات قاع مربعة أوقية تضخ 60 مل.
2. جمع الذباب من العمر المحدد
- رصد زجاجات من نوع البرية الذباب المخزنة في 25 درجة مئوية لمدة 5-7 أيام حتى يتم إرفاق كميات كبيرة من pupa (حوالي 200 pupa) إلى جانب الزجاجة. الزجاجات المستخدمة هي 6 أوقية دروسفيلا زجاجات الأسهم مع قيعان مربع.
- مسح البالغين الحاليين من الزجاجة. إما أن يقلب البالغين في زجاجة جديدة أو وضعها في الإيثانول بنسبة 70٪. استخدام نهاية مملة من فرشاة الطلاء #0 لدفع أي الكبار المتبقية في الطعام ذبابة. تأكد من مسح فرشاة الطلاء لأسفل مع 70٪ الإيثانول قبل وبعد الاستخدامات.
- السماح للزجاجات مسح للجلوس لمدة 3 أيام في حاضنة 25 درجة مئوية للسماح للجيل القادم لeclose. هذه الذباب سيكون بين 0 و 3 أيام من العمر.
3. فصل الطيران
- بعد 3 أيام، فصل الذكور عن الإناث وجمع العدد المطلوب لكل جنس لكل نقطة من النقاط الزمنية الأربعة. الذباب يمكن تمييزها حسب الجنس عن طريق فحص الأعضاء التناسلية; الذكور لديهم عتمة تقريب الأعضاء التناسلية في حين أن الإناث أخف وزنا، أكثر مدببة الأعضاء التناسلية. الإناث هي أيضا أكبر بكثير من الذباب الذكور.
- استخدام وسادة تخدير CO2 لفصل فعال الذباب والتمييز بين الجنسين. نقل الذباب مع فرش الطلاء لتجنب قتلهم.
- جمع 100 من الذكور و100 أنثى لكل نقطة زمنية، مع 50 ذكرا لكل قارورة و 100 أنثى لكل قارورة. الذكور تميل إلى أن تكون أكثر عدوانية وتفاعلاتهم الاجتماعية تؤدي إلى الكثير من الوفيات عندما يكون هناك 100 فرد في قارورة. الإناث تصل إلى 100 فرد- لا تتأثر في حين الواردة في القارورة.
- تنفيذ المجموعات في نقاط الوقت التالية: ZT1، ZT7، ZT13 وZT19(الجدول 1). لاحظ أن المجموعات التي يتم القيام بها في الظلام (ZT12-ZT24) حساسة للضوء في حين أن مجموعات ZT0-ZT11 يتم القيام به خلال أوقات الإضاءة وأضواء الغرفة يمكن أن تكون على. يرجى ملاحظة أنه يتم استخدام حاضتين منفصلتين مع أنماط الضوء العكسية 12 ساعة للسماح لجميع المجموعات أن تحدث خلال النهار وليس بين عشية وضحاها.
- استخدام الذباب الزائد لإنشاء زجاجات جديدة من الذباب لentrainment في المستقبل. مكان 25 الإناث مع 5-7 الذكور في كل زجاجة جديدة ومكان في الحاضنة في 25 درجة مئوية.
4. حضانة الطيران
- السماح للذباب بالبقاء في حاضة حاضنة منظمة لمدة 3-5 أيام للسماح entrainment circadian أن يحدث. تأكد من أن الحاضنات خفيفة الإحكام لأن حتى كميات صغيرة من التلوث الضوئي سوف تزعج entrainment.
5. تثبيت المناعة
- بعد entrainment، وإعداد قوارير جديدة من حل التثبيت للعينات التي سيتم استخدامها ل المناعةfluorescence. قبل إزالة الذباب من الحاضنة، إضافة 4.8 مل من 4٪ الفورمالديهايد المخفف في 1X PBS + 0.1٪ Tween-20 إلى كل قارورة ضيقة جديدة لكل 100 الذباب التي سيتم التركيز عليها. كل قارورة ستضم 100 ذكر أو 100 أنثى الذباب Circadian entrained. ضع القنينات الضيقة في الثلج.
6. جمع الفلورة المناعية
- عند جمع الذباب من الحاضنة للflufluorescence، وإزالة غطاء زجاجة وعكس بسرعة الزجاجة في القمع. الاستفادة بلطف الذباب في الحل عبر القمع للمساعدة في توجيه الذباب في القارورة; الجمع بين أنبوبين من الذكور 50 لمجموع 100 الذكور في قارورة واحدة واستخدام أنبوب واحد من 100 أنثى للقارورة الأخرى.
- تنفيذ مجموعات ZT13 وZT19 في الظلام؛ استخدام الضوء الأحمر من أجل أن نرى كما drosophila هي أقل حساسية لهذه الأطوال الموجية الخفيفة وبالتالي فهي أقل عرضة للتلوث الضوئي13. بروتين كريبتيكروم، على وجه الخصوص، حساس بشكل خاص للضوء الأزرق، والتي يجب تجنبها14.
- للحد من التعرض للضوء، تأكد من أن غرفة المجموعة خفيفة مع أي مصادر للضوء مسدودة أو مغطاة. التفاف هذه القوارير في احباط بحيث لا يتم تعرض الذباب ZT13 وZT19 للضوء عند وضعها على خلاط nutating في الخطوة التالية. ZT1 و ZT7 الذباب ليست حساسة للضوء ويمكن وضعها على خلاط دون احباط تغطي.
7. خلاط Nutating والتخزين
- بعد أن تم جمع الذباب، الشريط الجزء العلوي من قوارير تحتوي على تثبيت لتجنب انسكاب ووضعها على خلاط nutating في 165 دورة في الدقيقة في 4 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. الذباب لم تعد حساسة للضوء بعد هذه الخطوة التثبيت، لذلك قد تتم إزالة احباط للتحقق من أن الحل يتحرك والذباب يجري غمرها في المثبت.
- بعد إزالة ذبابة تحتوي على قارورة من خلاط nutating إزالة الفورمالديهايد وغسل ثلاث مرات مع 3000 ميكرولتر من 1X PBS، عكس القارورة مع كل غسل.
- تخزين قوارير تحمل عينات مناعية في 4 درجة مئوية في انتظار المناعةfluorescence15في المستقبل .
8. جمع لاستخراج البروتين
- إعداد أربعة أنابيب 50 مل وديوار يحتوي على النيتروجين السائل للحفاظ على عينات لاستخراج البروتين
- لجمع الذباب لاستخراج البروتين أو الحمض النووي، نقل الذباب من الزجاجات إلى الأنبوب بنفس الطريقة كما هو الحال في الخطوة 6.1 وسرعة سقف الأنبوب لمنع إطلاق الذباب ووضع الأنبوب في النيتروجين السائل إلى التجميد المفاجئ.
9. تخزين لاستخراج البروتين
- تخزين عينات المجمدة المفاجئة لاستخراج البروتين في -80 درجة مئوية. ويمكن معالجة هذه وفقا لبروتوكول استخراج البروتين المناسب لتحليل المصب، بما في ذلك16المناعة.
Representative Results
يسمح التدريب الإيقاعي المراقب للباحثين بفحص علم الأحياء في نقاط زمنية محددة طوال اليوم الإيقاعي باستخدام جداول توقيت ZT1-ZT19 أو إضافة نقاط زمنية حسب الضرورة. هنا نستخدم الضوء والظلام لentrain الذباب إلى دورات circadian والتحقق من entrainment عن طريق تحليل المناعة و المناعةfluorescence من البروتين الفترة، علامة لentrainment circadian(الشكل 1). عند entrainment الصحيح، يجب أن يكون للبروتينات فترة كثافة مميزة ونمط التنقل (الشكل 1أ) وينبغي أن تكون مرئية في مواقع محددة في الدماغ ZT1 (الشكل 1B). على الرغم من أن المتغيرات الأخرى، بما في ذلك الغذاء ودرجة الحرارة، يمكن أن تؤثر على entrainment circadian، ضوء هو الأكثر بسيطة وموثوق بها للسيطرة على17. لغرض هذه الطرق، يتم الاحتفاظ درجات الحرارة حاضنة ثابتة، والاعتماد على الخلايا العصبية على مدار الساعة الدماغي التي تتأثر الضوء لentrainment18.
الشكل 1: التحقق من التدريب. (أ) المناعية مقتطفات الخلية كاملة أعدت من رؤوس الذباب entrained يظهر أنماط الكنسي من حركة البروتين فترة وكثافة19. 1.4 تم تحليل رؤوس الإناث من كل من أوقات Zeitgeber المشار إليها (ZT) باستخدام جسم مضاد لكل. (ب)immunofluorescence من الأدمغة entrained التي تم جمعها في ZT، حيث تم العثور على البروتين الفترة في نمط مميز (الألواح السفلية، إعادة إنشائها من Helfrich-فورستر20). تظهر هي الصور التي التقطت من أقسام مختلفة من الدماغ, التقاط جميع الخلايا العصبية المتوقع أن تحتوي على بروتين الفترة في ZT1. شريط مقياس هو 40 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| ZT1 | ZT7 | ZT13 | ZT19 |
| خفيفة بين 10 صباحاً - 10 مساءً | خفيفة بين 10 صباحاً - 10 مساءً | اظلم بين 9 صباحاً - 9 مساءً | اظلم بين 9 صباحاً - 9 مساءً |
| يتم جمعها في الساعة 11 صباحا بعد ساعة واحدة في ضوء | يتم جمعها في الساعة 5 مساءً بعد 7 ساعات في الضوء | جمعت في 10 صباحا بعد 1 ساعة في الظلام | تم جمعها في الساعة 4 بعد الظهر بعد 7 ساعات في الظلام |
الجدول 1: ZT1-ZT19 جدول مواعيد توقيت إيقاع Circadian.
Discussion
يستخدم الباحثون هذا البروتوكول مع النجاح والاتساق. يسمح هذا الإجراء تثبيت تجمع أخذ العينات كبيرة التي يمكن تخزينها للتحليل في المستقبل. بالإضافة إلى ذلك، تحافظ هذه الاستراتيجية على الأنماط العصبية الناجمة عن entrainment لفحصها في المستقبل.
التثبيت للتخزين هو عنصر رئيسي في عملية entrainment كما أنه يساعد على استقرار أنسجة الدماغ ويسمح لمزيد من الوقت لتحليل كل دماغ من تجمع البيانات وبالتالي تقليل النفايات من الأدمغة التي تفقد القدرة على البقاء بسبب سن21. والهدف الرئيسي هو أن circadian entrain أكبر عدد ممكن من الذباب بحيث يكون هناك مخزون مستمر متاح لتشريح الرأس وفي نهاية المطاف immunofluorescence أو استخراج البروتين لمراقبة النتائج وتحديد ما إذا كانت النتائج هي من الثقة العالية. لضمان الحفاظ على entrainment circadian من خلال التثبيت، فمن جزء لا يتجزأ من أن يتم القضاء على أي مصدر من مصادر التلوث الضوئي. عملية التثبيت يسمح لدروسوروسفيليا ليتم تخزينها مع الحفاظ على العصبية "الطابع الزمني" بحيث يمكن تشريحها في وقت لاحق وتحليلها مع عدم وجود اختلافات ملحوظة للذباب التي يتم تشريحها وخضعت للflufluorescence مباشرة بعد entrainment. لأغراض التثبيت قبل الفلورة المناعية، حدد المختبر باتساق أن الذباب قابل للحياة على الأقل لمدة شهر واحد. تثبيت لاستخراج البروتين البقع الغربية تجعل الأدمغة قابلة للحياة إلى أجل غير مسمى عند تخزينها في -80 درجة مئوية.
آخر خطوة بروتوكول حاسم هو جنس الذباب. من المهم أن يتم تنفيذ هذه الخطوة بدقة حيث أن وجود كلا الجنسين في نفس القارورة قبل التثبيت يمكن أن يؤدي إلى التزاوج ، مما سيؤدي إلى ذباب جديد من عمر أصغر وفساد تحليل البروتين إذا تم فحص الذكور بطريق الخطأ بدلاً من الإناث أو العكس. بالإضافة إلى ذلك ، عند ممارسة الجنس من المهم إزالة عينات اليرقات التي يتم ربطها في بعض الأحيان بالإناث. وهذا يمنع تطوير ذرية جديدة داخل قارورة الإناث التي يمكن أن تؤدي إلى نتائج فاسدة.
قد تكون الخطوة التالية لبروتوكول entrainment مع العناصر المتعلقة بتحليل البيانات. يركز البروتوكول على توطين البروتين ، ولكن إذا كانت هناك متغيرات أخرى تتأثر بـ entrainment circadian ، فيجب استكشافها من خلال طرق جديدة ، تتطلب غالبًا استخراج البروتين أو الحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك، هناك بروتينات أخرى من الدماغ التي قد لا تزال يمكن تحليلها عن طريق هذا البروتوكول. وقد حللت التجارب المرتبطة بالبروتوكول بعض البروتينات ولكن قائمة الجينات والبروتينات التي تلعب دورا في البيولوجيا الإيقاعية لم تستنفد بعد. البروتوكول فعال في تحقيق هدف إنشاء إيقاع circadian ، ومع ذلك ، فإن التطبيقات واسعة النطاق.
Disclosures
اي.
Acknowledgments
شكر خاص لجامعة ميسوري كانساس سيتي ومختبر جيفري ل. برايس.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | ES-1000 | |
| 10-100uL pipette | Eppendorf | ES-100 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | 15710 | ||
| 1X PBS | Caisson Labs | PBL01-6X100ML | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423500 | |
| Anesthesia Filter Connection Kit | World Precision Instruments | EZ-251A | |
| Corn meal | Genesee Scientific | 62-100 | |
| Dried Molasses | Food Service Direct | OT280504 | |
| Droso-filler Food Pump | geneseesci.com | 59-169 | |
| Drosophila Stock bottles, 6 oz square bottom w/ Flugs | geneseesci.com | 32-130BF | |
| Drosophila vials, Narrow K-Resin super bulk | geneseesci.com | 32-118SB | |
| Dry active yeast | Genesee Scientific | 62-103 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15720 | |
| EZ Basic Anesthesia System | World Precision Instruments | EZ-175 | |
| Falcon Centrifuge tubes | Corning | 352097 | |
| Falcon round bottom tubes | Corning | 352057 | |
| Fine point Sharpie marker | Sharpie | 30001 | |
| Fisherbrand Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | |
| Flugs-Narrow Plastic Vials | Genesee Scientific | 49-102 | |
| Glass Thermometer | Cole-Palmer | EW-08008-12 | |
| Liquid nitrogen hose | Thermo Scientific | 398202 | |
| Liquid nitrogen tank-Dewar | Cooper Surgical Inc | 900109-1 | |
| Liquid nitrogen transfer vessel | Electron Mircoscopy Sciences | 61891-02 | |
| Paintbrushes(Red Sable) Size #0 | Electro Microscopy Sciences | 66100-00 | This is used to separate the flies via sex without causing injury. |
| Plastic funnel | Plews and Edelmann | 570-75-062 | |
| Polarizing light microscope | Microscope Central | 1100100402241 | Used to more clearly view Drosophila during sexing |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-100U | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-1M | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-5M | |
| Propionic Acid | Sigma Aldrich | P1386-1L | |
| Rayon Balls | Genesee Scientific | 51-100 | |
| Reynolds wrap standard aluminum foil | Staples | 1381273 | |
| Roaster Oven (Crockpot) | Hamilton Beach | 32950 | |
| Scotch 810 Magic Tape | Electron Microscopy Sciences | 77300 | |
| Spray bottle with trigger | US Plastic | 66446 | Used to spray ethanol to clean work bend areas |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Thermo Scientific Drosophila Incubator | Thermo Scientific | 3990FL | |
| Thermo Scientific Revco 4 degree Lab fridge | ThermoFisher Scientific | REL7504D | |
| Thermo Scientific Revco Lab Freezer | ThermoFisher Scientific | REL7504A | |
| Tween 20 | Anatrace | T1003-1-GA |
References
- Halberg, F. Some physiological and clinical aspects of 24-hour periodicity. The Journal-Lancet. 73 (1), 20-32 (1953).
- Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory. Behavioral Neuroscience. 128 (3), 283-303 (2014).
- Leng, Y., Musiek, E. S., Hu, K., Cappuccio, F. P., Yaffe, K. Association between circadian rhythms and neurodegenerative diseases. The Lancet. Neurology. 18 (3), 307-318 (2019).
- Hood, S., Amir, S.
- Sulli, G., Lam, M. T. Y., Panda, S. Interplay between Circadian Clock and Cancer: New Frontiers for Cancer Treatment. Trends in Cancer. 5 (8), 475-494 (2019).
- Zehring, W. A., et al. P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster. Cell. 39 (2 Pt 1), 369-376 (1984).
- Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila. Nature. 312 (5996), 752-754 (1984).
- Siwicki, K. K., Eastman, C., Petersen, G., Rosbash, M., Hall, J. C. Antibodies to the period gene product of Drosophila reveal diverse tissue distribution and rhythmic changes in the visual system. Neuron. 1 (2), 141-150 (1988).
- Hardin, P. E., Hall, J. C., Rosbash, M. Feedback of the Drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels. Nature. 343 (6258), 536-540 (1990).
- Liu, X., et al. The period gene encodes a predominantly nuclear protein in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 12 (7), 2735-2744 (1992).
- Vosshall, L. B., Price, J. L., Sehgal, A., Saez, L., Young, M. W. Block in nuclear localization of period protein by a second clock mutation, timeless. Science (New York, N.Y). 263 (5153), 1606-1609 (1994).
- Price, J. L., et al. double-time is a novel Drosophila clock gene that regulates period protein accumulation. Cell. 94 (1), 83-95 (1998).
- Hanai, S., Hamasaka, Y., Ishida, N. Circadian entrainment to red light in Drosophila: requirement of Rhodopsin 1 and Rhodopsin 6. Neuroreport. 19 (14), 1441-1444 (2008).
- Vinayak, P., et al. Exquisite light sensitivity of Drosophila melanogaster cryptochrome. PLoS Genetics. 9 (7), e1003615 (2013).
- Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains. Journal of Visualized Experiments. (129), e56174 (2017).
- Au-Eslami, A., Au-Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Fan, J. Y., Muskus, M. J., Price, J. L. Entrainment of the Drosophila circadian clock: more heat than light. Science's signal Transduction Knowledge Environment. (413), pe65 (2007).
- Miyasako, Y., Umezaki, Y., Tomioka, K. Separate sets of cerebral clock neurons are responsible for light and temperature entrainment of Drosophila circadian locomotor rhythms. Journal of Biological Rhythms. 22 (2), 115-126 (2007).
- Edery, I., Zwiebel, L. J., Dembinska, M. E., Rosbash, M. Temporal phosphorylation of the Drosophila period protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2260-2264 (1994).
- Helfrich-Forster, C. The neuroarchitecture of the circadian clock in the brain of Drosophila melanogaster. Microscopy Research and Technique. 62 (2), 94-102 (2003).
- Price, J. L. Genetic screens for clock mutants in Drosophila. Methods in Enzymology. 393, 35-60 (2005).
