Summary
Ici, nous détaillons comment synchroniser Drosophila à un jour circadien. Il s’agit de la première étape, et la plus importante nécessaire pour étudier les rythmes biologiques et la chronobiologie.
Abstract
Presque universels parmi les organismes, les rythmes circadiens coordonnent l’activité biologique à l’orbite terrestre autour du soleil. Pour identifier les facteurs qui créent ce rythme et pour comprendre les extrants qui en résultent, il faut entraîner des organismes modèles vers des délais circadiens définis. Ici, nous détaillons une procédure pour entraîner de nombreux Drosophila à un rythme circadien défini. En outre, nous détaillons les étapes post-entraînement pour préparer des échantillons pour l’immunofluorescence, l’acide nucléique, ou l’analyse basée sur l’extraction de protéines.
Introduction
Presque tous les organismes sur Terre, du plus grand à unicellulaire, ont une horloge biologique interne avec un cycle d’environ un jour. C’est ce qu’on appelle le rythme circadien (inventé en 1953 par Franz Halberg à partir des termes latins circa = environ / approximativement et « i » = jour)1. Bien que les composants de l’horloge centrale soient connus et que leurs mécanismes rudimentaires de fonction soient conceptualisés, il y a encore beaucoup à comprendre sur la façon dont les rythmes biologiques sont maintenus dans tout le corps. Fait important, la mauvaise régulation des rythmes biologiques est associée à de mauvais résultats pour la santé, y compris une mauvaise formation de la mémoire, troubles du sommeil, trouble affectif saisonnier, dépression, trouble bipolaire, diabète, obésité, neurodégénérescence, et le cancer2,3,4,5.
Drosophila est un modèle bien établi pour l’étude de la biologie circadienne. Génétiquement et biochimiquement maniable, un grand nombre sont facilement entraînés (comme on le verra). En fait, les sept publications citées comme des publications clés de soutien dans l’attribution du prix Nobel pour la découverte de rythmes circadiens ont tiré parti de ces forces du modèle Drosophila6,7,8,9,10,11,12.
En outre, nous montrons des stratégies efficaces pour la collecte des mouches entraînées aux fins de l’immunofluorescence, de l’acide nucléique ou de l’analyse basée sur l’extraction de protéines. À l’aide de ces stratégies, on peut traiter et stocker de plus grandes quantités d’échantillons pour analyse à l’avenir. Ces méthodes sont très avantageuses en ce qu’elles sont reproductibles et peuvent produire des centaines de mouches entraînées qui peuvent faire partie d’un grand pool de données.
Protocol
1. Production alimentaire à la mouche
- Par 1 L d’eau, préparer des aliments à la mouche composé de 4,69 g de mélasse séchée, 19,70 g de levure active sèche, 87,22 g de farine de maïs et 7,83 g d’agar.
- Mélanger le contenu indiqué ci-dessus dans une marmite et tourner la chaleur à 250 °F. Bien mélanger et ajouter les ingrédients.
- Gardez le couvercle sur la marmite pendant que la nourriture à mouche chauffe tout en mélangeant le contenu toutes les 10 minutes jusqu’à ce qu’il atteigne une ébullition de roulement. Laisser l’ébullition de roulement se poursuivre pendant 20 min avant d’éteindre le feu.
- Ajouter 83,60 mL d’eau et garder le couvercle de la marmite au loin pendant que les aliments refroidissent.
- Mélanger et enregistrer la température des aliments toutes les 10 minutes à l’aide d’un thermomètre en verre. Évitez de laisser une couche de film s’installer sur la nourriture.
- Une fois que les aliments ont refroidi à 60 °C, ajouter 10,44 mL de Tegosept et 5,51 mL d’acide propionique par litre d’eau ajoutée (voir étape 1.1).
- Bien mélanger et faire chauffer jusqu’à 60 °C pour éviter que les aliments ne deviennent trop frais.
- Pomper la nourriture mouche au besoin à l’aide de la Droso-remplissage.
- Pour les flacons étroits, pompez 10 ml et pour 6 oz bouteilles de fond carré pompe 60 ml.
2. Collecte des mouches d’âge défini
- Surveiller les bouteilles de mouches de type sauvage stockées à 25 °C pendant 5-7 jours jusqu’à ce que de grandes quantités de pupe (environ 200 pupes) soient fixées sur le côté de la bouteille. Les bouteilles utilisées sont 6 oz bouteilles de stock Drosophila avec des fonds carrés.
- Dégagez les adultes existants de la bouteille. Soit faire basculer les adultes dans une nouvelle bouteille ou les placer dans 70% d’éthanol. Utilisez l’extrémité terne d’un pinceau #0 pour pousser les adultes restants dans la nourriture à la mouche. Assurez-vous d’essuyer le pinceau avec 70% d’éthanol avant et après les utilisations.
- Laisser les bouteilles déblayées s’asseoir pendant 3 jours dans un incubateur de 25 °C pour permettre à la prochaine génération d’effacer. Ces mouches auront entre 0 et 3 jours.
3. Séparation des mouches
- Après 3 jours, séparer les mâles des femelles et recueillir le nombre souhaité pour chaque sexe pour chacun des quatre points de temps. Les mouches peuvent être différenciées par le sexe en examinant les organes génitaux; les mâles ont des organes génitaux arrondis foncés tandis que les femelles ont des organes génitaux plus légers et plus pointus. Les femelles sont également beaucoup plus grandes que les mouches mâles.
- Utilisez un tampon d’anesthésie CO2 pour séparer efficacement les mouches et différencier entre les sexes. Déplacez les mouches avec des pinceaux pour éviter de les tuer.
- Recueillir 100 mâles et 100 femelles pour chaque point de temps, avec 50 mâles par flacon et 100 femelles par flacon. Les hommes ont tendance à être plus agressifs et leurs interactions sociales entraînent beaucoup de décès lorsqu’il y a 100 personnes dans une fiole. Les femelles - jusqu’à 100 individus - ne sont pas affectées lorsqu’elles sont contenues dans la fiole.
- Effectuer les collections aux points d’heure suivants : ZT1, ZT7, ZT13 et ZT19 (Tableau 1). Notez que les collections réalisées dans l’obscurité (ZT12-ZT24) sont sensibles à la lumière tandis que les collections ZT0-ZT11 sont effectuées pendant les heures d’éclairage et les lumières de la pièce peuvent être allumées. Veuillez noter que deux incubateurs distincts sont utilisés avec des motifs de lumière inverses de 12 heures pour permettre à toutes les collections de se produire pendant la journée et non pendant la nuit.
- Utilisez des mouches excédentaires pour créer de nouvelles bouteilles de mouches pour l’entraînement futur. Placer 25 femelles avec 5 à 7 mâles dans chaque nouvelle bouteille et placer dans l’incubateur à 25 °C.
4. Incubation de mouches
- Laissez les mouches rester dans des incubateurs réglementés par la lumière pendant 3-5 jours pour permettre à l’entraînement circadienne de se produire. Assurez-vous que les incubateurs sont étanches à la lumière, car même de petites quantités de pollution lumineuse perturberont l’entraînement.
5. Fixation de l’immunofluorescence
- Après l’entraînement, préparez de nouveaux flacons de solution de fixation pour les échantillons qui seront utilisés pour l’immunofluorescence. Avant d’enlever les mouches de l’incubateur, ajouter 4,8 mL de 4% de formaldéhyde dilué en 1x PBS + 0,1% Tween-20 à chaque nouveau flacon étroit pour chaque 100 mouches qui doivent être fixés. Chaque flacon abritera 100 mâles ou 100 mouches circadiennes femelles. Placez les flacons étroits dans la glace.
6. Collecte d’immunofluorescence
- Lors de la collecte des mouches de l’incubateur pour l’immunofluorescence, retirer le bouchon de la bouteille et inverser rapidement la bouteille dans l’entonnoir. Appuyez doucement sur les mouches dans la solution par l’intermédiaire de l’entonnoir pour aider à guider les mouches dans le flacon; combiner deux tubes des 50 mâles pour un total de 100 mâles dans un flacon et utiliser un seul tube de 100 femelles pour l’autre flacon.
- Exécutez les collections ZT13 et ZT19 dans l’obscurité; utiliser une lumière rouge afin de voir que la drosophila sont beaucoup moins sensibles à ces longueurs d’onde lumineuses et sont donc moins sujettes à la pollution lumineuse13. La protéine cryptochrome, en particulier, est particulièrement sensible à la lumière bleue, qui doit être évitée14.
- Pour réduire l’exposition à la lumière, assurez-vous que la pièce de collecte est étanche à la lumière, toutes les sources de lumière étant bloquées ou couvertes. Enveloppez ces flacons dans du papier d’aluminium de sorte que les mouches ZT13 et ZT19 ne soient pas exposées à la lumière lorsqu’elles sont placées sur le mélangeur à noix à l’étape suivante. Les mouches ZT1 et ZT7 ne sont pas sensibles à la lumière et peuvent être placées sur le mélangeur sans revêtement de papier d’aluminium.
7. Mélangeur et rangement à la noix
- Une fois les mouches recueillies, collez le dessus des flacons contenant des produits fixatifs pour éviter les déversements et placez-les sur le mélangeur à 165 tr/min à 4 °C pendant 4 h. Les mouches ne sont plus sensibles à la lumière après cette étape de fixation, de sorte que le papier d’aluminium peut être enlevé pour vérifier que la solution se déplace et les mouches sont submergées dans le fixatif.
- Après avoir enlevé la mouche contenant des flacons du mélangeur à noix retirer le formaldéhyde et laver trois fois avec 3.000 μL de 1x PBS, inverser le flacon à chaque lavage.
- Stockez les flacons portant des échantillons d’immunofluorescence à 4 °C en attendant l’immunofluorescencefuture 15.
8. Collecte pour l’extraction de protéines
- Préparer quatre tubes de 50 mL et un Dewar contenant de l’azote liquide pour la conservation d’échantillons destinés à l’extraction de protéines
- Pour la collecte des mouches pour l’extraction de protéines ou d’acide nucléique, transférer les mouches des bouteilles vers le tube de la même manière qu’à l’étape 6.1 et rapidement plafonner le tube pour empêcher la libération des mouches et placer le tube dans l’azote liquide pour casser le gel.
9. Stockage pour l’extraction de protéines
- Conserver les échantillons congelés pour l’extraction de protéines à -80 °C. Ceux-ci peuvent être traités selon le protocole d’extraction de protéines approprié pour l’analyse en aval, y compris l’immunoblotting16.
Representative Results
L’entraînement circadien contrôlé permet aux chercheurs d’examiner la biologie à des moments précis tout au long de la journée circadienne en utilisant les calendriers ZT1-ZT19 ou d’ajouter des délais au besoin. Ici, nous utilisons la lumière et l’obscurité pour entraîner les mouches aux cycles circadiens et vérifier l’entraînement par immunoblotting et l’analyse de l’immunofluorescence de la protéine d’époque, un marqueur pour l’entraînement circadienne (Figure 1). Dès l’entraînement correct, les protéines de période doivent avoir une intensité caractéristique et un modèle de mobilité (figure 1A)et doivent être visibles à des endroits spécifiques dans le cerveau ZT1 (Figure 1B). Bien que d’autres variables, y compris la nourriture et la température, peuvent influencer l’entraînement circadien, la lumière est la plus simple et fiable pour contrôler17. Aux fins de ces méthodes, les températures de l’incubateur sont maintenues constantes, en s’appuyant sur les neurones de l’horloge cérébrale qui sont influencés par la lumière pour l’entraînement18.
Figure 1 : Vérification de l’entraînement. (A) Immunoblotting des extraits de cellules entières préparés à partir de têtes de mouches entraînées montre des modèles canoniques de mobilité protéique d’époque et d’intensité19. 1.4 les têtes femelles de chacun des temps indiqués de Zeitgeber (ZT) ont été analysées utilisant un anticorps anti-Per. (B) Immunofluorescence des cerveaux entraînés recueillis au ZT, où la protéine de période se trouve dans un modèle caractéristique (panneaux inférieurs, recréés à partir de Helfrich-Forster20). Sont montrés des images prises à partir de différentes sections du cerveau, capturant tous les neurones censés contenir des protéines de période à ZT1. La barre d’échelle est de 40 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| ZT1 | ZT7 | ZT13 | ZT19 |
| Lumière entre 10 h et 22 h | Lumière entre 10 h et 22 h | Sombre entre 9 h et 21 h | Sombre entre 9 h et 21 h |
| Recueilli à 11 h après 1 heure en lumière | Recueilli à 17 h après 7 heures en lumière | Recueilli à 10 h après 1 heure dans l’obscurité | Recueilli à 16 heures après 7 heures dans l’obscurité |
Tableau 1 : ZT1-ZT19 Calendriers de synchronisation du rythme circadien.
Discussion
Les chercheurs utilisent ce protocole d’entraînement avec succès et cohérence. Cette procédure permet la fixation d’une grande réserve d’échantillonnage qui peut être stockée pour une analyse future. En outre, cette stratégie préserve les modèles neurologiques induits par l’entraînement pour l’examen futur.
Fixation pour le stockage est un élément majeur du processus d’entraînement car il aide à stabiliser les tissus cérébraux et il permet plus de temps pour analyser chaque cerveau à partir de la piscine de données réduisant ainsi les déchets des cerveaux qui perdent la viabilité en raison de l’âgede 21. L’objectif principal est d’entraîner le plus grand nombre possible de mouches circadiennes afin qu’il y ait un inventaire continu disponible pour les dissections de la tête et, en fin de compte, l’immunofluorescence ou l’extraction de protéines afin d’observer les résultats et de déterminer si les résultats sont de grande confiance. Pour s’assurer que l’entraînement circadien est préservé par fixation, il est essentiel que toute source de pollution lumineuse soit éliminée. Le processus de fixation permet de stocker Drosophila tout en maintenant son « horodatage » neurologique afin qu’ils puissent être disséqués plus tard et analysés sans différences notables pour les mouches qui sont disséquées et ont subi l’immunofluorescence immédiatement après l’entraînement. Aux fins de la fixation avant l’immunofluorescence, le laboratoire a déterminé avec une consistance que les mouches sont viables au moins jusqu’à 1 mois. Les fixations pour l’extraction de protéines de tache occidentale rendent le cerveau viable indéfiniment lorsqu’ils sont stockés à -80 °C.
Une autre étape critique du protocole est le sexing des mouches. Il est important que cette étape soit faite avec précision car avoir les deux sexes dans le même flacon avant la fixation peut conduire à l’accouplement, ce qui donnera de nouvelles mouches qui sont de plus jeune âge et l’analyse des protéines corrompues si les mâles sont accidentellement examinés au lieu de femelles ou vice versa. En outre, lors du sexing, il est important d’enlever les spécimens de larves qui sont parfois attachés aux femelles. Cela empêche le développement de nouvelles descendants à l’intérieur du flacon féminin qui pourrait potentiellement corrompre les résultats.
La prochaine étape pour le protocole d’entraînement peut être avec les éléments liés à l’analyse des données. L’objectif du protocole est la localisation des protéines, mais s’il y a d’autres variables qui sont touchées par l’entraînement circadien, elles doivent être explorées par de nouvelles avenues, nécessitant souvent l’extraction de protéines ou d’acide nucléique. En outre, il existe d’autres protéines du cerveau qui peuvent encore être analysées via ce protocole. Les expériences associées au protocole ont analysé certaines protéines, mais la liste des gènes et des protéines qui jouent un rôle dans la biologie circadienne n’a pas été épuisée. Le protocole est efficace pour atteindre l’objectif d’établir un rythme circadien, cependant, les applications sont de grande envergure.
Disclosures
Aucun.
Acknowledgments
Un grand merci à l’Université du Missouri-Kansas City et au laboratoire Jeffrey L. Price.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | ES-1000 | |
| 10-100uL pipette | Eppendorf | ES-100 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | 15710 | ||
| 1X PBS | Caisson Labs | PBL01-6X100ML | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423500 | |
| Anesthesia Filter Connection Kit | World Precision Instruments | EZ-251A | |
| Corn meal | Genesee Scientific | 62-100 | |
| Dried Molasses | Food Service Direct | OT280504 | |
| Droso-filler Food Pump | geneseesci.com | 59-169 | |
| Drosophila Stock bottles, 6 oz square bottom w/ Flugs | geneseesci.com | 32-130BF | |
| Drosophila vials, Narrow K-Resin super bulk | geneseesci.com | 32-118SB | |
| Dry active yeast | Genesee Scientific | 62-103 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15720 | |
| EZ Basic Anesthesia System | World Precision Instruments | EZ-175 | |
| Falcon Centrifuge tubes | Corning | 352097 | |
| Falcon round bottom tubes | Corning | 352057 | |
| Fine point Sharpie marker | Sharpie | 30001 | |
| Fisherbrand Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | |
| Flugs-Narrow Plastic Vials | Genesee Scientific | 49-102 | |
| Glass Thermometer | Cole-Palmer | EW-08008-12 | |
| Liquid nitrogen hose | Thermo Scientific | 398202 | |
| Liquid nitrogen tank-Dewar | Cooper Surgical Inc | 900109-1 | |
| Liquid nitrogen transfer vessel | Electron Mircoscopy Sciences | 61891-02 | |
| Paintbrushes(Red Sable) Size #0 | Electro Microscopy Sciences | 66100-00 | This is used to separate the flies via sex without causing injury. |
| Plastic funnel | Plews and Edelmann | 570-75-062 | |
| Polarizing light microscope | Microscope Central | 1100100402241 | Used to more clearly view Drosophila during sexing |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-100U | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-1M | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-5M | |
| Propionic Acid | Sigma Aldrich | P1386-1L | |
| Rayon Balls | Genesee Scientific | 51-100 | |
| Reynolds wrap standard aluminum foil | Staples | 1381273 | |
| Roaster Oven (Crockpot) | Hamilton Beach | 32950 | |
| Scotch 810 Magic Tape | Electron Microscopy Sciences | 77300 | |
| Spray bottle with trigger | US Plastic | 66446 | Used to spray ethanol to clean work bend areas |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Thermo Scientific Drosophila Incubator | Thermo Scientific | 3990FL | |
| Thermo Scientific Revco 4 degree Lab fridge | ThermoFisher Scientific | REL7504D | |
| Thermo Scientific Revco Lab Freezer | ThermoFisher Scientific | REL7504A | |
| Tween 20 | Anatrace | T1003-1-GA |
References
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