Summary
ここでは、ショウジョウバエを概日に同期させる方法について詳しく説明します。これは、生物学的リズムとクロノバイオロジーを研究するために必要な最初の、そして最も重要なステップです。
Abstract
生物の間でほぼ普遍的な概日リズムは、太陽の周りの地球の軌道に生物活動を調整します。このリズムを生み出す因子を特定し、結果の出力を理解するために、定義された概日の時間ポイントにモデル生物を乗り込む必要があります。ここでは、多くのショウジョウバエを定義された概日リズムに巻き込む手順を詳述する。さらに、免疫蛍光、核酸、またはタンパク質抽出ベースの分析のためのサンプルを調製するための後のエントレインメントステップについて詳しく説明します。
Introduction
地球上のほぼすべての生物は、最大から単細胞まで、約1日のサイクルを持つ内部生物学的時計を有する。これは概日リズム(ラテン語の頃からフランツ・ハルバーグによって1953年に作られた=約/およそと"dies"=日)として知られています1.コアクロックの成分は知られており、その初歩的な機能機構が概念化されていますが、生体リズムが全身でどのように維持されているかを理解することはまだまだたくさんあります。重要なことに、生物学的リズムの誤調節は、記憶不良、睡眠障害、季節性影響障害、うつ病、双極性障害、糖尿病、肥満、神経変性、および癌22、3、4、53,4,5を含む健康状態の悪い転帰に関連している。
ショウジョウバエは、概日生物学の調査のための確立されたモデルです。遺伝的および生化学的に難易な、多数が容易に(示されるように)緊張される。実際、概日リズムの発見のためのノーベル賞の受賞を支援する主要な出版物として引用された7つの出版物はすべて、ショウジョウバエ,モデル,66、7、8、9、10、11、127のこれらの強みを活用しました。9,10,11,128
さらに、免疫蛍光、核酸、またはタンパク質抽出ベースの分析を目的として、緊張したハエを収集するための効果的な戦略を示します。これらの戦略を使用して、将来分析するために大量のサンプルを処理して保存することができます。これらの方法は、再現性があり、大規模なデータ プールの一部となり得る何百もの訓練されたハエを生成できるという点で非常に有利です。
Protocol
1. フライ食品生産
- 水の1 Lごとに、乾燥糖蜜の4.69 g、乾燥活性酵母の19.70 g、トウモロコシの食事の87.22 gと寒天の7.83グラムからなるフライ食品を調製します。
- 上記の内容物をクロックポットに組み合わせ、熱を250°Fに変えます。 材料と同様に混ぜる。
- フライフードが加熱されている間、蓋をクロックポットに置き、10分ごとに内容物を混ぜ合わせて、転がれ沸騰するまで蓋をします。沸騰したゆを20分間続けてから火を消します。
- 83.60mLの水を加え、食べ物が冷やすようにクロックポットの蓋を外します。
- ガラス温度計で10分ごとに食品の温度を混ぜて記録します。食べ物の上にフィルムの層を落ち着かせないようにしてください。
- 食品が60°Cに冷却されたら、テゴセプトの10.44 mLと加水1リットル当たりプロピオン酸5.51mLを加えます(ステップ1.1を参照)。
- よく混ぜて60°Cまで加熱し、食品が冷えすぎないようにします。
- ドロソフィラーを使用して、必要に応じてフライフードをポンプで送ります。
- 狭いバイアルの場合、ポンプ10 mLと6オンスの正方形の底のボトルポンプ60 mL。
2. 指定された年齢のハエの収集
- 野生型ハエのモニターボトルは、25°Cで5〜7日間保存され、大量の子犬(約200個の子犬)がボトルの側面に取り付けられるまで保管されています。使用されるボトルは、正方形の底を持つ6オンスショウジョウバエストックボトルです。
- ボトルから既存の大人をクリアします。大人を新しいボトルに入れるか、70%エタノールに入れます。#0の絵筆の鈍い端を使用して、残りの大人をフライフードに押し込みます。使用前と使用後に70%エタノールでペイントブラシを拭き取るようにしてください。
- クリアしたボトルを25°Cのインキュベーターで3日間座って、次世代が閉じられるようにします。これらのハエは0〜3日の間になります。
3. フライの分離
- 3日後、男性を女性から分離し、4つのタイムポイントごとに性別ごとに所望の数を集める。ハエは生殖器を調べることによってセックスによって区別することができる。男性は暗い丸みを帯びた生殖器を持っているのに対し、女性は明るく、より尖った生殖器を持っている。メスもオスのハエよりはるかに大きい。
- CO2麻酔2パッドを使用して、ハエを効果的に分離し、男女を区別します。ハエを殺さないように、ペイントブラシで動かしてください。
- 各タイムポイントに対して100人の男性と100人の女性を集め、バイアルあたり50人の男性とバイアルあたり100人の女性を集める。男性はより積極的になる傾向があり、彼らの社会的相互作用は、バイアルに100人の個人がいるときに多くの死につながります。バイアルに含まれている間、最大100人の女性は影響を受けません。
- ZT1、ZT7、ZT13、ZT19 (表 1) の時点でコレクションを実行します。暗い(ZT12-ZT24)で行われたコレクションは光に敏感であるのに対し、ZT0-ZT11コレクションはライトオン時に行われ、ルームライトは点灯することができます。2つの別々のインキュベーターは、すべてのコレクションが一晩ではなく日中に発生することを可能にするために、逆12時間の光パターンで使用されることに注意してください。
- 余分なハエを使用して、将来のエントレインメントのためにハエの新しいボトルを作成します。新しいボトルに5〜7人の男性を入れた25人のメスを入れ、25°Cの保育器に入れます。
4. フライインキュベーション
- 概日の巻き込みが発生できるように、ハエが3〜5日間光規制インキュベーターに滞在することを許可します。少量の光害でも封じ込めが妨げになるので、インキュベーターが軽く締まるようにしてください。
5. 免疫蛍光固定
- エントレーニング後、免疫蛍光に使用されるサンプルの固定溶液の新しいバイアルを準備します。インキュベーターからハエを取り除く前に、固定される100ハエごとに新しい狭いバイアルに1x PBS + 0.1%Tween-20で希釈した4%ホルムアルデヒドの4.8 mLを加えます。各バイアルは、100人の男性または100人の女性の概日訓練されたハエを収容します。細いバイアルを氷の中に入れる。
6. 免疫蛍光コレクション
- 蛍光免疫のためにインキュベーターからハエを採取する場合は、ボトルキャップを取り外し、ボトルを漏斗に素早く反転します。ハエを漏斗で溶液にそっとタップして、ハエをバイアルに導きます。1つのバイアルに合計100人の男性のための50の男性の2つのチューブを組み合わせ、他のバイアルのための100の女性の単一のチューブを使用しています。
- 暗闇の中でZT13とZT19コレクションを実行します。ショウジョウバエがこれらの光波長に対する感受性がはるかに低く、したがって光汚染13になりやすいので見るために赤い光を使用してください。特にクリプトクロムタンパク質は青色光に対して特に感受性であり、14を避けなければならない。
- 光の露出を減らすために、コレクションの部屋が遮られたり覆われた光の源で軽く締まるようにしなさい。次の手順で、ZT13およびZT19ハエがナットミキサーに置かれたときに光にさらされないように、これらのバイアルをホイルで包みます。ZT1およびZT7ハエは光に敏感ではなく、ホイルカバーなしでミキサーに置くことができる。
7. ミキサーとストレージの栄養を取り込む
- ハエが回収された後、こぼれを避けるために固定剤を含むバイアルの上部をテープで貼り付け、4°Cで165 RPMの栄養ミキサーに4時間置きます。この固定ステップの後、ハエはもはや光に敏感ではないので、溶液が動いていることを確認するためにホイルを取り除き、ハエが固定剤に沈められていることを確認することができます。
- ヌテッティングミキサーからバイアルを含むハエを取り除いた後、ホルムアルデヒドを取り出し、3,000 μLの1x PBSで3回洗浄し、洗浄ごとにバイアルを反転します。
- 免疫蛍光サンプルを持つバイアルを4°Cに保存して、将来の免疫蛍光15を待つ。
8. タンパク質抽出用コレクション
- タンパク質抽出用サンプルを保存するために、4本の50 mLチューブと液体窒素を含むデュワーを用意
- タンパク質または核酸抽出のためにハエを収集するために、ステップ6.1と同じ方法でボトルからチューブにハエを移し、すぐにチューブをキャップしてハエの放出を防ぎ、チューブを液体窒素に入れて凍結します。
9. タンパク質抽出用ストレージ
- タンパク質抽出用のスナップ凍結サンプルを-80 °Cに保存します。 これらは、下流分析に適したタンパク質抽出プロトコルに従って処理することができる、免疫ブロット16を含む。
Representative Results
制御された概日の訓練は、研究者がZT1-ZT19タイミングスケジュールを使用して概日を通して特定の時点で生物学を調べたり、必要に応じてタイムポイントを追加することを可能にします。ここでは、光と闇を使用して、ハエを概日サイクルに巻き込み、周期タンパク質の免疫ブロット法および免疫蛍光分析(概日巻き入れのマーカー)によってエントレインメントを検証します(図1)。正しいエントレインメントの際、周期タンパク質は特徴的な強度と移動パターンを持つ必要があります(図1A)、ZT1脳内の特定の場所(図1AB)で見える必要があります。食品や温度を含む他の変数は概日の入り込みに影響を与えることができますが、光は最もシンプルで、17を制御するために信頼性が高いです。これらの方法の目的のために、インキュベーター温度は一定に保たれ、エントレインメント18のための光の影響を受ける脳時計ニューロンに依存する。
図1:エントレインメントの検証(A)増殖したハエの頭部から調製された全細胞抽出物の免疫ブロットは、期間タンパク質移動度および強度19の正規パターンを示す。示されたツァイトゲバー時間(ZT)のそれぞれから1.4の女性の頭部は抗Per抗体を用いて分析した。(B) ZTで集められた、生理タンパク質が特徴的なパターンで見つかる、緊張した脳の免疫蛍光(下部パネル、ヘルフリッヒ・フォルスター20から再現)。図示は、脳の異なるセクションから撮影された画像であり、ZT1で期間タンパク質を含むと予想されるすべてのニューロンをキャプチャする。スケールバーは40 μmです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ZT1 | ZT7 | ZT13 | ZT19 |
| 午前10時から午後10時までの間の光 | 午前10時から午後10時までの間の光 | 暗い午前9時から午後9時 | 暗い午前9時から午後9時 |
| 光の中で1時間後の午前11時に収集 | 光の中で7時間後の午後5時に収集 | 暗闇の中で1時間後の午前10時に収集 | 暗闇の中で7時間後の午後4時に収集 |
表 1: ZT1-ZT19 概日リズムタイミングスケジュール
Discussion
研究者は、成功と一貫性を持つこのエントレインメントプロトコルを利用しています。この手順により、将来の分析のために格納できる大規模なサンプリング プールを固定できます。さらに、この戦略は、将来の検査のために訓練することによって誘発される神経学的パターンを維持する。
貯蔵のための固定は、脳組織を安定させるのに役立ち、データプールから各脳を分析する時間が増え、21歳までに生存率を失う脳からの無駄を最小限に抑えるため、エントレインメントプロセスの主要な構成要素である。主な目標は、頭部の切り抜きに利用可能な連続的な在庫があり、最終的には免疫蛍光またはタンパク質抽出が得られるように、できるだけ多くのハエを概日に巻き込み、その発見を観察し、結果が高い信頼度であるかどうかを判断することです。概日の巻き込みを固定によって確実に保存するためには、光害の源を排除することが不可欠です。固定プロセスにより、ショ ウジョウバエ は神経学的な「タイムスタンプ」を維持しながら保存できるため、後で解剖され、解剖され、接種直後に免疫蛍光を受けたハエに顕著な違いなしで分析することができます。免疫蛍光の前に固定の目的のために、実験室はハエが少なくとも1ヶ月まで生存可能であることを一貫性をもって決定した。ウェスタンブロットタンパク質抽出のための固定は、-80°Cで保存すると脳を無期限に生存可能にします。
もう一つの重要なプロトコルステップは、ハエのセックスです。このステップは、固定前に同じバイアルに男女の両方を持つことが交配につながる可能性があり、男性が女性の代わりに誤って検査された場合、若い年齢で腐敗したタンパク質分析を行う新しいハエを生み出す可能性がある、またはその逆を正確に行うことが重要です。さらに、セックスの際には、時には女性に付着している幼虫標本を取り除くことが重要です。これは潜在的に結果を破損する可能性がある女性のバイアル内の新しい子孫の開発を防ぎます.
エントレインメント プロトコルの次のステップは、データ分析に関連する項目です。プロトコルの焦点はタンパク質の局在化ですが、概日の封じ込めの影響を受ける他の変数がある場合、タンパク質または核酸抽出を必要とする新しい道を探索する必要があります。さらに、 このプロトコルを介して分析することができる脳の他のタンパク質があります。.プロトコルに関連する実験は、特定のタンパク質を分析したが、概日生物学で役割を果たす遺伝子とタンパク質のリストは使い果たされていない。このプロトコルは概日リズムを確立するという目標を達成するのに有効ですが、アプリケーションは広範囲に及んでいます。
Disclosures
なし。
Acknowledgments
ミズーリ大学カンザスシティ校とジェフリー・L・プライス研究所に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | ES-1000 | |
| 10-100uL pipette | Eppendorf | ES-100 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | 15710 | ||
| 1X PBS | Caisson Labs | PBL01-6X100ML | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423500 | |
| Anesthesia Filter Connection Kit | World Precision Instruments | EZ-251A | |
| Corn meal | Genesee Scientific | 62-100 | |
| Dried Molasses | Food Service Direct | OT280504 | |
| Droso-filler Food Pump | geneseesci.com | 59-169 | |
| Drosophila Stock bottles, 6 oz square bottom w/ Flugs | geneseesci.com | 32-130BF | |
| Drosophila vials, Narrow K-Resin super bulk | geneseesci.com | 32-118SB | |
| Dry active yeast | Genesee Scientific | 62-103 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15720 | |
| EZ Basic Anesthesia System | World Precision Instruments | EZ-175 | |
| Falcon Centrifuge tubes | Corning | 352097 | |
| Falcon round bottom tubes | Corning | 352057 | |
| Fine point Sharpie marker | Sharpie | 30001 | |
| Fisherbrand Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | |
| Flugs-Narrow Plastic Vials | Genesee Scientific | 49-102 | |
| Glass Thermometer | Cole-Palmer | EW-08008-12 | |
| Liquid nitrogen hose | Thermo Scientific | 398202 | |
| Liquid nitrogen tank-Dewar | Cooper Surgical Inc | 900109-1 | |
| Liquid nitrogen transfer vessel | Electron Mircoscopy Sciences | 61891-02 | |
| Paintbrushes(Red Sable) Size #0 | Electro Microscopy Sciences | 66100-00 | This is used to separate the flies via sex without causing injury. |
| Plastic funnel | Plews and Edelmann | 570-75-062 | |
| Polarizing light microscope | Microscope Central | 1100100402241 | Used to more clearly view Drosophila during sexing |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-100U | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-1M | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-5M | |
| Propionic Acid | Sigma Aldrich | P1386-1L | |
| Rayon Balls | Genesee Scientific | 51-100 | |
| Reynolds wrap standard aluminum foil | Staples | 1381273 | |
| Roaster Oven (Crockpot) | Hamilton Beach | 32950 | |
| Scotch 810 Magic Tape | Electron Microscopy Sciences | 77300 | |
| Spray bottle with trigger | US Plastic | 66446 | Used to spray ethanol to clean work bend areas |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Thermo Scientific Drosophila Incubator | Thermo Scientific | 3990FL | |
| Thermo Scientific Revco 4 degree Lab fridge | ThermoFisher Scientific | REL7504D | |
| Thermo Scientific Revco Lab Freezer | ThermoFisher Scientific | REL7504A | |
| Tween 20 | Anatrace | T1003-1-GA |
References
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