Summary
提出了一种通过手术阻断淋巴血管来阻止淋巴流动的方案。
Abstract
淋巴血管通过运输抗原、细胞因子和细胞排干淋巴结（LNs）来保持组织流动性平衡和优化免疫保护至关重要。淋巴流中断是研究淋巴血管功能的重要方法。从杂物足部到流行淋巴结（pLNs）的淋巴血管被明确界定为淋巴排入pLNs的唯一途径。给这些发性淋巴血管进行吸管可以选择性地防止淋巴流向pLAN。此方法允许干扰淋巴流，对排水 pLN 中的淋巴内皮细胞、支淋巴血管以及该区域周围的其他淋巴血管的损害最小。此方法已用于研究淋巴如何影响 LN 中的高内皮淋巴瘤（ HEV ）和化疗表达，以及淋巴如何在没有功能性淋巴血管的情况经 LN 周围的脂肪组织。随着人们越来越认识到淋巴功能的重要性，这种方法将有更广泛的应用，以进一步解开淋巴血管在调节LN微环境和免疫反应的功能。
Introduction
淋巴系统的空间组织提供结构和功能支持，以有效地去除细胞外液体，将抗原和抗原呈现细胞（APC）运送到排出的LNs。最初的淋巴血管（也称为淋巴毛细血管）由于其不连续的细胞间结，便于从周围的细胞外空间1有效地收集液体、细胞和其他材料， 因此具有高度渗透性。最初的淋巴血管合并成收集淋巴血管，这些血管有紧密的细胞间结，连续的地下室膜和淋巴肌肉覆盖。收集淋巴血管负责运输收集的淋巴到排水的LNs，并最终返回淋巴循环2，3。将淋巴推进到排水的LN的收集淋巴血管是发性淋巴血管4，5，6，7。淋巴血管的阻塞可以阻止淋巴流进入LNs，这是研究淋巴流动功能时有用的技术。
先前的研究表明，淋巴流动在运输抗原和药水，以及维持LN平衡方面起着重要作用。众所周知，组织衍生的APCs，通常激活的迁移树突状细胞（DCs），通过发源淋巴血管前往LN激活T细胞8。自由形式的抗原，如微生物或可溶性抗原，被动地与淋巴流动到LN激活LN居民APC的想法在过去十年中得到了接受9，10，11，12。与淋巴一起携带的自由形式抗原在感染后需要几分钟时间才能到达 LN，LN-驻留细胞活化可能在刺激后 20 分钟内发生。这比迁移 DC 的激活要快得多，迁移 DC 进入排空 LN 9 需要 8小时多。除了运输抗原以启动免疫保护外，淋巴还携带细胞因子和DC到LN，以维持其微环境，并支持免疫细胞平衡13，14。此前，通过阻断淋巴血管来阻断淋巴流动表明，淋巴需要维持支持恒流T细胞所需的HV表型，B细胞向LN15、16、17定位。CCL21是一种关键的化学素，它指导直流和T细胞在LN8，18中的定位。阻塞淋巴流会中断 LN 中的 CCL21 表达，并可能中断 LN19中的直流和 T 细胞定位和/或相互作用。因此，阻断淋巴流动可以通过破坏调节 LN 免疫反应的 LN 微环境，直接或间接地消除抗原/直流对排干 LN 的访问。为了更好地研究淋巴流动的功能，提出了一个实验方案（图1），通过将支脚的淋巴血管从脚垫到pLN的吸血，来阻止小鼠的淋巴流动。该方法是今后在健康和患病条件下研究淋巴功能的重要技术。
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Protocol
所有动物工作都需要得到机构和政府伦理及动物处理委员会的批准。 这是一个非生存手术。
1. 材料准备
- 通过将 70 mL 的 100% 乙醇与 30 mL 的无菌水混合，准备 100 mL 的 70% 乙醇。手术前将所有手术工具绝育，并在手术前和手术期间将工具保持为 70% 乙醇，以保持灭菌。
- 准备注射装置。
- 切割 ±30 厘米聚乙烯管（直径 0.28 毫米）。将 30 G x 1/2 针（针 A）的尖端连接到聚乙烯管的一端。小心地将另一根 30 G x 1/2 针（针 B）断开，然后将断裂侧连接到聚乙烯管的另一端。
- 将针头 A 连接到 1 mL 结核素注射器。
注：对于这种聚乙烯管，1.6厘米的流体在管内对应于1μL20。
- 在盐水中准备 10：1 氯胺酮/锡胺混合物（10 毫克/mL 氯胺酮和 1 mg/mL xyl xyl 汀）中（细菌静态 0.9% [w/v] 氯化钠）。使用前请重新准备溶液。
2. 动物手术准备
注：使用6~10周的小鼠。雌性小鼠和雄性小鼠均可以使用。在这项研究中，使用了6~10周大的C57BL/6只雌性小鼠。这种方法可以适用于其他小鼠菌株。
- 通过注射250μL的氯胺酮/西拉辛混合物，麻醉小鼠。等到鼠标完全入睡。确保鼠标不会对手趾捏做出反应，以检测完全麻醉。
- 用剪发器在腿上剃毛皮。
- 在腿部周围涂抹脱毛霜，等待5分钟。用湿润的纸巾擦去残留的毛皮和脱毛霜，用无菌水清洁腿部。在腿部周围喷洒 70% 乙醇，对操作区域进行消毒。乙醇被限制在切口部位。
3. 手术性淋巴血管
注：右腿被缝合，左腿用作假控件。淋巴缝合方案（步骤3.1~3.8）需要20~30分钟。
- 将鼠标保持在易发位置，用手术胶带将其固定，以露出右腿的手术区域。
- 在贸易中将 5 μL 的 1% Evans 蓝色染料或 9 厘米的注射装置的液体管插入脚垫。轻轻按摩足垫，帮助埃文斯蓝进入淋巴血管。
注：胰岛素注射器不容易控制小体积注射。使用注射装置可以更准确地控制音量。淋巴血管在皮肤下被蓝色染料可视化。通过广泛的训练，两个发源淋巴血管都可以看到肉眼作为透明血管在脂肪组织中，平行于Saphenous动脉。通过广泛的培训，可以缝合容器，而无需注射埃文斯蓝染料的情况下，有潜在的干扰从染料。 - 在解剖显微镜下，从波莱特叶的下边缘选择一个切口位点 5 mm。用剪刀在皮肤上做一个小切口（±5毫米）。使用精细的操作钳，拉伸切口，并暴露收集的淋巴血管（图1A）。
注：如有必要，可以去除一个小皮肤碎片，以暴露淋巴血管。 - 在解剖显微镜下识别导致pLAN的两个发性淋巴血管（图1B）。
注：从脚垫到 pLN 有两个发性淋巴血管。两者都需要被缝合，以完全阻止淋巴流动。 - 使用针架，小心地将缝合针（0.7公制或更小）插入到支点淋巴血管和Saphenous动脉之间，然后轻轻地将针头拉到支用淋巴血管周围。轻轻拉缝合线，留下约2厘米的缝合线。使用针架帮助将绳子紧紧系住，用外科医生的结缝合一个淋巴血管（图1C）。
注：切口下面的组织可能会干燥，长时间暴露在空气中。使切口尽可能小，并快速执行缝合（即，在5分钟内）将防止组织干燥。用棉签涂抹少量盐水，以保持组织水分。 - 轻轻按摩脚垫，以确保没有埃文斯蓝染料通过缝合现场，然后用剪刀切割多余的字符串。
- 在其他一个发淋巴容器上执行相同的缝合步骤（即步骤3.5和3.6）（图1D）。用步骤 3.5 中用于缝合血管的相同缝合切口关闭皮肤切口 （图 1E）.
- 对于假控制，在左脚垫上注射5μL的1%埃文斯蓝色染料，并按摩脚垫以可视化淋巴血管。用切除打开皮肤，然后闭合伤口而不使血管破裂（图1F）。
- 可选地，监测手术小鼠2~4小时。腿的缝合侧应该显示水肿与埃文斯蓝蔓延到大腿， 而控制腿将显示限制埃文斯蓝色染料在脚垫。如果小鼠醒来，将注射额外的氯胺酮/锡胺混合物，以保持麻醉，直到安乐死。
4. 淋巴流的跟踪
- 手术后，在控制部位和淋巴缝合腿的足垫中立即注射10微升2%氟辛同位素（FITC）。
- 用400μL的氯胺酮/西拉辛混合物对小鼠进行安乐死，当小鼠完全麻醉时，进行宫颈脱位。
- 从流行果细胞中收集pLAN，并在 FITC 注射后 2、6 和 12 小时在解剖显微镜下小心地去除 pLAN 周围的佩里诺达尔脂肪组织。
- 在最佳切割温度 （OCT） 化合物中，将 pLUN 与面向低温的金丝窦区域嵌入（图 1G，H）。
- 使用低温表示，准备 20 μm 冷冻部分。
- 在共声显微镜下成像低温，以确定 FITC 分布。
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Representative Results
淋巴细胞缝合在以前的研究中已经使用15，16，17，19，作为一个重要的工具，研究淋巴流的功能之前，淋巴细胞的分子生物学被更好地理解。阻塞淋巴流中断LN平衡，这导致 HEV 失去最佳淋巴细胞宿主到 LN15、16、 17所需的关键基因表达。从那时起，又花了20年的时间证明，携带淋巴旅行的DC对于维持 HEV 基因表达特征和淋巴细胞与 LN13 的定位至关重要。淋巴流提供的剪切应力对刺激 LN 中的化疗表达至关重要。阻塞淋巴流会中断LN19中的化疗CCL21表达，这对于引导直流和T细胞在LN中的定位至关重要。因此，中断的流量可能会损害DC和T单元在LN8、18中的定位。
手术后，一个小分子量荧光示踪剂，FITC，被用来跟踪淋巴流动。FITC（10 μL的2%FITC）被注射在假对照和淋巴缝合腿的脚垫中。排水 pLNs 在 2、6 和 12 小时后收集。排放的 pLN 嵌入在 OCT 中，并准备了 20 μm 冷冻部分。共和图像显示缝合后PLAN中的 FITC 积累大大减少。pLNS 中的残留 FITC 优先积聚在 LN 鼻窦中（图 2）。
使用淋巴缝合线对淋巴如何流过 LN 周围的脂肪组织进行了调查。导致pLAN的淋巴血管被缝合以阻止淋巴流动，并被确定为，当淋巴血管被阻断时，周生脂肪组织可以支持少量的淋巴流动。淋巴流经脂肪组织到LN胶囊被映射;它似乎喂入 Ln 鼻窦。随着时间的推移，少量的淋巴可能流入LN鼻窦（图3）。
图1：波莱特LN（pLN）的淋巴细胞缝合的步骤。简言之，在老鼠用氯胺酮和西拉辛混合物麻醉后，它们的腿被剃光，残留的皮毛被脱毛霜去除。右腿用于缝合，左腿是假控制。脚垫的右侧被非贸易注入 5 μL 的 1% 埃文斯蓝色染料在 PBS 中制备。（A） 通过轻轻按摩脚垫，埃文斯蓝染料填充了发淋巴血管。（B） 在远离pLN的地方进行一个小的皮肤切割，以暴露淋巴血管，这两个白色箭头表示。（C，D）两个发性淋巴血管都缝合了。（E） 皮肤切除被缝合封。（F） 控制腿接受埃文斯蓝色注射，皮肤切除，缝合关闭，而不缝合淋巴血管。（G） 淋巴流量阻塞的成功是由埃文斯蓝色染料表示的，它进入控制腿的pLN，而不是缝合的腿。 （H，I） 收集的pLN嵌入在 OCT 化合物中，其中亚帽鼻窦 （SCS） 和三角窦 （MS） 面对低温的一侧，然后捕捉到液体氮气中的卡。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：在假腿或缝合腿的排水 pLN 中，FITC 分布。FITC 注射后收集的 pLAN 的共合图像显示，缝合后 PLAN 中的 FITC 积累量大大减少。pLN 中的残留 FITC 优先在 LN 鼻窦中发现。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：FITC分布于周生脂肪组织（PAT），围绕假腿或缝合腿的排水pLAN。PAT 和 LN 的共合图像显示，FITC 进入 PAT 和 LN 鼻窦，但当淋巴血管阻塞时，在整个 LN 中未有效分布。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在健康和患病条件下，阻断淋巴流动在操纵抗原输送到LN方面有着广泛的应用。可以使用此方法控制抗原传递的时间，以研究连续淋巴流如何调节排空 LNs 中的免疫反应。这种淋巴流中断方法还可用于研究淋巴如何影响 LN 中的细胞分块、细胞激活、细胞迁移和细胞细胞相互作用。
专门表达人类白喉毒素受体（DTR）的小鼠在淋巴内皮细胞（Flt4-cre-dtr）中已经开发出来;这些可以用来专门消耗淋巴血管研究淋巴功能22。DT 的管理杀死淋巴血管和 LN 中的淋巴内皮细胞。淋巴内皮细胞的耗竭可以完全废除淋巴流动的区域或系统研究淋巴功能。这种方法在组织中引起显著的液体积累，是研究淋巴水肿和淋巴功能的一个很好的模型。
与淋巴内皮细胞特异性DTR表达模型相比，淋巴缝合法的优点是它中断淋巴流动，对淋巴内皮细胞或该区域周围任何其他淋巴细胞的损伤最小。干预不会直接影响排出的LN中的细胞，因此对LN微环境或免疫细胞通信的影响是淋巴流封锁的结果，而不是由DT引起的潜在细胞死亡。这种方法的另一个好处是，淋巴流在手术后立即阻塞，因此淋巴流阻塞的时间可以更好地控制。
这种方法的局限性是，它只能用于研究淋巴流从脚垫到pLN的淋巴血管的区域干预。这种方法需要确定收集淋巴血管的确切位置。收集淋巴血管在某些解剖位置很难识别，因此这项技术需要大量的解剖和手术训练，才能成功识别出位淋巴血管以阻止淋巴流动。另一个限制是，这种方法不能直接阻止淋巴进入初始淋巴血管。缝合后，阻塞的淋巴流可能会增加间体流动的压力，并改变初始淋巴血管的淋巴流动方向。因此，该区域周围完整的淋巴血管可以补偿中断的淋巴血管的功能，并改变淋巴流动的方向。
此外，Evans Blue 染料的注射会增加间质流体压力，从而可能干扰后续的示踪剂或抗原注射。埃文斯蓝染料的自荧光可能会干扰其他荧光示踪剂或其他用于免疫荧光染色的荧光。为了避免埃文斯蓝染料和潜在的抗原，其他示踪剂，或淋巴功能调节的潜在分子机制之间的任何相互作用，有可能识别收集淋巴血管没有埃文斯蓝染料与肉眼。这可以通过广泛的培训来识别船只。其他染料，如硫丹蓝色染料也可以用来取代埃文斯蓝染料。
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Disclosures
作者没有利益冲突要披露。
Acknowledgments
作者感谢艾娃·扎迪内扎德对手稿进行校对。这项工作得到了加拿大健康研究所（CIHR，PJT-156035）和加拿大SL创新基金会（32930）以及中国国家自然科学基金会（81901576）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
References
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