Summary
Un protocole pour bloquer le flux lymphatique par suturing chirurgical des vaisseaux lymphatiques afferents est présenté.
Abstract
Les vaisseaux lymphatiques sont essentiels au maintien de l’équilibre des fluides tissulaires et à l’optimisation de la protection immunitaire en transportant des antigènes, des cytokines et des cellules vers les ganglions lymphatiques drainants (LN). L’interruption du flux lymphatique est une méthode importante lors de l’étude de la fonction des vaisseaux lymphatiques. Les vaisseaux lymphatiques afferents du pied murin aux ganglions lymphatiques popliteal (pLNs) sont bien définis comme les seules voies pour le drainage lymphatique dans les pLN. Le suturing ces vaisseaux lymphatiques afferents peut sélectivement empêcher le flux lymphatique aux pLNs. Cette méthode permet d’interférer dans le flux lymphatique avec des dommages minimes aux cellules endothéliales lymphatiques dans le pLN drainant, les vaisseaux lymphatiques afferents, ainsi que d’autres vaisseaux lymphatiques autour de la région. Cette méthode a été utilisée pour étudier comment la lymphe affecte les venules endothéliales élevées (HEV) et l’expression de chimiokine dans le LN, et comment la lymphe coule par le tissu adipeux entourant le LN en l’absence des vaisseaux lymphatiques fonctionnels. Avec la reconnaissance croissante de l’importance de la fonction lymphatique, cette méthode aura des applications plus larges pour démêler davantage la fonction des vaisseaux lymphatiques dans la régulation du microenvironnement LN et des réponses immunitaires.
Introduction
L’organisation spatiale du système lymphatique fournit un soutien structurel et fonctionnel pour éliminer efficacement le liquide extracellulaire et transporter les antigènes et les cellules présentant des antigènes (APC) vers les LN drainants. Les vaisseaux lymphatiques initiaux (également appelés capillaires lymphatiques) sont hautement perméables en raison de leurs jonctions intercellulaires discontinues, qui facilitent la collecte efficace des fluides, des cellules et d’autres matériaux des espaces extracellulairesenvironnants 1. Les vaisseaux lymphatiques initiaux fusionnent dans la collecte des vaisseaux lymphatiques, qui ont des jonctions intercellulaires serrées, une membrane continue de sous-sol, et la couverture lymphatique de muscle. La collecte des vaisseaux lymphatiques sont responsables du transport de la lymphe recueillie vers les LN drainants et, éventuellement, le retour de la lymphe à la circulation2,3. Les vaisseaux lymphatiques de collecte qui propulsent la lymphe dans le LN drainant sont les vaisseaux lymphatiques afferents4,5,6,7. L’obstruction des vaisseaux lymphatiques afferents peut bloquer le flux lymphatique dans les LNs, qui est une technique utile lors de l’étude de la fonction du flux lymphatique.
Des études antérieures ont montré que le flux lymphatique joue un rôle important dans le transport des antigènes et des APC, ainsi que dans le maintien de l’homéostasie du LN. Il est bien entendu que les APC dérivés des tissus, généralement activés cellules dendritiques migration (CD), voyagent à travers les vaisseaux lymphatiques afferents vers le LN pour activer les lymphocytes T8. L’idée que les antigènes de forme libre, tels que les microbes ou les antigènes solubles, s’écoulent passivement avec la lymphe vers le LN pour activer les APC résidents de LN a gagné l’acceptation au cours dela dernière décennie 9,10,11,12. Les antigènes de forme libre voyageant avec la lymphe prennent quelques minutes après l’infection pour se rendre au LN, et l’activation cellulaire ln-résidente peut se produire dans les 20 minutes après la stimulation. C’est beaucoup plus rapide que l’activation des CD migrateurs, qui prend plus de 8 h pour entrer dans le LN9 drainant. En plus de transporter des antigènes pour initier la protection immunitaire, la lymphe transporte également des cytokines et des DCs au LN pour maintenir son microenvironnement, et pour soutenir l’homéostasie de cellulesimmunitaires 13,14. Auparavant, le blocage du flux lymphatique en suturant les vaisseaux lymphatiques afferents a démontré que la lymphe est nécessaire pour maintenir le phénotype HEV nécessaire pour soutenir la cellule T homéostatique et la cellule B homing à la LN15,16,17. CCL21 est une chimiokine critique qui dirige le positionnement des cellules DC et T dans le LN8,18. Le blocage du flux lymphatique interrompt l’expression du CCL21 dans le LN et interrompt potentiellement le positionnement et/ou l’interaction des cellules DC et T dans le LN19. Ainsi, le blocage du flux lymphatique peut abroger directement ou indirectement l’accès à l’antigène/DC au LN drainant en perturbant le microenvironnement LN qui régule les réponses immunitaires dans le LN. Pour mieux étudier la fonction du flux lymphatique, un protocole expérimental est présenté (figure 1) pour bloquer le flux lymphatique chez la souris en suturant les vaisseaux lymphatiques afferents du pied au pLN. Cette méthode peut être une technique importante pour de futures études sur la fonction lymphatique dans des conditions saines et maladies.
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Protocol
Tous les travaux sur les animaux doivent être approuvés par le comité institutionnel et gouvernemental d’éthique et de manipulation des animaux. C’est une opéra tion de non-survie.
1. Préparation des matériaux
- Préparer 100 mL d’éthanol à 70 % en mélangeant 70 mL d’éthanol à 100 % avec 30 mL d’eau stérile. Autoclave tous les outils chirurgicaux avant la chirurgie et garder les outils dans 70% d’éthanol avant et pendant la chirurgie pour maintenir la stérilisation.
- Préparer un appareil d’injection.
- Coupez ~30 cm de tube en polyéthylène (0,28 mm de diamètre). Connectez la pointe d’une aiguille de 30 G x 1/2 (aiguille A) à une extrémité du tube de polyéthylène. Déloger soigneusement une autre aiguille de 30 G x 1/2 (aiguille B) et relier le côté cassé à l’autre extrémité du tube de polyéthylène.
- Fixez l’aiguille A à une seringue tuberculine de 1 mL.
REMARQUE : Pour ce tube en polyéthylène, 1,6 cm de liquide dans le tube correspond à 1 μL20.
- Préparer un mélange kétamine/xylazine 10:1 (10 mg/mL de kétamine et 1 mg/mL de xylazine) dans le chlorure de sodium salin (bactériostatique 0,9 % [w/v]. Préparez la solution fraîchement avant utilisation.
2. Préparation de l’animal pour la chirurgie
REMARQUE : Utilisez des souris âgées de 6 à 10 semaines. Les souris femelles et mâles peuvent être utilisées. Dans cette étude, des souris femelles C57BL/6 âgées de 6 à 10 semaines ont été utilisées. Cette méthode peut être adaptée à d’autres souches de souris.
- Anesthésier la souris en injectant 250 μL du mélange kétamine/xylazine intraperitoneally. Attendez que la souris soit complètement endormie. Assurez-vous que la souris ne réagit pas à une pincement d’un outeil pour détecter l’anesthésie complète.
- Raser la fourrure autour des jambes avec des tondeuses à cheveux.
- Appliquer la crème depilatory autour de la jambe et attendre 5 min. Essuyez la fourrure résiduelle et la crème depilatory à l’aide d’un tissu humide et nettoyez la jambe avec de l’eau stérile. Vaporiser 70% d’éthanol autour de la jambe pour stériliser la zone d’opération. L’éthanol est limité au site d’incision.
3. Suturing chirurgical des vaisseaux lymphatiques afferents
REMARQUE: La jambe droite est sutured, et la jambe gauche est utilisée comme le contrôle factice. Le protocole de suture lymphatique (étapes 3.1−3.8) prend 20−30 min.
- Gardez la souris à une position couchée et fixez-la avec du ruban chirurgical pour exposer la zone d’opération sur la jambe droite.
- Injecter intradermally 5 μL de 1% Evans colorant bleu ou 9 cm du fluide de l’appareil d’injection tube dans le footpad. Masser doucement le pavé pour aider Evans blue à pénétrer dans les vaisseaux lymphatiques.
REMARQUE : La seringue à insuline n’est pas facile à contrôler pour l’injection en petit volume. Le volume peut être contrôlé avec plus de précision à l’aide de l’appareil d’injection. Les vaisseaux lymphatiques sont visualisés par colorant bleu sous la peau. Avec une formation approfondie, les deux vaisseaux lymphatiques afferents peuvent être vus à l’œil nu comme des vaisseaux transparents dans le tissu adipeux, parallèlement à l’artère saphenous. Avec une formation approfondie, il est possible de suturer les vaisseaux sans injecter evans colorant bleu dans les cas où il ya des préoccupations de perturbations potentielles de la teinture. - Sous un microscope disséquant, choisissez un emplacement d’incision de 5 mm à partir du bord inférieur de la fossa popliteal. Faire une petite incision (~5 mm) dans la peau avec des ciseaux. À l’aide de forceps d’opération fine, étirer l’incision, et exposer les vaisseaux lymphatiques de collecte (Figure 1A).
REMARQUE : Si nécessaire, un petit fragment de peau peut être enlevé pour exposer les vaisseaux lymphatiques. - Identifier les deux vaisseaux lymphatiques afferents menant aux PLN sous le microscope disséquant (Figure 1B).
REMARQUE : Il y a deux vaisseaux lymphatiques afferents du footpad au pLN. Les deux doivent être sutured pour bloquer le flux lymphatique complètement. - À l’aide d’un porte-aiguille, insérez prudemment l’aiguille de suture (0,7 métrique ou plus petite) entre le vaisseau lymphatique afferent et l’artère saphénienne et tirez l’aiguille doucement autour du vaisseau lymphatique afferent. Tirez doucement la corde de suture et laissez environ 2 cm de la corde de suture derrière. Utilisez le porte-aiguille pour aider à attacher la corde étroitement pour suturer un vaisseau lymphatique avec le nœud d’un chirurgien (figure 1C).
REMARQUE : Le tissu sous l’incision peut se dessécher avec une exposition prolongée à l’air. Faire l’incision aussi petite que possible et effectuer la suture rapidement (c.-à-d., dans les 5 minutes) empêchera le tissu de sécher. Maintenir l’humidité des tissus en appliquant un petit volume de solution saline à l’moyen d’un coton-tige. - Masser doucement le pavé pour s’assurer qu’aucun colorant Evans Blue ne passe devant le site de suture, puis coupez l’excédent de ficelle avec des ciseaux.
- Effectuez les mêmes étapes de suture (c.-à-d. les étapes 3.5 et 3.6) sur l’autre vaisseau lymphatique afferent(figure 1D). Fermez l’incision cutanée avec la même suture qui a été utilisée pour suturer les vaisseaux à l’étape 3.5 (Figure 1E).
- Pour le contrôle factice, injecter intradermally 5 μL de 1% Evans colorant bleu au pied gauche et masser le footpad pour visualiser les vaisseaux lymphatiques. Ouvrez la peau avec une excision, puis fermez la plaie sans suturer le navire (Figure 1F).
- En option, surveillez les souris opérées pendant 2−4 h. Le côté suture de la jambe devrait montrer l’oedème avec Evans Blue écarté à la cuisse, tandis que la jambe de commande montrera le colorant bleu d’Evans limité dans le footpad. Si les souris se réveillent, un mélange supplémentaire de kétamine/xylazine sera injecté pour rester anesthésié jusqu’à l’euthanasie.
4. Suivi du flux lymphatique
- Immédiatement après la chirurgie, injectez intradermally 10 μL de 2% d’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) dans le pied du contrôle et de la jambe sutured lymphatique.
- Euthanasier les souris avec 400 μL de mélange kétamine/xylazine et effectuer la dislocation cervicale lorsque les souris sont entièrement anesthésiés.
- Recueillir les pLN de la fossa popliteal et retirer soigneusement le tissu adipeux périodal autour des pLN sous le microscope de dissection à 2, 6 et 12 h après l’injection de FITC.
- Intégrer les pLN avec la zone des sinus médullaires face au côté du cryomold dans le composé de température de coupe optimale (OCT) composé (Figure 1G,H).
- Préparer 20 sections congelées de μm à l’aide d’un cryotome.
- Imagez les cryosections sous un microscope confocal pour déterminer la distribution du FITC.
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Representative Results
Suture des vaisseaux lymphatiques a été utilisé dans les étudesprécédentes 15,16,17,19, où il a servi d’outil important pour étudier la fonction du flux lymphatique avant la biologie moléculaire des vaisseaux lymphatiques a été mieux compris. Le blocage du flux lymphatique interrompt l’homéostasie LN, ce qui conduit à hevs perdre l’expression génétique critique nécessaire pour homing lymphocyte optimal à la LN15,16,17. Depuis lors, il a fallu encore deux décennies pour démontrer que les CD voyageant avec la lymphe sont essentiels pour maintenir le profil d’expression du gène HEV et les lymphocytes homing à la LN13. Le stress de cisaillement fourni par le flux lymphatique est essentiel pour stimuler l’expression de chimiokine dans le LN. Le blocage du flux lymphatique interrompt l’expression de la chimiokine CCL21 dans le LN19, ce qui est essentiel pour diriger le positionnement des cellules DC et T dans le LN. Par conséquent, le flux interrompu peut compromettre le positionnement des CD et des cellules T dans le LN8,18.
Immédiatement après la chirurgie, un petit traceur fluorescent de poids moléculaire, FITC, a été employé pour suivre le flux lymphatique. Fitc (10 μL de 2% FITC) a été injecté intradermally dans le pied du contrôle factice et de la jambe surture lymphatique. Les pLN drainants ont été rassemblés 2, 6, et 12 h plus tard. Les pLN drainants ont été incorporés dans oct, et 20 sections congelées de μm ont été préparées. Les images confoccales ont montré l’accumulation sensiblement réduite de FITC dans les pLNs après suture. Le FITC résiduel dans les PLN a été préférentiellement accumulé dans les sinus LN (Figure 2).
Comment la lymphe coule à travers le tissu adipeux entourant le LN a été étudié à l’aide de suture lymphatique. Les vaisseaux lymphatiques afferents menant aux pLN ont été sutured pour bloquer le flux lymphatique, et il a été déterminé que le tissu adipeux perinodal pourrait soutenir une petite quantité de flux lymphatique quand les vaisseaux lymphatiques ont étébloqués 21. Le flux lymphatique à travers le tissu adipeux à la capsule du LN a été cartographié; il semblait se nourrir dans les sinus LN. De petites quantités de lymphe peuvent avoir coulé dans les sinus LN au fil du temps (Figure 3).
Figure 1 : Étapes de la suture des vaisseaux lymphatiques afferents popliteal LN (pLN). Brièvement, après que les souris aient été anesthésiées avec un mélange de kétamine et de xylazine, leurs jambes ont été rasées, et la fourrure résiduelle a été enlevée par une crème depilatory. La jambe droite a été utilisée pour la suture et la jambe gauche était le contrôle factice. Le côté droit du footpad a été injecté de façon intradermally avec 5 μL de 1% Evans Blue colorant préparé dans PBS. (A) En massant doucement le footpad, Evans Blue colorant rempli les vaisseaux lymphatiques afferents. (B) Une petite coupe de peau a été effectuée à 5 mm du pLN pour exposer les vaisseaux lymphatiques, qui sont indiqués par les deux flèches blanches. (C,D) Les deux vaisseaux lymphatiques afferents ont été sutured. (E) L’excision de la peau a été fermée par des sutures. (F) La jambe de contrôle a reçu l’injection bleue d’Evans, l’excision de peau, et la fermeture de suture sans suturing les vaisseaux lymphatiques. (G) Le succès du blocage du flux lymphatique a été indiqué par evans colorant bleu, qui est entré dans le pLN de la jambe de contrôle, mais pas la jambe sutured. (H,I) Les pLNs recueillis ont été incorporés dans le composé OCT avec sinus subcapsulaire (SCS) et sinus médullaire (MS) face au côté de la cryomold avant de casser la congélation dans l’azote liquide. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Distribution fitc dans les pLNs drainants de la jambe simulée ou sutured. Les images confoccales des pLN recueillies 2, 6, et 12 h après injection de FITC ont montré l’accumulation sensiblement réduite de FITC dans les pLN après suture. Le FITC résiduel dans les pLN a été préférentiellement trouvé dans les sinus de LN. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Distribution du FITC dans le tissu adipeux périodal (PAT), autour des pLN drainants de la jambe simulée ou suture. Des images confoccales du PAT et du LN ont montré que le FITC entre dans les sinus pat et LN, mais n’a pas été efficacement distribué dans tout le LN lorsque les vaisseaux lymphatiques ont été bloqués. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le blocage du flux lymphatique aura de larges applications dans la manipulation de l’administration d’antigènes au LN dans des conditions saines et maladies. Il est possible d’utiliser cette méthode pour contrôler le moment de l’administration d’antigènes afin d’étudier comment le flux lymphatique continu régule la réponse immunitaire dans l’évacuation des LN. Cette méthode d’interruption du flux lymphatique peut également être utilisée pour étudier comment la lymphe influe sur la compartimentation cellulaire, l’activation cellulaire, la migration cellulaire et les interactions cellule-cellule dans le LN.
Des souris exprimant spécifiquement le récepteur humain de toxine de diphtérie (DTR) dans leurs cellules endothéliales lymphatiques (Flt4-cre-dtr) ont été développées ; ceux-ci peuvent être utilisés pour épuiser spécifiquement les vaisseaux lymphatiques pour étudier la fonction lymphatique22. L’administration de DT tue les cellules endothéliales lymphatiques le long des vaisseaux lymphatiques et dans le LN. L’épuisement des cellules endothéliales lymphatiques peut abroger complètement le flux lymphatique à l’échelle régionale ou systémique pour étudier la fonction lymphatique. Cette méthode provoque une accumulation importante de liquide dans les tissus et sert de modèle idéal pour étudier le lymphœdème et la fonction lymphatique.
Comparé au modèle lymphatique d’expression de DTR cellule-spécifique, l’avantage de la méthode lymphatique de suture est qu’elle interrompt le flux lymphatique avec des dommages minimaux aux cellules endothéliales lymphatiques ou à n’importe quel autre vaisseau lymphatique autour de la région. L’intervention n’a pas d’impact direct sur les cellules dans le LN drainant, de sorte que l’impact qui en résulte sur le microenvironnement LN ou la communication des cellules immunitaires est une conséquence du blocus du flux lymphatique plutôt que de la mort cellulaire potentielle induite par le DT. Un autre avantage de cette méthode est que le flux lymphatique est instantanément bloqué après la chirurgie, de sorte que le moment du blocus du flux lymphatique peut être mieux contrôlé.
La limitation de cette méthode est qu’elle ne peut être utilisée que pour étudier l’intervention régionale du flux lymphatique dans les vaisseaux lymphatiques afferents du pied au pLN. Cette méthode nécessite l’identification de l’emplacement exact des vaisseaux lymphatiques de collecte. La collecte des vaisseaux lymphatiques est difficile à identifier dans certains endroits anatomiques, et donc cette technique nécessite une formation anatomique et chirurgicale étendue avant l’identification réussie des vaisseaux lymphatiques afferents pour bloquer le flux lymphatique. Une autre limitation est que cette méthode ne peut pas bloquer directement la lymphe entrant dans les vaisseaux lymphatiques initiaux. Après la suture, le flux lymphatique bloqué peut augmenter la pression du liquide interstitiel et changer la direction du flux lymphatique dans les vaisseaux lymphatiques initiaux. Ainsi, les vaisseaux lymphatiques intacts autour de la zone peuvent compenser la fonction des vaisseaux lymphatiques interrompus et changer la direction du flux lymphatique.
De plus, l’injection de colorant Evans Blue augmente la pression du liquide interstitiel, ce qui peut interférer avec le traceur ou l’injection subséquente d’antigènes. L’autofluorescence du colorant Evans Blue peut interférer avec d’autres traceurs fluorescents ou d’autres fluorophores utilisés pour la coloration immunofluorescente. Pour éviter toute interaction entre evans colorant bleu et antigènes potentiels, d’autres traceurs, ou des mécanismes moléculaires potentiels de la régulation de la fonction lymphatique, il est possible d’identifier les vaisseaux lymphatiques de collecte sans Evans Blue colorant à l’œil nu. Cela peut être réalisé avec une formation approfondie pour identifier les navires. D’autres colorants, comme le colorant bleu isosulfan, peuvent également être utilisés pour remplacer le colorant Evans Blue.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Ava Zardynezhad pour la relecture du manuscrit. Ces travaux sont appuyés par l’Institut canadien de recherche en santé (IRSC, PJT-156035), la Fondation canadienne pour l’innovation pour la SL (32930) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine pour Yujia Lin (81901576).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
References
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