Summary
흡혈류 혈관의 외과 봉합에 의한 림프 흐름을 차단하는 프로토콜이 제시된다.
Abstract
림프관은 항원, 사이토카인 및 세포를 림프절(LN)을 배출하도록 이송하여 조직 유체 균형을 유지하고 면역 보호를 최적화하는 데 중요합니다. 림프류의 작동을 연구할 때 림프 흐름의 중단은 중요한 방법입니다. 뮤린 풋패드에서 포플라이트 림프절(pLN)까지의 퍼포성 림프관은 pLN으로 림프 배수를 위한 유일한 경로로 잘 정의됩니다. 이러한 흡혈류 혈관을 봉합하면 pLN으로의 림프 흐름을 선택적으로 방지할 수 있습니다. 이 방법은 배수 pLN, 흡신성 림프관뿐만 아니라 주변의 다른 림프관에서 림프 내피 세포에 최소한의 손상과 림프 흐름의 간섭을 허용합니다. 이 방법은 림프가 LN에서 높은 내피 정맥 (HEV) 및 chemokine 발현에 미치는 영향과 기능성 림프혈관이 없는 경우 LN을 둘러싼 지방 조직을 통해 림프가 어떻게 흐르는지 연구하는 데 사용되었습니다. 림프 기능의 중요성에 대한 인식이 증가함에 따라이 방법은 LN 미세 환경 및 면역 반응을 조절하는 림프관의 기능을 더욱 해명하기 위한 광범위한 응용 프로그램을 갖게 될 것입니다.
Introduction
림프계의 공간 조직은 세포외 유체를 효율적으로 제거하고 항원 제시 세포(AC)를 배수 LN으로 수송하는 구조적 및 기능적 지원을 제공한다. 초기 림프혈관(림프모세혈관이라고도 함)은 주변 세포외 공간에서 유체, 세포 및 기타 물질의 효과적인 수집을 용이하게 하는 불연속 세포 간 접합으로 인해 매우 투과성이 있다1. 초기 림프관은 세포간 접합, 연속 지하 막 및 림프 근육 커버리지가 있는 림프혈관을 수집하는 것으로 병합됩니다. 림프혈관을 채취하면 수거된 림프를 배수 LN으로 운반하고 결국 림프를 순환2,3로되돌려야 합니다. 림프를 배수 LN으로 추진하는 림프류를 수집하는 것은 포근림프용기4,5,6,7이다. 흡수성 림프관의 방해는 림프흐름의 기능을 연구할 때 유용한 기술인 LN으로 림프흐름을 차단할 수 있다.
이전 연구는 림프 흐름항원 및 APC를 수송에 중요 한 역할을 하는 것으로 나타났습니다., LN 항상성을 유지 뿐만 아니라. 조직 유래 APC, 전형적으로 활성화된 수지상 세포(DC)가 T세포(8)를활성화하기 위해 포구성 림프혈관을 통해 LN으로 이동하는 것으로 잘 이해된다. 미생물이나 수용성 항원과 같은 자유형 항원들이 LN 거주자 APC를 활성화하기 위해 LN으로 림프로 수동적으로 흐르고 있다는 생각은 지난 10년동안 9,10,11,12에서수용을 얻고 있다. 림프로 여행하는 자유 형태 항원은 감염 후 몇 분 정도 걸리며, LN 거주자 세포 활성화는 자극 후 20 분 이내에 발생할 수 있습니다. 이는 배수 LN9에들어가는 데 8시간 이상이 걸리는 마이그레이션 DC의 활성화보다 훨씬 빠릅니다. 림프는 면역 보호를 시작하기 위해 항원을 운반하는 것 외에도 세포카인과 DC를 LN으로 운반하여 미세 환경을 유지하고 면역 세포항상성(13,14)을지원합니다. 이전에는 포근성 림프혈관을 봉합하여 림프흐름을 차단함으로써 LN15,16, 17에동종성 T 세포 및 B 세포 호밍을 지원하는 데 필요한 HEV 표현형을 유지하는 데 림프가 필요하다는 것을입증했다. CCL21은 LN8,18에서DC 및 T 셀 포지셔닝을 지시하는 중요한 케모키네이다. 차단 림프 흐름은 LN에서 CCL21 발현을 방해하고 잠재적으로 LN19에서DC 및 T 셀 위치 및/또는 상호 작용을 방해한다. 따라서, 림프 흐름을 차단하는 것은 LN에서 면역 반응을 조절하는 LN 미세 환경을 방해함으로써 배수 LN에 항원/DC 접근을 직간접적으로 물들수 있다. 림프 흐름의 기능을 더 잘 조사하기 위해, 발패드에서 pLN까지 흡혈류 혈관을 봉합하여 마우스의 림프 흐름을 차단하는 실험프로토콜(도 1)이제시된다. 이 방법은 건강하고 병들게 하는 조건에서 림프 기능에 대한 향후 연구를위한 중요한 기술이 될 수 있습니다.
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Protocol
모든 동물 작업은 기관 및 정부 윤리 및 동물 처리 위원회의 승인을 받아야 합니다. 이것은 비 생존 수술입니다.
1. 재료 의 준비
- 멸균수 30mL와 100% 에탄올 70mL를 혼합하여 70% 에탄올100mL를 준비한다. 자동 클라브 수술 전에 모든 수술 도구를 유지하고 살균을 유지하기 위해 수술 전과 수술 중에 70 % 에탄올에 도구를 유지합니다.
- 사출 장치를 준비합니다.
- 폴리에틸렌 튜브의 ~30cm 를 잘라 (직경 0.28 mm). 30 G x 1/2 바늘(바늘 A)의 끝을 폴리에틸렌 튜브의 한쪽 끝에 연결합니다. 다른 30 G x 1/2 바늘(바늘 B)을 조심스럽게 빼내고 깨진 면을 폴리에틸렌 튜빙의 다른 쪽 끝에 연결합니다.
- 바늘 A를 1 mL 결핵 주사기에 부착합니다.
참고:이 폴리에틸렌 튜브의 경우 튜브내의 1.6cm의 유체는 1 μL20에해당합니다.
- 식염수 (세균성 0.9 % [w /v] 염화 나트륨)에서 10:1 케타민 / 자일라진 혼합물 (10 mg / mL 케타민 및 1 mg / mL 자일라진)을 준비하십시오. 사용하기 전에 솔루션을 신선하게 준비하십시오.
2. 수술을 위한 동물의 준비
참고: 6-10주 된 생쥐를 사용하십시오. 암컷마우스와 수컷 마우스를 모두 사용할 수 있다. 이 연구에서는 6-10주 된 C57BL/6 암컷 마우스가 사용되었습니다. 이 방법은 마우스의 그밖 긴장에 적응될 수 있습니다.
- 케타민/자일라진 혼합물의 250 μL을 관전적으로 주입하여 마우스를 마취한다. 마우스가 완전히 잠들어 때까지 기다립니다. 마우스가 발가락 핀치에 반응하지 않도록 전체 마취를 감지하십시오.
- 머리 깎기와 다리 주위에 모피를 면도.
- 레그 주위에 디필 크림을 바르고 5분 정도 기다립니다. 촉촉한 티슈를 사용하여 잔류 모피와 탈모 크림을 닦고 멸균물로 다리를 청소하십시오. 수술 부위를 살균하기 위해 다리 주위에 70 % 에탄올을 스프레이하십시오. 에탄올은 절개 부위로 제한됩니다.
3. 흡신 림프관의 외과 봉합
참고: 오른쪽 다리가 봉합되고 왼쪽 다리가 가짜 컨트롤로 사용됩니다. 림프 봉합사 프로토콜 (단계 3.1-3.8)은 20-30 분 걸립니다.
- 마우스를 경향이 있는 위치에 두고 수술 용 테이프로 고정하여 오른쪽 다리의 수술 영역을 노출시십시오.
- 1%의 에반스 블루 염료 또는 풋패드에 튜브를 넣는 주입 장치의 유체의 9cm의 5 μL을 부동킵니다. 에반스 블루림프용기에 들어갈 수 있도록 풋패드를 부드럽게 마사지합니다.
참고: 인슐린 주사기는 소량 주사를 제어하기 쉽지 않습니다. 부피는 사출 장치를 사용하여 보다 정확하게 제어할 수 있다. 림프관은 피부 아래의 푸른 염료로 시각화됩니다. 광범위한 훈련을 통해 두 분포성 림프관은 사페누동맥과 평행한 지방 조직의 투명한 혈관으로 육안으로 볼 수 있습니다. 광범위한 훈련을 통해 염료로 인한 잠재적 장애에 대한 우려가 있는 경우 에반스 블루 염료를 주입하지 않고 선박을 봉합할 수 있습니다. - 해부 현미경에서, 포라이트 포사의 하단 가장자리에서 5mm 절개 부위를 선택합니다. 가위로 피부에 작은 절개(~5mm)를 만듭니다. 미세 조작 포셉을 사용하여 절개를 스트레칭하고 수집 림프용기(도1A)를노출한다.
참고: 필요한 경우 작은 피부 조각을 제거하여 림프혈관을 노출시킬 수 있습니다. - 해부현미경(도 1B)하에서pLN으로 이어지는 두 분포성 림프혈관을 식별한다.
참고 : pLN에 풋 패드에서 두 개의 포이포성 림프용기가 있습니다. 둘 다 림프 흐름을 완전히 차단하기 위해 봉합되어야합니다. - 바늘 홀더를 사용하여, 조심스럽게 봉합체 바늘 (0.7 미터 또는 작은) 흡개 림프 용기와 사페누스 동맥 사이에 삽입하고 포근 림프 용기 주위에 부드럽게 바늘을 당겨. 봉합사 끈을 부드럽게 당기고 봉합사 끈의 약 2cm를 남겨 둡니다. 바늘 홀더를 사용하여 외과 의사의 매듭(그림 1C)으로한 림프 용기에 단단히 끈을 묶습니다.
참고: 절개 아래 의 조직은 공기에 장기간 노출되어 건조할 수 있습니다. 절개를 가능한 한 작게 만들고 봉합사를 신속하게 수행 (즉, 5 분 이내에) 조직이 건조에서 방지 할 수 있습니다. 소량의 식염수를 면봉으로 적용하여 조직 수분을 유지합니다. - 발패드를 부드럽게 마사지하여 에반스 블루 염료가 봉합사 부위를 통과하지 못하도록 한 다음 가위로 여분의 끈을 자릅니다.
- 다른 흡혈구용기(그림 1D)에서동일한 봉합단계(즉, 3.5 및 3.6단계)를 수행한다. 3.5 단계(도 1E)에서혈관을 봉합하는 데 사용 된 동일한 봉합사로 피부 절개를 닫습니다.
- 가짜 컨트롤의 경우, 왼쪽 풋패드에 에반스 블루 염료 1%의 5μL을 주입하고 풋패드를 마사지하여 림프혈관을 시각화합니다. 절제로 피부를 열고 혈관을 봉합하지 않고 상처를 닫습니다(도 1F).
- 선택적으로, 2-4 h에 대한 작동 마우스를 모니터링합니다. 다리의 봉합사 측은 에반스 블루가 허벅지로 퍼지는 부종을 보여주어야 하며, 컨트롤 레그는 풋패드에 제한된 에반스 블루 염료를 표시합니다. 쥐가 깨어나면, 안락사 때까지 마취를 유지하기 위해 추가 케타민 /자일라진 믹스를 주입합니다.
4. 림프 흐름 추적
- 수술 직후, 대조군과 림프봉 다리의 발판에 2%의 형광이소이소야네이트(FITC)의 10μL을 주입한다.
- 케타민/자일라진 혼합물의 400μL로 마우스를 안락사시키고 마우스가 완전히 마취될 때 자궁 경부 탈구를 수행합니다.
- 포클레타 포사로부터 pLN을 수집하고 FITC 주입 후 2, 6, 12h에서 해부 현미경하에서 pLNs 주위의 천자 다지방 조직을 조심스럽게 제거한다.
- 최적의 절삭 온도(10월)화합물(도 1G, H)에서극저온의 측면을 향한 수질 부비동 부위를 포함시켰습니다.
- 저온을 사용하여 20 μm 냉동 섹션을 준비합니다.
- FITC 분포를 결정하기 위해 공초점 현미경의 밑에 극저온부분을 이미지합니다.
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Representative Results
림프혈관 봉합사는15,16,17,19에서사용되어 림프관의 분자 생물학이 더 잘 이해되기 전에 림프류의 기능을 연구하는 중요한 도구로 사용되었다. 차단 림프 흐름은 LN 항상성을 방해하며,이는 LN15,16,17에최적의 림프구 호밍에 필요한 중요한 유전자 발현을 잃고 있는 HEV로 이어집니다. 그 이후로 림프를 주행하는 DC가 HN13에대한 HEV 유전자 발현 프로파일 및 림프구를 유지하는 데 중요하다는 것을 입증하는 데 2 년이 더 걸렸습니다. 림프 흐름에 의해 제공되는 전단 응력은 LN에서 케모키네 발현을 자극하는 데 중요합니다. 차단 림프 흐름은 LN19에서chemokine CCL21 발현을 방해하며, 이는 LN에서 DC 및 T 셀 포지셔닝을 지시하는 데 중요합니다. 따라서, 중단된 흐름은 LN8,18에서DC 및 T 셀 위치를 손상시킬 수 있다.
수술 직후, 작은 분자량 형광 추적자 인 FITC는 림프 흐름을 추적하는 데 사용되었습니다. FITC(2% FITC의 10μL)는 샴 컨트롤과 림프봉 다리의 풋패드에 상인으로 주입하였다. 배수 pLN은 2, 6 및 12 시간 후에 수집되었다. 배수 pLN은 10월에 내장되었고, 20 μm의 냉동 섹션이 준비되었다. 공초점 이미지는 봉합사 후 pLN에서 FITC 축적이 크게 감소하는 것으로 나타났습니다. pLN의 잔류 FITC는 LN 부비동(도2)에서우선적으로 축적되었다.
림프가 LN을 둘러싼 지방 조직을 통해 흐르는 방법은 림프봉을 사용하여 조사되었다. pLN으로 이어지는 포퍼런트 림프관은 림프흐름을 차단하도록 봉합되었고, 림프관이막히면천자 지방 조직이 소량의 림프 류를 지원할 수 있다고 판단되었다. LN의 캡슐에 지방 조직을 통해 림프 흐름이 매핑되었다; 그것은 LN 부비동에 공급하는 것처럼 보였다. 소량의 림프가 시간이 지남에 따라 LN 부비동으로 유입되었을 수있습니다(도 3).
그림 1: 포라이트 LN(pLN) 흡혈류 혈관 봉합사의 단계. 간단히 말해서, 마우스가 케타민과 자일라진 혼합물로 마취된 후, 다리를 면도하고 잔류 모피는 탈모 크림에 의해 제거되었습니다. 오른쪽 다리는 봉합사에 사용되었고 왼쪽 다리는 가짜 컨트롤이었습니다. 풋패드의 오른쪽은 PBS에서 제조된 에반스 블루 염료 1%의 5μL을 들여 무급으로 주입되었습니다. (A)풋패드를 부드럽게 마사지함으로써 에반스 블루 염료가 흡수성 림프혈관을 채웠다. (B)작은 피부 절단은 두 개의 흰색 화살표로 표시된 림프혈관을 노출시키기 위해 pLN에서 5mm 떨어진 곳에서 수행되었다. (C,D) 두 흡혈구 혈관모두 봉합되었다. (E)피부 절제는 봉합사에 의해 폐쇄되었다. (F)제어 다리는 림프혈관을 봉합하지 않고 에반스 블루 사출, 피부 절제 및 봉합봉을 받았다. (G)림프 흐름 막힘의 성공은 에반스 블루 염료에 의해 표시되었다, 이는 제어 다리의 pLN을 입력하지만 봉제 다리하지.(H, I)수집 된 pLNs는 캡슐 부비동 (SCS) 및 수질 부비동 (MS)이 액체 질소동결 전에 울림의 측면을 직면 10 월 화합물에 포함되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 샴 또는 봉합 된 다리의 배수 pLN에서 FITC 분포. FITC 주입 후 2, 6 및 12h수집된 pLNs의 공초점 이미지는 봉합사 후 pLN에 FITC 축적이 크게 감소하는 것으로 나타났다. pLNs의 잔류 FITC는 LN 부비동에서 우선적으로 발견되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 부피 또는 봉제 다리의 배수 pLN 주위, 천리노달 지방 조직 (PAT)에서 FITC 분포. PAT와 LN의 공초점 이미지는 FITC가 PAT와 LN 부비동에 진입하지만 림프관이 차단되었을 때 LN 전체에 효과적으로 분포되지 않은 것으로 나타났습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
림프 흐름을 차단하는 것은 건강하고 병들게 하는 조건에서 LN에 항원 전달을 조작하는 광범위한 응용 을 가질 것이다. 이 방법을 사용하여 항원 전달의 타이밍을 조절하여 지속적인 림프 흐름이 LN 을 배수하는 데 면역 반응을 어떻게 조절하는지 연구할 수 있다. 림프 흐름 중단의 이 방법은 또한 림프가 세포 구획화, 세포 활성화, 세포 이동 및 LN에서 세포 세포 상호 작용에 미치는 영향을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다.
마우스는 특히 림프내피세포(Flt4-cre-dtr)에서인간 디프테리아 독소 수용체(DTR)를 발현하는 것으로 개발되었다. 이들은 림프 기능을 연구하기 위하여 림프관(22)를구체적으로 고갈시키기 위하여 이용될 수 있다. DT의 투여는 림프혈관과 LN에서 림프내피세포를 죽인다. 림프내막 세포의 고갈은 림프 기능을 연구하기 위해 지역적으로 또는 체계적으로 림프 흐름을 완전히 해브계 할 수 있습니다. 이 방법은 조직에 상당한 유체 축적을 일으키고 림프부종과 림프 기능을 연구하는 훌륭한 모델역할을합니다.
림프내막 세포 별 DTR 발현 모델과 비교하여 림프 봉합사의 장점은 림프 내피 세포 또는 주변의 다른 림프 용기에 최소한의 손상으로 림프 흐름을 방해한다는 것입니다. 개입은 배수 LN에서 세포에 직접 영향을 미치지 않으므로 LN 미세 환경 또는 면역 세포 통신에 미치는 영향은 DT에 의해 유도된 잠재적 세포 사멸보다는 림프 흐름 봉쇄의 결과입니다. 이 방법의 또 다른 장점은 림프 흐름이 수술 후 즉시 차단되어 림프 흐름 봉쇄의 타이밍을 더 잘 제어 할 수 있다는 것입니다.
이 방법의 한계는 풋패드에서 pLN까지 의 림프류의 지역적 개입을 연구하는 데만 사용될 수 있다는 것이다. 이 방법은 수집 림프관의 정확한 위치를 식별해야합니다. 림프관을 수집하는 것은 일부 해부학 적 위치에서 식별하기 어렵기 때문에이 기술은 림프 흐름을 차단하기 위해 포퍼런트 림프혈관을 성공적으로 식별하기 전에 광범위한 해부학 및 외과 훈련이 필요합니다. 또 다른 제한은이 방법은 직접 초기 림프관에 들어가는 림프를 차단 할 수 없다는 것입니다. 봉합사 후, 막힌 림프 흐름은 중간 유체 압력을 증가시키고 초기 림프용기의 림프 흐름 방향을 바꿀 수 있다. 따라서, 주변의 온전한 림프관은 중단된 림프관의 기능을 보상하고 림프 흐름의 방향을 바꿀 수 있다.
더욱이, 에반스 블루 염료의 주사는 간질 유체 압력을 증가, 이는 후속 추적자 또는 항원 주입을 방해 할 수 있습니다. 에반스 블루 염료의 자동 형광은 면역 형광 염색에 사용되는 다른 형광 추적자 또는 기타 형광을 방해 할 수 있습니다. 에반스 블루 염료와 잠재적인 항원, 다른 추적자, 또는 림프 기능 조절의 잠재적인 분자 메커니즘 사이의 상호 작용을 피하기 위해, 육안으로 에반스 블루 염료없이 수집 림프 혈관을 식별 할 수있다. 이는 선박을 식별하는 광범위한 교육을 통해 달성할 수 있습니다. 이소술판 블루 염료와 같은 다른 염료도 에반스 블루 염료를 대체하는 데 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 원고를 교정해 준 아바 자르디네하드에게 감사를 표한다. 이 작품은 캐나다 보건 연구소 (CIHR, PJT-156035)와 캐나다 SL 혁신 재단 (32930)과 Yujia Lin (81901576)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
References
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