Summary
שיטה זו מתארת פרוטוקול להכנת תמצית חלבון בתפוקה גבוהה מדגימות אלגנים של Caenorhabditis ו- co-immunoprecipitation לאחר מכן.
Abstract
שיטות חיסון משותף משמשות לעתים קרובות לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון. אישור של אינטראקציות חלבון חלבון המשוערות או זיהוי של חדשים יכול לספק מידע רב ערך על הפונקציה של חלבון של עניין. חלק מהשיטות המסורתיות להכנת תמצית דורשות לעתים קרובות טכניקות עתירות עבודה וגוזלות זמן. כאן, פרוטוקול הכנת תמצית שונה באמצעות homogenizer טחנת חרוזים חרוזי מתכת מתואר כחלופה מהירה לשיטות הכנת חלבון מסורתיות. שיטת הכנת תמצית זו תואמת למחקרי חיסון משותף במורד הזרם. כדוגמה, השיטה שימשה בהצלחה שיתוף immunoprecipitate C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 ושני אינטראקציות ידועות ALG-1: AIN-1, ו HRPK-1. פרוטוקול זה כולל תיאורים של איסוף דגימות בעלי חיים, הכנת תמצית, הבהרה תמצית, ו immunoprecipitation חלבון. הפרוטוקול המתואר יכול להיות מותאם לבדיקת אינטראקציות בין כל שני או יותר אנדוגני, מתויג אנדוגני, או overexpressed C. elegans חלבונים במגוון של רקעים גנטיים.
Introduction
זיהוי האינטראקציות המקרומולקולריות של חלבון בעל עניין יכול להיות המפתח ללמוד עוד על תפקודו. ניסויים אימונו-חיסוניים וניסויי חיסון משותף יכולים לשמש לזיהוי כל האינטראקציה של חלבון באמצעות גישות פרוטאומיות בקנה מידה גדול1 או כדי לבדוק באופן ספציפי את יכולתו של חלבון להתמודד עם אינטראקציה המשוערת. ב C. elegans, שתי השיטות שימשו בהצלחה כדי ללמוד יותר על הפעילות של מגוון רחב של חלבונים, כולל אלה הפועלים באופן הדוק עם microRNAs לווסת ביטויגנים 2,3,4. ניסויי חיסון משותף יש את היתרון של בדיקת אינטראקציות חלבון חלבון בסביבה התאית המקורית שלהם, אבל הכנת תמצית יכול להיות מאתגר זמן רב. תמוגה יעילה של המדגם היא הכרחית, אבל יש להקפיד כדי למזער את ההפרעה של אינטראקציות חלבון חלבון. שיטות כגון douncing5, sonication6, הומוגניזציה בלך7, ו זירקוניה חרוזים הומוגניזציה8,9 שימשו בהצלחה להכין C. elegans תמציות חלבון הכולל. לשיטות אלה, למעט הומוגניזציה של חרוזי זירקוניה, יש מגבלות מבחינת מספר הדגימות שניתן לעבד בו זמנית. מוצגת היא שיטה חלופית שניתן לשנות בקלות כדי לאפשר תפוקה גבוהה, הכנת תמצית חלבון מהירה מדגימות C. elegans ואחריו שיתוף immunoprecipitation. באופן ספציפי, השיטה יכולה להכין עד 24 דגימות בכל פעם, מאוד להפחית את הזמן הנדרש להכנת תמצית. לעומת זאת, לדוגמה, douncing בדרך כלל מאפשר הכנה מדגם אחד בלבד בכל פעם. שיטת תמצית זו יכולה לשמש להכנת תמציות מכל שלב התפתחותי של C. elegans.
המתואר הוא הליך צעד אחר צעד לאיסוף דגימות בעלי חיים, הכנת תמצית, immunoprecipitation, והצגת נתוני נפיחות מערביים כדי לאשר נסיגה מוצלחת של חלבון וזיהוי של חלבון שיתוף immunoprecipitating של עניין. כדי להדגים את האפקטיביות של הפרוטוקול, שני ניסויים שיתוף אימונו-חיסוני בוצעו בין 1) microRNA Argonaute ALG-1 ו- AIN-1, הומולוגי GW182; ו-2) ALG-1 ו- HRPK-1, אינטראקציה ALG-1 שזוהתה לאחרונה2. ALG-1 ו- AIN-1 הם חלבוני ליבה המרכיבים את קומפלקס ההשתקה הנגרמת על ידי microRNA (miRISC) והאינטראקציה בין שני חלבונים אלה מבוססת היטב10,11. פרוטוקול הכנת התמצית היה יעיל בניסוי החיסון המשותף ALG-1-AIN-1. פרוטוקול זה גם אישר בהצלחה את האינטראקציה בין ALG-1 לבין האינטראקציה החדשה שזוהתה,HRPK-12.
לסיכום, כתב היד מתאר פרוטוקול הכנה תמצית C. elegans שניתן לשנות את קנה המידה שלו עד בו זמנית לעבד 24 דגימות יחד עם פרוטוקול חיסוני משותף שניתן להשתמש בו כדי לזהות אינטראקציות חדשות או לאשר השערות בין חלבונים. פרוטוקול הכנת התמצית תואם למספר ניסויים במורד הזרם, כולל אימונופרציפיטציה של חלבונים2 ומיקרו-רנ"א נסוג12. יתר על כן, פרוטוקול immunoprecipitation יכול להיות מותאם לבדיקת אינטראקציות בין כל שני או יותר אנדוגני, מתויג אנדוגני, או overexpressed C. חלבונים אלגנס במגוון של רקעים גנטיים.
Protocol
1. איסוף דגימת תולעת
- זרע שלב מעורב אומסונכרן 13 תולעים על לוחות מוצקים NGM בטמפרטורה הנדרשת ולאפשר לתולעים לגדול עד השלב הרצוי. לצמיחה ותחזוקה בסיסיות של C. elegans, אנא ראו Stiernagle et al. ופורטה-דה-לה-ריבה ואח '14,13.
- לאסוף תולעים בצינור צנטריפוגה חרוט 15 מ"ל על ידי שטיפת לוחות התולעת עם חיץ M9.
- גלולה את התולעים על ידי צנטריפוגה ב 400 x גרם בטמפרטורת החדר (RT) במשך 2 דקות ולהשליך את supernatant.
הערה: גודל גלולת התולעת להכנת תמצית הוא בין 100 μL ו 500 μL. גלולה 300 μL של תולעים ארוז מומלץ לניסויים immunoprecipitation במורד הזרם ובדרך כלל מניב ~ 4.5 מ"ג של חלבון הכולל, בעוד גלולה μL 500 יניב ~ 7.5 מ"ג של חלבון הכולל. - בצעו שטיפות נוספות של 3-5 עם חיץ M9 (ראו טבלה 1)או עד שהעל-טבעי כבר לא יהיה מעונן.
- בצע שטיפה אחרונה עם ddH2O.
- להעביר את גלולת תולעת רופף לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל ולסובב למטה ב 400 x g ב RT במשך 2 דקות. להשליך את supernatant הנותרים כדי לקבל גלולה תולעת ארוז ולהמשיך לחלץ הכנה.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. כדורי תולעת עשויים להיות פלאש קפוא חנקן נוזלי מיד ומאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס או חנקן נוזלי. שים לב כי כדורי תולעת ניתן להפשיר רק פעם אחת ולא ניתן refrozen.
2. לחלץ הכנת גלולת התולעת
הערה: הכנת התמצית צריכה להתבצע על קרח או ב 4 מעלות צלזיוס.
- אם קפוא, להפשיר גלולת תולעת על קרח.
הערה: אם גודל גלולת התולעת הארוזה הרצוי של 300 μL לא הושג במהלך איסוף מדגם, כדורי קטן מרובים ניתן לשלב עד מספיק חומר קיים עבור מיצוי נוסף. - הוסף נפח שווה של מאגר תמוגה 2x קר כקרח (60 mM HEPES, pH = 7.4, 100 מ"מ אשלגן כלורי, 0.1% טריטון X, 4 מ"מ מגנזיום כלורי, 10% גליצרול, 2 מ"מ DTT עם מעכב RNase, מעכבי פרוטאז, מעכבי פוספטאז; ראה טבלה 1) ומערבולת או פיפטה למעלה ולמטה לערבב. סובבו את הצינור למטה כדי לאסוף את התערובת בתחתית הצינור.
- להעביר את התערובת לתוך צינור 1.5 מ"ל RNase ללא המכיל חרוזי מתכת (ראה טבלה של חומרים) ולשיםאת המדגם homogenizer טחנת חרוזים (ראה טבלה של חומרים)ב 4 מעלות צלזיוס. ודא כי כובעי הצינור מהודקו ואת הדגימות מאוזנות בתוך homogenizer.
- הומוגניזציה המדגם במהירות הגבוהה ביותר (הגדרת 12) במשך 4 דקות.
- הסר את המדגם מן החרוזים ומניחים אותו לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל. לחלופין, מגנט המסופק עם homogenizer יכול לשמש כדי להסיר את החרוזים מן המדגם.
- סובבו את התמצית ב-19,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להבהיר את תמצית החלבון.
- מעבירים את ה-supernatant לצינור טרי של 1.5 מ"ל על הקרח, תוך הימנעות מהשתלטות על המשקעים הלבנים, המעוננים, שנוצרים מעל המדגם. הסופרנט הוא עכשיו התמצית המובהרת.
הערה: שמור 10 μL של תמצית הבהיר כדי לקבוע את ריכוז החלבון הכולל. - השתמש בתמצית מיד לניסויים הבאים או פלאש להקפיא את התמצית חנקן נוזלי ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. תמציות ניתן לאחסן בטמפרטורה אולטרה נמוכה (-80 מעלות צלזיוס מקפיא או חנקן נוזלי במשך ~ 6 חודשים). תמציות קפואות עלולות להיות מופשרות פעם אחת ולא ניתן לחדד. - לקבוע את ריכוז החלבון הכולל של התמצית באמצעות ערכת מבחני ריכוז חלבון התואמת לחומרי ניקוי (ראה טבלת חומרים)בהתאם להוראות היצרן.
3. כשל חיסוני
הערה: כל שלבי האימונופרציפיטציה להכנת תמצית צריכים להתבצע על קרח או ב 4 מעלות צלזיוס. מומלץ להשתמש 2 מ"ג של חלבון הכולל עבור כל immunoprecipitation. עם זאת, בוצעו בדיקות חיסוניות מוצלחות עם 0.8–1 מ"ג חלבון כולל. יש להשתמש תמיד בתמציות חלבון טריות או טריות. הפרוטוקול הבא מתואר לביצוע כשל חיסוני מ-2 מ"ג חלבון כולל, או ניסוי אימונו-פרציפיטציה יחיד. ניתן להגדיל או להקטין את כמות החרוזים והנוגדנים בהתאם לדגימות מרובות או אם נעשה שימוש בכמות אחרת של תמצית חלבון.
- מניחים או מפשירים את תמצית החלבון על הקרח. המדגם יכול להיות מדולל ל 10 מ"ג / מ"ל או 5 מ"ג / מ"ל עם מאגר תמוגה קר כקרח 1x (ראה טבלה 1).
- להחזיר את החרוזים המגנטיים על ידי היפוך ולהעביר 150 μL של השעיית חרוזים 50% לתוך צינור 1.5 מ"ל. ממגנטים את החרוזים על הקרח כנגד מעמד מגנטי למשך דקה או עד שהפתרון ברור. השלך את הסופרנט.
- הסר את הצינור מהמעמד המגנטי ולשטוף את החרוזים במאגר תמוגה 1x באמצעות 2 כרכים (כלומר, 300 μL) של תרחיף חרוזים. חזור על לשטוף 2x עבור סך של שלוש שטיפות.
- להחזיר את החרוזים ב 150 μL של חיץ תמוגה קר כקרח.
- מעבירים 75 μL של תרחיף החרוזים ל-2 מ"ג תמצית חלבון ודגורה ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעה עם תסיסה עדינה. שמור את השעיית החרוזים הנותרת על הקרח לשימוש מאוחר יותר.
הערה: שלב זה מבוצע כדי להפחית חלבון לא ספציפי מחייב חרוזים במהלך שלב immunoprecipitation. - מניחים את הצינור עם מדגם על המעמד המגנטי על הקרח במשך דקה או עד החרוזים ממוגנטים לחלוטין ואת המדגם ברור. להעביר את supernatant לצינור חדש 1.5 מ"ל; אל תפריעו חרוזים. זהו ליסטר החלבון precleared. שמור 10% מהמדגם לניתוח כתמים מערביים.
- מוסיפים 20 מיקרוגרם של זיקה נוגדן מטוהרים lysate precleared ואת הדגירה ב 4 °C (69 °F) עבור 1 h עם תסיסה עדינה.
הערה: כמות הנוגדנים המשמשים immunoprecipitation הוא ספציפי נוגדן וחלבון צריך להיות נחוש באופן אמפירי כדי להבטיח immunoprecipitation יעיל של חלבון היעד. - מוסיפים את 75 μL הנותרים של השעיית החרוזים השטויפים מראש (שלב 3.5) לתערובת הנוגדנים /lysate ואת הדגירה במשך 1 שעות ב 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
- מניחים את הצינור בדוכן המגנטי על הקרח במשך דקה או עד החרוזים ממוגנטים לחלוטין ואת המדגם ברור. שמור את supernatant עבור ניתוח כתם מערבי (אופציונלי).
- לשטוף את החרוזים המכילים immunoprecipitate 3x ב 450 μL של חוצץ לשטוף (30 mM HEPES, pH = 7.4, 100 מ"מ אשלגן כלורי, 0.1% טריטון X, 2 מ"מ מגנזיום כלורי, 10% גליצרול, 1 מ"מ DTT; ראה טבלה 1) על קרח.
הערה: שטיפות נוספות עשויות להתבצע אם עדיף על תנאי כביסה מחמירים יותר. - Resuspend גלולת חרוז ב 20 μL של 2x SDS / BME חלבון ג'ל טעינה מאגר (ראה טבלה של חומרים)ו denature על ידי רותחים ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות לפני טעינה על ג'ל SDS-PAGE. לחלופין, דגימות denatured ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים.
הערה: חלק של immunoprecipitate חרוז ניתן לשמור לבידוד RNA במורד הזרם, אם תרצה.
4. זיהוי כתמים מערביים של דגימות IP
- טען את דגימות ה- IP על ג'ל SDS-PAGE (ראה טבלת חומרים). הימנע העברת החרוזים על ידי הצבת צינורות IP על המעמד המגנטי במשך 1 דקה לפני השאיפה של המדגם.
- בצע את הכתם המערבי15,16 ו נוגדן מכתים16 עם השינויים הבאים: לדלל את הנוגדן ALG-117 1:500 ב 5% חלב יבש ללא שומן (NFDM); לדלל את הנוגדן HRPK-12 1:1,000 ב 5% NFDM; ולדלל את הנוגדןAIN-1 18 1:10,000 ב 5% NFDM. נוגדנים משניים (ראו טבלת חומרים)שימשו בהתאם להוראות היצרן.
- לזהות את הרצועות עם chemiluminescence מבוסס HRP (ראה טבלה של חומרים).
Representative Results
פרוטוקול זה (סכמטי באיור 1)שימש בהצלחה להשגת תמציות חלבון סה"כ של C. elegans (איור 2) עבור כשל חיסוני במורד הזרם של מספר חלבונים2 (איור 3 ואיור 4). פרוטוקול ההומוגניזר של טחנת החרוזים שהוצג היה דומה בסך הכל מיצוי החלבון לשיטות מבוססות דונסה(איור 2)ומופק ביעילות גרעינית (COL-19::GFP(NLS) (איור 2)וחלבונים ציטופלזמיים (איור 3 ואיור 4). דגימות מרובות בגדלים שונים חולצו בו זמנית (איור 2). חלבונים Argonaute אינטראקציה עם בני משפחת החלבון GW182, להרכיב את miRISCs כי לאגד RNAs שליח היעד ולהדחיק את הביטוי שלהם10. איור 3 מראה חיסון משותף מוצלח של רכיבי miRISC בסיסיים ALG-1 ו- AIN-1, בהתאם לדיווחיםקודמים 11,17. לאחרונה נעשו מאמצים לזהות אינטראקציות חלבון נוספות של ArgonauteALG-13 על מנת ללמוד עוד על האופן שבו ביוגנזה ופעילות microRNA עשויות להיות מוסדרות על ידי גורמי עזר. החלבון המחייב RNA HRPK-1 זוהה ב ALG-1 immunoprecipitates3. אינטראקציה זו אושרה לאחרונה בניסוי חיסוני HRPK-1 הדדי2. פרוטוקולי התמצית והחיסוניות שהוצגו הצליחו לשחזר את ALG-1 ב- HRPK-1-ספציפי ל- co-immunoprecipitates (איור 4). בנוסף, האינטראקציה ALG-1-AIN-1 נבדקה במגוון רקעים גנטיים ו- HRPK-1 הוכח כמיותר עבור הרכבת ALG-1/AIN-1 miRISC2 (איור 3). נתונים משלימים מסופקים כדי להראות את הממברנה המלאה שנבדקה (איור משלים 1).
איור 1: סכמטי זרימת עבודה עבור C. elegans לחלץ הכנה ו immunoprecipitation. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: השוואת כתמים מערבית של GFP מקומי גרעיני, COL-19::GFP(NLS), רמות בדגימות מוכנות dounce והומוגני מ 250 μL ו 100 כדורי תולעת μL. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: GW182 הומולוגית AIN-1 שיתוף אימונו-פרופרציטיאטים עם ALG-1. סופג מערבי לחלבוני ALG-1 ו-AIN-1 באימונופרציפיטטים ALG-1. מערכת החיסון המשותפת ALG-1/AIN-1 לא הושפעה מהיעדר hrpk-1. קלט = 10% של IP. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ALG-1 שיתוף אימונו-חיסוני עם HRPK-1. סופג מערבי עבור HRPK-1 ו ALG-1 ב HRPK-1 immunoprecipitates מוצג. קלט = 10% של IP. * מציין שרשרת כבדה נוגדנים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| מאגר M9 (1 L) | |
| KH2PO4 | 3 גר' |
| Na2HPO4 | 6 גר' |
| נקלה (נקל) | 5 גר' |
| 1 מ"גסו4 | 1 מ"ל |
| ddH2O | עד 1 L |
| מאגר תמוגה 2x (5 מ"ל) | |
| היפס (עמ' 7.4) | 200 μL |
| 2 M KCl | 250 μL |
| 10% טריטון אקס | 100 μL |
| 1 M MgCl2 | 20 μL |
| 100% גליצרול | 1 מ"ל |
| ddH2O | עד 5 מ"ל |
| הוסף טרי: | |
| 1 M DTT | 20 μL |
| מעכב פרוטאז ללא EDTA | טאבלט אחד |
| קוקטייל מעכבי פוספטאז 2 | 100 μL |
| קוקטייל מעכבי פוספטאז 3 | 100 μL |
| מאגר תמוגה 1x | |
| לדלל 2x מאגר תמוגה עם נפח שווה של ddH20. | |
| 1x מאגר לשטוף 10 מ"ל) | |
| היפס (עמ' 7.4) | 300 μL |
| 2 M KCl | 500 μL |
| 10% טריטון אקס | 100 μL |
| 1 M MgCl2 | 20 μL |
| 100% גליצרול | 1 מ"ל |
| ddH2O | עד 10 מ"ל |
| 1 M DTT | 20 μL (להוסיף טרי) |
טבלה 1: מתכונים
איור משלים 1. קרום כתם מערבי מלא המשמש ליצירת איורים 2-4 מוצגים. (A) קרום בדיקה לאיור 2. שים לב כי הממברנה נחתכה כדי לאפשר בקשה לבדיקה בו זמנית עבור GFP ו Tubulin, צמצום גודל הכתם הכולל. (ב) קרום בדיקה לאיור 3. (ג) קרום בדיקה לאיור 3. *מציין שרשרת כבדה של נוגדנים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
ג. אלגנס הוא מודל מצוין לחקר שאלות יסוד בביולוגיה תאית, מולקולרית והתפתחותית19. בנוסף לכוחה כמערכת מודלים גנטיים, C. elegans הוא נוח לגישות ביוכימיות, כולל, אך לא רק, חיסוניות חלבון ו- co-immunoprecipitation. משוכה פוטנציאלית אחת בעת ביצוע ניסויים immunoprecipitation הוא חוסר נוגדנים ספציפיים חלבונים של עניין. אם אין נוגדן זמין, נוגדנים פוליקלונליים או חד שבטיים מותאמים אישית יכולים להיווצר. עם זאת, החידושים האחרונים בטכנולוגיית עריכת הגנום אפשרו לחוקרים להציג במהירות מוטציות או לתייג גנים אנדוגניים C. elegans 20,21, להקל על מחקרים לפענח את האינטראקציות הגנטיות, התפקודיות והפיזיות בין הגנים והחלבונים המקודדים. באופן ספציפי, תיוג בתיווך CRISPR/Cas9 של גנים C. elegans בלוקוסים אנדוגני הפחית את התלות של ניסויים immunoprecipitation על זמינות נוגדנים, מה שהופך ניסויים חיסוניים משותפים הרבה יותר ריאלי. C. גנים אלגנים ניתן לתייג עם מגוון רחב של תגים החל תגים פלואורסצנטיים כגון GFP או mCherry לתגים קטנים כגון דגל HA. נוגדנים המזהים תגים אלה זמינים מסחרית, מה שמקל על מחקרים של אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות גישות immunoprecipitation.
את הפרוטוקול המוצג, המתואר באיור 1, ניתן לבצע עבור מספר קטן של דגימות או לשנות את קנה המידה, מה שמאפשר עד 24 הכנות לדוגמה בכל פעם. בעוד האפיונים הראשוניים של אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות immunoprecipitation נעשים בדרך כלל ברקעים מסוג בר בתנאי גידול נורמליים, מחקרי מעקב לעתים קרובות מחייבים בדיקת אינטראקציות חלבון חלבון במגוון של רקעים גנטיים או בתנאי צמיחה שונים. היכולת להכין בו זמנית תמציות מרובות חוסכת זמן, וחשוב מכך, מבטיחה עקביות הכנת תמצית בין הדגימות השונות. תמיד נדרשת שליטה שלילית, כאשר השליטה האידיאלית היא מוטציה בטלה בקידוד הגנים עבור החלבון בעל השליטה במערכת החיסון (ראו איור 3 ואיור 4 לדוגמאות).
פרוטוקול תמצית זה מאפשר הכנת תמצית חלבון מהירה מדגימות C. elegans והוא דומה הומוגניזציה מבוססת חרוזי זירקוניום8. הומוגניזציה חרוזים באופן כללי ניתן לשנות עד תכשירים מדגם בו זמנית מרובים באמצעות מגוון רחב של homogenizers טחנת חרוזים או ציוד דומה. כמה homogenizers טחנת חרוז חסכוני יותר עשוי להפחית את מספר הדגימות שניתן לעבד בו זמנית, עם זאת. לחלופין, פרוטוקול התמצית המוצג תואם להכנת תמצית מבוססת dounce, המייצגת חלופה חסכונית. בעוד homogenizers טחנת חרוזים שונים לא נבדקו, רובם עשויים להיות תואמים לפרוטוקול תמצית חלבון זה, כל עוד שיבוש מוחלט של דגימות C. elegans מושגת.
כפי שהוצג, פרוטוקול הכנת תמצית זה תואם לניסויים מרובים במורד הזרם, כולל אימונו-פרציפיטציה של חלבונים2 ומיקרו-רנ"א12 ומאפשר איסוף במורד הזרם של רכיבי חלבון ו-RNA כאחד. הוא גם מחלץ ביעילות חלבונים גרעיניים וציטופלסמיים(איור 2, איור 3 ואיור 4). באופן דומה, פרוטוקול immunoprecipitation שהוצג מאפשר בידוד RNA מ immunoprecipitates הקשורים לחלבון. בעוד פרוטוקול immunoprecipitation פותח במקור כדי לזהות אינטראקציות חלבון ALG-1, השיטה יכולה להיות מותאמת לבדיקת אינטראקציות בין כל חלבונים מעניינים. למעשה, תנאי האימונופרציפיטציה שבהם נעשה שימוש עבדו באותה מידה עבור מערכת חיסונית ALG-1(איור 3)ו-HRPK-1(איור 4). פרוטוקול זה הוא נקודת התחלה מצוינת עבור immunopurification של חלבונים מחייבי RNA. יש לציין, עם זאת, כי שינויים מסוימים בהרכב החיץ עשויים להידרש עבור חלבונים אחרים של עניין. השינויים עשויים להיות תלויים בתכונות הפיזיות והביוכימיות של החלבון המעניין ויש ליישם אותו על בסיס כל מקרה לגופו.
לאחר חלבון היעד (כאן, ALG-1 או HRPK-1) הוא immunoprecipitated, סופג מערבי יכול לשמש כדי לבדוק את שיתוף immunoprecipitate עבור אינטראקציות חלבון ספציפיות.
לחלופין, immunoprecipitate copurified יכול להיות נתון לניתוח ספקטרומטריה המונית כדי לזהות את כל החלבונים אינטראקציה putative. לאחר מכן ניתן לבחון אינטראקציות מאומתות של חיסונים משותפים במגוון רקעים גנטיים או תנאים לזיהוי ויסות פוטנציאלי של האינטראקציה הספציפית. לדוגמה, כדי לקבוע אם hrpk-1 ממלא תפקיד בהרכבה ALG-1/AIN-1 miRISC, ALG-1-AIN-1 הוערך הן ברקע מסוג פראי והן בהיעדר HRPK-1 (איור 3). hrpk-1 נמצאה לוותר על ALG-1/AIN-1 אינטראקציה2 (איור 3). בנוסף, ניתן להציע טכנולוגיית עריכת גנום CRISPR/Cas9 כדי ליצור מוטציות חד-נקודתיות או מחיקת דומיין בחלבונים המעניינים. בדיקה חוזרת של היכולת של המוטנטים שנוצרו להתמודד עם אינטראקציות החלבון שלהם יכולה לחשוף אילו תחומים או שאריות מתווכים את האינטראקציה הפיזית. מחקרים עתידיים כאלה יכולים להניב מידע שלא יסולא בפז על המנגנון של תפקוד חלבון ורגולציה. גישות אלה, בשילוב עם כוחה של הגנטיקה C. elegans, יכולות לספק תובנות חשובות על התהליכים המולקולריים הבסיסיים השולטים בהתפתחות בעלי החיים ובתפקוד התאי.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קנזס INBRE, P20GM103418 ללי וזיאנובייבה ו- R35GM124828 לזינובייבה. אנו מודים למין האן על שיתוף הנוגדן נגד איי-איי-1 בנדיבות. חלק מהזנים המשמשים במהלך עבודה זו סופקו על ידי המרכז לגנטיקה Caenorhabditis (CGC), במימון משרד NIH של תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tube | VWR | 89039-664 | STEP 1.2 |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRed | 1610737 | STEP 3.11 |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRed | 4561096 | STEP 4.1 |
| anti-AIN-1 monoclonal antibody | custom generated | n/a | STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007 |
| anti-ALG-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| anti-HRPK-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| Bullet Blender Storm Homogenizer | MidSci | BBY24M | STEP 2.3 |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779-5G | Table 1 |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher | 10002D | STEP 3.2 |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | STEP 3.2 |
| EDTA-free protease inhibitors | Roche | 11836170001 | Table 1 |
| GFP antibody (FL) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8334 | Figure 2 |
| Glycerol | Thermo Fisher | G33-500 | Table 1 |
| Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP | BioRed | 1662408 | STEP 4.2 |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | 31470 | STEP 4.2 |
| HEPES | Sigma | H4034-500G | Table 1 |
| LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit | LI-COR | 926-95000 | STEP 4.3 |
| Magnesium chloride hexahydrate ACS | VWR | VWRV0288-500G | Table 1 |
| Magnesium Sulfate Anhydrous | Thermo Fisher | M65-500 | Table 1 |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | STEP 1.6 |
| N2 wild type | CGC | ||
| Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL) | MidSci | NAVYR1-RNA | STEP 2.3 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726-1ML | Table 1 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044-1ML | Table 1 |
| Potassium Chloride | Thermo Fisher | P217-500 | Table 1 |
| Potassium phosphate monobasic | Thermo Fisher | P285-3 | Table 1 |
| RC DC Protein Assay Kit I | BioRed | 5000121 | STEP 2.9 |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | Table 1 |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher | S271-500 | Table 1 |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Thermo Fisher | S374-500 | Table 1 |
| TritionX-100 | Sigma | X100-500ML | Table 1 |
| UY38 hrpk-1(zen17) | available upon request | ||
| VT1367 col-19::gfp(maIS105) | available upon request | ||
| VT3841 alg-1(tm492) | available upon request |
References
- Liu, X., et al. An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations. Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).
- Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development. PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).
- Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).
- Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans. Cell. 136 (5), 926-938 (2009).
- Zou, Y., et al. Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers. Science. 340 (6130), 372-376 (2013).
- Zanin, E., Dumont, J., et al. Affinity purification of protein complexes in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).
- Bhaskaran, S., et al. Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application. Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).
- Kohl, K., et al. Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes. Journal of Visualized Experiments. (138), e58117 (2018).
- Larance, M., Bailly, A. P., et al. Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes. Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).
- Ding, L., Han, M. GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing. Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).
- Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans. Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).
- Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2’-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices. Methods in Molecular Biology. 725, Chapter 16 233-249 (2011).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T.
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression. PLoS Genetics. 10 (4), 1004286 (2014).
- Zhang, L., et al. Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2. Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Farboud, B., et al. Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms. Journal of Visualized Experiments. (135), e57350 (2018).
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
