Summary
Denne metode beskriver en protokol for høj-gennemløb proteinekstrakt forberedelse fra Caenorhabditis elegans prøver og efterfølgende co-immunoprecipitation.
Abstract
Co-immunoprecipitation metoder bruges ofte til at studere protein-protein interaktioner. Bekræftelse af hypotese protein-protein interaktioner eller identifikation af nye kan give uvurderlige oplysninger om funktionen af et protein af interesse. Nogle af de traditionelle metoder til ekstraktforberedelse kræver ofte arbejdskrævende og tidskrævende teknikker. Her beskrives en modificeret ekstraktforberedelsesprotokol ved hjælp af en perlemølle homogenisator og metalperler som et hurtigt alternativ til traditionelle proteinforberedelsesmetoder. Denne ekstraktpræparatmetode er kompatibel med downstream-co-immunoprecipitationsundersøgelser. Som et eksempel blev metoden brugt til at medimforbedre C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 og to kendte ALG-1 interactors: AIN-1 og HRPK-1. Denne protokol indeholder beskrivelser af indsamling af dyreforsøg, ekstraktpræparat, ekstraktklaration og proteinim immunoprecipitation. Den beskrevne protokol kan tilpasses for at teste for interaktioner mellem to eller flere endogene, endogene mærkede eller overekspresserede C. elegans proteiner i en række genetiske baggrunde.
Introduction
Identifikation af makromolekylære interaktioner af et protein af interesse kan være nøglen til at lære mere om dets funktion. Immunoprecipitation og co-immunoprecipitationseksperimenter kan bruges til at identificere hele interactomet af et protein gennem store proteomic tilgange1 eller specifikt teste et proteins evne til at coprecipitate med en hypotese interactor. I C. eleganser begge metoder med succes blevet anvendt til at lære mere om aktiviteten af en række proteiner, herunder dem, der fungerer tæt sammen med microRNA'er for at regulere genekspression2,3,4. Co-immunoprecipitation eksperimenter har den fordel, at teste protein-protein interaktioner i deres oprindelige cellulære miljø, men ekstrakt forberedelse kan være udfordrende og tidskrævende. Effektiv lysis af prøven er nødvendig, men der skal udvises forsigtighed for at minimere forstyrrelsen af proteinproteininteraktioner. Metoder som douncing5, sonikering6,Balch homogenisering7, og zirconia perler-homogenisering8,9 er blevet brugt til at forberede C. elegans samlede proteinekstrakter. Disse metoder, med undtagelse af zirconia bead homogenisering, har begrænsninger med hensyn til antallet af prøver, der kan behandles samtidigt. Præsenteret er en alternativ metode, der let kan skaleres op for at give mulighed for høj gennemstrømning, hurtigt proteinekstraktpræparat fra C. elegans prøver efterfulgt af co-immunoprecipitation. Specifikt kan metoden forberede op til 24 prøver ad gangen, hvilket i høj grad reducerer den tid, der kræves til ekstraktforberedelse. I modsætning hertil giver douncing typisk kun mulighed for en prøveforberedelse ad gangen. Denne ekstraktmetode kan bruges til at forberede ekstrakter fra ethvert udviklingsstadium i C. elegans.
Beskrevet er en trin-for-trin procedure for indsamling af dyreforsøg, ekstrakt forberedelse, immunoprecipitation, og præsentation af vestlige blotting data for at bekræfte vellykket protein pulldown og påvisning af co-immunoprecipitating protein af interesse. For at demonstrere protokollens effektivitet blev der udført to co-immunoprecipitationsforsøg mellem 1) microRNA Argonaute ALG-1 og AIN-1, en GW182 homolog; og 2) ALG-1 og HRPK-1, en nyligt identificeret ALG-1 interactor2. ALG-1 og AIN-1 er kerneproteiner, der omfatter det mikroRNA-inducerede lyddæmpningskompleks (miRISC), og samspillet mellem disse to proteiner er veletableret10,11. Ekstraktforberedelsesprotokollen var effektiv i ALG-1-AIN-1-co-immunoprecipitationseksperimentet. Denne protokol bekræftede også interaktionen mellem ALG-1 og dens nyligt identificerede interactor, HRPK-12.
Sammenfattende beskriver manuskriptet en C. elegans ekstrakt forberedelse protokol, der kan skaleres op til samtidig proces 24 prøver sammen med en co-immunoprecipitation protokol, der kan bruges til at identificere nye eller bekræfte hypotese interaktioner mellem proteiner. Ekstraktforberedelsesprotokollen er kompatibel med en række downstream-forsøg, herunder proteinim immunoprecipitation2 og microRNA-pulldowns12. Desuden kan immunoprecipitationsprotokollen tilpasses for at teste for interaktioner mellem to eller flere endogene, endogene mærkede eller overekspresserede C. elegans proteiner i en række genetiske baggrunde.
Protocol
1. Orm prøve indsamling
- Frø blandet fase eller synkroniseret13 orme på NGM faste plader ved den krævede temperatur og lad ormene til at vokse, indtil den ønskede fase. For grundlæggende C. elegans vækst og vedligeholdelse, se Stiernagle et al. og Porta-de-la-Riva et al.14,13.
- Saml orme i et 15 mL konisk centrifugerør ved at vaske ormepladerne med M9-buffer.
- Pellet ormene ved centrifugering ved 400 x g ved stuetemperatur (RT) i 2 min og kassér supernatanten.
BEMÆRK: Ormens pelletstørrelse til ekstraktpræparat er mellem 100 μL og 500 μL. En 300 μL pellet af pakkede orme anbefales til downstream immunoprecipitationsforsøg og giver typisk ~4,5 mg totalprotein, mens en 500 μL pellet vil give ~7,5 mg totalprotein. - Udfør yderligere 3-5 vasker med M9 buffer (se tabel 1), eller indtil supernatanten ikke længere er overskyet.
- Udfør en sidste vask med ddH2O.
- Flyt den løse orm pellet til en 1,5 mL mikrocentrifuge rør og spin ned på 400 x g på RT i 2 min. Kassér de resterende supernatant at opnå en pakket orm pellet og fortsætte med at udtrække forberedelse.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. Ormepiller kan straks lynes ned i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C eller i flydende nitrogen. Bemærk, at ormepiller kun kan optøs én gang og ikke kan optøs igen.
2. Ekstrakt forberedelse af ormen pellet
BEMÆRK: Ekstraktpræparatet skal udføres på is eller ved 4 °C.
- Hvis det fryses, tø orm pellet på is.
BEMÆRK: Hvis den ønskede pakkede ormpillestørrelse på 300 μL ikke blev opnået under prøveopsamlingen, kan flere mindre pellets kombineres, indtil der er nok materiale til yderligere ekstraktion. - Der tilsættes en lige stor mængde iskold 2x lysisbuffer (60 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM kaliumchlorid, 0,1% Triton X, 4 mM magnesiumchlorid, 10% glycerol, 2 mM DTT med RNase-hæmmer, proteasehæmmer og fosfatasehæmmere; se tabel 1) og vortex eller pipette op og ned til mix. Drej rørene ned for at samle blandingen i bunden af røret.
- Blandingen flyttes til et 1,5 mL RNasefrit rør, der indeholder metalperler (se materialetabel),og prøven anbringes i perlemøllens homogenisator (se materialetabel)ved 4 °C. Sørg for, at rørhætterne strammes, og at prøverne er afbalancerede inde i homogenisatoren.
- Prøven homogeniseres med den højeste hastighed (indstilling 12) i 4 min.
- Prøven tages ud af perlerne, og den anbringes i et nyt mikrocentrifugerør på 1,5 mL. Alternativt kan en magnet, der følger med homogenisatoren, bruges til at fjerne perlerne fra prøven.
- Ekstraktet skal drejes ned ved 19.000 x g i 20 minutter ved 4 °C for at tydeliggøre proteinekstraktet.
- Supernatanten overføres til et friskt 1,5 mL rør på is, samtidig med at man undgår overførsel af det hvide, overskyede bundfald, der dannes oven på prøven. Supernatanten er nu det tydelige uddrag.
BEMÆRK: Gem 10 μL af det tydelige ekstrakt for at bestemme den samlede proteinkoncentration. - Ekstraktet anvendes straks til følgende forsøg, eller ekstraktet fryses i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C.
BEMÆRK: Protokollen kan være sat på pause her. Ekstrakter kan opbevares ved ultralav temperatur (-80 °C fryser eller flydende nitrogen i ~6 måneder). Frosne ekstrakter kan optøs én gang og kan ikke fryses igen. - Ekstraktets samlede proteinkoncentration bestemmes ved hjælp af et proteinkoncentrationsanalysesæt, der er kompatibelt med vaskemidler (se materialetabel)i overensstemmelse med producentens anvisninger.
3. Immunoprecipitation
BEMÆRK: Alle immunoprecipitationstrinnene til ekstraktpræparat skal udføres på is eller ved 4 °C. Det anbefales at bruge 2 mg totalprotein til hver immunoprecipitation. Der er dog blevet udført vellykkede immunoprecipitationer med 0,8-1 mg totalprotein. Brug altid friske eller frisk optøede proteinekstrakter. Følgende protokol er skitseret til at udføre immunoprecipitation fra 2 mg totalprotein eller et enkelt immunoprecipitationseksperiment. Mængden af perler og antistoffer kan øges eller nedsættes tilsvarende for flere prøver, eller hvis der anvendes en anden mængde proteinekstrakt.
- Placer eller tø proteinekstraktet op på is. Prøven kan fortyndes til 10 mg/mL eller 5 mg/mL med iskold 1x lysisbuffer (se tabel 1).
- De magnetiske perler opsættes igen ved inversion, og 150 μL af 50% perler suspenderes til et 1,5 mL rør. Magnetisere perlerne på is mod et magnetisk stativ i 1 min eller indtil opløsningen er klar. Kassér supernatanten.
- Røret fjernes fra magnetstativet, og perlerne vaskes i 1x lysisbuffer med 2 volumener (dvs. 300 μL) perleslam. Gentag vask 2x for i alt tre vasker.
- Resuspend perlerne i 150 μL iskold lysis buffer.
- 75 μL af perleslamsen overføres til 2 mg proteinekstrakt, og der inkuberes ved 4 °C i 1 time med let omrøring. Gem den resterende perleaffjedring på is til senere brug.
BEMÆRK: Dette trin udføres for at reducere uspecifik proteinbinding til perler under immunoprecipitationstrinnet. - Røret anbringes med prøve på magnetstativet på isen i 1 min., eller indtil perlerne er fuldt magnetiserede, og prøven er klar. Supernatanten overføres til et nyt 1,5 mL rør; forstyrr ikke perlerne. Dette er det præclearede protein lysat. Gem 10% af prøven til Western blot analyse.
- Der tilsættes 20 μg affinitetsrenset antistof til det præclearede lysat og inkuberes ved 4 °C i 1 time med let omrøring.
BEMÆRK: Mængden af antistof, der anvendes til immunoprecipitation, er specifik for antistoffet og proteinet og bør empirisk bestemmes for at sikre effektiv immunoprecipitation af målproteinet. - De resterende 75 μL af den forvaskede beadsaffjedring (trin 3.5) til antistof/lysatblandingen tilsættes og inkuberes i 1 time ved 4 °C med let omrøring.
- Placer røret i magnetstativet på is i 1 min. eller indtil perlerne er fuldt magnetiseret, og prøven er klar. Gem supernatanten til Western Blot-analyse (valgfrit).
- Perlerne med immunoprecipitat 3x vaskes 3x i 450 μL vaskebuffer (30 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM kaliumchlorid, 0,1% Triton X, 2 mM magnesiumchlorid, 10% glycerol, 1 mM DTT; se tabel 1) på is.
BEMÆRK: Der kan foretages yderligere vask, hvis strengere vaskebetingelser foretrækkes. - Perlepillen genbruges i 20 μL af 2x SDS/BME proteingelbelastningsbuffer (se materialetabel)og denatureres ved kogning ved 95 °C i 5 minutter inden pålæsning på en SDS-PAGE gel. Alternativt kan denaturerede prøver opbevares ved -20 °C i flere måneder.
BEMÆRK: En del af perleimfortaten kan om ønsket gemmes til RNA-isolering.
4. Vestlig skamplet påvisning af IP-prøver
- Ip-prøverne indlæses på SDS-PAGE-gelen (se Materialeoversigt). Undgå at overføre perlerne ved at placere IP-rørene på magnetstativet i 1 minut før prøvens aspiration.
- Den vestlige blotting15,16 og antistoffarvning16 udføres med følgende modifikationer: ALG-1-antistoffetfortyndes 17 1:500 i 5% fedtfri tørmælk (NFDM); hrpk-1-antistoffet2 1:1.000 fortyndes i 5 % NFDM og fortynd AIN-1 antistof18 1:10,000 i 5% NFDM. Sekundære antistoffer (se materialeoversigten)blev anvendt i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger.
- Registrer båndene med HRP-baseret chemiluminescens (se Materialeoversigt).
Representative Results
Denne protokol (skemalagt i figur 1) blev anvendt med succes til at opnå C. elegans samlede proteinekstrakter (figur 2) til downstream-immunoprecipitation af flere proteiner2 (figur 3 og figur 4). Den præsenterede homogenisatorprotokol for perlemøller var sammenlignelig med douncebaserede metoder(figur 2)og effektivt udvundet nuklear (COL-19::GFP(NLS) (Figur 2) og cytoplasmiske proteiner (figur 3 og figur 4). Flere prøver af forskellig størrelse blev udvundet samtidigt (figur 2). Argonaute proteiner interagerer med medlemmer af GW182 proteinfamilien og danner de miRISC'er, der binder sig til målbuddet RNA'er og undertrykker deres udtryk10. Figur 3 viser vellykket co-immunoprecipitation af kernemiRISC-komponenterne ALG-1 og AIN-1 , i overensstemmelse med tidligere rapporter11,17. For nylig blev der gjort en indsats for at identificere yderligere proteininteragere af Argonaute ALG-13 for at lære mere om, hvordan mikroRNA-biogenese og aktivitet kan reguleres af hjælpefaktorer. Det RNA-bindende protein HRPK-1 blev identificeret i ALG-1 immunoprecipitates3. Denne interaktion blev for nylig bekræftet i et gensidigt HRPK-1 immunoprecipitationseksperiment2. De præsenterede ekstrakt- og immunoprecipitationsprotokoller genvandt med succes ALG-1 i HRPK-1-specifikke co-immunoprecipitater (figur 4). Derudover blev ALG-1-AIN-1-interaktionen testet i en række genetiske baggrunde, og HRPK-1 viste sig at være unødvendig for ALG-1/AIN-1 miRISC-samling2 (Figur 3). Der fremlægges supplerende tal for at vise den fulde membran, der er undersøgt(supplerende figur 1).
Figur 1: Skema for arbejdsgange for C. elegans ekstraktforberedelse og immunoprecipitation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Vestlig blot sammenligning af en nuklear lokaliseret GFP, COL-19::GFP(NLS), niveauer i dounce-tilberedte og homogeniserede prøver fra 250 μL og 100 μL orm pellets. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: GW182 homolog AIN-1 co-immunoprecipitates med ALG-1. Vestlig blotting for ALG-1 og AIN-1 proteiner i ALG-1 immunoprecipitates. ALG-1/AIN-1 co-immunoprecipitation blev ikke påvirket af fraværet af hrpk-1. Input = 10% af IP. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: ALG-1 co-immunoprecipitates med HRPK-1. Vestlig blotting for HRPK-1 og ALG-1 i HRPK-1 immunoprecipitates er vist. Input = 10% af IP. * indikerer antistof tung kæde. Klik her for at se en større version af dette tal.
| M9-buffer (1 L) | |
| KH2PO4 | 3 g |
| Na2HPO4 | 6 g |
| NaCl | 5 g |
| 1 M MgSO4 | 1 mL |
| ddH2O | op til 1 L |
| 2x Lysis buffer (5 mL) | |
| HEPES (pH 7,4) | 200 μL |
| 2 M KCl | 250 μL |
| 10% TritonX | 100 μL |
| 1 M MgCl2 | 20 μL |
| 100% glycerol | 1 mL |
| ddH2O | op til 5 mL |
| Tilføj frisk: | |
| 1 M DTT | 20 μL |
| EDTA-fri proteasehæmmer | 1 tablet |
| fosfatasehæmmercocktail 2 | 100 μL |
| fosfatasehæmmercocktail 3 | 100 μL |
| 1x Lysis buffer | |
| Lysisbufferen fortyndes med et tilsvarende volumen ddH20. | |
| 1x Vaskebuffer 10 mL) | |
| HEPES (pH 7,4) | 300 μL |
| 2 M KCl | 500 μL |
| 10% TritonX | 100 μL |
| 1 M MgCl2 | 20 μL |
| 100% glycerol | 1 mL |
| ddH2O | op til 10 mL |
| 1 M DTT | 20 μL (tilsæt frisk) |
Tabel 1: Opskrifter
Supplerende figur 1. Fuld probed vestlige blot membraner bruges til at generere Tal 2-4 er vist. (A) Probed membran for figur 2. Bemærk, at membranen blev skåret for at give mulighed for samtidig sondering for GFP og Tubulin, hvilket reducerer den samlede skampletstørrelse. (B) Probed membran for figur 3. c) Probedmembran for figur 3. * betegner antistof tung kæde. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
C. elegans er en fremragende model til at studere grundlæggende spørgsmål i celle-, molekylær- og udviklingsbiologi19. Ud over sin magt som et genetisk modelsystem er C. elegans modtagelig for biokemiske tilgange, herunder, men ikke begrænset til, proteinim immunoprecipitation og co-immunoprecipitation. En potentiel forhindring ved udførelse af immunoprecipitationseksperimenter er mangel på antistoffer, der er specifikke for de proteiner, der er af interesse. Hvis der ikke findes noget antistof, kan der genereres brugerdefinerede polyklonale eller monoklonale antistoffer. Imidlertid har nylige innovationer inden for genomredigeringsteknologi gjort det muligt for forskere hurtigt at introducere mutationer eller tag endogene C. elegans gener20,21, hvilket letter undersøgelser, der optrævler de genetiske, funktionelle og fysiske interaktioner mellem generne og de kodede proteiner. Specifikt har CRISPR/Cas9-medieret mærkning af C. elegans gener på den endogene loci reduceret afhængigheden af immunoprecipitationseksperimenter på antistoftilgængelighed, hvilket gør co-immunoprecipitationseksperimenter meget mere gennemførlige. C. elegans gener kan mærkes med en række tags lige fra fluorescerende tags såsom GFP eller mCherry til små tags som FLAG og HA. Antistoffer, der genkender disse tags, er let tilgængelige kommercielt, hvilket letter undersøgelserne af proteinproteininteraktioner via immunoprecipitationsmetoder.
Den præsenterede protokol, der er skitseret i figur 1, kan udføres for et lille antal prøver eller skaleres op, hvilket giver mulighed for op til 24 prøvepræparater ad gangen. Mens de indledende karakteristik af protein-protein interaktioner via immunoprecipitation er typisk sker i vilde type baggrunde under normale vækstbetingelser, opfølgende undersøgelser ofte kræver test af protein-protein interaktioner i en række genetiske baggrunde eller under forskellige vækstbetingelser. Evnen til samtidig at forberede flere ekstrakter sparer tid og, vigtigst af alt, sikrer ekstraktforberedelseskonsistens mellem de forskellige prøver. Der kræves altid en negativ kontrol, idet den ideelle kontrol er en null-mutation i genkodningen for det immunoprecipiterede protein af interesse (se figur 3 og figur 4 for eksempler).
Denne ekstraktprotokol giver mulighed for hurtig proteinekstraktpræparat fra C. elegans prøver og kan sammenlignes med zirconium perlebaseret homogenisering8. Perle homogenisering i almindelighed kan skaleres op til flere samtidige prøve præparater ved hjælp af en række perle mølle homogenisatorer eller lignende udstyr. Nogle mere økonomiske perle mølle homogenisatorer kan reducere antallet af prøver, der kan behandles samtidigt, dog. Alternativt er den fremlagte udtræksprotokol forenelig med et douncebaseret ekstraktpræparat, som udgør et økonomisk alternativ. Mens forskellige perlemølle homogenisatorer ikke blev testet, er de fleste sandsynligvis kompatible med denne proteinekstraktprotokol, så længe der opnås fuldstændig forstyrrelse af C. elegans-prøverne.
Som præsenteret er denne ekstraktforberedelsesprotokol kompatibel med flere downstream-eksperimenter, herunder proteinim immunoprecipitation2 og microRNA-pull-down12 og giver mulighed for downstream-indsamling af både protein- og RNA-komponenter. Den udvinder også effektivt både nukleare og cytoplasmiske proteiner (figur 2, figur 3og figur 4). På samme måde tillader den fremlagte immunoprecipitationsprotokol RNA-isolering fra proteinrelaterede immunoprecipitater. Mens immunoprecipitationsprotokollen oprindeligt blev udviklet til at identificere ALG-1 proteininteraktionsfaktorer, kan metoden tilpasses for at teste for interaktioner mellem proteiner af interesse. De anvendte immunoprecipitationsbetingelser fungerede faktisk lige så godt for immunoprecipiterende ALG-1 (figur 3) og HRPK-1 (figur 4). Denne protokol er et glimrende udgangspunkt for immunopurificering af RNA-bindende proteiner. Det skal dog bemærkes, at der kan være behov for visse ændringer i buffersammensætningen for andre proteiner af interesse. Ændringerne kan afhænge af de fysiske og biokemiske egenskaber ved det protein, der er af interesse, og skal gennemføres fra sag til sag.
Når målproteinet (her ALG-1 eller HRPK-1) er immunoprecipiteret, kan vestlig blotting bruges til at teste co-immunoprecipitatet for specifikke proteininteraktionsfaktorer.
Alternativt kan copurified immunoprecipitate udsættes for massespektrometri analyse for at identificere alle de formodede interagerende proteiner. Bekræftede interaktioner med co-immunoprecipitation kan derefter undersøges i en række genetiske baggrunde eller tilstande for at identificere potentiel regulering af den specifikke interaktion. For at afgøre, om hrpk-1 spiller en rolle i ALG-1/AIN-1 miRISC-samling, blev ALG-1-AIN-1-coprecipitation f.eks. vurderet både i en vild type baggrund og i mangel af HRPK-1 (Figur 3). hrpk-1 viste sig at kunne undværes til ALG-1/AIN-1 interaktion2 (Figur 3). Derudover kan CRISPR/Cas9 genomredigeringsteknologi anvendes til at generere enkeltpunkts- eller domænesletningsmutationer i de proteiner, der er af interesse. At teste de genererede mutanters evne til at klare sig med deres proteininteraktionsbånd kan afsløre, hvilke domæner eller rester der formidler den fysiske interaktion. Sådanne fremtidige undersøgelser kan give uvurderlige oplysninger om mekanismen for proteinfunktion og regulering. Disse tilgange, kombineret med kraften i C. elegans genetik, kan give vigtig indsigt i de grundlæggende molekylære processer, der styrer dyrs udvikling og cellulære funktion.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af Kansas INBRE, P20GM103418 til Li og Zinovyeva og R35GM124828 til Zinovyeva. Vi takker Min Han for generøst at dele anti-AIN-1 antistof. Nogle af de stammer, der anvendes i løbet af dette arbejde blev leveret af Caenorhabditis Genetics Center (CGC), finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tube | VWR | 89039-664 | STEP 1.2 |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRed | 1610737 | STEP 3.11 |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRed | 4561096 | STEP 4.1 |
| anti-AIN-1 monoclonal antibody | custom generated | n/a | STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007 |
| anti-ALG-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| anti-HRPK-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| Bullet Blender Storm Homogenizer | MidSci | BBY24M | STEP 2.3 |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779-5G | Table 1 |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher | 10002D | STEP 3.2 |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | STEP 3.2 |
| EDTA-free protease inhibitors | Roche | 11836170001 | Table 1 |
| GFP antibody (FL) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8334 | Figure 2 |
| Glycerol | Thermo Fisher | G33-500 | Table 1 |
| Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP | BioRed | 1662408 | STEP 4.2 |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | 31470 | STEP 4.2 |
| HEPES | Sigma | H4034-500G | Table 1 |
| LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit | LI-COR | 926-95000 | STEP 4.3 |
| Magnesium chloride hexahydrate ACS | VWR | VWRV0288-500G | Table 1 |
| Magnesium Sulfate Anhydrous | Thermo Fisher | M65-500 | Table 1 |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | STEP 1.6 |
| N2 wild type | CGC | ||
| Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL) | MidSci | NAVYR1-RNA | STEP 2.3 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726-1ML | Table 1 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044-1ML | Table 1 |
| Potassium Chloride | Thermo Fisher | P217-500 | Table 1 |
| Potassium phosphate monobasic | Thermo Fisher | P285-3 | Table 1 |
| RC DC Protein Assay Kit I | BioRed | 5000121 | STEP 2.9 |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | Table 1 |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher | S271-500 | Table 1 |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Thermo Fisher | S374-500 | Table 1 |
| TritionX-100 | Sigma | X100-500ML | Table 1 |
| UY38 hrpk-1(zen17) | available upon request | ||
| VT1367 col-19::gfp(maIS105) | available upon request | ||
| VT3841 alg-1(tm492) | available upon request |
References
- Liu, X., et al. An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations. Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).
- Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development. PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).
- Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).
- Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans. Cell. 136 (5), 926-938 (2009).
- Zou, Y., et al. Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers. Science. 340 (6130), 372-376 (2013).
- Zanin, E., Dumont, J., et al. Affinity purification of protein complexes in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).
- Bhaskaran, S., et al. Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application. Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).
- Kohl, K., et al. Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes. Journal of Visualized Experiments. (138), e58117 (2018).
- Larance, M., Bailly, A. P., et al. Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes. Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).
- Ding, L., Han, M. GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing. Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).
- Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans. Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).
- Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2’-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices. Methods in Molecular Biology. 725, Chapter 16 233-249 (2011).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T.
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression. PLoS Genetics. 10 (4), 1004286 (2014).
- Zhang, L., et al. Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2. Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Farboud, B., et al. Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms. Journal of Visualized Experiments. (135), e57350 (2018).
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
