Summary
Wir beschreiben Fluoreszenz-Photoaktivierungsmethoden zur Analyse des axonalen Transports von Neurofilamenten in einzelnen myelinierten Axonen peripherer Nerven von transgenen Mäusen, die ein photoaktivierbares Neurofilamentprotein exprimieren.
Abstract
Neurofilament-Proteinpolymere bewegen sich entlang von Axonen in der langsamen Komponente des axonalen Transports bei Durchschnittsgeschwindigkeiten von 0,35-3,5 mm/Tag. Bis vor kurzem war die Untersuchung dieser Bewegung vor Ort nur mit radioisotopischer Pulsbeschriftung möglich, die eine Analyse des axonalen Transports in ganzen Nerven mit einer zeitlichen Auflösung von Tagen und einer räumlichen Auflösung von Millimetern ermöglicht. Um den Neurofilamenttransport vor Ort mit höherer zeitlicher und räumlicher Auflösung zu untersuchen, haben wir eine hThy1-paGFP-NFM transgene Maus entwickelt, die Neurofilamentprotein M mit photoaktivierbarem GFP in Neuronen ausdrückt. Hier beschreiben wir Fluoreszenz-Photoaktivierung Puls-Escape und Puls-Spread-Methoden zur Analyse des Neurofilamenttransports in einzelnen myelinierten Axonen von tibiaellen Nerven von diesen Mäusen ex vivo. Isolierte Nervensegmente werden auf der Mikroskopstufe durch Perfusion mit sauerstoffhaltiger Saline erhalten und durch drehende Plattenkonfokaleszenzmikroskopie abgebildet. Violettes Licht wird verwendet, um die Fluoreszenz in einem kurzen axonalen Fenster zu aktivieren. Die Fluoreszenz in den aktivierten und flankierenden Regionen wird im Laufe der Zeit analysiert, was die Untersuchung des Neurofilamenttransports mit zeitlicher und räumlicher Auflösung in der Größenordnung von Minuten bzw. Mikrometern ermöglicht. Mathematische Modellierung kann verwendet werden, um kinetische Parameter des Neurofilamenttransports einschließlich der Geschwindigkeit, der Richtungsverzerrung und des Pausungsverhaltens aus den resultierenden Daten zu extrahieren. Die Puls-Escape- und Puls-Spread-Methoden können auch angepasst werden, um den Neurofilamenttransport in anderen Nerven zu visualisieren. Mit der Entwicklung zusätzlicher transgener Mäuse könnten diese Methoden auch verwendet werden, um den axonalen Transport anderer zytoskelettaler und zytosolischer Proteine in Axonen abzubilden und zu analysieren.
Introduction
Der axonale Transport von Neurofilamenten wurde erstmals in den 1970er Jahren durch radioisotopische Pulsbeschriftung1demonstriert. Dieser Ansatz hat eine Fülle von Informationen über Neurofilament-Transport in vivoergeben, aber es hat relativ geringe räumliche und zeitliche Auflösung, in der Regel in der Größenordnung von Millimetern und Tagen bestenfalls2. Darüber hinaus ist die radioisotopen pulsierende Kennzeichnung ein indirekter Ansatz, der die Injektion und das Opfer mehrerer Tiere erfordert, um einen einzigen Zeitverlauf zu erzeugen. Mit der Entdeckung fluoreszierender Proteine und Fortschritten in der Fluoreszenzmikroskopie in den 1990er Jahren wurde es später möglich, neurofilamenten Transport direkt in kultivierten Neuronen auf einer Zeitskala von Sekunden oder Minuten und mit Submikrometer räumlicher Auflösung abzubilden, was einen viel größeren Einblick in den Mechanismus der Bewegung3ermöglichte. Diese Studien haben gezeigt, dass Neurofilamentpolymere in Axonen sich sowohl in anterograde als auch in retrograde Richtungen entlang von Mikrotubulispuren, angetrieben von mikrotubule motorischen Proteinen, schnell und intermittierend bewegen. Neurofilamente sind jedoch beugungsbegrenzte Strukturen mit einem Durchmesser von nur 10 nm, die in der Regel nur um zig Nanometer von ihren Nachbarn entfernt sind; Daher können die Polymere nur in kultivierten Neuronen verfolgt werden, die dünn verteilte Neurofilamente enthalten, so dass die beweglichen Polymere von ihren Nachbarn gelöst werden können4. Daher ist es derzeit nicht möglich, einzelne Neurofilamente in Axonen zu verfolgen, die reichlich Neurofilamentpolymere enthalten, wie z. B. myelinierte Axone.
Um den axonalen Transport von Neurofilamenten in neurofilamentreichen Axonen mittels Fluoreszenzmikroskopie zu analysieren, verwenden wir eine fluoreszenz-Photoaktivierungs-Puls-Escape-Methode, die wir entwickelt haben, um das langfristige Pausungsverhalten von Neurofilamenten in kultivierten Nervenzellen4,5zu untersuchen. Neurofilamente, die mit einem photoaktivierbaren fluoreszierenden Neurofilament-Fusionsprotein markiert sind, werden in einem kurzen Segment von Axon aktiviert, und dann wird die Abflugrate dieser Filamente aus der aktivierten Region durch Messung des Fluoreszenzzerfalls im Laufe der Zeit quantifiziert. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es sich um eine Populations-Level-Analyse des Neurofilamenttransports handelt, die auf einer Zeitskala von Minuten oder Stunden angewendet werden kann, ohne die Bewegung einzelner Neurofilamentpolymere verfolgen zu müssen. Zum Beispiel haben wir diese Methode verwendet, um die Kinetik des Neurofilamenttransports in myelinierenden Kulturen zu analysieren6.
Kürzlich beschrieben wir die Entwicklung einer hThy1-paGFP-NFM transgenen Maus, die niedrige Konzentrationen eines paGFP-markierten Neurofilament-Proteins M (paGFP-NFM) in Neuronen unter der Kontrolle des menschlichen neuronspezifischen Thy1-Promotors7ausdrückt. Diese Maus ermöglicht die Analyse des Neurofilamenttransports in situ mittels Fluoreszenzmikroskopie. In diesem Artikel beschreiben wir die experimentellen Ansätze zur Analyse des Neurofilamenttransports in myelinierten Axonen von tibiaellen Nerven von diesen Mäusen mit zwei Ansätzen. Der erste dieser Ansätze ist die oben beschriebene Puls-Escape-Methode. Diese Methode kann Informationen über das Pausungsverhalten der Neurofilamente generieren, ist aber blind für die Richtung, in der die Filamente den aktivierten Bereich abfahren, und erlaubt daher keine Messung der Nettorichtung und Transportgeschwindigkeit8. Der zweite dieser Ansätze ist eine neue Puls-Spread-Methode, bei der wir nicht nur den Verlust der Fluoreszenz aus der aktivierten Region analysieren, sondern auch die vorübergehende Zunahme der Fluoreszenz in zwei flankierenden Fenstern, durch die sich die fluoreszierenden Filamente bewegen, während sie den aktivierten Bereich sowohl anterograde als auch retrograde Richtungen ablassen. In beiden Ansätzen können Parameter des Neurofilamenttransports wie Durchschnittsgeschwindigkeit, Nettorichtungund Pausierungsverhalten durch mathematische Analyse und Modellierung der Fluoreszenzveränderungen in den Messfenstern ermittelt werden. Abbildung 3 zeigt diese beiden Ansätze.
Dieses Protokoll demonstriert die Zerlegung und Vorbereitung des Nervs, Aktivierung und Bildgebung der paGFP Fluoreszenz, und Quantifizierung des Neurofilament-Transports aus den erfassten Bildern mit dem FIJI-Verteilungspaket von ImageJ9. Wir verwenden den Tibianerv, weil er lang ist (mehrere cm) und nicht verzweigt; Grundsätzlich ist jedoch jeder Nervenausdruck paGFP-NFM für die Verwendung mit dieser Technik geeignet, wenn es seziert und entmantelt werden kann, ohne die Axone zu beschädigen.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Ohio State University genehmigt.
1. Vorbereitung der Nervensalinelösung
- Machen Sie 100 ml Breuer-Salzlinie10: 98 mM NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 1,5 mM CaCl2, 5,6% D-Glucose, 23,8 mM NaHCO3 in doppelt destilliertem Wasser.
- Blase 95% Sauerstoff/5% Kohlendioxid (Carbogen) durch die Saline-Lösung für mindestens 30 Minuten vor der Verwendung. Rest-Saline kann innerhalb einer Woche wiederverwendet werden; es muss jedoch vor jedem Gebrauch reoxygeniert werden.
- Gießen Sie sauerstoffhaltige Saline in eine 60 ml Spritze und stellen Sie sicher, dass nur noch wenig Luft in der Spritze vorhanden ist.
2. Erstmontage der Nervenperfusionskammer
- Schließen Sie die Spritze und den Schlauch wie in Abbildung 1Adargestellt an und legen Sie das Abflussrohr in einen Abfallkolben.
- Legen Sie die äußere Dichtung in das Perfusionskammergehäuse, um sicherzustellen, dass die Ein- und Auslasspfosten mit den Löchern in der Dichtung ausgerichtet sind.
- Legen Sie die Innendichtung (Silikon, 100 m dick) auf einen #1,5 kreisförmigen Deckelschlupf (40 mm Durchmesser) und glätten Sie sorgfältig alle Falten in der Dichtung, um eine enge Abdichtung zu gewährleisten. Um die spätere Montage zu erleichtern, legen Sie den Deckel und die Dichtung auf ein Papiertuch oder das Aufgabentuch mit nach oben gerichteter Dichtung.
3. Dissektion und Vorbereitung des Maus-Tibialnervs
- Opfern Sie das Tier durch Kohlendioxid-Inhalation oder eine andere institutionell zugelassene Methode. Starten Sie einen Timer, wenn das Tier die Bewegung/Atmung einstellt, da Experimente nur innerhalb von 3 Stunden nach Opfer7durchgeführt werden dürfen.
- Sprühen Sie das Fell mit 70% Ethanol und entfernen Sie so viel wie möglich von den Beinen und Rücken des Tieres mit einem elektrischen Rasiermesser.
- Mit einer großen Sezierschere, machen Sie einen dorsalen Schnitt in der Haut in der Nähe der Mitte der Wirbelsäule und setzen Sie den Schnitt um den ventralen Aspekt des Tieres fort. Ausgehend von diesem Schnitt, reflektieren Sie langsam die Haut von den Beinen, indem Sie sie sanft vom Muskel wegziehen und die Faszien schneiden.
- Legen Sie das Tier in eine Supine-Position auf eine Sezierschale und heften Sie alle vier Pfoten an. Optional den Schwanz festanheften, um die Bewegung weiter zu reduzieren.
- Mit MikrodissektionSchere, machen einen Schnitt in den Oberschenkelmuskeln auf halbem Weg zwischen Dem Schwanz und Knie, um den Ischiasnerv auszusetzen. Stellen Sie sicher, dass der Nerv, der durch den Muskel sichtbar ist, nicht geschnitten wird.
- Erweitern Sie den Schnitt dorsal und ventral, um den Muskel zu entfernen. In ähnlicher Weise entfernen Sie die Muskeln der Wade, halten Schnitte flach und kurz, um schäden Nerven zu vermeiden.
- Entfernen Sie Muskeln, bis der Tibianerv vollständig von dem Punkt ausgesetzt ist, an dem er vom Ischiasnerv (am Knie) bis zur Ferse zweigt (Abbildung 2A).
HINWEIS: Vermeiden Sie in allen Schritten einschließlich und nach der Zerlegung des Tibianervs eine unnötige Exposition gegenüber Umgebungslicht, um eine mögliche zufällige Aktivierung von paGFP im Nerv zu minimieren. - Greifen Sie den Tibianerv am rücken-proximalen Ende mit einer Zange und schneiden Sie den Nerv mit einer Mikrodissektionsschere. Achten Sie darauf, keine Spannung auf den Nerv zu setzen, heben Sie es weg von den Muskeln, schneiden Sie alle Befestigungen.
- Schneiden Sie das rückendistale Ende des Tibianervs und übertragen Sie auf eine kleine Petrischale mit Raumtemperatur sauerstoffhaltiger Saline. Von diesem Punkt an in der Prozedur, immer sicher sein, den Überblick über die proximalen und distalen Enden des Nervs zu halten.
HINWEIS: Eine Möglichkeit, dies zu tun, ist das distale Ende des Nervs mit einem abgewinkelten Schnitt zu markieren, so dass die Verjüngung sichtbar ist. - Ausgehend vom proximalen Ende des Nervs, greifen Sie vorsichtig die exponierten Axonenenden mit einem Paar sehr feinspitzen Zangen.
- Mit einem zweiten Zangenpaar die Nervenhülle proximal greifen und langsam zum distalen Ende des Nervs ziehen. Die Nervenscheide gleitet mit minimalem Widerstand entlang der Axone. Stellen Sie sicher, dass während dieses Prozesses keine übermäßige Spannung auf den Nerv angewendet wird.
4. Endnervenperfusionskammer-Montage
- Das proximale Ende des Nervs erfassen, aus der Formlinlinie entfernen und langsam auf den Deckelrutsch der Perfusionskammer innerhalb der rechteckigen Öffnung der inneren Dichtung legen, wobei eine sanfte Spannung des Nervs beibehalten wird, während Sie ihn so hinlegen, dass er gerade liegt.
- Platzieren Sie das Mikroaquedukt-Dia über den Nerv mit der gerillten Seite zum Nerv und der Strömungsrichtung parallel zum Nerv. Drehen Sie die Deckelrutsch- und Mikroaquädukt-Baugruppe um und legen Sie sie in das Perfusionskammergehäuse mit dem Mikroaqueduktschlitten, der auf die äußere Dichtung aufgebracht ist. Die Nerven- und umgebende Innendichtung wird nun zwischen dem Deckelrutsch und dem Mikroaqueduktschlitten eingeklemmt, die durch die Dichtung getrennt sind, wobei der Deckelnachoben(Abbildung 1B) nach oben gerichtet ist ( Abbildung 1B ).
- Sichern Sie die Perfusionskammer, indem Sie sie in das Metallgehäuse legen und den Verriegelungsring drehen. Stellen Sie sicher, dass sich das Kunststoffgehäuse vollständig unter allen Metallklammern befindet, und ziehen Sie es gut an, um ein Wasserhautleck zu vermeiden. Eine Überspannung kann den Mikroaqueduktschlitten oder den Deckelrutsch knacken. Drehen Sie die Kammer um, so dass der Deckelschlupf nach unten gerichtet ist.
- Drücken Sie den Salinespritzenkolben langsam, um die Perfusionskammer zu füllen. Halten Sie den Ein- und Auslassschlauch, den Auslasskolben und die Spritze während des Aufbaus und der Bildgebung jederzeit über der Kammer selbst erhöht. Dadurch wird ein Absiphoning vermieden, das Blasen auslösen oder aufgrund des Unterdrucks in der Kammer zu Fokusinstabilität führen kann.
- Übertragen Sie die Perfusionsbaugruppe auf eine invertierte Mikroskopstufe und montieren Sie die Salinespritze in die Spritzenpumpe. Starten Sie den Motor mit einer entsprechenden Drehzahl bei einer Durchflussrate von 0,25 ml/min. Dann verbinden und schalten Sie die Inline-Lösungsheizung auf 37 °C eingestellt.
- Schließen Sie die Objektivheizung an und stellen Sie sie auf 37 °C ein, tragen Sie Öl auf das Objektiv auf und legen Sie die Perfusionskammer in die Stufenhalterung ein.
- Öl auf das Kammerheizpad auftragen und an der Perfusionskammer befestigen. Schließen Sie die Kammerheizung an und schalten Sie sie ein; auf 37 °C eingestellt.
HINWEIS: Temperaturänderungen können dazu führen, dass sich in der Perfusionskammer Blasen bilden, da die Lösung ausgäuert wird. Wenn sich Blasen bilden, erhöhen Sie kurz die Lösungsdurchflussrate um 5-10x, bis Blasen die Kammer räumen. - Verriegeln Sie die Perfusionskammer in den Bühnenadapter und bringen Sie das Objektivöl mit dem Deckelschlupf an der Unterseite der Kammer in Kontakt.
HINWEIS: Die hier verwendete Bioptechs-Kammer mit ASI-Bühnenadapter ist für eine invertierte Mikroskopkonfiguration ausgelegt.
5. Fluoreszenzaktivierung und Bildaufnahme
- Konzentrieren Sie sich bei der Beleuchtung mit hellen Felden auf die Achselschicht auf der unteren Oberfläche des Nervs, der der Deckbedeckungsoberfläche am nächsten liegt (Abbildung 2B). Myelinierte Axone (typischerweise 1 - 6 m Im Durchmesser bei erwachsenen Mäusen) können durch das Vorhandensein eines Myelinmantels identifiziert werden, der unter hellfelddurchlässiger Lichtbeleuchtung ohne Kontrastverbesserung sichtbar ist. Schmidt-Lanterman Spalten und Knoten von Ranvier sind auch leicht zu erkennen. Unmyelinierte Axone sind schlanker (typischerweise <1 m Durchmesser) und sind in der Regel in Bündeln (Remak-Bundles) vorhanden, wo sie in der Regel zu eng aufeinander abgewogen werden.
- Wenn auf dem Mikroskop verfügbar ist, aktivieren Sie das Autofokus-System, um den Fokus während der Zeitraffer-Bildgebung zu erhalten.
- Erfassen Sie ein hellfeld-Referenzbild. Zeichnen Sie die Ausrichtung des Nervs (spine-proximale und distale Enden) in Bezug auf Bilder auf.
- Erfassen Sie ein konfokales Bild mit einem 488 nm Laser und einem emissionsfilter, der für paGFP geeignet ist (z. B. 525/50 nm), um die Vorbleichautofluoreszenz aufzuzeichnen. Halten Sie die Laserleistung niedrig, um Photobleichungen zu minimieren, wobei die Belichtungszeit entsprechend angepasst wird, um das schwache Signal zu erkennen. So wurden beispielsweise repräsentative Daten mit einer Laserleistung von 5 % und einer Belichtung von 4 s ermittelt. Zeichnen Sie die Erfassungseinstellungen für alle zukünftigen Experimente auf.
HINWEIS: Nach der Photoaktivierung erzeugen die idealen Bildeinstellungen ein Signal-Rausch-Verhältnis > 8 und Photobleichung von weniger als 25 % des ursprünglichen Signals im Laufe von 20 Bildern. Die Axone können auch durch Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskopie abgebildet werden, wie wir es ursprünglich7taten, aber die Bildqualität wird aufgrund mangelnder Konfokalität schlechter sein. - Stellen Sie die Laserleistung auf etwa das 5-fache der normalen Bildleistung ein und erfassen Sie ein Bild mit einer Belichtungszeit von 3-4 Minuten. Obwohl dieser Schritt nicht unbedingt erforderlich ist, wird empfohlen, Autofluoreszenz und andere Quellen unerwünschter Fluoreszenz zu bleichen, um das Hintergrundsignal zu reduzieren und so das Signal-zu-Rauschen der photoaktivierten Fluoreszenz zu maximieren.
- Erfassen Sie ein Bild mit den in Schritt 5.4 verwendeten Einstellungen, um die Autofluoreszenz vor der Aktivierung nach diesem Bleichschritt aufzuzeichnen.
- Zeichnen Sie auf dem Hellfeldbild eine Linie parallel zu den Axonen mit einer Länge, die der gewünschten Aktivierungsfenstergröße entspricht. Die Länge dieses Fensters variiert je nach dem experimentellen Ziel und den Parametern, aber die typischen Längen sind 5 'm für das Puls-Escape-Paradigma und 40 'm für das Puls-Spread-Paradigma.
- Zeichnen Sie diese Linie als Leitfaden, indem Sie einen rechteckigen Bereich von Interesse (ROI) über das Sichtfeld ziehen, das senkrecht zu den Axonen liegt. Die Region muss alle Axone umfassen, die fotoaktiviert werden sollen.
- Bestimmen Sie optimale Einstellungen für die Photoaktivierung mit 405 nm Beleuchtung.
HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt und diese Unterschritte nur vor der ersten experimentellen Aktivierung aus. Im Laufe eines Experiments müssen die gleichen Fotoaktivierungseinstellungen verwendet werden.- Aktivieren Sie wiederholt einen Bereich von Interesse mit der 405 nm Laserlinie, geringer Laserleistung (z. B. 5%) und Pixelverweilzeit (z. B. 40 s) und einem Impuls, um nach jeder Aktivierung ein Bild der aktivierten GFP-Fluoreszenz zu erhalten. Wiederholen Sie dies, bis die Fluoreszenz nicht mehr zunimmt, und quantifizieren Sie dann die Fluoreszenz in einer Region, die für jedes Bild von Interesse ist.
- Zeichnen Sie die durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten im Vergleich zur Pulszahl. Wählen Sie die Anzahl der Impulse aus, nach denen die Fluoreszenz nicht mehr steigt, da die optimale Anzahl von Impulsen für die Aktivierung ist.
- Aktivieren Sie die paGFP-Fluoreszenz der region, die in Schritt 5.8 durch gemusterte Anregung mit 405 nm Licht gezeichnet wird. Stellen Sie sicher, dass ein Bild kurz vor und kurz nach der Aktivierung aufgenommen wird.
HINWEIS: Die ideale paGFP-Aktivierung erzeugt einen klar definierten Fluoreszenzbereich mit scharfen Grenzen, die im ROI enthalten sind. - Starten Sie einen 1-Minuten-Timer, wenn die Aktivierung abgeschlossen ist. Am Ende von 1 Minute beginnen Sie mit der Erfassung einer Zeitrafferserie.
HINWEIS: Die 1 Minute Verzögerung ist notwendig, um die Erhöhung der Fluoreszenz zu ermöglichen, die nach der Photoaktivierung von paGFP11beobachtet wird. Für die Puls-Spread-Methode reicht eine Erfassungsdauer von 5-10 Minuten mit 30 Sekunden Zeitrafferintervallen aus, um die Anfangsneigungen in den Mittel- und Flankenfenstern zu messen, um Geschwindigkeit und Richtungsweise zu messen. Für die Puls-Escape-Methode ermöglicht eine Erfassungsdauer von 30-150 Minuten mit 5 oder 10 Minuten Zeitrafferintervallen die Analyse des langzeitpausigen Verhaltens der Filamente - Speichern Sie alle aufgenommenen Bilder sowie den ROI, der für die Fluoreszenzaktivierung verwendet wird.
- Wechseln Sie zu einer neuen Region des Nervs und wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.11. Wenn sich die neue Region entlang desselben Axons befindet, muss sie mindestens 500 m von der zuvor aktivierten Region entfernt sein, um den Nachweis von fluoreszierenden Neurofilamenten zu vermeiden, die sich aus der anderen aktivierten Region entfernt haben. Die Erfassung des letzten Zeitraffers muss vor dem Ende des 3-Stunden-Fensters abgeschlossen sein.
HINWEIS: Es ist möglich, dass die Zubereitung länger als 3 Stunden lebensfähig ist, aber wir haben das nicht bestätigt. Mit kompetenter Sezierung und Vorbereitung können innerhalb dieses 3-Stunden-Fensters zwischen fünf und acht 10-minuten-Zeitraffer-Bildsätze erfasst werden. - Nach dem Erwerb der letzten Zeitraffer-Bildserie stoppen Sie den Fluss der Saline, trennen Sie die Lösung und die Kammerheizungen und entfernen Sie das Perfusionsgerät aus der Mikroskopstufe.
6. Flatfield- und Dunkelfeld-Bildaufnahme
- Machen Sie eine Lösung von Fluorescein, indem Sie 250 mg Fluoresceinpulver zu 0,5 ml doppelt destilliertem Wasser hinzufügen. Mischen Sie, bis keine sichtbaren Partikel vorhanden sind, und drehen Sie die Lösung 30 Sekunden lang in einer Tischzentrifuge, um ungelöstes Material zu sedimentieren. Diese Lösung kann bei Lichteinwirkung für mehrere Monate bei 4 °C gelagert werden.
- Fügen Sie 8 l Fluorescein-Lösung zu einem Dia hinzu und tragen Sie einen #1.5-Abdeckungsfolie auf. Überschüssige Flüssigkeit ablassen, mit Nagellack abdichten und trocknen lassen.
HINWEIS: Bei dieser hohen Konzentration löscht die starke Absorption des Fluoresceinfarbstoffs den leuchtenden Strahl innerhalb der Lösung aus und erzeugt eine dünne Fluoreszenzebene an der Oberfläche des Abdeckschlupfes, die gleichmäßig und resistent gegen Photobleichungen durch schnellen diffusiven Austausch12ist. - Legen Sie den Fluorescein-Schiebedeckel seitlich nach unten auf die invertierte Mikroskopstufe und passen Sie den Fokus auf die dünne Fluoreszenzebene an der Oberfläche des Coverslips an. Bewegen Sie sich auf der Folie, um ein Sichtfeld zu finden, das keine Luftblasen (dunkle Flecken) oder große Fluoresceinpartikel (helle Flecken) enthält.
- Erfassen Sie einen Z-Stack, der sich in 0,2 m Intervallen über 6 m erstreckt, sodass das mittlere Bild die ursprüngliche Fokusebene ist. Verwenden Sie eine kurze Belichtungszeit (z. B. 40 ms), da die Fluoreszenz sehr hell ist. Diese Z-Stack-Erfassung ist notwendig, um die maximale Fluoreszenz über das Sichtfeld zu erfassen, da der Deckschrutsch selten perfekt horizontal ist und die Fluoreszenzebene sehr schmal ist. Wiederholen Sie dies für insgesamt 25 Sichtfelder, indem Sie die Bühne um mindestens 20 m in eine beliebige Richtung zwischen den Feldern verschieben.
- Schließen Sie alle Lichtwegläden, einschließlich des Kameraverschlusses, und stellen Sie die Laserleistung und die Belichtungszeit auf Null ein. Erfassen Sie einen Stapel von 100 Bildern mit diesen Einstellungen. Diese Bilder werden gemittelt, um das Dunkelfeldbild zu erzeugen, das verwendet wird, um für dunklen Strom und den Vorspannungsversatz auf dem Kamerachip zu korrigieren.
HINWEIS: Die Streaming-Erfassung ist eine ideale Möglichkeit, diese Bilder zu erfassen.
7. Bildgärlykolytisch gehemmte Nerven zur Bleichkorrektur
- Machen und sauerstoffhaltige eine Saline-Lösung wie in Schritt 1; jedoch 2-Deoxy-D-Glucose für D-Glucose ersetzen und 0,5 mM Natriumjodoacetat hinzufügen, um die Glykolyse zu hemmen13. Wir bezeichnen dies als "hemmende Saline".
- Wiederholen Sie die Schritte 2-5 mit der hemmenden Saline, wobei ein 10-30-minütiges Zeitrafferbild in Schritt 5.11 eingestellt ist. Erlauben Sie 40-50 Minuten nach der Anwendung von hemmender Saline vor der Bildgebung, um eine vollständige Hemmung des Neurofilamenttransports zu gewährleisten.
HINWEIS: Die glykolytische Hemmung wird schließlich die Axone töten, so dass es ein enges Zeitfenster nach der Hemmung gibt, in dem Daten erfasst werden können, in der Regel etwa 30 Minuten. Ein Indikator für den Grad der metabolischen Hemmung ist die Flavin-Autofluoreszenz der axonalen Mitochondrien, die in der Zeitrafferserie aufgrund der langen Belichtungen, die wir verwenden, um die paGFP Fluoreszenz14abzubilden, nachgewiesen werden können. Typischerweise, mitochondriale Autofluoreszenz wird während der Behandlung mit hemmender Saline erhöhen. Wenn die Mitochondrien beginnen, sich aufzurunden oder zu fragmentieren, dann beenden Sie die Bildgebung.
8. Bildverarbeitung und -analyse mit ImageJ
- Flatfield- und Dunkelfeldkorrektur
- Öffnen Sie den Dunkelfeld-Bildstapel, und durchschnittlich die Bilder, indem Sie auf Bild | Stapel | Z Projekt und Auswahl der durchschnittlichen Intensität im Dropdown-Menü, um das Dunkelfeldbild zu generieren.
- Öffnen Sie die Fluorescein-Flachfeld-Bildstapel und erstellen Sie eine maximale Intensitätsprojektion von jedem (insgesamt 25), indem Sie auf Bild | Stapel | Z Projekt und Auswahl max Intensity im Dropdown-Menü.
- Kombinieren Sie die resultierenden 25 maximalen Projektionsbilder in einem Stapel, indem Sie auf Bild | Stapel | Bilder zu Stack. Erstellen Sie eine durchschnittliche Intensitätsprojektion dieses Stapels, indem Sie auf Bild | Stapel | Z Projekt und Auswahl der durchschnittlichen Intensität aus dem Dropdown-Menü, um das Flachfeldbildzu generieren.
- Subtrahieren Sie das Dunkelfeldbild vom Flachfeldbild, indem Sie auf Prozess | Bildrechner, und wählen Subtrahier als Vorgang aus. Stellen Sie sicher, dass die 32-Bit-Ergebnisoption (Float) aktiviert ist. Das Ergebnis ist das korrigierte Flachfeldbild.
- Messen Sie die durchschnittliche Pixelintensität des korrigierten Flachfeldbildes, indem Sie zuerst auf Analysieren | Legen Sie Die Messungen fest, und aktivieren Sie das Kästchen Mittlerer Grauwert, und drücken Sie dann die Taste "m".
- Dividieren Sie das korrigierte Flachfeldbild durch seine durchschnittliche Intensität, indem Sie auf Prozess | Mathe | Dividieren und Eingeben des durchschnittlichen Grauwertes in Schritt 7.1.5. Dadurch wird das inverse Gain-Bild erzeugt.
- Öffnen Sie die Vor- und Nachaktivierungsbilder zusammen mit dem Zeitraffer-Image-Stack. Kombinieren Sie die Bilder in einem einzigen Stapel, indem Sie auf Bild | Stapel | Werkzeuge | Verketten ,und wählen Sie die Bilder in chronologischer Reihenfolge aus den Dropdown-Menüs aus. Stellen Sie sicher, dass die Option Als 4D-Bild öffnen nicht ausgewählt ist. Der resultierende Stapel ist der vollständige Bildsatz.
- Wiederholen Sie Schritt 8.1.4 im vollständigen Bildsatz, und dividieren Sie das Ergebnis durch das inverse Gain-Bild, indem Sie auf Prozess | Bildrechner und wählen Sie Divide als Vorgang aus. Dadurch wird der korrigierte vollständige Bildsatzerzeugt, in dem jedes Bild für die Ungleichmäßigkeit im Bereich der Beleuchtung und auf dem Detektor korrigiert wurde.
- Image-Stack-Ausrichtung
- Um die Fehlausrichtung der Bildebenen in der Zeitrafferserie aufgrund von Stufen- oder Beispieldrift zu korrigieren, installieren Sie das Alignment by fixed region plugin (Supplemental File 1) durch Klicken auf Plugins | Installieren Sie PlugIn, navigieren Sie zu dem Ordner, der die Plugin-Datei enthält, und wählen Sie das Plugin aus. Starten Sie ImageJ nach der Installation des Plugins neu.
HINWEIS: Dieses Plugin richtet Bilder basierend auf dem "Least Squares congealing" Prinzip15aus. - Zeichnen Sie einen ROI auf dem korrigierten vollständigen Bildsatz, der mehrere Axone umfasst und nicht über die proximalen und distalen Grenzen der aktivierten Fluoreszenz innerhalb jedes der Axone hinausgeht. Die Geometrie des Bereichs ist unwichtig, jedoch wird die Ausrichtung von Bereichen, in denen Strukturen Form oder Größe ändern, nicht ausgeschlossen.
- Führen Sie das Ausrichtungs-Plugin aus, indem Sie auf Plugins | Ausrichtung nach festem Bereich. Das Plugin platziert ein standardmäßiges 2-Pixel-Maximum auf der Verschiebung zwischen Frames, dies kann jedoch im ersten Pop-up-Fenster angepasst werden, wenn es eine signifikante Drift der Probe gibt. Die Ausrichtung kann je nach Größe des Bildstapels mehrere Minuten dauern.
- Überprüfen Sie den ausgerichteten Stapel visuell, um die Qualität der Ausrichtung zu bewerten. Einige Frames müssen dann möglicherweise manuell ausgerichtet werden, da die automatisierte Ausrichtung bei großen Fluoreszenzschwankungen zwischen Frames möglicherweise nicht gut funktioniert. Dies kann beim Anzeigen eines Frames erreicht werden, der durch Klicken auf Bild | verschoben werden muss. Transformieren | Übersetze. Klicken Sie im folgenden Pop-up auf Nein und fragen Sie, ob der gesamte Stapel übersetzt werden soll. Verwenden Sie nur ganzzahlige Pixelwerte in der Übersetzung, und stellen Sie sicher, dass das Menü für die Dropdown-Interpolation auf Keinefestgelegt ist, da bruchstückhafte Pixelverschiebungen oder Interpolationen die Daten aufgrund des Resamplings der Pixelintensitäten ändern.
- Speichern Sie dies als ausgerichteter vollständiger Bildsatz.
- Um die Fehlausrichtung der Bildebenen in der Zeitrafferserie aufgrund von Stufen- oder Beispieldrift zu korrigieren, installieren Sie das Alignment by fixed region plugin (Supplemental File 1) durch Klicken auf Plugins | Installieren Sie PlugIn, navigieren Sie zu dem Ordner, der die Plugin-Datei enthält, und wählen Sie das Plugin aus. Starten Sie ImageJ nach der Installation des Plugins neu.
- Messung der Fluoreszenzintensitäten
- Zeichnen Sie einen ROI mit dem Winkelwerkzeug auf dem ersten Frame des ausgerichteten vollständigen Bildsatzes mit dem ersten Arm entlang einer Kante des aktivierten Bereichs, senkrecht zu den Axonen und dem zweiten Arm vertikal. Drücken Sie die "m"-Taste, um den Winkel zu messen, der die Ausrichtung der Axone im Sichtfeld beschreibt.
- Legen Sie den Maßstab der Bilder so fest, dass Die Abmessungen in Mikrometern gemessen werden, indem Sie auf Analysieren | Legen Sie Skalierung fest, und geben Sie die entsprechenden Werte ein.
- Öffnen Sie den ROI-Manager, indem Sie auf Analysieren | Werkzeuge | ROI Manager. Um das Puls-Escape-Paradigma zu suchen, fahren Sie mit Schritt 8.3.7 fort. Für den Puls-Spread Schritt 8.3.4 fortsetzen.
- Zeichnen Sie einen quadratischen ROI beliebiger Dimensionen, und klicken Sie dann auf Bearbeiten | Auswahl | Angeben . Stellen Sie sicher, dass die Option Skalierte Einheiten aktiviert ist, und legen Sie dann den ROI auf eine Breite von 15 m und eine Höhe fest, die der Höhe des Bildes entspricht oder größer ist.
- Drehen Sie den ROI um den in Schritt 8.3.1 gemessenen Winkel, indem Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Drehen Sie, um es senkrecht zu den Axonen zu machen, und platzieren Sie den ROI mit einer Seite entlang der proximalen Kante des aktivierten Bereichs. Fügen Sie diesen ROI, den wir als proximalen Guide ROI bezeichnen, dem Manager hinzu, indem Sie die Taste "t" drücken.
- Ziehen Sie den ROI, um ihn an der distalen Kante der aktivierten Region auszurichten, und fügen Sie den ROI-Manager erneut hinzu, indem Sie die Taste "t" drücken. Wir werden dies als den distalen Führer ROI bezeichnen. Die proximalen und distalen Führungs-ROIs werden später verwendet, um die flankierenden Mess-ROIs zu zeichnen.
- Wählen Sie Axone für die Quantifizierung aus, indem Sie die in Schritt 5.11 oben erfasste Zeitrafferbildsequenz verwenden. Diese Bildsequenz ist für diesen Zweck hilfreich, da sie die schwache Autofluoreszenz der Axone erfasst und ihre Morphologie außerhalb der aktivierten Region enthüllt.
HINWEIS: Axone, die die folgenden Kriterien nicht erfüllen, sind von der Analyse ausgeschlossen:- Axone müssen über die gesamte Länge aller Messfenster im Fokus stehen.
- Axone müssen innerhalb von 5° senkrecht zu den proximalen und distalen Enden des Aktivierungsbereichs liegen.
- Axone dürfen keine Invaginationen innerhalb von 5 m von den proximalen und distalen Enden des Aktivierungsbereichs haben.
- Axone ausschließen, die sich während der Bildgebung sichtbar verändern.
- Axone ausschließen, die ungesund erscheinen, wie das Fehlen einer diskreten aktivierten Region im Bild nach der Aktivierung zeigt(Abbildung 2C, unten), da dies auf eine diffusive Dispersion der aktivierten Fluoreszenz hindeutet, die auftritt, wenn das Axon stirbt.
- Beobachten Sie das Langbelichtungsbleichbild ab Schritt 5.5 für autofluoreszierende Strukturen innerhalb von Axonen. Diese Fluoreszenz ist auf Flavinen innerhalb von Mitochondrien16zurückzuführen. Axone aus der Analyse ausschließen, wenn diese Mitochondrien gerundet oder fragmentiert erscheinen (Abbildung 2D, unten), im Gegensatz zu erweiterten, linearen Strukturen (Abbildung 2D, oben), da dies ein Hinweis auf den metabolischen Rückgang ist.
- Zeichnen Sie anhand der oben erstellten proximalen und distalen Führungs-ROIs drei MessROIs pro analysiertem Axon: ein zentrales Fenster, das das Axon innerhalb des aktivierten Bereichs von 40 m umfasst, und zwei flankierende Fenster mit einer Breite, die durch ein flankierendes Fenster von 15 m ROIs eingeschränkt ist, und eine Höhe, die durch den Durchmesser des Axons am Rand des Aktivierungsbereichs begrenzt ist. Fügen Sie alle drei Regionen zum ROI-Manager hinzu. Zeichnen Sie bei glykolytisch gehemmten Axonen einen einzelnen Bereich, der nicht mehr als 5 m breit ist, in der Mitte des aktivierten Bereichs und der sich nicht außerhalb des Axons erstreckt. Für das Puls-Escape-Paradigma ist der aktivierte Bereich nur 5 m breit, so dass das gesamte Fenster verwendet werden muss.
- Wiederholen Sie Schritt 8.3.9 für alle Axone, die die Kriterien der Schritte 8.3.7 und 8.3.8 erfüllen.
- Festlegen aktiver Messungen auf die durchschnittliche Pixelintensität, indem Sie auf Analysieren | Legen Sie Messungen fest, und wählen Sie die Option Mittlerer Grauwert aus. Stellen Sie sicher, dass keine anderen Messoptionen überprüft werden.
- Wählen Sie alle ROIs im ROI-Manager-Fenster aus, indem Sie das Fenster auswählen und 'Strg' + 'a' drücken. Klicken Sie im Fenster ROI-Manager auf Mehr | Multi-Messung zur Messung der Fluoreszenzintensitäten. Kopieren Sie die Daten aus dem Ergebnisfenster zur weiteren Analyse in eine Kalkulationstabelle.
- Festlegen aktiver Messungen auf Regionsbereich, indem Sie auf Analysieren | Legen Sie Die Messungen fest, und wählen Sie die Option Bereich aus. Stellen Sie sicher, dass keine anderen Messoptionen überprüft werden.
- Wiederholen Sie Schritt 8.3.12. Es ist nur notwendig, eine Zeile der Ergebnisse für den Bereich zu kopieren, da der Bereich nicht mit der Zeit variiert.
9. Photoblebleiche-Korrektur
- Subtrahieren Sie in der Datentabelle für glykolytisch gehemmte Axone die mittlere Fluoreszenz von Frame 1 (dem Voraktivierungsrahmen) von der mittleren Fluoreszenz jedes Frames ab Frame 3 (dem ersten Zeitrafferrahmen) für einen gegebenen ROI. Die Ergebnisse sind die hintergrundsubtrahierten Mittelwerte.
- Zeichnen Sie die Daten als Streudiagramm mit den Framenummern als Abszisse. Passen Sie eine exponentielle Trendlinie an die Daten aus jedem ROI (die meisten Tabellenkalkulationsprogramme haben diese Funktion) mit einer Gleichung in Form von Ae-bxan. Diese Gleichung entspricht der Photobleichfunktion Ft = F0 * e-tɣ wobei F0 die Fluoreszenz beim ersten Frame des Zeitraffers ist, ɣ die exponentielle Bleichrate ist, t die Zeit und e die natürliche Logarithmusbasis ist.
- Wiederholen Sie die Schritte 9.1.1-9.1.2 für alle ROIs aller Axone aus den glykolytisch gehemmten Nerven. Für die genaueste Schätzung der Photobleichrate verwenden Sie insgesamt mindestens 15 Axone von mindestens 5 separaten Nerven. Verwenden Sie den Durchschnitt der exponentiellen Bleichraten (ɣ) aller gehemmten Axone, um die experimentellen Daten für photobleaching zu korrigieren. Für jedes Experiment oder jede Studie muss eine neue Bleichkalibrierung durchgeführt werden, da das Photobleichen von den Bildaufnahmeeinstellungen und der Laserleistung abhängt, die sich im Laufe der Zeit ändern kann.
- Wiederholen Sie Schritt 9.1.1 für alle Achsenbereiche, die mit normaler Kochung dargestellt sind (d. h. nicht glykolytisch gehemmt).
- Teilen Sie jeden Datenpunkt durche-tɣ, wobei die Zeit für t und die durchschnittliche ɣ in Schritt 9.1.3 verwendet werden. Dies sind die photobleichkorrigierten Mittel.
- Multiplizieren Sie jeden Datenpunkt mit dem Gebiet für diese Interessenregion, um die gesamtfluoreszenzierte Fluoreszenz in dieser Region zu jeder Zeit zu ermitteln.
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Representative Results
Abbildung 3 zeigt repräsentative Bilder von Puls-Escape- und Puls-Spread-Experimenten. Wir haben mehrere Studien veröffentlicht, die Daten beschreiben, die mit der Puls-Escape-Methode und unseren Methoden zur Analyse dieserDaten5,6,7,8,17. Im Folgenden zeigen wir, wie die Puls-Spread-Daten Informationen über die Richtung und Geschwindigkeit des Neurofilamenttransports liefern können, die wir zuvor nicht berichtet haben.
Der Neurofilamenttransport im Axon ist intermittierend und bidirektional. Dieser Transport kann durch den Anteil der Filamente beschrieben werden, die sich zu einem bestimmten Zeitpunkt in anterograde und retrograde Richtungen bewegen, 
bzw. und ihre Geschwindigkeiten in anterograde und retrograde Richtungen, bezeichnet durch 
und 
. Nimmt man die Gesamtmenge des Neurofilamentpolymers pro Längeneinheit des Axons, so werden 
die Flussmittel in anterograde und retrograde Richtungen durch eine bestimmte Region durch
Und
,
und der Gesamtfluss 
wird durch
,
wo 
hat Einheiten-1, 
hat Einheiten und hat Einheiten 
. Da der Fluss an einer bestimmten Stelle entlang des Axons die Menge an Neurofilamentpolymer ist, die sich in einer Zeiteinheit an dieser Stelle vorbeibewegt, ist sie mit der durchschnittlichen Geschwindigkeit 
durch 
verbunden. So können wir
.
In einem Puls-Spread-Experiment kann der Fluss flussweise aus der Abflugrate der fluoreszierenden Neurofilamente aus dem aktivierten Bereich bestimmt werden, die wir als zentrales Fenster bezeichnen. Der Gesamtverlust von fluoreszierendem Neurofilamentpolymer aus diesem zentralen Fenster pro Sekunde 
ist die Summe der Verluste durch fluoreszierende Neurofilamentpolymere, die in anterograde und retrograde Richtungen, d.h.
Normalisiert auf den Anfangsgehalt des fluoreszierenden Neurofilamentpolymers im zentralen Fenster, d.h. 
wo die Länge des 
Zentralfensters ist, wird diese Verlustrate
wobei 
die Steigung der Fluoreszenzabnahme im zentralen Fenster ist, die zunächst linear für einen Zeitraum ist, der durch 8 angegeben 
8wird. Bei einem 40-mm-Zentralfenster entspricht dies nur zig Sekunden. Bei Fenstern, die so groß sind, erfolgt der Übergang zur exponentiellen Zerfallsphase jedoch schrittweise und die Neigung ist effektiv für mehrere Minuten oder mehrlinear.
In frühen Zeiten erfassen die flankierenden Fenster alle Neurofilamente, die das zentrale Fenster verlassen, weil diese Filamente nicht genügend Zeit haben, um durch die flankierenden Fenster zu gehen und sie auf der anderen Seite zu verlassen. In diesem Fall werden die Mengen an fluoreszierendem Neurofilamentpolymer, die das zentrale Fenster anterograde lypgradig und retrogradely pro Sekunde verlassen, d.h. die Flussmittel 
und , durch die Erhöhung des 
Neurofilamentgehalts 
und in den 
flankierenden Fenstern angegeben. Normalisiert auf den Anfangsgehalt des fluoreszierenden Neurofilamentpolymers im zentralen Fenster werden die Steigerungsraten in den flankierenden Fenstern
wo 
und sind die Hänge der Erhöhung der 
Fluoreszenz in den proximalen bzw. distalen flankierenden Fenstern.
So können wir die durchschnittliche Geschwindigkeit in Bezug auf die Steigungen in den flankierenden Fenstern ausdrücken, d.h.
(1. Platz)
und das Verhältnis der Anzahl der anterograden und retrograd bewegten Neurofilamente in Bezug auf das Verhältnis dieser Steigungen, d.h.
(2. Platz)
wo 
und bezeichnen Sie die 
Raten, mit denen Neurofilamente von anterogradely zu retrogradely bewegen und umgekehrt8umkehren. Die Werte von 
und können durch Messung der Bewegung der einzelnen 
Neurofilamente in kultivierten Neuronen bestimmt werden, wie zuvor berichtet17. Wichtig ist, dass der Ausdruck für die Geschwindigkeit in Eq. 1 nur zu kurzen Zeiten nach der Aktivierung gilt, bei denen fluoreszierende Neurofilamente in das flankierende Fenster eindringen, aber nicht verlassen. Die Dauer dieses kurzen Zeitfensters hängt von der Länge der flankierenden Fenster und der Kinetik der Neurofilamentbewegung ab. Je länger die flankierenden Fenster, desto grundsätzlich das Zeitfenster. Theoretisch kann man testen, ob dieses Kriterium erfüllt ist, indem man bestätigt, dass
(Eq. 3)
Im Gegensatz zum Ausdruck für die Geschwindigkeit in Eq. 1, der durch den Unterschied zwischen den Hängen in den flankierenden Fenstern gegeben wird, ist der Ausdruck für die Richtung in Eq. 2 robust bis flankierende Fenstergröße, da er durch das Verhältnis der Steigungen in den flankierenden Fenstern gegeben wird.
Abbildung 3 zeigt repräsentative Ergebnisse aus Puls-Escape- und Puls-Spread-Experimenten an myelinierten Axonen im Tibianerv einer 8 Wochen alten männlichen Maus aus unserer hThy1 paGFP-NFM-Linie auf einem C57Bl/6J-Hintergrund mit Fenstergrößen von 5 bzw. 40 m. Mäuse von mindestens 2 Wochen alt, sowohl männlich als auch weiblich, wurden für diese experimentellen Paradigmen verwendet. Das angemessene Alter und Geschlecht sollte vom Forscher je nachdem bestimmt werden, was in der Studie getestet wird. Im Laufe der Zeit kann man sehen, dass die Ränder der aktivierten Regionen durch das Verlassen von Neurofilamenten sowohl in anterograde als auch in retrograde Richtung verschwimmen, was zu einem Verlust der Fluoreszenz aus dem zentralen Fenster führt.
Für die Puls-Escape-Methode (Abbildung 3A, C, E) kann die Fluoreszenzzerfallskinetik im aktivierten Bereich Informationen über das langfristige und kurzfristige Pausenverhalten8,18liefern. Für diese Experimente kann der aktivierte Bereich kurz sein (wir verwenden in der Regel 5 m; siehe gelbebox in Abbildung 3A). Für die Puls-Spread-Methode (Abbildung 3B, D, F) verwenden wir einen längeraktivierten Bereich (40 m hier; siehe gelbe Box in Abbildung 3B), um einen größeren Pool an fluoreszierenden Neurofilamenten bereitzustellen. Dies verlängert die Zeit, über die die Fluoreszenzzunahme in den flankierenden Regionen linear bleibt (siehe oben). Die lineare Domäne dieser Fluoreszenzzunahme in den flankierenden Fenstern kann auch durch vergrößerung der Länge dieser Fenster erhöht werden, wird jedoch durch die Größe des Sichtfeldes begrenzt. Für die in Abbildung 3Ddargestellten Daten verwendeten wir 15 m flankierende Fenster, die rot und grün dargestellt sind.
Abbildung 3E,3F zeigt die Quantifizierung der gesamten Fluoreszenzintensitäten (d. h. der Summe der Pixelintensitäten) für die in Abbildung 3C,3D dargestellten Messfenster. Für die Puls-Escape-Methode ist der Zerfall biphasisch, mit einem anfänglichen exponentiellen Zerfall, der die Abfahrt von On-Track-Neurofilamenten darstellt. Dieser übergeht bei etwa 10-20 Minuten zu einem zweiten langsameren exponentiellen Zerfall, der die Mobilisierung und Abfahrt von Off-Track-Filamenten8darstellt. Zum Vergleich mit der Puls-Spread-Methode zeigen wir nur einen 12-minütigen Zeitverlauf in Abbildung 3E, aber in der Regel muss der Zeitverlauf der Analyse länger sein (in der Regel 30-120 Minuten), um die langanhaltende Kinetik5,6,18zu erfassen. Für die Puls-Spread-Strategie sind die Berechnungen der Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung nur von den Steigungen in den flankierenden Fenstern abhängig. Bei den hier verwendeten Fensterlängen erstreckt sich die lineare Phase ca. 5 Minuten. Die Dauer dieses Zeitfensters der Linearität sollte bewertet werden, indem die Zeit, die für die Messung der Neigung verwendet wird, schrittweise verkürzt und der Punkt bestimmt wird, an dem die Neigung nicht mehr ansteigt. Diese Dauer kann durch Erhöhung der Fensterlängen erhöht werden, wenn das Kamerasichtfeld dies zulässt, obwohl die Fensterlängen für alle Axone in einem bestimmten Experiment konstant gehalten werden sollten. Als Beispiel haben wir die ersten 5 Minuten der Daten verwendet, um die Steigungen für die Puls-Spread-Daten in Abbildung 3Fzu messen. Dies führt zu Steigungen von 72 A.U./min, -594 A.U./min und 111 A.U./min für die proximalen, zentralen und distalen Fenster (A.U. = beliebige Einheiten). Um diese Werte zu normalisieren, werden sie durch die anfängliche Fluoreszenz des zentralen Fensters dividiert, was zu Raten von 0,108 %F0/min, -0,962 %F0/min und 0,173 %F0/min führt. Dies ist eine technische Einschränkung aufgrund des Sichtfeldes unserer EMCCD-Kamera (82 x 82 m). Kameras mit sCMOS-Chips, die viel größere Sichtfelder haben können, könnten die Verwendung größerer flankierender Fenstergrößen ermöglichen. Wir können jedoch nicht ausschließen, dass diese Diskrepanz zwischen den mittel- und flankierenden Hängen zumindest teilweise auch auf eine Unterschätzung des Ausmaßes der Photobleichung (siehe Diskussion) zurückzuführen ist, was dazu führen würde, dass die positiven Hänge in den flankierenden Fenstern unterschätzt und die negative Neigung im zentralen Fenster überschätzt würde.
Aus den Raten in den flankierenden Fenstern (%F0/min) und Eq. 2 oben, und mit Werten von 
und 
17berechnen wir das Verhältnis 
= 2,12. Dies deutet darauf hin, dass 68% der Filamente anterograde und 32% retrograde bewegten. Unter Verwendung der gleichen Raten und Eq. 1 oben berechnen wir die durchschnittliche Nettobevölkerungsgeschwindigkeit 
= 40*(0.00173-0.00108) = 0.026 m/min oder 0.037 mm/Tag. Radioisotope Puls-Etikettierungsstudien an Mäusen ähnlichen Alters haben eine Neurofilament-Populationsgeschwindigkeit von etwa 0,6 mm/Tag in den proximalsten Teilen des Ischiasnervs berichtet, die sich über eine Entfernung von zwei Zentimeternauf,200,12 mm/Tag verlangsamt. Unsere Puls-Spread-Daten wurden im Tibianerv gesammelt, etwa weitere 2-3 Zentimeter distal zu diesen Maßnahmen. Aus den oben genannten Gründen glauben wir, dass die Schätzung von 0,037 mm/Tag eine Unterschätzung der wahren Geschwindigkeit ist. Die Extrapolation der räumlichen Verlangsamung, die durch radioisotopen pulsierende Pulsbeschriftung in den Tibianerv beobachtet wird, ist jedoch nicht unvernünftig, insbesondere wenn man bedenkt, dass sie mit einer ganz anderen Methodik auf einer ganz anderen räumlichen und zeitlichen Skala bestimmt wurde.
Um die Fähigkeit der Puls-Spread-Methode zu demonstrieren, signifikante Unterschiede zwischen den Populationen zu erkennen, verglichen wir die proximalen und distalen flankierenden Fensterhänge, gemessen von Nerven, die sowohl mit Normal- als auch mit Inhibitor-Salines durchsetzt sind. Hemmung der Glykolyse blockiert die Bewegung von Neurofilamenten, wie wir zuvor berichtet haben5,6,7. Wir werden später die Auswahl der Probengrößen für Experimente besprechen, aber hier haben wir einen Nerv in normaler Saline und zwei in hemmender Saline verwendet, aufgrund der Begrenzung eines Erfassungsfeldes pro Nerv während der Hemmung. Abbildung 4A zeigt einen Beispielzeitraffer eines glykolytisch gehemmten Nervs, der eine offensichtliche Verringerung des Transports aus dem aktivierten Bereich zeigt. Tatsächlich finden wir deutlich niedrigere distale und proximale Steigungen(Abbildung 4B, p = 0,00000639 bzw. 0,0121, Tukeys paarweiser Vergleich nach ANOVA) bei Nerven, die mit hemmender Kochung behandelt werden, im Vergleich zu Nerven, die mit normaler Kochlinie durchdrungen sind. Wir finden auch eine signifikante Verringerung der Bevölkerungsgeschwindigkeit zwischen diesen beiden Bedingungen (Abbildung 4C, p = 0,0232, t-Test mit ungleichen Varianzen, nach F-Test auf gleiche Varianz mit p = 0,0190).
Abbildung 1: Die Perfusionskammer. (A) Diagramm, das die Montage des Perfusionskammergehäuses und der Äußeren Dichtung zeigt, mit Schläuchen, die mit der Salinespritze und dem Abfallkolben verbunden sind. (B) Diagramm, das die Montage der Kammer selbst zeigt. Die Innendichtung ist flach auf die #1.5-Abdeckunggelegt. Der Nerv wird auf den Deckelschlupf in der durch die rechteckige Öffnung der Innendichtung erzeugten Gutsrutsche gelegt. Der Mikroaqueduktschlitten wird über den Nerv gelegt, um den Nerv zwischen dem #1.5-Abdeckungsrutsch und dem Mikroaqueduktschlitten zu verdrehen. Schließlich wird das Sandwich vor der Montage auf der Äußeren Dichtung der in (A) gezeigten Einheit gekippt und mit einem Verriegelungsring gesichert (nicht gezeigt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die tibiale Nervenpräparation. (A) Bild zeigt die Lage des Tibianervs im Bein einer Maus, in dem die Gluteus-Oberflächlichkeit, biceps femoris, semitendinosus, popliteus, tibialis caudalis und flexor digitorum longus-Muskeln entfernt wurden. Der Tibianerv kann als einer von drei Hauptzweigen des Amiseisnervs am Knie angesehen werden. (B) Schematische steile den Nerv im Querschnitt in der montierten Kammer, die das Öl-Immersionsobjektiv unter dem Deckelschlupf zeigt. Die beste optische Qualität wird durch Aktivieren und Abbilden der Aufschubschicht auf der Oberfläche des Abdeckrutsches erreicht; Die Bildqualität sinkt durch Lichtstreuung tiefer in den Nerv. (C) Beispiele für ein gesundes Axon (oben) und ein ungesundes Axon (unten) unmittelbar nach der Aktivierung. Die gestrichelte gelbe Linie markiert den aktivierten Bereich. Die aktivierte Fluoreszenz hat im gesunden Axon scharfe Grenzen, während im ungesunden Axon die aktivierte Fluoreszenz schnell aus dem aktivierten Bereich diffundiert und das Axon innerhalb von Sekunden füllt. Skalenbalken = 10 m. (D) Beispiele für das mitochondriale Erscheinungsbild in einem gesunden Axon (oben) und einem ungesunden Axon (unten). Die Mitochondrien sind durch Flavin-Autofluoreszenz16sichtbar. Sie erscheinen linear (solide Pfeilspitzen) in gesunden Axonen. Bei ungesunden Axonen werden die Mitochondrien zuerst punktgenau (offene Pfeilspitzen) und dann im Laufe der Zeit schwächer, was einen Indikator für die Gesundheit des Axons liefert. Die gestrichelte offene Pfeilspitze im gesunden Axon zeigt auf ein Mitochondrion, das von linear zu punktiat übergeht. Skalenbalken = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Puls-Escape- und Puls-Spread-Experimente. Beispiel für Voraktivierungs-, Postaktivierungs- und Zeitrafferbilder von myelinierten Axonen im Tibianerv einer 8 Wochen alten Maus in (A) einem Puls-Escape-Experiment und (B) einem Puls-Spread-Experiment. Das Voraktivierungsbild ist das obere Panel, mit den Post-Aktivierungsbildern unten. Die Zeitstempel zeigen die zeitverstrichene Zeit nach der Aktivierung an. Die gelben Felder stellen den aktivierten Bereich dar. Diese Aktivierungen wurden mit 5 Scans mit einer Verweilzeit von 40 S s und einer Laserleistung von 5 % durchgeführt. Skalenbalken = 10 m. (C) Die MessROIs (gelb) für drei Axone in einem Puls-Escape-Experiment. (D) Die proximalen (roten), zentralen (gelben) und distalen (grünen) MessROIs für drei Axone in einem Puls-Spread-Experiment. Die MessROIs für jedes Axon sind in durchgehendem Rot (proximal), durchgehend gelb (Zentralfenster) und durchgehend grün (distales Fenster) dargestellt. (E) Diagramm der durchschnittlichen Fluoreszenz versus Zeit, Durchschnitt der 3 Axone in C. Dashed Linie ist eine exponentielle Funktion passend zu den Daten, der Form Ft = Ae-t, wie zuvor beschrieben7. F) Diagramme der Fluoreszenz in den zentralen, distalen und proximalen ROIs im Vergleich zur Zeit, Durchschnitt von 14 Axonen einschließlich der drei Axone in D. Die Steigung wird aus Trendlinien berechnet, die auf die ersten 5 Minuten der Daten passen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Die Wirkung von metabolischen Inhibitoren auf den Neurofilamenttransport. (A) Beispiel für Zeitrafferbilder eines mit 5,6% (w/v) 2-Deoxy-Glucose und 0,5 mM Natriumjodoacetat vorbehandelten Nerven, um die Glykolyse zu hemmen und das zelluläre ATP zu deplete. Beachten Sie, dass die distalen und proximalen Grenzen der aktivierten Regionen scharf bleiben, was auf eine Hemmung des Neurofilamenttransports hindeutet. Skala bar = 10 m. (B) Quantifizierung der Hänge in den distalen (D) und proximalen (P) flankierenden Fenstern (anterograde bzw. retrograde), ausgedrückt als Prozent der Anfangsfluoreszenz im Zentralfenster (%F0/min), von einem Nerv (14 Axone) mit Standardkochigkeit und von zwei Nerven (8 Axone), die mit Kochchen vorbehandelt werden. (C) Neurofilament-Populationsgeschwindigkeiten, die aus Hängen in den flankierenden Fenstern berechnet werden, was eine signifikante Abnahme der Geschwindigkeit nach der Inhibitorbehandlung zeigt. - p < 0,005; ** - p < 0,01; * - p < 0,05. Die Daten zeigen eine signifikante Beeinträchtigung des Neurofilamenttransports in Gegenwart der Inhibitoren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzendes Video. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Bei der Analyse von Puls-Escape- und Puls-Spread-Experimenten ist Vorsicht geboten, da ein erhebliches Potenzial für die Einschleppung von Fehlern während der Nachbearbeitung, vor allem während der Flachfeldkorrektur, Bildausrichtung und Bleichkorrektur, besteht. Die Flachfeldkorrektur ist notwendig, um die Ungleichmäßigkeit in der Beleuchtung zu korrigieren, was zu einem Rückgang der Intensität über das Sichtfeld von der Mitte zur Peripherie führt. Das Ausmaß der Ungleichmäßigkeit ist wellenlängenabhängig und sollte daher immer bei der Wellenlänge durchgeführt werden, die für die Erfassung der experimentellen Daten verwendet werden soll. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Ungleichmäßigkeit im Flachfeldbild wirklich repräsentativ für die Ungleichmäßigkeit in den zu korrigierenden Bildern ist. Puls-Spread-Experimente sind besonders anfällig für Fehler durch unsachgemäße Flachfeldkorrektur, da sich die MessROIs in Richtung der Bildperipherie erstrecken, wo der Intensitätsabfall am größten ist.
Die optimalen paGFP-Aktivierungseinstellungen variieren je nach Aktivierungsmethode und Laserparametern und müssen vor der ersten Imaging-Sitzung empirisch bestimmt werden. Zu wenig Aktivierung führt zu einem niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis für die aktivierte Fluoreszenz, während zu viel zum Bleichen der aktivierten Fluoreszenz führt, da sowohl das nicht aktivierte als auch das aktivierte paGFP durch violettes Licht angeregt werden kann. Um einen Bereich, der für das Bild interessant ist, selektiv zu beleuchten, verwenden wir einen Andor FRAPPA Laser-Galvo-Scanner, der einen klar definierten Fluoreszenzbereich mit scharfen Grenzen erzeugt, wie in den repräsentativen Ergebnissen dargestellt. Wir hatten auch Erfolg mit einem Andor Mosaic Digital Diaphragm, einem digitalen Mikrospiegelgerät, mit einer Quecksilberlichtbogenlampe als Beleuchtungsquelle7. Andere Optionen sind im Handel erhältlich. Eine Herausforderung bei der Arbeit mit paGFP ist die verzögerte Erhöhung der Fluoreszenzintensität, die innerhalb von 1 Minute nach dem Photoaktivierungsschritt auftritt. Dieser Anstieg tritt auf, weil die Beleuchtung mit violettem Licht dazu führt, dass ein Teil der aktivierten paGFP-Moleküle in einen "dunklen Zustand" eintritt, aus dem sie sich auf einem Zeitverlauf von zig Sekunden11entspannen können. Nach unserer Erfahrung beträgt der Anstieg in der Regel weniger als 5% bei Weitfeldanregung, kann aber bei Laseranregung 20% übersteigen, was zu einer signifikanten Unterschätzung der aktivierten Fluoreszenz führen kann. Wir berücksichtigen dies, indem wir 1 Minute nach der Photoaktivierung ein zweites "Post-Aktivierung"-Bild der paGFP-Fluoreszenz erwerben und dieses Bild dann als Bezugspunkt für den nachfolgenden Zeitraffer verwenden. Es ist jedoch wichtig zu erkennen, dass dies eine weitere potenzielle Fehlerquelle bei der Bestimmung der anfänglichen Fluoreszenz und der Zerfallskinetik in frühen Zeiten einführt.
Besondere Aufmerksamkeit muss der Ausrichtung der Bildstapel gewidmet werden. Die Hauptquelle der Fehlausrichtung ist Drift oder andere Bewegung der Probe während der Zeitraffer-Bildaufnahme. Dies kann minimiert werden, indem Innendichtungen der entsprechenden Dicke verwendet werden und die Zubereitung vor der Bildgebung "ein- und aussetzen" kann. Eine solche Verzögerung wird jedoch die Zeit für die Bildaufnahme verringern, da die Vorbereitung über ein begrenztes Zeitfenster der Rentabilität verfügt. Es ist auch wichtig, Ausrichtungsalgorithmen zu vermeiden, die das Bild verziehen oder Subpixelverschiebungen einführen, da diese Verfahren die Pixelintensitäten im Bild neu sampeln würden. Puls-Spread-Experimente sind besonders anfällig für Fehler, die durch unsachgemäße Ausrichtung entstehen, da die Grenzen der Region mit aktivierter Fluoreszenz relativ scharf sind und die Fluoreszenz in dieser Region deutlich höher ist als die flankierenden nicht aktivierten Regionen. Selbst eine leichte Fehlausrichtung der Bildebenen im Stapel kann zu großen Sprüngen der Fluoreszenzwerte in den distalen und proximalen Messfenstern führen. Daher ist es zwingend erforderlich, dass Bildsätze richtig ausgerichtet und sorgfältig geprüft werden, bevor sie mit der Analyse fortfahren.
Eine Korrektur der Photobleichung ist notwendig, um sicherzustellen, dass Veränderungen der Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit Veränderungen der Menge des fluoreszierenden Proteins genau widerspiegeln. Solche Korrekturen können eine signifikante Fehlerquelle bei der Schätzung der absoluten Fluoreszenzintensitäten in den zentralen und flankierenden Fenstern sein. Da die Photobleichktik von der Beleuchtungsintensität und der Umgebung des Fluorophors abhängt, können die tatsächlichen Photobleichraten zwischen den Sitzungen und von Axon zu Axon variieren. Daher ist es notwendig, mehrere Axone zu messen und die resultierenden Daten zu durchschnittlich, was selbst einen Fehler einführt. Der oben beschriebene Ansatz besteht darin, den Nerv mit glykolytischen Inhibitoren zu behandeln und dann die Fluoreszenz in einer Region von Interesse zu aktivieren und den Verlust der Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit zu verfolgen. Die glykolytischen Inhibitoren dezimieren ATP und hemmen so den Neurofilamenttransport, so dass der Fluoreszenzverlust ausschließlich auf Photobleichmittel und nicht auf die Bewegung von Neurofilamenten aus dem aktivierten Bereich zurückzuführen ist. Die auf diese Weise ermittelte durchschnittliche Bleichktik wird dann zur Korrektur der experimentellen Daten verwendet. Da es nicht praktikabel ist, in jeder Bildgebungssitzung eine separate Bleichkalibrierung durchzuführen, muss eine einzige Kalibrierung auf mehrere Sitzungen angewendet werden, die über viele Wochen verteilt sind. Ein Nachteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er keine Schwankungen der Laserleistung/Beleuchtungsintensität von Tag zu Tag berücksichtigt, die daher überwacht werden sollten. Ein alternativer Ansatz, den wir als "intrinsische Bleichkorrektur" bezeichnen, besteht darin, die Photobleiche zu schätzen, indem die Fluoreszenz in der Mitte des aktivierten Bereichs in den gleichen Zeitrafferfilmen quantifiziert wird, die für die Transportmessungen verwendet werden. Wenn dieser Messbereich zentral gelegen ist und viel kürzer als die Länge der aktivierten Region ist, und dann werden zu kurzer Zeit alle fluoreszierenden Neurofilamente, die sich aus dem Messbereich bewegen, durch fluoreszierende Neurofilamente ersetzt, die sich in diesen Bereich bewegen. Mit der Zeit steigt jedoch die Wahrscheinlichkeit, dass sich nicht fluoreszierende Neurofilamente aus flankierenden nicht fluoreszierenden Regionen des Axons in den Messbereich bewegen, was zu einer Überschätzung des Fluoreszenzverlusts durch Bleichen führt. Ein Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er die Bleicheigenschaften innerhalb desselben Feldes korrigiert, aber ein Nachteil ist, dass die Dauer des Zeitfensters empirisch bestimmt werden muss und sowohl von der Transportgeschwindigkeit als auch von der Länge der aktivierten Region abhängt. Nach all dem ist zu beachten, dass die Schätzung der Richtung des Neurofilamenttransports mit unserer Methode robust gegenüber Bleichfehlern ist (wie es bei der flankierenden Fenstergröße der Fall ist), da sie durch das Verhältnis der Steigungen in den flankierenden Fenstern gegeben wird und jede Bleichkorrektur ein Multiplikator ist, der sowohl auf Denumerator als auch auf Nenner in dieser Berechnung angewendet wird.
Aufgrund des Rauschens, das einem Fluoreszenzsystem innewohnt, und des Potenzials für zusätzliche Fehler, die während der oben beschriebenen Bildnachbearbeitungsschritte hinzugefügt werden, ist es wichtig, große Stichprobengrößen für eine ausreichende statistische Leistung zu verwenden. Obwohl es nicht möglich ist, die Mittelwerte der Grundgesamtheit, Abweichungen und Effektgrößen vor dem Experimentieren genau zu bestimmen, empfehlen wir die Verwendung der Cohen-Methode21 unter der Annahme einer mittleren Wirkungsgröße und eines Alphawerts von 0,05. Dies führt zu einem Cohen es d, das ist der Unterschied in den Mitteln geteilt durch die gepoolte Standardabweichung beider Populationen, von 0,5, was darauf hindeutet, dass mindestens 105 Proben pro Gruppe zu erwerben. Sobald dieser Schwellenwert erreicht ist, kann eine Post-hoc-Leistungsanalyse durchgeführt werden, um die statistische Leistung im Lichte der tatsächlichen Bevölkerungsmessungen neu zu bewerten. Unter optimalen experimentellen Bedingungen sollte es möglich sein, von 1-7 analyzierbaren Axonen (von 9-20 Gesamtaxonen) pro Aktivierung und 5-8 Aktivierungen pro Nerv unter der Annahme eines 10-minütigen Zeitraffers pro Aktivierung zu erhalten.
Transgene Mäuse, die fluoreszierende Fusionsproteine ex vivo 22 , 23 , 24 , 25 , ex vivo 22 , 23 , 24 , 25 , axonalen Transport von membranösen Organellen in peripheren Nerven ex vivo22,23,24,25untersuchen. Darüber hinaus hat das Schiavo-Labor Ansätze entwickelt, um den axonalen Transport von retrograd bewegten membranösen Organellen in Axonen in vivo mit fluoreszierend markierten Tetanustoxinfragmenten abzubilden, die in den Muskel injiziert und von Motornervenklemmen aufgenommen werden26. Da membranöse Organellen jedoch in diesen Axonen durch Fluoreszenzmikroskopie aufgelöst werden können, ist es möglich, die Geschwindigkeit und Frequenz ihrer Bewegung direkt mittels Zeitraffer- oder Kymographenanalyse zu analysieren. Die hier beschriebenen Puls-Flucht- und Puls-Spread-Methoden wurden mit dem spezifischen Ziel entwickelt, die Kinetik des Neurofilamenttransports in diesen Axonen zu analysieren, bei denen einzelne Neurofilamente nicht aufgelöst werden können. Dies erfordert eine Analyse auf Bevölkerungsebene über einen Zeitraum von Minuten oder Zehnerminuten. Wir verwenden eine transgene Maus für diesen Zweck, aber es sollte auch möglich sein, das photoaktivierbare Protein mit Methoden wie virale Transduktion oder in der Utero-Elektroporation auszudrücken. Während der Schwerpunkt auf dem Neurofilamenttransport lag, können die Puls-Escape- und Puls-Spread-Methoden auch angepasst werden, um die Bewegung anderer zytoskelettaler und zytosolischer Proteine zu untersuchen, die entlang von Axonen in den langsamen Komponenten des axonalen Transports transportiert werden. Wir beschränken unsere Analysen auf myelinierte Axone, weil ihre Größe und Myelinscheide es uns ermöglicht, sie von ihren Nachbarn zu lösen. Unmyelinierte Axone können aufgrund ihres Kleinkalibers und ihrer Neigung zum Clustern in Remak-Bündeln nicht aufgelöst werden. Wir beschreiben die Verwendung von Tibianerven ex vivo, aber die Methoden sollten auch auf andere periphere Nerven anwendbar sein, die ausreichend lang (>5 mm) und unverzweigt sind. Grundsätzlich sollte es auch möglich sein, diese Methoden an den Bild-Neurofilament-Transport in vivo anzupassen (z. B. durch chirurgische Sedieren eines Nervs in einer sedierten Maus und anschließende Platzierung der Maus auf einer Mikroskopstufe).
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Paula Monsma für die Unterweisung und Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie und tibialen Nervensektion und Dr. Atsuko Uchida, Chloe Duger und Sana Chahande für die Unterstützung bei der Maushaltung. Diese Arbeit wurde teilweise durch die kollaborativen National Science Foundation Grants IOS1656784 an A.B. unterstützt. und IOS1656765 an P.J., und National Institutes of Health Grants R01 NS038526, P30 NS104177 und S10 OD010383 an A.B. N.P.B. wurde durch ein Stipendium des Postdoctoral Scholars Program der Ohio State University unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| 30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
| 35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
| 40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| 60mL syringe - Luer-lock tip | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
| Calcium chloride | Fisher | C79 | |
| Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
| D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
| Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
| Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
| FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
| Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
| Objective oil - type A | Nikon | discontinued | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
| Tubing adapter - female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
| Tubing adapter - male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
| Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
References
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