Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Avbildning og analyse av neurofilamenttransport i ekskisert mus tibial nerve

Published: August 31, 2020 doi: 10.3791/61264
Automatic Translation
1, 1,2, 3,4, 1
1Department of Neuroscience, The Ohio State University, 2Present address: Interdepartmental Neuroscience Graduate Program and Department of Neurobiology, Northwestern University, 3Quantitative Biology Institute, Ohio University, 4Department of Physics and Astronomy, Ohio University

Summary

Vi beskriver fluorescensfotoaktiveringsmetoder for å analysere aksonal transport av nevrofilamenter i enkelt myelinerte aksler av perifere nerver fra transgene mus som uttrykker et fotoaktiverbart nevrofilamentprotein.

Abstract

Neurofilament protein polymerer beveger seg langs aksoner i den langsomme komponenten av aksonal transport ved gjennomsnittlige hastigheter på ~ 0,35-3,5 mm / dag. Inntil nylig var studien av denne bevegelsen in situ bare mulig ved hjelp av radioisotopisk pulsmerking, noe som tillater analyse av aksonal transport i hele nerver med en timelig oppløsning på dager og en romlig oppløsning på millimeter. For å studere nevrofilamenttransport in situ med høyere temporal og romlig oppløsning, utviklet vi en hThy1-paGFP-NFM transgen mus som uttrykker neurofilamentprotein M merket med fotoaktiverbar GFP i nevroner. Her beskriver vi fluorescens fotoaktivering puls-escape og puls-spredning metoder for å analysere neurofilament transport i enkelt myelinated aksoner av tibiale nerver fra disse musene ex vivo. Isolerte nervesegmenter opprettholdes på mikroskopstadiet ved perfusjon med oksygenert saltvann og avbildet ved å spinne diskkonokal fluorescensmikroskopi. Fiolett lys brukes til å aktivere fluorescensen i et kort aksonalt vindu. Fluorescensen i de aktiverte og flankerende regionene analyseres over tid, slik at studien av nevrofilamenttransport med timelig og romlig oppløsning i løpet av minutter og mikron, henholdsvis. Matematisk modellering kan brukes til å trekke ut kinetiske parametere for nevrofilamenttransport, inkludert hastighet, retningsbias og pauseatferd fra de resulterende dataene. Pulsflukt- og pulsspredningsmetodene kan også tilpasses for å visualisere nevrofilamenttransport i andre nerver. Med utviklingen av ytterligere transgene mus kan disse metodene også brukes til å bilde og analysere aksonal transport av andre cytoskeletale og cytosoliske proteiner i aksoner.

Introduction

Aksonal transport av nevrofilamenter ble først demonstrert på 1970-tallet av radioisotopisk pulsmerking1. Denne tilnærmingen har gitt et vell av informasjon om neurofilament transport in vivo, men den har relativt lav romlig og timelig oppløsning, vanligvis i rekkefølgen av millimeter og dager i bestefall 2. Videre er radioisotopisk pulsmerking en indirekte tilnærming som krever injeksjon og offer av flere dyr for å generere et enkelt tidskurs. Med oppdagelsen av fluorescerende proteiner og fremskritt i fluorescensmikroskopi på 1990-tallet, ble det senere mulig å bilde nevrofilamenttransport direkte i kultiverte nevroner på en tidsskala på sekunder eller minutter og med sub-mikrometer romlig oppløsning, noe som gir mye større innsikt ibevegelsesmekanismen 3. Disse studiene har vist at neurofilament polymerer i aksoner beveger seg raskt og midlertidig i både anterograde og retrograd retninger langs mikrotubuli spor, drevet av mikrotubuli motorproteiner. Imidlertid er nevrofilamenter diffraksjonsbegrensede strukturer bare 10 nm i diameter som vanligvis er fordelt bortsett fra sine naboer med bare titalls nanometer; Derfor kan polymerene bare spores i kultiverte nevroner som inneholder tynt fordelte nevrofilamenter slik at de bevegelige polymerene kan løses fra naboene4. Dermed er det for tiden ikke mulig å spore enkelt neurofilamenter i aksoner som inneholder rikelig nevrofilamentpolymerer, for eksempel myelinerte aksoner.

For å analysere aksonal transport av nevrofilamenter i neurofilamentrike aksoner ved hjelp av fluorescensmikroskopi, bruker vi en fluorescens fotoaktiveringspulsfluktmetode som vi utviklet for å studere den langsiktige pauseatferden til nevrofilamenter i kultiverte nerveceller4,5. Neurofilamenter merket med et fotoaktiverbart fluorescerende neurofilamentfusjonsprotein aktiveres i et kort segment av akson, og deretter kvantifiseres avgangshastigheten til disse filamentene fra den aktiverte regionen ved å måle fluorescensforfallet over tid. Fordelen med denne tilnærmingen er at det er en populasjonsnivåanalyse av nevrofilamenttransport som kan brukes på en tidsskala av minutter eller timer uten å måtte spore bevegelsen av individuelle nevrofilamentpolymerer. For eksempel har vi brukt denne metoden til å analysere kinetikken til nevrofilamenttransport i myelinerende kulturer6.

Nylig beskrev vi utviklingen av en hThy1-paGFP-NFM transgen mus som uttrykker lave nivåer av et paGFP-merket neurofilamentprotein M (paGFP-NFM) i nevroner under kontroll av den menneskelige nevron-spesifikke Thy1-promotoren7. Denne musen tillater analyse av neurofilament transport in situ ved hjelp av fluorescens mikroskopi. I denne artikkelen beskriver vi de eksperimentelle tilnærmingene for å analysere nevrofilamenttransport i myelinerte aksoner av tibiale nerver fra disse musene ved hjelp av to tilnærminger. Den første av disse tilnærmingene er pulsfluktmetoden beskrevet ovenfor. Denne metoden kan generere informasjon om pauseatferden til nevrofilamentene, men er blind for retningen der filamentene forlater den aktiverte regionen, og tillater derfor ikke måling av netto retningsbestemthet og transporthastighet8. Den andre av disse tilnærmingene er en ny pulsspredningsmetode der vi analyserer ikke bare tapet av fluorescens fra den aktiverte regionen, men også den forbigående økningen i fluorescens i to flankerte vinduer der fluorescerende filamenter beveger seg når de forlater den aktiverte regionen i både anterograde og retrograd retninger. I begge tilnærminger kan parametere for nevrofilamenttransport som gjennomsnittlig hastighet, netto retningsbestemthet og pauseatferd oppnås ved hjelp av matematisk analyse og modellering av endringene i fluorescens i målevinduene. Figur 3 illustrerer disse to tilnærmingene.

Denne protokollen demonstrerer disseksjon og utarbeidelse av nerve, aktivering og avbildning av paGFP fluorescens, og kvantifisering av neurofilament transport fra de oppkjøpte bildene ved hjelp av FIJI distribusjonspakke av ImageJ9. Vi bruker tibial nerve fordi den er lang (flere cm) og ikke gren; Men i prinsippet er enhver nerve som uttrykker paGFP-NFM egnet for bruk med denne teknikken hvis den kan dissekeres og de-sheathed uten å skade aksonene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder som er beskrevet her har blitt godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Ohio State University.

1. Tilberedning av nerve saltoppløsning

  1. Lag 100 ml Breuers saltvann10:98 mM NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH2PO4,1 mM MgSO4,1,5 mM CaCl2, 5,6% D-glukose, 23,8 mM NaHCO3 i dobbeltdestillert vann.
  2. Boble 95% oksygen/5% karbondioksid (karbaogen) gjennom saltvannsløsningen i minst 30 minutter før bruk. Rester saltvann kan gjenbrukes innen en uke; Det må imidlertid reoksygeneres før hver bruk.
  3. Hell oksygenert saltvann i en 60 ml sprøyte og sørg for at det er minimal luft igjen i sprøyten.

2. Første montering av nerveperfusjonskammer

  1. Koble sprøyten og slangen som vist i figur 1A, ogplasser utløpsrøret i en avfallsflaske.
  2. Plasser den ytre pakningen i perfusjonskammerets hus, slik at strømningsinntaket og utløpsstolpene er på linje med hullene i pakningen.
  3. Legg den indre pakningen (silikon, 100 μm tykk) på en #1,5 sirkulær dekkslips (40 mm diameter), forsiktig utjevning av rynker i pakningen for å sikre en tett forsegling. For å lette senere montering, plasser dekkslippen og pakningen på et papirhåndkle eller oppgave tørk med pakningen vendt opp.

3. Disseksjon og fremstilling av mus tibial nerve

  1. Ofre dyret ved karbondioksidinnånding eller en annen institusjonelt godkjent metode. Start en timer når dyret slutter å bevegelse/puste, da eksperimenter bare må utføres innen 3 timer etter offer7.
  2. Spray pelsen med 70% etanol og fjern så mye som mulig fra dyrets ben og rygg ved hjelp av en elektrisk barberhøvel.
  3. Ved hjelp av et par store disseksjon saks, gjør et ryggsnitt i huden nær midten av ryggraden og fortsett kuttet rundt ventral aspektet av dyret. Starter fra dette kuttet, sakte reflektere huden fra bena ved å forsiktig trekke den bort fra muskelen og kutte fascia.
  4. Plasser dyret i en liggende stilling på et disseksjonsbrett og pin alle fire potene. Alternativt feste halen for å redusere bevegelsen ytterligere.
  5. Ved hjelp av mikrodisseksjon saks, gjør et snitt i lårmusklene midtveis mellom halen og kneet for å avsløre isjiasnerven. Sørg for at nerven, som er synlig gjennom muskelen, ikke er kuttet.
  6. Utvide snittet dorsally og ventrally å fjerne muskelen. På samme måte fjerner du kalvens muskler, holder kutt grunne og korte for å unngå å skade nerven.
  7. Fjern musklene til tibialnerven er fullstendig eksponert fra det punktet hvor den grener fra isjiasnerven (i kneet) til hælen (figur 2A).
    MERK: I alle trinn, inkludert og etter disseksjon av tibialnerven, unngå unødvendig eksponering for omgivelseslys for å minimere mulig tilfeldig aktivering av paGFP i nerven.
  8. Grip tibialnerven i ryggraden-proksimal ende med et par tang og kutt nerven ved hjelp av et par mikrodisseksjonsaks. Ta vare på ikke å sette spenning på nerven, løft den bort fra muskelen, kutte noen vedlegg.
  9. Skjær den ryggrads distale enden av tibialnerven og overfør til en liten petriskål med romtemperatur oksygenert saltvann. Fra dette punktet i prosedyren, alltid være sikker på å holde styr på de proksimale og distale endene av nerven.
    MERK: En måte å gjøre dette på er å markere den distale enden av nerven med et vinklet kutt slik at taperen er synlig.
  10. Fra den proksimale enden av nerven, ta forsiktig tak i de eksponerte aksonendene med et par svært fintippede tang.
  11. Med et annet par tang, ta tak i nervehylsen proksimalt, og trekk sakte mot den distale enden av nerven. Nervehylsen vil gli langs aksonene med minimal motstand. Sørg for at ingen unødig spenning påføres nerven under denne prosessen.

4. Endelig nerveperfusjonskammermontering

  1. Gripe den proksimale enden av nerven, fjern den fra saltvannet og legg den sakte ned på dekkslepet på perfusjonskammeret i den rektangulære åpningen av den indre pakningen, og oppretthold forsiktig spenning på nerven når du legger den ned slik at den ligger rett.
  2. Plasser mikroavedukten gli over nerven med den rillede siden vendt mot nerven, og strømningsretningen parallelt med nerven. Snu dekkslippen og mikroaveduktenheten over, og plasser den i perfusjonskammerets hus med mikroaveduktsklien som er apposert til den ytre pakningen. Nerven og den omkringliggende indre pakningen vil nå bli klemt mellom dekkslipsen og mikroaveduktlysbildet, som er atskilt av pakningen, med dekkslippen vendt opp (figur 1B).
  3. Fest perfusjonskammeret ved å plassere det i metallhuset og rotere låseringen. Sørg for at plasthuset er helt under alle metallklips og stram godt for å hindre saltvannslekkasje. Overtightening kan knekke mikroavedukten lysbilde eller dekklips. Snu kammeret slik at dekkslippen vender ned.
  4. Trykk forsiktig inn saltvannssprøytestempelet for å fylle perfusjonskammeret. Hold innløps- og utløpsslangen, utløpskolbe og sprøyte hevet over selve kammeret til enhver tid under oppsett og avbildning. Dette unngår siphoning, som kan introdusere bobler eller forårsake ustabilitet i fokus på grunn av negativt trykk i kammeret.
  5. Overfør perfusjonsenheten til et invertert mikroskopstadium og monter saltvannssprøyten i sprøytepumpen. Start motoren med en passende hastighet for en strømningshastighet på 0,25 ml/min. Koble deretter til og slå på den in-line løsning varmeapparatet satt til 37 °C.
  6. Koble objektivvarmeren og sett til 37 °C, påfør olje på målet, og sett perfusjonskammeret inn i scenefestet.
  7. Påfør olje på kammervarmeputen og fest til perfusjonskammeret. Koble til og slå på kammervarmeren; satt til 37 °C.
    MERK: Temperaturendringer kan føre til at det dannes bobler i perfusjonskammeret på grunn av utgassing av oppløsningen. Hvis bobler dannes, kan du kort øke oppløsningsstrømningshastigheten med 5-10x til bobler fjerner kammeret.
  8. Lås perfusjonskammeret inn i sceneadapteren og få den objektive oljen i kontakt med dekkslippen på undersiden av kammeret.
    MERK: Bioptechs-kammeret med ASI-trinnsadapter som brukes her, er designet for en invertert mikroskopkonfigurasjon.

5. Fluorescens aktivering og bildeanskaffelse

  1. Ved hjelp av brightfield belysning, fokusere på laget av aksoner på undersiden av nerven nærmest dekkglassoverflaten (Figur 2B). Myelinerte aksoner (vanligvis 1 - 6 μm i diameter hos voksne mus) kan identifiseres ved tilstedeværelse av en myelinhylse, som er synlig under brightfield overført lysbelysning uten kontrastforbedring. Schmidt-Lanterman kløfter og noder av Ranvier er også lett synlige. Unmyelinated aksoner er slankere (vanligvis <1 μm diameter) og er vanligvis til stede i bunter (Remak bunter), hvor de er generelt for tett apposed å bli løst fra hverandre.
  2. Hvis det er tilgjengelig på mikroskopet, aktiverer du autofokussystemet for å opprettholde fokus i løpet av timelapse-bildebehandling.
  3. Få et brightfield referansebilde. Registrer orienteringen av nerven (spine-proksimale og distale ender) med hensyn til bilder.
  4. Få et konfokalt bilde ved hjelp av en 488 nm laser og et utslippsfilter som passer for paGFP (f.eks. 525/50 nm) for å registrere for-blekemiddel autofluorescens. Hold lasereffekten lav for å minimere fotobleaching, med eksponeringstid justert tilsvarende for å oppdage det svake signalet. Som et eksempel ble representative data anskaffet ved 5% laserkraft og 4 s eksponeringer. Registrer anskaffelsesinnstillingene for bruk i alle fremtidige eksperimenter.
    MERK: Etter fotoaktivering vil de ideelle bildeinnstillingene gi et signal-til-støy-forhold > 8 og fotobleaching på mindre enn 25 % av det opprinnelige signalet i løpet av 20 bilder. Aksonene kan også avbildes av widefield epifluorescence mikroskopi som vi gjordeopprinnelig 7,men bildekvaliteten vil være dårligere på grunn av mangel på konfocality.
  5. Sett lasereffekten til omtrent 5x normal bildeeffekt og skaff deg et bilde med en eksponeringstid på 3-4 minutter. Selv om det ikke er viktig, anbefales dette trinnet å bleke autofluorescens og andre kilder til uønsket fluorescens for å redusere bakgrunnssignalet og dermed maksimere signal-til-støy av den fotoaktiverte fluorescensen.
  6. Skaff deg et bilde med innstillingene som brukes i trinn 5.4 for å registrere autofluorescence før aktiveringen etter dette blekingstrinnet.
  7. På brightfield-bildet tegner du en linje parallelt med aksonene med en lengde som er lik ønsket aktiveringsvindusstørrelse. Lengden på dette vinduet vil variere avhengig av det eksperimentelle målet og parametrene, men typiske lengder er 5 μm for pulsfluktparadigmet og 40 μm for pulsspredningsparadigmet.
  8. Bruk denne linjen som en veiledning til å tegne et rektangulært interesseområde (ROI) over synsfeltet vinkelrett på aksonene. Regionen må omfatte alle aksonene som skal fotoaktiveres.
  9. Bestem optimale innstillinger for fotoaktivering med 405 nm belysning.
    MERK: Utfør bare dette trinnet og deltrinnene før første eksperimentelle aktivering. I løpet av et eksperiment må de samme innstillingene for fotoaktivering brukes.
    1. Aktiver en interesseregion gjentatte ganger ved hjelp av 405 nm laserlinje, lav lasereffekt (f.eks. 5 %) og pikselbotid (f.eks. 40 μs) og én puls, og et bilde av den aktiverte GFP-fluorescensen etter hver aktivering. Gjenta til fluorescensen ikke lenger øker, og kvantifisere deretter fluorescensen i et område av interesse for hvert bilde.
    2. Plott den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten versus pulsnummer. Velg antall pulser hvoretter fluorescens ikke lenger øker som det optimale antallet pulser for aktivering.
  10. Aktiver paGFP-fluorescensen regionen tegnet i trinn 5.8 ved mønstret eksitasjon med 405 nm lys. Kontroller at et bilde er anskaffet like før og bare etter aktivering.
    MERK: Den ideelle paGFP-aktiveringen vil produsere et klart definert område av fluorescens med skarpe grenser som finnes i avkastningen.
  11. Start en tidtaker på 1 minutt når aktiveringen er ferdig. På slutten av 1 minutt, starte oppkjøpet av en timelapse-serien.
    MERK: 1 minutts forsinkelse er nødvendig for å tillate økning i fluorescens som observeres etter fotoaktivering av paGFP11. For pulsspredningsmetoden er en 5-10 minutters oppkjøpsperiode med 30 sekunders timelapseintervaller tilstrekkelig for måling av de første bakkene i de sentrale og flankerende vinduene for å måle hastighet og retningsbestemthet. For pulse-escape-metoden tillater en oppkjøpsperiode på 30-150 minutter med 5 eller 10 minutters timelapseintervaller analyse av den langsiktige pauseoppførselen til filamentene
  12. Lagre alle bildene som er anskaffet, samt avkastningen som brukes til fluorescensaktivering.
  13. Flytt til et nytt område av nerven og gjenta trinn 5.1-5.11. Hvis den nye regionen er langs samme axon, må den være minst 500 μm fra den tidligere aktiverte regionen for å unngå påvisning av fluorescerende nevrofilamenter som flyttet ut av det andre aktiverte området. Oppkjøpet av den endelige timelapse må fullføres før slutten av 3 timers vinduet.
    MERK: Det er mulig at preparatet kan være levedyktig i mer enn 3 timer, men det har vi ikke bekreftet. Med dyktig disseksjon og forberedelse, mellom fem og åtte 10-minutters timelapse bildesett kan kjøpes innen dette 3 timers vinduet.
  14. Etter at den endelige timelapsebildeserien er anskaffet, stopp strømmen av saltvann, koble fra løsningen og kammervarmere, og fjern perfusjonsapparatet fra mikroskopstadiet.

6. Flatfield og darkfield bilde oppkjøp

  1. Lag en løsning av fluorescein ved å tilsette 250 mg fluoresceinpulver til 0,5 ml dobbelt destillert vann. Bland til det ikke er synlige partikler og spinn oppløsningen i 30 sekunder i en bordplate sentrifuge for å sedimentere noe uløst materiale. Denne oppløsningen kan oppbevares i flere måneder ved 4 °C hvis den er beskyttet mot lyseksponering.
  2. Tilsett 8 μL fluoresceinløsning på et lysbilde og bruk en #1,5 dekkslips. Blot overflødig væske, forsegle med neglelakk, og la tørke.
    MERK: Ved denne høye konsentrasjonen slukker den sterke absorpsjonen av fluoresceinfargestoffet den opplysende strålen i løsningen, og produserer et tynt planet med fluorescens på overflaten av dekkslippen som er både ensartet og motstandsdyktig mot fotobleking på grunn av rask diffusivutveksling 12.
  3. Plasser fluoresceinskliedekslip-side ned på det inverterte mikroskopstadiet og juster fokuset på det tynne planet av fluorescens på overflaten av dekkglasset. Flytt rundt lysbildet for å finne et synsfelt som ikke inneholder luftbobler (mørke flekker) eller store fluoresceinpartikler (lyse flekker).
  4. Skaff deg en z-stabel som strekker seg over 6 μm med 0,2 μm intervaller slik at det midterste bildet er det opprinnelige fokusplanet. Bruk en kort eksponeringstid (f.eks. 40 ms) fordi fluorescensen vil være svært lys. Dette z-stack oppkjøpet er nødvendig for å fange den maksimale fluorescens over synsfeltet som dekkerlip er sjelden perfekt horisontal og planet av fluorescein fluorescens er svært smal. Gjenta dette for totalt 25 synsfelt, og flytt fasen med minst 20 μm i alle retninger mellom felt.
  5. Lukk alle lysbaneskodder, inkludert kameralukkeren, og sett lasereffekten og eksponeringstiden til null. Skaff deg en stabel med 100 bilder med disse innstillingene. Disse bildene vil bli gjennomsnittlig for å generere darkfield-bildet, som vil bli brukt til å korrigere for mørk strøm og bias offset på kamerabrikken.
    MERK: Streaming oppkjøp er en ideell måte å fange disse bildene på.

7. Imaging glykolytisk hemmet nerver for blekemiddelkorreksjon

  1. Lag og oksygener en saltløsning som i trinn 1; Men erstatte 2-deoksy-D-glukose for D-glukose og tilsett 0,5 mM natrium iodoacetat for å hemme glykose13. Vi refererer til dette som "hemmende saltvann".
  2. Gjenta trinn 2-5 ved hjelp av den hemmende saltvann, med en 10-30 minutters timelapse bilde satt i trinn 5.11. La det være 40-50 minutter etter påføring av hemmende saltvann før avbildning for å sikre fullstendig hemming av nevrofilamenttransport.
    MERK: Glykolytisk hemming vil til slutt drepe aksonene, så det er et smalt tidsvindu etter hemming for å skaffe data, vanligvis ca 30 minutter. En indikator på nivået av metabolsk hemming er flavin autofluorescens av aksonal mitokondrier, som kan oppdages i timelapse-serien på grunn av de lange eksponeringene som vi bruker til å bilde paGFP fluorescens14. Vanligvis vil mitokondrie autofluorescence øke under behandling med hemmende saltvann. Hvis mitokondriene begynner å runde opp eller fragmentere, så slutte å avbildning.

8. Bildebehandling og analyse ved hjelp av ImageJ

  1. Flatfield og darkfield korreksjon
    1. Åpne darkfield-bildestakken og gjennomsnittlig bildene ved å klikke på Bilde | Stabler | Z Prosjekt og velg Gjennomsnittlig intensitet i rullegardinmenyen for å generere darkfield-bildet.
    2. Åpne fluorescein flatfield bilde stabler og opprette en maksimal intensitet projeksjon av hver (25 totalt) ved å klikke Bilde | Stabler | Z Prosjekt og velg Maks intensitet i rullegardinmenyen.
    3. Kombiner de resulterende 25 maksimale projeksjonsbildene i en stabel ved å klikke bilde | Stabler | Bilder som skal stables. Opprett en gjennomsnittlig intensitetsprojeksjon av denne stakken ved å klikke Bilde | Stabler | Z Prosjekt og velg Gjennomsnittlig intensitet fra rullegardinmenyen for å generere flatfield-bildet.
    4. Trekk darkfield-bildet fra flatfield-bildet ved å klikke prosess | Bildekalkulator, og velg Trekk fra som operasjon. Kontroller at det er merket av for 32-biters (flottør) resultat. Resultatet er det korrigerte flatfeltbildet.
    5. Mål den gjennomsnittlige pikselintensiteten til det korrigerte flatfeltbildet ved først å klikke analyser | Angi Målinger og merk av for Gjennomsnittlige grå verdi, og trykk deretter på 'm'-tasten.
    6. Del det korrigerte flatfield-bildet med gjennomsnittlig intensitet ved å klikke prosess | Matematikk | Del og angi den gjennomsnittlige grå verdien som er oppnådd i trinn 7.1.5. Dette vil produsere det inverse gevinstbildet.
    7. Åpne bildene før aktivering og etter aktivering sammen med timelapse-bildestakken. Kombiner bildene i en enkelt stabel ved å klikke bilde | Stabler | Verktøy | Sammenkoble ,og velg bildene i kronologisk rekkefølge fra rullegardinmenyene. Kontroller at alternativet Åpne som 4D-bilde ikke er valgt. Den resulterende stakken er hele bildesettet.
    8. Gjenta trinn 8.1.4 på hele bildesettet,og del deretter resultatet med det inverse forsterkningsbildet ved å klikke Prosess | Bildekalkulator og velge Del som operasjon. Dette vil produsere korrigert full bildesett, der hvert bilde er korrigert for ikke-ensartethet innen belysning og på detektoren.
  2. Justering av bildestakk
    1. For å korrigere for feiljustering av bildeplanene i timelapse-serien på grunn av scene eller prøvedrift, installer justeringen av fast region plugin (Supplerende fil 1) ved å klikke Plugins | Installer PlugIn, naviger til mappen som inneholder plugin-filen, og velg plugin-modulen. Start ImageJ på nytt etter at du har installert programtillegget.
      MERK: Denne plugin justerer bilder basert på "minst firkanter congealing" prinsippet15.
    2. Tegn en avkastning på det korrigerte fullbildesettet som strekker seg over flere aksoner og ikke strekker seg utover de proksimale og distale grensene for den aktiverte fluorescensen i hver av aksonene. Geometrien i regionen er uviktig, men unntatt områder der strukturer endrer form eller størrelse vil forbedre justeringen.
    3. Kjør justeringpluginen ved å klikke plugins | Justering etter fast område. Programtillegget plasserer en standard maksimum på 2 piksler på forskyvningen mellom rammer, men dette kan justeres i det første popup-vinduet hvis det er betydelig drift av prøven. Justeringen kan ta flere minutter, avhengig av størrelsen på bildestakken.
    4. Inspiser den justerte stakken visuelt for å vurdere kvaliteten på justeringen. Noen rammer må kanskje justeres manuelt, da den automatiske justeringen kanskje ikke fungerer bra for store svingninger i fluorescens mellom rammer. Dette kan gjøres mens du ser på en ramme som må flyttes ved å klikke Bilde | Transformer | Oversett. Klikk Nei i følgende popup-vindu som spør om hele stakken skal oversettes. Bruk bare heltallspikselverdier i oversettelsen, og kontroller at rullegardininterpoleringsmenyen er satt til Ingen, siden brøkdels pikselskift eller interpolering vil endre dataene på grunn av omsampling av pikselintensitetene.
    5. Lagre dette som det justerte fullbildesettet.
  3. Måling av fluorescensintensiteter
    1. Tegn en roi ved hjelp av vinkelverktøyet på den første rammen av det justerte fullbildesettet med den første armen langs den ene kanten av det aktiverte området, vinkelrett på aksonene og den andre armen vertikal. Trykk på 'm'-tasten for å måle vinkelen, som beskriver retningen på aksonene i synsfeltet.
    2. Angi omfanget av bildene slik at dimensjoner måles i mikron ved å klikke analyser | Angi Skaler og angi de riktige verdiene.
    3. Åpne ROI-lederen ved å klikke analyser | Verktøy | ROI Manager. For pulsfluktparadigmet, hopp til trinn 8.3.7. For pulsspredningen fortsetter du til trinn 8.3.4.
    4. Tegn en firkantet avkastning av alle dimensjoner, og klikk deretter Rediger | Valg | Angi. Kontroller at alternativet Skalerte enheter er merket, og sett deretter avkastningen til en bredde på 15μm og en høyde som er lik eller større enn høyden på bildet.
    5. Roter avkastningen med vinkelen målt i trinn 8.3.1 ved å klikke Rediger | Valg | Roter for å gjøre den vinkelrett på aksonene, og plasser avkastningen med den ene siden langs den proksimale kanten av det aktiverte området. Legg til denne avkastningen, som vi vil referere til som proksimal guide roi, til lederen ved å trykke på 't'-tasten.
    6. Dra avkastningen for å justere etter den distale kanten av det aktiverte området, og legg til roi-lederen på nytt ved å trykke på t-tasten. Vi vil referere til dette som den distale guiden ROI. Proksimale og distale guide-ROIer vil bli brukt senere til å tegne flankemålings-ROIene.
    7. Velg aksoner for kvantifisering ved hjelp av timelapse-bildesekvensen som er anskaffet i trinn 5.11 ovenfor. Denne bildesekvensen er nyttig for dette formålet fordi den fanger den svake autofluorescence av aksonene, avslører deres morfologi utenfor den aktiverte regionen.
      MERK: Axons som ikke oppfyller følgende kriterier er utelatt fra analysen:
      1. Axons må være i fokus langs hele lengden av alle målevinduer.
      2. Axons må være innenfor 5° av vinkelrett på de proksimale og distale endene av aktiveringsområdet.
      3. Aksoner må ikke ha noen invaginasjoner innen 5μm av de proksimale og distale endene av aktiveringsområdet.
      4. Ekskluder aksoner som endrer form synlig i løpet av bildet.
      5. Ekskluder aksoner som virker usunne som det fremgår av fraværet av et diskret aktivert område i bildet etter aktivering (figur 2C, bunn), da dette indikerer diffus diffus dispersjon av den aktiverte fluorescensen, som skjer når aksonen dør.
    8. Vær oppmerksom på blekingsbilde med lang eksponering fra trinn 5.5 for autofluorescerende strukturer i aksoner. Denne fluorescensen skyldes flavins innenfor mitokondrier16. Ekskluder aksoner fra analyse hvis disse mitokondriene vises avrundet eller fragmentert (Figur 2D, bunn), i motsetning til utvidede, lineære strukturer (Figur 2D, topp), da dette er en indikasjon på metabolsk nedgang.
    9. Ved hjelp av proksimale og distale guide-ROIer som er opprettet ovenfor, tegner du tre måle-ROIer per axon som analyseres: et sentralt vindu som omfatter axon innenfor det 40 μm aktiverte området, og to flankerende vinduer med bredde begrenset av flankeringsvindu 15 μm-ROIer og høyde begrenset av diameteren på axon på grensen til aktiveringsområdet. Legg til alle tre regionene i roi manager. For glykolytisk hemmet aksoner, tegn en enkelt region som ikke er mer enn 5 μm bred i midten av det aktiverte området, og som ikke strekker seg utenfor axon. For pulsfluktparadigmet er den aktiverte regionen bare 5 μm bred, så hele vinduet må brukes.
    10. Gjenta trinn 8.3.9 for alle aksoner som oppfyller kriteriene for trinn 8.3.7 og 8.3.8.
    11. Angi aktive målinger til gjennomsnittlig pikselintensitet ved å klikke analyser | Angi Målinger og velg alternativet Lem grå verdi. Kontroller at ingen andre målealternativer er merket.
    12. Velg alle ROIer i ROI Manager-vinduet ved å velge vinduet og trykke 'Ctrl' + 'a'. I vinduet ROI Manager klikker du på Mer | Multi Measure for å måle fluorescensintensiteten. Kopier dataene fra resultatvinduet til et regneark for videre analyse.
    13. Angi aktive målinger til områdeområdet ved å klikke Analyser | Angi Målinger og velg Område-alternativet. Kontroller at ingen andre målealternativer er merket.
    14. Gjenta trinn 8.3.12. Det er bare nødvendig å kopiere en rad av resultatene for området, da området ikke varierer med tiden.

9. Photobleach korreksjon

  1. I dataregnearket for glykolytisk hemmede aksoner trekker du den gjennomsnittlige fluorescensen av ramme 1 (foraktiveringsrammen) fra gjennomsnittlig fluorescens av hver ramme som starter på ramme 3 (første timelapseramme) for en gitt avkastning. Resultatene er bakgrunnsstredde midler.
  2. Plott dataene som en scatterplot med rammenumrene som abscissa. Tilpass en eksponentiell trendlinje til dataene fra hver avkastning (de fleste regnearkprogrammer har denne funksjonen) med en formel i form av Ae-bx. Denne ligningen tilsvarer fotobleaching-funksjonen Ft = F0 * e-tɣ hvor F0 er fluorescens ved den første rammen av timelapse, ɣ er eksponentiell blekingshastighet, t er tiden, og e er den naturlige logaritmen basen.
  3. Gjenta trinn 9.1.1-9.1.2 for alle ROIer av alle aksoner fra glykolytisk hemmet nerver. For det mest nøyaktige estimatet av fotobleachingshastigheten, bruk minst 15 aksoner totalt fra minst 5 separate nerver. Bruk gjennomsnittet av eksponentielle bleking priser (ɣ) fra alle hemmede aksoner for å korrigere eksperimentelle data for fotobleaching. En ny blekekalibrering må utføres for hvert eksperiment eller studie, fordi fotobleaching er avhengig av bildeanskaffelsesinnstillingene og laserkraften, som kan endres over tid.
  4. Gjenta trinn 9.1.1 for alle aksler avbildet med normal saltvann (det vil si ikke glykolytisk hemmet).
  5. Del hvert datapunkt med e-tɣ, ved hjelp av tid for t og gjennomsnittlig ɣ funnet i trinn 9.1.3. Dette er fotobleach-korrigerte midler.
  6. Multipliser hvert datapunkt etter området for det området av interesse for å finne den totale fluorescensen i dette området til hver gang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 3 viser representative bilder fra pulsflukt- og pulsspredningseksperimenter. Vi har publisert flere studier som beskriver data innhentet ved hjelp av pulse-escape metoden og våre metoder for analyse av disse dataene5,6,7,8,17. Nedenfor viser vi hvordan pulsspredningsdataene kan gi informasjon om retningsbestemtheten og hastigheten til nevrofilamenttransport, som vi ikke har rapportert tidligere.

Neurofilament transport i axon er intermitterende og toveis. Denne transporten kan beskrives av fraksjonen av filamenter som beveger seg til enhver tid i anterograde og retrograd retninger, Equation 41 og Equation 40 henholdsvis, og deres hastigheter i anterograde og retrograd retninger, betegnet av Equation 39 og Equation 38 . Hvis vi tar den totale mengden neurofilament polymer per enhet lengde av akson å Equation 37 være , så flukser i anterograde og retrograd retninger gjennom en gitt region er gitt av

Equation 36

Og

Equation 35,

henholdsvis, og den totale Equation 34 fluksen gis av

Equation 33,

hvor Equation 70 har enheter μm-1, Equation 32 har enheter og har enheter Equation 31 Equation 34 Equation 30 . Siden fluksen på et gitt sted langs akson er mengden nevrofilamentpolymer som beveger seg forbi det stedet i en tidsenhet, er det relatert til gjennomsnittlig hastighet Equation 29 gjennom Equation 28 . Dermed kan vi skrive

Equation 27.

I et pulsspredningseksperiment kan fluksen bestemmes fra avgangshastigheten til fluorescerende nevrofilamenter fra den aktiverte regionen, som vi refererer til som det sentrale vinduet. Det totale tapet av fluorescerende neurofilamentpolymer fra dette sentrale vinduet per sekund Equation 26 er summen av tapene på grunn av fluorescerende nevrofilamentpolymerer som forlater i anterograde og retrograd retninger, det vil si.

Equation 25

Normalisert til det opprinnelige innholdet av fluorescerende neurofilamentpolymer i det sentrale vinduet, det vil Equation 24 si, hvor Equation 23 er lengden på det sentrale vinduet, blir denne tapshastigheten da

Equation 22

hvor Equation 21 er skråningen av nedgangen i fluorescens i det sentrale vinduet, som i utgangspunktet er lineær for en tidsperiode gitt av Equation 20 8. For et 40 μm sentralt vindu tilsvarer dette bare titalls sekunder. Men for vinduer så store, er overgangen til eksponentiell forfall fase gradvis og skråningen er effektivt lineær i flere minutter eller mer8.

I tidlige tider fanger de flankerte vinduene alle nevrofilamentene som går ut av det sentrale vinduet fordi disse filamentene ikke har tilstrekkelig tid til å passere gjennom de flankerende vinduene og gå ut av dem på den andre siden. I dette tilfellet er mengdene fluorescerende neurofilamentpolymer som forlater det sentrale vinduet anterogradely og retrogradely per sekund, det vil si fluksene og , gitt av økningen i Equation 19 Equation 18 neurofilamentinnholdet og i Equation 17 Equation 16 de flankerende vinduene. Normalisert til det opprinnelige innholdet av fluorescerende neurofilamentpolymer i det sentrale vinduet, blir økningen i flankevinduene

Equation 15

Equation 14

hvor Equation 13 og Equation 12 er bakkene av økningen i fluorescens i proksimale og distale flankerende vinduer, henholdsvis.

Dermed kan vi uttrykke den gjennomsnittlige hastigheten når det gjelder bakkene i de flankerende vinduene, det vil si.

Equation 11      (Eq. 1)

og forholdet mellom antall anterograde og retrograd bevegelige neurofilamenter i forhold til forholdet mellom disse bakkene, det vilå.

Equation 10     (Eq. 2)

hvor Equation 9 og Equation 8 betegne hvor hvor og betegne priser som neurofilaments reversere fra anterogradely til retrogradely flytte og vice versa8. Verdiene av Equation 7 og Equation 6 kan bestemmes ved å måle bevegelsen av individuelle neurofilamenter i kultiverte nevroner, som rapportert tidligere17. Viktigere, uttrykket for hastigheten i Eq. 1 gjelder bare på korte tider etter aktivering der fluorescerende nevrofilamenter kommer inn i flankevinduet, men ikke forlater. Varigheten av dette korte tidsvinduet vil avhenge av lengden på flankevinduene og kinetikken til nevrofilamentbevegelsen. Jo lenger flankering vinduer, i prinsippet, jo lengre tidsvinduet. Teoretisk kan man teste at dette kriteriet oppfylles ved å bekrefte at

Equation 5     (Eq. 3)

I motsetning til uttrykket for hastigheten i Eq. 1, som er gitt av forskjellen mellom bakkene i de flankerende vinduene, er uttrykket for retningsbestemthet i Eq. 2 robust til flankerende vindusstørrelse fordi det er gitt av forholdet mellom bakkene i de flankerende vinduene.

Figur 3 viser representative resultater fra pulsflukt- og pulsspredningseksperimenter på myelinerte aksoner i tibialnerven til en 8-ukers gammel hannmus fra vår hThy1 paGFP-NFM-linje på en C57Bl/6J-bakgrunn, med vindusstørrelser på henholdsvis 5 og 40 μm. Mus på minst 2 uker, både mannlige og kvinnelige, har blitt brukt til disse eksperimentelle paradigmene. Riktig alder og kjønn bør bestemmes av forskeren avhengig av hva som testes i studien. Over tid kan det ses at kantene på de aktiverte regionene blir uskarpe på grunn av avgang av nevrofilamenter i både anterograde og retrograd retninger, noe som resulterer i tap av fluorescens fra det sentrale vinduet.

For pulsfluktmetoden (figur 3A, C, E)kan fluorescensforfallet kinetikk i den aktiverte regionen gi informasjon om den langsiktige og kortsiktige pauseatferden8,18. For disse eksperimentene kan det aktiverte området være kort (vi bruker vanligvis 5 μm, se gul boks i figur 3A). For pulsspredningsmetoden (figur 3B, D, F) bruker vi et lengre aktivert område (40 μm her; se gul boks i figur 3B) for å gi et større utvalg av fluorescerende nevrofilamenter. Dette forlenger tiden som fluorescensøkningen i flankerområdene forblir lineære (se ovenfor). Det lineære domenet til denne fluorescensøkningen i flankeringsvinduene kan også økes ved å øke lengden på disse vinduene, men dette er begrenset av størrelsen på synsfeltet. Vi brukte 15 μm flankerende vinduer, vist i rødt og grønt, for dataene som vises i figur 3D.

Figure 3E,3F shows the quantification of the total fluorescence intensities (i.e., the sum of the pixel intensities) for the measurement windows shown in Figure 3C,3D respectively. For pulsfluktmetoden er forfallet bifasisk, med en innledende eksponentiell forfall som representerer avgang av on-track neurofilamenter. Dette går over på rundt 10-20 minutter til en annen langsommere eksponentiell forfall som representerer mobilisering og avgang av off-track filamenter8. For sammenligning med pulsspredningsmetoden viser vi bare et 12 minutters tidskurs i figur 3E, men vanligvis må tidsforløpet for analysen være lengre (vanligvis 30-120 minutter) for å fange den langsiktige pausennetisk5,,6,,18. For pulsspredningsstrategien er beregningene av bevegelsens hastighet og retningsbestemthet bare avhengig av bakkene i de flankerte vinduene. For vinduslengdene som brukes her, strekker den lineære fasen seg i ca. 5 minutter. Varigheten av dette tidsvinduet av linearitet bør vurderes ved trinnvis forkorte tiden som brukes til å måle skråningen, og bestemme punktet der skråningen ikke lenger øker. Denne varigheten kan økes ved å øke vinduslengdene hvis kamerafeltet tillater det, selv om vinduslengdene skal holdes konstante for alle aksoner i et gitt eksperiment. Som et eksempel har vi brukt de første 5 minuttene med data til å måle bakkene for pulsspredningsdataene i figur 3F. Dette resulterer i bakker på 72 A.U./min, -594 A.U./min og 111 A.U./min for proksimale, sentrale og distale vinduer, henholdsvis (A.U. = vilkårlige enheter). For å normalisere disse verdiene, er de delt på den første fluorescensen i det sentrale vinduet, noe som resulterer i priser på 0,108 %F0/min, -0,962 %F0/min og 0,173 %F0/min. Bruk av Eq. 3 finner vi at bevaringskriteriet ikke er oppfylt, noe som indikerer at vi ikke fanger opp alle fluorescensene i flankevinduene. Dette er en teknisk begrensning på grunn av synsfeltet til vårt EMCCD-kamera (82 μm x 82 μm). Kameraer med sCMOS-brikker, som kan ha mye større synsfelt, kan tillate bruk av større flankerende vindusstørrelser. Vi kan imidlertid ikke utelukke muligheten for at denne uoverensstemmelsen mellom de sentrale og flankerende bakkene også kan skyldes, i hvert fall delvis, å undervurdere omfanget av fotobleaching (se Diskusjon), som ville ha effekten av å undervurdere de positive bakkene i flankervinduene og overvurdere den negative skråningen i det sentrale vinduet.

Fra satsene i flankervinduene (%F0/min) og Eq. 2 ovenfor, og ved hjelp av verdier Equation 4 på og Equation 3 17beregner vi forholdet Equation 2 = 2,12. Dette indikerer at 68% av filamentene beveget seg anterograde og 32% retrograd. Ved hjelp av samme sats og Eq. 1 ovenfor beregner vi gjennomsnittlig netto befolkningshastighet Equation 1 = 40 * (0,00173-0,00108) = 0,026 μm / min, eller 0,037 mm / dag. Radioisotopiske pulsmerkingsstudier hos mus av lignende alder har rapportert en neurofilamentpopulasjonshastighet på ca. 0,6 mm/dag i de mest proksimale delene av isjiasnerven, og bremser til 0,12 mm/dag over en avstand på to centimeter19,,20. Våre pulsspredningsdata ble samlet inn i tibialnerven, omtrent 2-3 centimeter distal til disse tiltakene. Av de grunner som er nevnt ovenfor, mener vi at estimatet på 0,037 mm / dag er en undervurdering av den sanne hastigheten. Men ekstrapolering av romlig brems observert av radioisotopisk pulsmerking i tibialnerven, dette estimatet ikke urimelig, spesielt når vi anser at det ble bestemt ved hjelp av en helt annen metodikk på en helt annen romlig og timelig skala.

For å demonstrere evnen til pulsspredningsmetoden for å oppdage betydelige forskjeller mellom populasjoner, sammenlignet vi de proksimale og distale flankerende vindusbakkene målt fra nerver som er fulle av både normale og hemmersalter. Hemming av glykose blokkerer bevegelse av nevrofilamenter, som vi tidligere harrapportert 5,6,7. Vi vil diskutere senere valg av prøvestørrelser for eksperimenter, men her brukte vi en nerve i normal saltvann og to i hemmende saltvann, på grunn av begrensningen av ett oppkjøpsfelt per nerve under hemming. Figur 4A viser et eksempel timelapse fra en glykolytisk hemmet nerve, noe som viser en tilsynelatende reduksjon i transport ut av den aktiverte regionen. Faktisk finner vi betydelig lavere distale og proksimale bakker (figur 4B, p = 0,00000639 og 0,0121, henholdsvis Tukeys parvis sammenligning etter ANOVA) i nerver behandlet med hemmende saltvann versus de som er gjennomsyret med normal saltvann. Vi finner også en betydelig reduksjon i populasjonshastigheten mellom disse to forholdene (figur 4C, p = 0,0232, t-test med ulik avvik, etter F-test for lik varians med p = 0,0190).

Figure 1
Figur 1: Perfusjonskammeret. (A) Diagram som viser montering av perfusjonskammeret huset og den ytre pakningen, med rør koblet til saltvannsprøyten og avfall kolbe. (B) Diagram som viser monteringen av selve kammeret. Den indre pakningen legges flatt på toppen av #1,5 dekkslipp. Nerven er plassert på dekkslippen i brønnen skapt av den rektangulære åpningen av den indre pakningen. Mikroaveduktsklien plasseres over nerven for å smøre nerven mellom #1,5 dekkslipp og mikroaveduktlysbildet. Til slutt vendes smørbrødet før montering på toppen av den ytre pakningen på enheten vist i (A) og sikres med en låsering (ikke vist). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Tibial nerve forberedelse. (A) Bilde som viser plasseringen av tibial nerve i beinet av en mus, der gluteus overfladiske, biceps femoris, semitendinosus, popliteus, tibialis caudalis og flexor digitorum longus muskler har blitt fjernet. Tibialnerven kan ses på som en av tre store grener av isjiasnerven som oppstår i kneet. (B)Skjematisk av nerven i tverrsnittet i det monterte kammeret, som viser olje-nedsenking målet under dekkslips. Den beste optiske kvaliteten oppnås ved å aktivere og forestille seg laget av aksoner som er apposed til overflaten av dekkslippen; bildekvaliteten avtar dypere inn i nerven på grunn av lyssprøning. (C) Eksempler på en sunn akson (øverst), og av en usunn axon (nederst) umiddelbart etter aktivering. Den stiplede gule linjen markerer det aktiverte området. Den aktiverte fluorescensen har skarpe grenser i den sunne aksonen, mens den aktiverte fluorescensen i den usunne aksen diffuserer raskt ut av det aktiverte området og fyller axonen i løpet av sekunder. Vektstangen = 10 μm. (D)Eksempler på mitokondrieutseendet i en sunn akson (øverst) og en usunn akson (bunn). Mitokondriene er synlige på grunn av flavin autofluorescence16. De vises lineære (solide pilspisser) i sunne aksoner. I usunne aksoner blir mitokondriene først punktat (åpne pilspisser) og deretter svakere over tid, noe som gir en indikator på axon helse. Det stiplede åpne pilhodet i den sunne axon peker på en mitokondrieovergang fra lineær til punktat. Vektstangen = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Puls-flukt og puls-spredning eksperimenter. Eksempel på pre-aktivering, post-aktivering og timelapse bilder av myelinated axons i tibial nerve av en 8 uker gammel mus i (A) en puls-escape eksperiment og (B) en puls-spredning eksperiment. Bildet før aktivering er topppanelet, med bildene etter aktiveringen nedenfor.  Tidsstemplene viser tiden som er gått etter aktivering. De gule boksene representerer regionen som er aktivert. Disse aktiveringene ble utført ved hjelp av 5 skanninger med en 40 μs pixel dwell tid og 5% laserkraft. Vektstenger = 10 μm. (C) Målingen ROIer (gul) for tre aksoner i en puls-escape eksperiment. (D)Den proksimale (røde), sentrale (gule) og distale (grønne) måle-ROIene for tre aksoner i et pulsspredningseksperiment. Måle-ROIene for hver akson vises i heldekkende rødt (proksimalt), solid gult (sentralt vindu) og heldekkende grønt (distal vindu). (E) Plot av gjennomsnittlig fluorescens versus tid, gjennomsnitt av 3 aksoner i C. Stiplet linje er en eksponentiell funksjon som passer til dataene, av skjemaet Ft = Ae-τt, som beskrevet tidligere7. F) Tomter av fluorescens i de sentrale, distale og proksimale ROI versus tid, gjennomsnitt på 14 aksoner inkludert de tre aksonene i D. Hellingen beregnes fra trendlinjer som passer til de første 5 minuttene med data. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Effekten av metabolske hemmere på nevrofilamenttransport. (A)Eksempel på timelapsebilder av en nerve forbehandlet med 5,6 % (w/v) 2-deoksy-glukose og 0,5 mM natriumjodacetat for å hemme glykose og tømme cellulær ATP. Merk at de distale og proksimale grensene for de aktiverte regionene forblir skarpe, noe som indikerer en hemming av nevrofilamenttransport. Vektstangen = 10 μm. (B)Kvantifisering av bakkene i distal (D) og proksimale (P) flankerende vinduer (henholdsvis anterograd og retrograd), uttrykt som prosent av første fluorescens i det sentrale vinduet (%F0/min), fra en nerve (14 aksoner) ved hjelp av standard saltvann og fra to nerver (8 aksoner) forbehandlet med saltvann som inneholder glykolytiske hemmere. (C) Neurofilament populasjonshastigheter beregnet fra skråninger i flankerende vinduer, viser en betydelig nedgang i hastighet etter hemmerbehandling. - p < 0,005; ** - p < 0,01; * - p < 0,05. Dataene viser betydelig svekkelse av nevrofilamenttransport i nærvær av inhibitorene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ekstra video. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det må tas hensyn til i analysen av pulsflukt- og pulsspredningseksperimenter fordi det er betydelig potensial for innføring av feil under etterbehandlingen, hovedsakelig under flatfeltkorreksjon, bildejustering og blekemiddelkorreksjon. Flatfeltkorreksjon er nødvendig for å korrigere for ikke-ensartethet i belysningen, noe som resulterer i et fall i intensitet over synsfeltet fra sentrum til periferi. Omfanget av ikke-ensartethet er bølgelengdeavhengig og bør derfor alltid utføres ved bølgelengden som skal brukes til å anskaffe eksperimentelle data. Det er viktig å sikre at ikke-ensartethet i flat-feltet bildet er virkelig representativt for ikke-ensartethet i bildene som skal korrigeres. Pulsspredningseksperimenter er spesielt sårbare for feil fra feil flatfeltkorreksjon fordi måle-ROIene strekker seg mot periferien av bildet der intensitetsfallet er størst.

De optimale paGFP-aktiveringsinnstillingene varierer etter aktiveringsmetode og laserparametere, og må bestemmes empirisk før den første bildeøkten. For lite aktivering vil resultere i et lavt signal-til-støy-forhold for den aktiverte fluorescensen, mens for mye vil resultere i bleking av aktivert fluorescens fordi både den ikke-aktiverte og aktiverte paGFP kan være begeistret av fiolett lys. For å selektivt belyse en region av interesse for bildet, bruker vi en Andor FRAPPA laser galvo skanner, som genererer en klart definert region av fluorescens med skarpe grenser, som vist i representative resultater. Vi har også hatt suksess med å bruke en Andor Mosaic Digital Membran, som er en digital mikromirrorenhet, med en kvikksølvbuelampe som belysningskilde7. Andre alternativer er kommersielt tilgjengelige. En utfordring når du arbeider med paGFP er den forsinkede økningen i fluorescensintensiteten som skjer innen 1 minutt etter fotoaktiveringstrinnet. Denne økningen oppstår fordi belysning med fiolett lys fører til at en andel av de aktiverte paGFP-molekylene går inn i en "mørk tilstand" som de kan slappe av fra på et tidsforløpet på titalls sekunder11. I vår erfaring er økningen vanligvis mindre enn 5% med widefield eksitasjon, men kan overstige 20% med laser eksitasjon, noe som kan føre til en betydelig undervurdering av aktivert fluorescens. Vi tar høyde for dette ved å anskaffe et annet "post-aktivering" bilde av paGFP fluorescens 1 minutt etter fotoaktivering, og deretter bruke dette bildet som referansepunkt for den påfølgende timelapse. Det er imidlertid viktig å erkjenne at dette introduserer en annen potensiell feilkilde ved å bestemme den første fluorescensen og forfallet kinetikk i tidlige tider.

Ytterligere oppmerksomhet må rettes mot justeringen av bildestakkene. Den viktigste kilden til feiljustering er drift eller annen bevegelse av prøven under timelapse bildeoppkjøp. Dette kan minimeres ved hjelp av indre pakninger av riktig tykkelse og slik at preparatet kan "bosette seg" før avbildning. En slik forsinkelse vil imidlertid redusere tiden som er tilgjengelig for bildeanskaffelse siden preparatet har et begrenset vindu av levedyktighet. Det er også viktig å unngå justeringsalgoritmer som fordreier bildet eller introduserer subpikselskift, da disse prosedyrene vil sette pikselintensitetene i bildet på plass igjen. Pulsspredningseksperimenter er spesielt sårbare for feil som oppstår som følge av feil justering fordi grensene til regionen med aktivert fluorescens er relativt skarpe, og fluorescensen i denne regionen er betydelig høyere enn de flankerende uaktiverte områdene. Selv en liten feiljustering av bildeplanene i stabelen kan resultere i store hopp i fluorescensverdiene i de distale og proksimale målevinduene. Dermed er det viktig at bildesettene er riktig justert og inspisert nøye før du fortsetter med analysen.

Korreksjon for fotografering er nødvendig for å sikre at endringer i fluorescensintensitet over tid nøyaktig gjenspeiler endringer i mengden av det fluorescerende proteinet. Slike rettelser kan være en betydelig feilkilde ved å estimere de absolutte fluorescensintensitetene i de sentrale og flankerende vinduene. Etter hvert som fotobleaching kinetikk avhenger av intensiteten av belysning og miljøet i fluorofor, kan faktiske fotobleaching priser variere mellom økter og fra axon til axon. Dermed er det nødvendig å måle flere aksoner og gjennomsnittlig de resulterende dataene, som i seg selv introduserer noen feil. Tilnærmingen beskrevet ovenfor er å behandle nerven med glykolytiske hemmere og deretter aktivere fluorescensen i et område av interesse og spore tapet av fluorescensintensitet over tid. De glykolytiske hemmerne reduserer ATP og hemmer dermed nevrofilamenttransport slik at tapet av fluorescens skyldes helt og holdent fotobleaching og ikke bevegelse av nevrofilamenter ut av den aktiverte regionen. Den gjennomsnittlige bleking kinetikk bestemt på denne måten brukes deretter til å korrigere eksperimentelle data. Siden det ikke er praktisk å utføre en separat blekekalibrering i hver bildebehandlingsøkt, må en enkelt kalibrering brukes på flere økter spredt over mange uker. En ulempe med denne tilnærmingen er at den ikke tar høyde for variasjoner i laserkraft/belysningsintensitet fra dag til dag, som derfor bør overvåkes. En alternativ tilnærming, som vi refererer til som "egen blekekorreksjon", er å estimere fotobleaching ved å kvantifisere fluorescensen i midten av den aktiverte regionen i samme timelapse filmer som brukes til transportmålinger. Hvis denne måleregionen er sentralt plassert og mye kortere enn lengden på den aktiverte regionen, og deretter vil eventuelle fluorescerende nevrofilamenter som beveger seg ut av måleområdet bli erstattet av fluorescerende nevrofilamenter som beveger seg inn i den. Men med tiden øker sannsynligheten for ikke-fluorescerende nevrofilamenter som beveger seg inn i måleområdet fra flankerende ikke-fluorescerende områder av akson, noe som fører til en overestimering av tap av fluorescens på grunn av bleking. En fordel med denne tilnærmingen er at den korrigerer for blekeegenskapene innenfor det samme feltet, men en ulempe er at varigheten av tidsvinduet må bestemmes empirisk og vil avhenge av transporthastigheten samt lengden på den aktiverte regionen. Alt dette har blitt sagt, bør det bemerkes at estimeringen av retningsbestemt nevrofilamenttransport ved hjelp av vår metode er robust for blekingsfeil (som det er for flankering vindusstørrelse) fordi det er gitt av forholdet mellom bakkene i de flankerende vinduene og eventuell bleking korreksjon er en multiplikator som brukes på både teller og nevner i den beregningen.

På grunn av støyen som ligger i et fluorescerende system og potensialet for ytterligere feil lagt til under bilde etterbehandlingstrinnene beskrevet ovenfor, er det viktig å bruke store utvalgsstørrelser for tilstrekkelig statistisk kraft. Selv om det ikke er mulig å nøyaktig bestemme populasjonsmidler, avvik og effektstørrelser før eksperimentering, anbefaler vi at du brukerCohen-metoden 21 forutsatt en middels effektstørrelse og en alfa på 0,05. Dette resulterer i en Cohen's d, som er forskjellen i midler delt på den samlede standardavvik av begge populasjoner, på 0,5, noe som tyder på å anskaffe minst 105 prøver per gruppe. Når denne terskelen er nådd, kan man utføre en post hoc-kraftanalyse for å revurdere statistisk kraft i lys av faktiske befolkningstiltak. Under optimale eksperimentelle forhold, det bør være mulig å få fra 1-7 analyserbare aksoner (av 9-20 totalt axons) per aktivering, og 5-8 aktiveringer per nerve forutsatt oppkjøpet av en 10-minutters timelapse per aktivering.

Transgene mus som uttrykker fluorescerende fusjonsproteiner rettet mot mitokondrier eller vesikler har også blitt brukt til å studere aksonal transport av membranøse organeller i perifere nerver ex vivo22,,23,,24,,25. I tillegg har Schiavo-laboratoriet utviklet tilnærminger for å bilde av aksonal transport av retrograde flytte membranøse organeller i aksoner in vivo ved hjelp av fluorescerende merkede stivkrampetoksinfragmenter, som kan injiseres i muskelen og tas opp av motornerveterminaler26. Men siden membranøse organeller kan løses i disse aksonene ved fluorescensmikroskopi, er det mulig å analysere hastigheten og frekvensen av bevegelsen direkte ved hjelp av timelapse eller kymografanalyse. Pulsflukt- og pulsspredningsmetodene som er beskrevet her, ble utviklet med det spesifikke målet om å analysere kinetikken til nevrofilamenttransport i disse aksonene, der enkeltnevrfilamenter ikke kan løses. Dette krever en analyse på befolkningsnivå over en periode på minutter eller titalls minutter. Vi bruker en transgen mus til dette formålet, men det bør også være mulig å uttrykke det fotoaktive proteinet ved hjelp av metoder som viral transduksjon eller in utero elektroporasjon. Mens fokuset har vært nevrofilamenttransport, kan pulsflukt- og pulsspredningsmetodene også tilpasses for å studere bevegelsen av andre cytoskeletale og cytosoliske proteiner som transporteres langs aksoner i de langsomme komponentene i aksonal transport. Vi begrenser våre analyser til myelinerte aksoner fordi deres størrelse og myelinhylse tillater oss å løse dem fra sine naboer. Unmyelinated axons kan ikke løses på grunn av deres lille kaliber og tendens til å klynge i Remak bunter. Vi beskriver bruken av tibiale nerver ex vivo, men metodene bør også gjelde for andre perifere nerver som er tilstrekkelig lange (> 5 mm) og unbranched. I prinsippet bør det også være mulig å tilpasse disse metodene til bilde neurofilament transport in vivo (f.eks. ved kirurgisk å utsette en nerve i en sedert mus og deretter plassere musen på et mikroskop stadium).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke Paula Monsma for instruksjon og hjelp med konokal mikroskopi og tibial nerve disseksjon og Dr. Atsuko Uchida, Chloe Duger og Sana Chahande for hjelp med mus husdyrhold. Dette arbeidet ble delvis støttet av samarbeidende National Science Foundation Grants IOS1656784 til A.B. og IOS1656765 til P.J., og National Institutes of Health Grants R01 NS038526, P30 NS104177 og S10 OD010383 til A.B. N.P.B. ble støttet av et fellesskap fra Ohio State University President's Postdoctoral Scholars Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm Bioptechs 1907-1422-100 inner gasket
2-deoxy-D-glucose Sigma D6134
30mm Round Gasket w/ Holes Bioptechs 1907-08-750 outer gasket
35 x 10mm dish Thermo Fisher 153066 dissection dishes
40mm round coverslips Bioptechs 40-1313-0319
60mL syringe - Luer-lock tip BD 309653
Andor Revolution WD spinning-disk confocal system Andor outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems
Calcium chloride Fisher C79
Coverslips Fisher 12-541-B for fluorescein slide
D-(+)-glucose solution Sigma G8769
Dissecting pins Fine Science Tools 26001-70
Dissection forceps Fine Science Tools 11251-30 fine tipped forceps
Dissection microscope Zeiss 47 50 03
Dissection pan with wax Ginsberg Scientific 568859
Dissection scissors Fine Science Tools 14061-09 initial dissection scissors
FCS2 perfusion chamber Bioptechs 060319-2-03
Fluorescein sodium Fluka 46960
Inline solution heater Warner Instruments SH27-B
Laminectomy forceps Fine Science Tools 11223-20 initial dissection forceps
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506
Microaqueduct slide Bioptechs 130119-5
Microscope slides Fisher 12-544-3 for fluorescein slide
Microscope stage insert Applied Scientific Instrumentation I-3017
Objective heater system Okolab Oko Touch with objective collar
Objective oil - type A Nikon discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective Nikon MRD01901
Potassium chloride Fisher P217
Potassium phosphate Sigma-Aldrich P0662
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium iodoacetate Sigma-Aldrich I2512
Syringe pump Sage Instruments Model 355
Tubing adapter - female Small Parts Inc. 1005109
Tubing adapter - male Small Parts Inc. 1005012
Tygon tubing Bioptechs 1/16" ID, 1/32" wall thickness
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15018-10 fine scissors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffman, P. N., Lasek, R. J. The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons. Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).
  2. Brown, A. Slow Axonal Transport. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
  3. Wang, L., Ho, C. -L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses. Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).
  4. Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons. Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).
  5. Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons. Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).
  6. Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells. Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).
  7. Walker, C. L., et al. Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier. Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).
  8. Li, Y., Brown, A., Jung, P. Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method. Physical Biology. 11 (2), 026001 (2014).
  9. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  10. Breuer, A. C., et al. Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis. Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).
  11. Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
  12. Model, M. Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes. Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).
  13. Schmidt, M. M., Dringen, R. Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes. Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).
  14. Surre, J., et al. Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival. Scientific Reports. 8 (1), 12088 (2018).
  15. Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images. Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).
  16. Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein. Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).
  17. Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics. Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).
  18. Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses. Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).
  19. Xu, Z., Tung, V. W. Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons. Neuroscience. 102 (1), 193-200 (2001).
  20. Jung, P., Brown, A. Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve. Physical Biology. 6 (4), 046002 (2009).
  21. Cohen, J. The effect size index: d. Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed. , Lawrence Erlbaum Associates. 20-26 (1988).
  22. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
  23. Gilley, J., et al. Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a "P301L" tau knockin mouse. Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).
  24. Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).
  25. Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability. Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).
  26. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 162 aksonal transport nevrofilament fotoaktivering pulsspredning pulsflukt nerve konfokal mikroskopi
Avbildning og analyse av neurofilamenttransport i ekskisert mus tibial nerve
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boyer, N. P., Azcorra, M., Jung, P., … More

Boyer, N. P., Azcorra, M., Jung, P., Brown, A. Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve. J. Vis. Exp. (162), e61264, doi:10.3791/61264 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter