Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Modellering Brain Metastaser gennem intrakraniel injektion og magnetisk resonans Imaging

Published: June 7, 2020 doi: 10.3791/61272
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2, 1,4, 1, 1,4, 1,2
1The Comprehensive Cancer Center, The Ohio State University, 2Department of Radiation Oncology, The Ohio State University, 3Department of Veterinary Biosciences, The Ohio State University, 4Davis Heart & Lung Research Institute, The Ohio State University

Summary

Intrakraniel hjerne metastase modellering kompliceres af en manglende evne til at overvåge tumor størrelse og reaktion på behandling med præcise og rettidige metoder. Den præsenterede metode par intrakraniel tumor injektion med magnetisk resonans imaging analyse, som når de kombineres, dyrker præcise og konsekvente injektioner, forbedret dyreovervågning, og præcise tumor volumen målinger.

Abstract

Metastatisk spredning af kræft er en uheldig konsekvens af sygdomsprogression, aggressive kræft undertyper, og / eller sen diagnose. Hjernemetastaser er særligt ødelæggende, vanskelige at behandle, og giver en dårlig prognose. Mens den præcise forekomst af hjernen metastaser i USA er fortsat svært at vurdere, det er sandsynligt, at stige som ekstrakranære behandlinger fortsætte med at blive mere effektiv i behandling af kræft. Det er derfor nødvendigt at identificere og udvikle nye terapeutiske tilgange til behandling af metastase på dette sted. Til dette formål, intrakraniel injektion af kræftceller er blevet en veletableret metode til at modellere hjernen metastase. Tidligere, den manglende evne til direkte at måle tumorvækst har været en teknisk hindring for denne model; men, øge tilgængeligheden og kvaliteten af små dyr billeddannelse modaliteter, såsom magnetisk resonans imaging (MR), er langt bedre evne til at overvåge tumorvækst over tid og udlede ændringer i hjernen i den eksperimentelle periode. Heri, intrakraniel injektion af murine mammary tumorceller i immunkompetente mus efterfulgt af MR-scanning er påvist. Den præsenterede injektion tilgang udnytter isofluran anæstesi og en stereotaktisk setup med en digitalt styret, automatiseret bore- og nåleindsprøjtning for at øge præcisionen og reducere tekniske fejl. MR-scanning måles over tid ved hjælp af en 9,4 Tesla instrument i The Ohio State University James Omfattende Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumor volumen målinger er demonstreret på hvert tidspunkt gennem brug af ImageJ. Samlet set denne intrakraniel injektion tilgang giver mulighed for præcis injektion, dag-til-dag overvågning, og præcise tumor volumen målinger, som tilsammen i høj grad forbedre nytten af denne model system til at teste nye hypoteser om driverne af hjernen metastaser.

Introduction

Hjernen metastaser er 10 gange mere almindelige end voksne primære centralnervesystemet tumorer1,og er blevet rapporteret i næsten alle solide tumortype med lungekræft, brystkræft, og melanom udviser den højeste forekomst2. Uanset den primære tumor site, udviklingen af hjernen metastase fører til en dårlig prognose ofte forbundet med kognitiv tilbagegang, vedvarende hovedpine, anfald, adfærdsmæssige og / eller personlighedsændringer1,,3,,4,5. Med hensyn til brystkræft, der har været mange fremskridt i forebyggelse og behandling af sygdommen. Men, 30% af kvinder diagnosticeret med brystkræft vil gå på at udvikle metastaser, og af dem med fase IV sygdom, ca 7% (SEER 2010-2013) har hjernen metastase6,7. Nuværende behandlingsmuligheder for hjernemetastaser indebærer kirurgisk resektion, stereotaktisk radiokirurgi og/eller hel hjernestrålebehandling. Men selv med denne aggressive behandling, median overlevelse for disse patienter er en kort 8-11 måneder7,,8,,9. Disse dystre statistikker støtter kraftigt behovet for at identificere og gennemføre nye, effektive terapeutiske strategier. Således, som med alle kræftformer, der metastaserer til hjernen, er det vigtigt at korrekt model brystkræft associeret hjerne metastase (BCBM) i laboratoriet for at sikre betydelige fremskridt på området.

Til dato har forskere udnyttet en række metoder til at studere mekanismer af metastase til hjernen, hver med forskellige fordele og begrænsninger10,11. Eksperimentelle metastase metoder såsom hale vene og intracardiac injektion sprede tumorceller i hele kroppen og kan resultere i enorme tumor byrde på andre metastatiske steder afhængigt af de injicerede celler. Disse resultater er derefter confounding hvis specifikt studere metastase til hjernen. Den intracarotis arterie injektion metode er fordelagtig, da det specifikt er rettet mod hjerne-såning af tumorceller, men er begrænset, da det kan være teknisk vanskeligt at udføre. Ortopisk primær tumor resektion er ofte betragtes som den mest klinisk relevante model af metastase, da det opsummerer hele metastatisk kaskade. Men denne tilgang indebærer længere ventetider for spontan metastase at forekomme med dramatisk lavere satser for hjernens metastase i forhold til de andre metastatiske steder såsom lymfeknuden, lungen og leveren. Ofte skal dyr fjernes fra undersøgelser på grund af tumor byrde på disse andre metastatiske steder forud for udviklingen af hjerne metastase. Andre metoder, der involverer hjernen tropiske cellelinjer er effektive til metastasering til hjernen; men disse modeller er begrænset i, at de tager tid at udvikle og ofte mister deres tropisme med formering. I betragtning af disse begrænsninger, forskere har rutinemæssigt brugt den intrakranielle injektion metode til model kræft metastase til hjernen11,12,,13,14 med varierende metoder15,16,17,18,19. Det erkendes, at denne fremgangsmåde ligeledes har begrænsninger, vigtigst af alt i, at det ikke giver mulighed for undersøgelse af tidlige metastatiske skridt, herunder intravasation ud af den primære tumor, penetrans gennem blod-hjerne barrieren, og etablering i hjernen. Men, Det giver mulighed for forskere at teste (1) hvad tumor afledte faktorer mægle vækst i hjernen (f.eks genetisk manipulation af en onkogen faktor i tumorceller), (2) hvordan ændringer i metastatisk mikromiljø ændre kræft vækst på dette sted (f.eks sammenligning mellem transgene mus med ændrede stromale komponenter) og (3) effektiviteten af nye terapeutiske strategier på vækst af etablerede læsioner.

I betragtning af den potentielle nytte af den intrakranielle injektion model, Er det absolut nødvendigt at reducere tekniske fejl under injektion og til præcist at overvåge tumorvækst over tid. Den metode, der er beskrevet heri indebærer kontinuerlig dosering af inhaleret gas anæstesi, og direkte implantation af tumorceller i hjernen parenkym ved hjælp af en stereotaktisk bore- og injektionsstand. Administration af gasbedøvelse giver mulighed for finjustering af dybden og længden af anæstesi samt sikre en hurtig og glat genopretning. Et digitalt styret, automatiseret bore- og nåleindsprøjtningssystem forbedrer injektionsstedets præcision og reducerer tekniske fejl, der ofte opstår ved boring og håndindsprøjtningsmetoder. Brugen af magnetisk resonans imaging (MR) yderligere øger præcisionen i overvågningen tumorvækst, tumor volumen, væv svar, tumor nekrose, og reaktion på behandling. MR er den billeddannende modalitet valg for blødt væv20,21. Denne billeddannelsesteknik bruger ikke iioniserende stråling og foretrækkes frem for computertomografi (CT), især for flere billedbehandlinger i løbet af en undersøgelse. MR har langt større udvalg af tilgængelige blødt væv kontrast derefter CT eller ultralyd imaging (USG) og præsenterer anatomi i flere detaljer. Det er mere følsom og specifik for abnormiteter i selve hjernen. MR kan udføres i enhver billedbehandling fly uden at skulle fysisk flytte emnet, som det er tilfældet i 2D USG eller 2D optisk billeddannelse. Det er vigtigt at nævne, at kraniet ikke dæmpe MR-signalet som i andre billeddannelse modaliteter. MR tillader evaluering af strukturer, der kan skjules af artefakter fra knogle i CT eller USG. En yderligere fordel er, at der er mange kontrastmidler til rådighed for MR, som øger læsion detektion grænse, med relativt lav toksicitet eller bivirkninger. Vigtigere, MR tillader overvågning i realtid i modsætning til histologisk evaluering på tidspunktet for obduktion, som er begrænset i dechifrere tumor volumen. Andre billeddannelse modaliteter, såsom bioluminescerende billeddannelse, er faktisk effektive til tidlig tumor detektion og overvågning over tid; Denne metode kræver dog genetisk manipulation (f.eks. luciferase/GFP-mærkning) af cellelinjer og giver ikke mulighed for volumetriske målinger. MR er yderligere fordelagtig, da det afspejler patient overvågning og downstream volumetrisk analyse af MR-billeder er kendt for at være stærkt korreleret til histologisk tumor størrelse ved obduktion22. Serieovervågning med MR-screening øger også den kliniske overvågning af neurologiske funktionsnedsættelser, hvis de opstår.

Samlet, den præsenterede metode til stereotokratisk intrakraniel tumor injektion efterfulgt af seriel MR giver os mulighed for at producere pålidelige, forudsigelige, og målbare resultater til at studere mekanismer af hjernen metastase i kræft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder, der er beskrevet heri, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på The Ohio State University (P.I. Gina Sizemore; protokol #2007A0120). Alle gnaver overlevelse kirurgi IACUC politikker følges, herunder brug af sterile teknikker, forsyninger, instrumenter, samt pels fjernelse og steril forberedelse af indsnit site.

1. Intrakraniel injektion af brystkræftceller

BEMÆRK: Den metode, der er beskrevet heri udnyttet DB7 murine mammary tumor cellelinje stammer fra en primær MMTV-PyMT tumor23. Tidligere undersøgelser har etableret intrakraniel injektion af DB7 celler som en model af BCBM med histologi, der efterligner den menneskelige sygdom12. Vigtigere er det, immun-kompetente FVB / N mus anvendes til denne model som DB7 celler blev afledt af denne mus stamme. Da dette er en brystkræft model, voksne kvindelige mus bruges til disse undersøgelser.

  1. Forbered celler.
    1. I en steril hætte, aspirere medier fra cellekultur plader ved hjælp af standard teknikker.
    2. Vask celler med 1x DPBS og trypsinize ved hjælp af producentens protokol.
    3. Der tilsættes en passende mængde FBS-holdige medier for at stoppe trypsinreaktionen, og koncentrationen af celler bestemmes ved hjælp af et hæmocytometer eller en foretrukken metode.
    4. Pelletceller ved 300 x g i 4 min. ved 4 °C.
    5. Aspirere medier, vaskes med 1x DPBS, re-spin ved 300 x g i 4 min ved 4 °C.
    6. Opslæmrede celler i 1x DPBS til en passende koncentration, ca. 50.000 celler pr. injicerbart volumen på 2 μL.
      BEMÆRK: Cellenummeret afhænger af linjens aggressivitet og skal bestemmes af investigator. Vi bruger rutinemæssigt 2 μL, men brug af volumener <6 μL rapporteres15,,16,,17,,18,19. Lave lydstyrker er afgørende for at opretholde præcisionen.
    7. Placer resuspenderede celler på is, indtil injiceres for at opretholde levedygtigheden.
  2. Forbered mus til kirurgi.
    1. For mus med pels: Fjern pels fra kraniet, enten ved depilatorisk creme/lotion eller ved barbering. Gør dette inden for 24-48 timer før operationen som udfører dette trin for tæt på kirurgi kan forstyrre hudens kvalitet og sutur styrke.
      BEMÆRK: Kvindelige FVB/N-mus, der vejede ca. 25 g, blev anvendt på grund af studiet af metastatisk brystkræft, en overvejende kvindelig sygdom.
    2. Analgetika som bestemt af IACUC og til behandling hos dyrlægen: en subkutan injektion af Buprenorphin SR-LAB (0,05-0,1 mg/kg dosis Buprenorphin lager: 0,5 mg/ml for en dosis på 0,0025-0,088 ml) mindst 24 timer før operationen for at give op til 72 h analgesi, som kan gentages 48-72 h efter den første dosis, hvis det er nødvendigt. Også administrere NSAID (20% ibuprofen i drikkevand f.eks 1 mg/5 ml) mindst 24-48 timer før operationen og fortsætte i 2-7 dage efter operationen for at give et minimum 72 h post-operative analgesi.
      BEMÆRK: På Ohio State University, buprenorphin SR-LAB administreres af University Lab Animal Resources Veterinærpersonale, da det er et kontrolleret stof.
  3. Forbered stereotaktiske enheder til kirurgi.
    1. Tænd for alle anæstesimaskiner, digitale Vernier-vægte og digitale injektorer.
      BEMÆRK: Alle kirurgiske værktøjer skal rengøres og steriliseres tilstrækkeligt før operationen.
    2. Udnyt bedøvelsesmaskiner med induktionskammer fastgørelse i et biologisk sikkerhedsskab (Figur 1A).
    3. Sørg for, at alle rør fra anæstesimaskiner er tilsluttet de stereotaktiske rammer (Figur 1B, indsat 1C) og klemmer på rørene er åbne for alle enheder, der anvendes. Luk alle klemmer på rør, der går til stereotaktiske rammer, der ikke vil blive brugt til kirurgi.
    4. Indstil anæstesimaskiner til producentens anbefalede næsekevestrømningshastighed baseret på musevægten (f.eks. 25 g dyrevægt: næsekegeflowhastighed 34 ml/min.).
      BEMÆRK: Hovedholderen, der er inkluderet i denne stereotaktiske opsætning, anbefales kun til voksne mus. Sørg for, at producentens anbefalinger, der følger med den stereotiske opsætning, følges.
    5. Sørg for, at det relevante bedøvelsesmiddel (f.eks. isofluran) i sprøjten er fastgjort til bedøvelsesmaskinen (Figur 1B).
      BEMÆRK: Over-priming sprøjten kan forårsage for meget anæstesi, der skal leveres til musene under operationen og resultere i en bedøvelse overdosis.
    6. Forbered øvelserne ved at dreje scenelåsen, indsætte en borebitadapter og et 1 mm borebit i hvert bor og låse boret ved manuelt at stramme bitlåsen.
    7. Fastgør boremaskiner på stereotaktiske rammer (Figur 1C).
    8. Rengør Hamilton sprøjter med 5 skiftevis vasker af 1x DPBS, derefter 70% ethanol, så igen i 1x DPBS. Sted til side, indtil dyret er prepped til injektion.
    9. Indstil den digitale injektor til at levere med en hastighed på 0,4 μL/min. og et mål på 2 μL. Denne hastighed og volumen giver mulighed for langsom indførelse af tumorceller i hjernen, hvilket reducerer trykket og tilhørende skader.
  4. Placer mus på stereotaktiske rammer.
    1. Bedøve mus (f.eks isofluran) ved hjælp af ovennævnte induktion kammer.
    2. Vedligehold mus under hele proceduren på et dybt bedøvelsesfly. Den % anæstesi, der administreres af maskinen, afhænger af en række faktorer, herunder: strømningshastighed, stimuleringsgrad og kropstemperatur. Monitorer musene hyppigt under hele proceduren for dybde af anæstesi ved at evaluere for rytmiske respirationer (dyret gisper ikke); mangel på palpebral refleks (flagrende af øjenlågene, når stimuleret med en bomuld spids applikator); og mangel på tå knivspids (tilbagetrækning af lemmer på den skadelige stimulus klemme tæerne).
      BEMÆRK: Forskellige stammer af mus vil have en anden reaktion på anæstesi.
    3. Når musene er på et passende, dybt bedøvelsesmiddelplan, overføres musene til den stereotaktiske enhed. Brug en varmepude, mens musen er på den stereotaktiske maskine til at opretholde kropstemperaturen og en passende bedøvelsesplan.
      BEMÆRK: For at opnå lav profil bruger vi luftaktiverede håndvarmere placeret i en omvendt pipettespidskasse (museophævningsboks i figur 1D).
    4. Åbn musens mund og læg tænderne i mundbjælkens trug på næsestykket på den stereotaktiske ramme (Figur 2A). Skub næsekegen hen over musens næse/mund (Figur 2B).
      1. Placer mus med hovedet niveau til munden bar. Åbn forsigtigt munden med den stumpe ende af en bomuldsspidsapplikator og skub på plads. Sørg for, at næsekeden er helt over musens næse eller anæstesi, vil ikke blive leveret korrekt. Næsekeden vil ikke gå i indgreb med næsen, hvis tænderne ikke sidder inden for denne rille (Indsat figur 2A).
    5. Brug en steril vatpind, placere øjensmøremiddel på hver af musens øjne. Anvendelse af øjensmøremiddel afbøder tørring af hornhinden og reducerer risikoen for hornhinde skader og postoperative komplikationer relateret til hornhinde traumer.
    6. Stabilisere musens kranium ved at trykke den venstre ørebjælke op mod den mediale canthus af venstre øre, låse den på plads ved hjælp af skruen på stereotaktiske ramme. Skub derefter højre ørebjælke mod det mediale kanthus på højre øre og skru stramt på den stereotaktiske ramme (Figur 2B).
      BEMÆRK: Sørg for, at musens hoved er i niveau og lige, når du placerer ørestænger. Hvis hovedet er skævt eller vinklet, injektionen vil være på det forkerte sted i hjernen. Ørepropperne bør kun strammes, indtil kraniet er immobiliseret ved stimulering med moderat manuel sondering.
  5. Lav et calvarial vindue.
    1. Forbered og rengør hovedbunden med 3x skiftevis passerer hver af en betadin opløsning og 70% ethanol. På grund af nærheden af det kirurgiske sted til øjnene, skal du bruge betadin opløsning over den kirurgiske krat.
    2. Ved hjælp af en steril skalpel, foretage en 3 mm snit gennem huden langs den centrale median aspekt af kraniet (efter sagittal sutur linje). Blødning ved snittet bør være minimal. Hvis det sker, skal der trykkes konsekvent, fast tryk på blødningsstedet med en steril bomuldstipapplikator i >30 sekunder.
    3. Identificer og orientere boret vinkelret på bregma (Figur 2C), og sørg for at nulstille den digitale Vernier-skala til nul.
    4. Flyt boret 2 mm lateralt til sagittalsuturen og 1 mm forreste til koronalsuturen (Figur 2C). For reproducerbarhed skal du sørge for, at placeringen til venstre eller højre for den sagittale suturlinje forbliver ensartet for alle dyr.
    5. Drej boret på sin højeste hastighed. Sørg for, at huden flyttes væk fra boret for at undgå vævsskader forårsaget af den roterende bit og forsigtigt indlede boret på kraniet. Bor et hul ca. 0,5 mm dybt gennem calvariaen, hvilket resulterer i kalkningsvinduet. Pas på ikke at sænke boret for langt, ellers vil den bore ind i hjernen. Hvis du dropper sterilt saltvand på borestedet, mens boret er i bevægelse, kan det opveje enhver varme, der genereres af maskinen, og som kan forårsage termisk skade på det omgivende væv.
    6. Når calvarial vinduet er lavet, skal du forsigtigt hæve boret og fjerne den fra den stereotaktiske ramme.
    7. Rengør borebitsene med 70% ethanol og der er afsat, hvis de bruges igen. Hvis ikke, skal du fjerne borebits og nedsænkes i 70% ethanol.
  6. Indsprøjtning kræftceller i hjernen
    1. Fastgør den automatiske injektorenhed til det stereotaktiske apparat (Figur 1D).
    2. Træk op >2 μL celler grundigt opslænkes i 1x DPBS i en ren Hamilton sprøjte. Sørg for at opslænnes cellerne, umiddelbart før sprøjten fyldes, for at reducere sammenklumpdannelsen og sikre en homogen celleslam. Det er ideelt at trække op 6-8μL af cellevolumen for at sikre, at der ikke er nogen luftlommer / bobler.
    3. Placer Hamilton-sprøjten på injektorapparatet, og sæt kanylen til injektion ved at dispensere en lille mængde volumen på en engangssterillig drapere for at sikre, at injektoren fungerer korrekt. Tør sprøjten af med 70 % ethanol med en applikator med bomuldsspids(figur 1D, indsat). Dette fjerner tumorceller fra den ydre tønde af nåleskakten reducere risikoen for tumorcellesåning langs injektionskanalen.
    4. Juster nålespidsen til midten af calvarial vinduet, næsten røre den udsatte cerebrum.
    5. Nulstil den digitale Vernier-skala til nul.
    6. Stik langsomt nålen i en dybde på 3 mm ind i hjernen og lad nålen forblive i hjernen i mindst 60 sekunder, før du fortsætter. Denne tidsramme giver hjernen parenkym at tilpasse sig omkring nålen, hvilket reducerer modtryk og potentiel udvisning af tumorceller langs nålen tarmkanalen.
    7. Vælg Kør på injektorskærmen for at begynde leveringen af celler til injektionsstedet. Det vil tage ca. 5 min. at injicere dette volumen. Den forlængede tid for dette trin er at reducere sekundære skader forårsaget af injektion kraft på hjernen parenkym.
    8. Når injektionsprotokollen er færdig, skal nålen hvile i hjernen i mindst 3 min. igen, hvilket igen gør det muligt for hjernen parenkym at akklimatisere til injektionen.
    9. Efter mindst 3 min, hæve nålen fra hjernen med en hastighed på 0,75 mm / min. Gør dette på en ekstremt langsom og konsekvent måde at reducere modtryk og tumor sporing op nålen tarmkanalen.
    10. Når nålen er kommet ud af hjernen, fjernes Hamilton-sprøjten forsigtigt fra injektoren og rengøres som beskrevet i trin 1.2.8.
    11. Påfør varm knoglevoks på calvarial vinduet ved hjælp af en steril vatpind. Knoglevoks fungerer som en fysisk barriere for at holde tumoren i kraniet.
    12. Luk snittet (f.eks. 5-0 PDS opløselige suturer i et simpelt afbrudt mønster ELLER suturclips, alt efter hvad der er mest behageligt for kirurgen).
    13. Stop administrationen af anæstesi og fjern musen fra apparatet ved at låse op og skubbe ørepropperne ud, skubbe næsekeden af musen og frigøre tænderne fra mundbjælken.
    14. Placer musen i et rent bur, der er på en varmere indstillet til 37 °C til nyttiggørelse. Monitor mus under restitution, som typisk opstår 10-15 minutter efter anæstesi er blevet afbrudt.
    15. Når musen er fundet, overvåges for kriterier for tidlig fjernelse som fastlagt af værtsinstitutionens IACUC.

2. Magnetisk resonans imaging

  1. Gadolinium-baseret kontrastmiddel (100 μL/20 g kropsvægtmus på 0,1 M MultiHance) administreres til mus ved standardinperitonealinjektion 24 10-20 minutter før billeddannelse. Derefter bedøves ved hjælp af et induktionskammer med et inhaleret bedøvelsesmiddel (f.eks. isofluran) blandet med 95% O2 og 5% CO2 (dvs. leveret rumluftgas).
  2. Placer musen på en opvarmet holder for at opretholde kropstemperaturen. Fastgør hovedet med øre ben og en bid bar, og pladsholder i 9,4 T magnet udstyret med en mus hjerne overflade spole. Opretholde anæstesi under billeddannelse tid, en undersøgelse tager typisk omkring 20 min per mus. Monitor respirationsfrekvens og puls (~ 70 bpm) under hele proceduren ved hjælp af en pneumatisk pude og små dyr overvågningssystem.
  3. Anskjà 000-4228 ms, TE=12 ms, RARE Factor = 8, FOV=2,0 x 2,0 cm, matrixstørrelse = 256 x 256, 1 mm eller 0,5 mm skivetykkelse, NA=2-4, 15-30 sammenhængende skiver) og post Gadolinium-baseret kontrast T1-vægtet SJÆLDEN sekvens (TR = 1200 ms, TE=7,5 ms, SJÆLDEN Factor = 4 , FOV=2,0 x 2,0 cm, matrixstørrelse = 256 x 256, 1 mm eller 0,5 mm skivetykkelse, NA=2-4, 15-30 sammenhængende skiver).
  4. Post-imaging, placere musen i et bur på en varmere indstillet til 37 °C til nyttiggørelse.

3. Volumetriske tumormålinger

  1. Opnåelse af total tumorvolumen
    1. Åbn MR-DICOM datafil i ImageJ, en billedbehandling software til rådighed som en gratis download via National Institutes of Health (https://imagej.nih.gov/ij/)25.
      BEMÆRK: ImageJ giver mulighed for visning af DICOM-filer, som er forpligtet til at udnytte de indlejrede pixel dimensioner for tumor volumen beregninger (se Billede, Egenskaber, hvor "enhed af længde" kan indstilles som ønsket (f.eks mm)).
    2. Brug frihåndsmarkeingsværktøjet til at tegne en kontur omkring tumoren. Udfør disse valg i et mørkt rum for at øge synligheden. Juster ikke lysstyrke/kontrast for at bevare overensstemmelsen mellem sessionerne.
    3. Vælg Målér under fanen Analysér for at hente området i det valgte område. Hvis enhed af millimeter blev valgt i trin 3.1.1., vil området blive givet i kubik millimeter. Hvis det ønskes, skal du integrere Markering af frihånd ved at markere ctrl+D. Ændre outputfarven ved at gå til Rediger | Valgmuligheder | Farve. Konvertere billedet til et RGB-billede (Billede | Type | RGB-farve) før du gemmer som en .tif fil.
    4. Fortsæt med at måle alle tumorholdige udsnit for en individuel mus og kopiere værdier i en passende dataanalyse software program (f.eks Microsoft Excel eller GraphPad Prism).
    5. Sum områderne fra hver skive for at få den samlede tumorvolumen. Sørg for at rette området baseret på udsnitstykkelse (område/tykkelse).
    6. Gennemfør trin 3.1.1.-3.1.5. indtil alle mus har en total tumorvolumen. I betragtning af den noget subjektive karakter skitserer tumorer, er det ideelt, hvis den samme metode gentages flere gange og i gennemsnit for at reducere tekniske fejl.
    7. Hvis du vil angive skaleringslinjer, skal du åbne DICOM-datafilen og gå til Analysér | Redskaber | Skalerbar. Da dimensionerne allerede er indlejret i DICOM-filen, skal du blot vælge den ønskede længde/bredde. Skjult til et RGB-billede (Billede | Type | RGB-farve) før du gemmer som en .tif fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 3 oversigter tumor volumen kvantificering for en enkelt mus på to tidspunkter (dag 7 og dag 10) post-injektion af murine mammary tumorceller. Til dette eksperiment blev 50.000 DB7-celler injiceret, og dyrets hjerne blev evalueret af MR. For hver scanning blev der fanget 30 skiver (0,5 mm tykkelse). Evaluering af de 30 skiver pr scanning viste, at på dag 7 efter injektion, 5 skiver udstillet tumor byrde (Figur 3A) og på dag 10 efter injektion, 9 skiver udstillet tumor byrde (Figur 3B). Hvert billede blev evalueret for tumorområde som beskrevet, og området for hver ramme er afbildet i figur 3C. Den samlede tumor volumen bestemmes og justeres for skive tykkelse. Figur 4 viser de repræsentative data i publikationsformat, herunder repræsentative billeder (Figur 4A) og et histogram af tumorvolumen over tid (Figur 4B).

Figure 1
Figur 1: Stereotaktiske systemer og anæstesisystemer. anæstesi induktionskammer setup i en biologisk sikkerhed kabinet.A (B) Stereotactic anæstesi levering setup fremhæve anæstesi slanger fra bedøvelsesmiddel maskine til næsen kegle på stereotaktiske apparat (se indsat i (C)). Grønne pile angiver leveret bedøvelsesgasslanger, og blå pile angiver scavenged gasslanger. (C) Stereotaktisk stativ med boretilbehør. Indsat viser bedøvelsesslang (grønne og blå pile), mund bar, og øre barer. (D) Stereotaktisk stativ med automatiseret sprøjtepumpe og museopr opløftende kasse. Boksen er en omvendt pipettespidskasse, der indeholder håndvarmere, der bruges til at løfte musen til den rette højde og opretholde kropstemperaturen. Indsat viser retningen af Hamilton sprøjten i det automatiserede injektionsapparat. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Billedlig gengivelse af tandplaceringen på en stereotaktisk enhed, placering af ørestænger og calvarial vindue i forhold til Bregma. (A) Den billedlige af maxillary fortænder i tanden hak på næsen kegle. (B) Placeringen af venstre og højre øre stænger i den mediale kanthus af de respektive ører. CC) En pil angiver bregma og en rød prik angiver det sted, hvor calvarial vinduet skal foretages (2 mm lateral til sagittal sutur og 1 mm forreste til koronal sutur). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Eksempel på kvantificering af tumorvolumen for en enkelt mus over to tidspunkter efter injektionen. Billeder af skiver, der indeholder tumor på (A) dag 7 og (B) dag 10 efter injektion. Gul betegner tumorområde kvantificeret i ImageJ. (C)Udsnitsområde og samlet volumetrisk kvantificering som bestemt i ImageJ (*=korrektion for udsnitstykkelse (0,5 mm)). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Repræsentativ tumorvolumen kvantificering i publikationsformat. (A) Repræsentative billeder med skalabjælker (=2 mm). (B) Histogram skildrer tumor volumen (mm3) for de to tidspunkter. Fold ændring er noteret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Udnyttelsen af intrakraniel injektion efterfulgt af seriel overvågning med MR giver den unikke evne til at visualisere tumorvækst med tumorvolumen nøjagtighed over tid. Anvendelsen af digital billeddannelse analyse giver mulighed for fortolkning af hjernelæsioner for tumor volumen, blødning, nekrose, og reaktion på behandling.

Som med enhver procedure, er der vigtige skridt, der skal følges for succes. For det første er omhyggelig opsætning af stereotaktiske enheder afgørende for denne tekniks succes. På grund af den lille størrelse af murine kranium, let uoverensstemmelser kan resultere i dramatisk forskellige virkninger på tumor vækstrate og tage i eksperimentelle dyr. Som sådan er det nødvendigt med en ordentlig uddannelse i anvendelsen af disse instrumenter. For det andet sikrer en varmekilde under hele proceduren, at bedøvelsesplanet ikke falder for lavt. Lave kropstemperaturer placerer dyrene i risiko for pludselig at dø under anæstesi på grund af nedsat lægemiddelmetabolisme og utilsigtet overdosis af anæstesi og/eller kan forlænge restitutionstiderne. De præfabrikerede varmepuder kan være voluminøse og vanskelige at manøvrere rundt på den stereotaktiske maskine, men små, luftaktiverede håndvarmere købt gennem enhver kommerciel leverandør opretholde temperaturen og er små nok til at blive placeret i den omvendte pipette tip boks bruges til at ophøje musene til det relevante niveau for stereotaktisk setup. Endelig, kvantificering er ligetil, men ofte bestemme, hvad der er tumor versus hvad der ikke tumor kan være udfordrende. Det anbefales, at efterforskere rådfører sig med billedbehandlingspersonale for at sikre en nøjagtig vurdering. Det er også nyttigt at gentage tumor volumen målinger flere gange for at reducere fejl. Samt, hver undersøgelse bør analyseres af den samme person for alle billeder.

Den præsenterede protokol kan ændres afhængigt af brugerpræferencer. For det første er brugen af injicerbar anæstesi (f.eks. ketamin/xylazin) almindelig og kan helt sikkert anvendes i stedet for en inhaleret anæstesi (f.eks. isofluran) afhængigt af investigatorpræferencen. Det er dog vigtigt at overveje fordelene ved en inhaleret anæstesi: (1) ikke et kontrolleret stof, (2) niveau af anæstesi kan justeres over tid (sammenlignet med en forudgående dosis af ketamin bestemt af dyrs vægt), og (3) nyttiggørelse er relativt hurtig sammenlignet med ketamin/xylazin. For det andet giver brugen af den automatiske boremaskine en høj grad af nøjagtighed, men tilføjer tid til proceduren i betragtning af den tid, det tager at sætte op og rive enheden ned. Det er helt sikkert rimeligt at bruge en fri håndteknik, hvis det ønskes.

Denne protokol udnytter både en stereotaktisk opsætning samt brugen af MR, begge er forbundet med øgede omkostninger. Alternative metoder til intrakraniel injektion er tidligerebeskrevet 15,16,17,18,19. Nogle af disse metoder også ansætte brugen af bioluminescerende billeddannelse til at overvåge tumorvækst i hele undersøgelsen, hvis det foretrækkes.

Som nævnt ovenfor, Det er vigtigt at bestemme korrekt cellenummer til injektion afhængigt af det modelsystem, der undersøges. Injektion af murinceller i en immunkompetent vært har tendens til at kræve færre celler end injektion af humane celler i en immundefekt vært. Post-injektion tumor byrde overvågning af MR hjælper med at afgøre, om antallet af injicerede celler er passende, da det er muligt at se, hvornår tumorer nå et bestemt volumen og på hvilket tidspunkt mus begynder at nå tidlig fjernelse kriterier.

Nytten og den brede anvendelse af MR til ikkeinvasiv overvågning er blevet anvendt af andre i små dyreforsøg26. Mens MR giver flere fordele som allerede drøftet, der er faktisk begrænsninger værd at nævne. For det første er brugen af maskinen afhængig af kerneservicepersonale og maskintilgængelighed. For det andet kan det være dyrt at bruge. Hvis disse er bekymringer, brugen af bioluminescerende billeddannelse er et gyldigt alternativ til tumor overvågning17,19. For det tredje, kontrast mellem tumor og det omgivende væv (dvs. hjernen) kan variere mellem forskellige cellelinjer; men denne metode giver den største chance for at identificere tumor in vivo i mangel af celle mærkning. Endelig, MR er begrænset i sin beslutning, som kan skævvride tumor volumen data til, hvor det ser ud som om der er eksponentiel vækst, når der i virkeligheden væksten er lineær. Der er også en maksimal tumor volumen, der kan opnås gennem MR billeddannelse, men dette er mindre af en bekymring, fordi det er usandsynligt, en mus kunne overleve en tumor i den øvre ende. Tumoren afsløring grænse afhænger af typen og placeringen af tumoren i hjernen, om der er blod hjernebarriere lækage, og om tumoren er godt afgrænset eller infiltrerer i det omgivende væv. Det er også afhængig af, om det er en kontrast styrke tumor og hvilken type af MR imaging protokol anvendes. Det er vores erfaring, med en in-plane voxel størrelse på 78x78 μm og en 0,5 mm skive tykkelse, kan vi observere en 0,5 mm diameter tumor rutinemæssigt med en minimumsgrænse omkring 0,3 mm.

Med hensyn til intrakraniel injektion, der er flere begrænsninger at overveje. Første, intrakranielle injektioner ikke afspejler metastatisk kaskade i, at de helt omgå udviklingen af metastatiske egenskaber inden for den primære tumor, intravasation i blodbanen, og penetration gennem blod-hjerne barrieren11. For det andet, ved direkte indsprøjtning i hjernen denne metode inducerer betændelse, som kan forvirre resultater forbundet med neuroinflammation. Endelig kan direkte indsprøjtning på dette sted resultere i hurtig vækst over en kort periode. Det er afgørende at overvåge mus for neurologiske symptomer, herunder baglemmasslamelse, sløvhed, og ataksi.

Alle betragtes, injektion direkte ind i hjernen giver mulighed for overvågning af tumor tage sats, som kan informere forskeren om vækst specifikt inden for denne metastatisk site samt interaktion med hjernen metastatisk mikromiljø. Endvidere, overvågning af tumor byrde over tid gør det muligt for investigator til direkte at sammenligne ændrede tumor fænotyper, ændret mikromiljø fænotyper og reaktion på eksperimentelle terapeutiske strategier. I betragtning af den relativt lave forekomst af både spontan og eksperimentel hjernemetastase i musemodeller er den intrakranielle teknik faktisk et værdifuldt værktøj.

Kræft metastase til hjernen er en katastrofal diagnose med dårlig reaktion på de nuværende behandlingsstrategier1,,11,,27. Mens brystkræft er den fremherskende årsag til hjernen metastase hos kvinder og fokus heri, lungekræft er den mest almindelige årsag til hjernen metastase i alle kræftpatienter2. Yderligere, hjernen metastaser er blevet rapporteret hos patienter diagnosticeret med en række solide tumortyper, og det forventes, at forekomsten vil fortsætte med at stige som behandlinger fortsætte med at forbedre til behandling af ekstrakraniel sygdom. Således, mens fokus i dette forslag er på BCBM, intrakraniel kræft injektion og MR-analyse gælder for at studere hjernen metastaser af andre solide tumortyper samt primære hjernetumorer. Udnytte den intrakranielle injektion model af hjernen metastase gør det muligt for forskere at opsummere sygdom i store kohorter af dyr til at teste en række forskningsspørgsmål i håb om at bedre patientpleje. Ved at koble denne model med høj opløsning digitale billeder opnået ved MR, er det muligt at overvåge tumor volumen på flere tidspunkter samt tumor reaktion på terapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen oplysninger.

Acknowledgments

Repræsentative data blev finansieret gennem National Cancer Institute (K22CA218472 til G.M.S.). Intrakraniel injektioner udføres i The Ohio State University Comprehensive Cancer Center Target Validering Shared Resource (Direktør - Dr. Reena Shakya) og MR er afsluttet i The Ohio State University Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource (Direktør - Dr. Kimerly Powell). Begge delte ressourcer er finansieret gennem OSUCCC, OSUCCC Cancer Center Support Grant fra National Cancer Institute (P30 CA016058), partnerskaber med The Ohio State University gymnasier og afdelinger, og etablerede tilbageførselssystemer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Materials
Betadine Purdue Products 19-027132 Povidone-iodine, 7.5%
Bone Wax Surgical Specialities 903 Sterile and malleable beeswax and isopropyl palmitate
Buponorphine SR-Lab ZooPharm N/A Long acting injectable analgesic 5 mL (0.5 mg/mL) polymetric formulation
Cotton tip applicators Puritan 25-806 10WC Sterile long stemmed cotton tip applicators
Eye Ointment Puralube 17033-211-38 Lubricating petrolatum and mineral oil based ophthalmic ointment
Handwarmers Hothands HH2 Air-activated heat packs
Ibuprofen Up & Up 094-01-0245 100mg per 5mL in liquid suspension
Isoflurane Henry Schein INC 1182097 Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer
Scalpels Integra Miltex 4-410 #10 disposable scalpel blade
Skin Glue Vetbond 1469SB Skin safe wounds adhesive
Sterile Dressing TIDI Products 25-517 Individually packed sterile drapes
Suture Covidien SP5686G 45cm swedged 5-0 monofilament polypropylene suture
Stereotaxic Unit
High Speed Drill (Foredom) Kopf Model 1474 Max of 38,000 RPM
Mouse Gas Anesthesia Head Holder Kopf Model 923-B Mouth bar with teeth hole and nosecone
Non-Rupture Ear Bars Kopf Model 922 Ear bars suitable for mouse applications
Stereotaxic Instrument Kopf Model 940 Base plate, frame and linear scale assembly with digital readout monitor
Injector
Injector Needle and syringe Hamilton 80366 26 gauge needle, 51 mm needle length and 10 μL volume syringe
Legato 130A automated Syringe Pump KD Scientific P/N: 788130 Programmable touch screen base with automated injector
Anesthesia Machine
SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer Kent Scientific SS-01 Digital anesthesia machine
SomnoSuite Starter Kit for mice Kent Scientific SOMNO-MSEKIT Includes induction chamber, 2x anesthesia syringes, 18" tubing, plastic nosecone, 2x waste aneshesia gas canisters

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lin, X., DeAngelis, L. M. Treatment of Brain Metastases. Journal of Clinical Oncology. 33 (30), 3475-3484 (2015).
  2. Ostrom, Q. T., Wright, C. H., Barnholtz-Sloan, J. S. Brain metastases: epidemiology. Handbook of Clinical Neurology. 149, 27-42 (2018).
  3. Eichler, A. F., et al. The biology of brain metastases-translation to new therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 8 (6), 344-356 (2011).
  4. Steeg, P. S., Camphausen, K. A., Smith, Q. R. Brain metastases as preventive and therapeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 352-363 (2011).
  5. Valiente, M., et al. The Evolving Landscape of Brain Metastasis. Trends in Cancer. 4 (3), 176-196 (2018).
  6. Wang, H., et al. The prognosis analysis of different metastasis pattern in patients with different breast cancer subtypes: a SEER based study. Oncotarget. 8 (16), 26368-26379 (2017).
  7. Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
  8. Gong, Y., Liu, Y. R., Ji, P., Hu, X., Shao, Z. M. Impact of molecular subtypes on metastatic breast cancer patients: a SEER population-based study. Scientific Reports. 7, 45411 (2017).
  9. Kim, Y. J., Kim, J. S., Kim, I. A. Molecular subtype predicts incidence and prognosis of brain metastasis from breast cancer in SEER database. Journal of Cancer Researchearch and Clinical Oncology. 144 (9), 1803-1816 (2018).
  10. Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
  11. Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
  12. Meisen, W. H., et al. Changes in BAI1 and nestin expression are prognostic indicators for survival and metastases in breast cancer and provide opportunities for dual targeted therapies. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (1), 307-314 (2015).
  13. Russell, L., et al. PTEN expression by an oncolytic herpesvirus directs T-cell mediated tumor clearance. Nature Communications. 9 (1), 5006 (2018).
  14. Thies, K. A., et al. Stromal platelet-derived growth factor receptor-beta signaling promotes breast cancer metastasis in the brain. Cancer Research. , (2020).
  15. Kramp, T. R., Camphausen, K. Combination radiotherapy in an orthotopic mouse brain tumor model. Journal of Visualized Experiments. (61), e3397 (2012).
  16. Pierce, A. M., Keating, A. K. Creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors. Journal of Visualized Experiments. (91), e52017 (2014).
  17. Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
  18. Donoghue, J. F., Bogler, O., Johns, T. G. A simple guide screw method for intracranial xenograft studies in mice. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
  19. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  20. Fink, J. R., Muzi, M., Peck, M., Krohn, K. A. Multimodality Brain Tumor Imaging: MR Imaging, PET, and PET/MR Imaging. Journal of Nuclear Medicine. 56 (10), 1554-1561 (2015).
  21. Borges, A. R., Lopez-Larrubia, P., Marques, J. B., Cerdan, S. G. MR imaging features of high-grade gliomas in murine models: how they compare with human disease, reflect tumor biology, and play a role in preclinical trials. American Journal of Neuroradiology. 33 (1), 24-36 (2012).
  22. Prabhu, S. S., Broaddus, W. C., Oveissi, C., Berr, S. S., Gillies, G. T. Determination of intracranial tumor volumes in a rodent brain using magnetic resonance imaging, Evans blue, and histology: a comparative study. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 47 (2), 259-265 (2000).
  23. Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical & Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
  24. Journal of Visualized Experiments. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2020).
  25. Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  26. Lee, D., Marcinek, D. Noninvasive in vivo small animal MRI and MRS: basic experimental procedures. Journal of Visualized Experiments. (32), (2009).
  27. Shah, N., et al. Investigational chemotherapy and novel pharmacokinetic mechanisms for the treatment of breast cancer brain metastases. Pharmacological Research. 132, 47-68 (2018).

Tags

Cancer Research Intrakraniel injektion kræft hjerne metastase magnetisk resonans imaging billedanalyse stereotaktisk
Modellering Brain Metastaser gennem intrakraniel injektion og magnetisk resonans Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geisler, J. A., Spehar, J. M.,… More

Geisler, J. A., Spehar, J. M., Steck, S. A., Bratasz, A., Shakya, R., Powell, K., Sizemore, G. M. Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (160), e61272, doi:10.3791/61272 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter