Summary
Intrakraniell hjärnan metastas modellering kompliceras av en oförmåga att övervaka tumörstorlek och svar på behandling med exakta och snabba metoder. Den presenterade metodik par intrakraniell tumör injektion med magnetic resonance imaging analys, som när de kombineras, odlar exakta och konsekventa injektioner, förbättrad djur övervakning och noggrann tumör volym mätningar.
Abstract
Metastaserande spridning av cancer är en olycklig konsekvens av sjukdomsprogression, aggressiva cancer subtyper, och / eller sen diagnos. Hjärnmetastaser är särskilt förödande, svåra att behandla, och ger en dålig prognos. Medan den exakta förekomsten av hjärnan metastaser i USA är fortfarande svårt att uppskatta, Det är sannolikt att öka som extrakraniell terapier fortsätter att bli mer effektiva vid behandling av cancer. Således är det nödvändigt att identifiera och utveckla nya terapeutiska metoder för att behandla metastasering på denna webbplats. För detta ändamål, intrakraniell injektion av cancerceller har blivit en väletablerad metod för att modellera hjärnan metastasering. Tidigare har oförmågan att direkt mäta tumörtillväxt varit ett tekniskt hinder för denna modell; dock ökar tillgängligheten och kvaliteten på små djur imaging modaliteter, såsom magnetisk resonanstomografi (MRT), är kraftigt förbättra förmågan att övervaka tumörtillväxt över tiden och dra slutsatsen förändringar i hjärnan under den experimentella perioden. Häri, intrakraniell injektion av murine bröst tumör celler i immunkompetenta möss följt av MRI påvisas. Den presenterade injektionsmetoden utnyttjar isoflurananestesi och en stereotaktisk setup med en digitalt styrd, automatiserad borr- och nålinjektion för att förstärka precisionen, och minska tekniska fel. MRI mäts över tid med hjälp av ett 9,4 Tesla-instrument i Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumörvolymmätningar demonstreras vid varje tidpunktspunkt genom användning av ImageJ. Sammantaget möjliggör denna intrakraniell injektion strategi för exakt injektion, dag till dag övervakning, och korrekt tumör volym mätningar, som tillsammans kraftigt öka nyttan av denna modell system för att testa nya hypoteser på förarna av hjärnan metastaser.
Introduction
Hjärnmetastaser är 10 gånger vanligare än vuxna primära centrala nervsystemet tumörer1, och har rapporterats i nästan varje solid tumör typ med lungcancer, bröstcancer, och melanom uppvisar den högsta incidensen2. Oavsett den primära tumörplatsen leder utvecklingen av hjärnmetastas till en dålig prognos som ofta förknippas med kognitiv försämring, ihållande huvudvärk, kramper, beteendemässiga och/eller personlighetsförändringar1,3,4,5. När det gäller bröstcancer har det skett många framsteg när det gäller förebyggande och behandling av sjukdomen. 30% av kvinnor som diagnostiserats med bröstcancer kommer dock att fortsätta att utveckla metastaser, och av dem med stadium IV sjukdom, cirka 7% (SEER 2010-2013) har hjärnmetastas6,7. Nuvarande behandlingsalternativ för hjärnan metastasering innebär kirurgiska samband, stereotaktisk radiokirurgi och/eller hela hjärnan strålbehandling. Ändå, även med denna aggressiva terapi, median överlevnad för dessa patienter är en kort 8-11 månader7,8,9. Dessa dystra statistik stöder starkt behovet av identifiering och genomförande av nya, effektiva terapeutiska strategier. Således, som med alla cancerformer som metastaserar till hjärnan, det är viktigt att korrekt modellera bröstcancer associerade hjärnmetastaser (BCBM) i laboratoriet för att säkerställa betydande framsteg inom området.
Hittills har forskare utnyttjat en mängd olika metoder för att studera mekanismer för metastasering till hjärnan, var och en med tydliga fördelaroch begränsningar 10,11. Experimentell metastasering metoder såsom svans ven och intracardiac injektion sprida tumörceller i hela kroppen och kan resultera i enorma tumör börda på andra ögonbevarande platser beroende på de celler som injiceras. Dessa resultat är sedan förvirrande om specifikt studera metastasering till hjärnan. Intracarotid artär injektion metod är fördelaktigt eftersom det specifikt mål hjärnan-sådd av tumörceller men är begränsad eftersom det kan vara tekniskt svårt att utföra. Orthotopic primära tumör samband anses ofta vara den mest kliniskt relevanta modellen av metastasering som det rekapitulates hela ögonbevarande kaskad. Ändå innebär detta tillvägagångssätt långvariga väntetider för spontana metastasering ske med dramatiskt lägre frekvens av hjärnmetastaser jämfört med andra metastaserande platser såsom lymfkörteln, lungan och levern. Ofta måste djur tas bort från studier på grund av tumörbörda på dessa andra metastaserande platser före utvecklingen av hjärnmetastas. Andra metoder som involverar hjärntropic cellinjer är effektiva vid metastasering till hjärnan; emellertid, dessa modeller är begränsade i att de tar tid att utveckla och ofta förlorar sin tropism med förökning. Med tanke på dessa begränsningar har forskare rutinmässigt använt den intrakraniella injektionsmetoden för att modellera cancermetastas till hjärnan11,12,13,14 med varierande metodologier15,16,17,18,19. Det är erkänt att detta tillvägagångssätt på samma sätt har begränsningar, viktigast av allt i att det inte tillåter för undersökning av tidiga ögonbevarande steg inklusive intravasation ur den primära tumören, penetrans genom blod-hjärnbarriären, och etablering i hjärnan. Det gör det dock möjligt för forskare att testa (1) vilka tumör härledda faktorer medla tillväxt i hjärnan (t.ex. genetisk manipulation av en onkogen faktor i tumörceller), (2) hur förändringar i den metastaserande mikromiljö ändra cancertillväxt på denna webbplats (t.ex. jämförelse mellan transgena möss med förändrade stromalkomponenter) och (3) effektivitet av nya terapeutiska strategier på tillväxt av etablerade lesioner.
Med tanke på den potentiella nyttan av den intrakraniella injektionsmodellen är det absolut nödvändigt att minska tekniskt fel under injektionen och att exakt övervaka tumörtillväxt över tiden. Den metod som beskrivs häri innebär kontinuerliga dosing av inhalerade gas anestesi, och direkt implantation av tumörceller i hjärnan parenkym med hjälp av en stereotaktisk borr och injektionsställ. Administrera gasbedövning möjliggör finjustering djup och längd anestesi samt säkerställa en snabb och smidig återhämtning. Ett digitalt styrt, automatiserat borr- och nålinsprutningssystem förstärker injektionsplatsens precision och minskar tekniska fel som ofta uppstår genom borrning och frihandsinsprutningsmetoder. Användningen av magnetisk resonanstomografi (MRT) ytterligare ökar precisionen i övervakningen av tumörtillväxt, tumörvolym, vävnad svar, tumörnekros, och svar på behandling. MRI är den bildframställning modalitet val för mjuka vävnader20,21. Denna avbildningsteknik använder inte joniserande strålning och är att föredra framför datortomografi (CT), särskilt för flera bildtagningssessioner under loppet av en studie. MRI har mycket större utbud av tillgängliga mjukdelar kontrast sedan CT eller ultraljud avbildning (USG) och presenterar anatomi mer i detalj. Det är mer känsligt och specifikt för avvikelser i hjärnan själv. MRI kan utföras i alla bildframställning plan utan att fysiskt flytta ämnet som är fallet i 2D USG eller 2D optisk avbildning. Det är viktigt att nämna att skallen inte dämpa MRI signalen som i andra bildframställning modaliteter. MRI tillåter utvärdering av strukturer som kan vara skymd av artefakter från ben i CT eller USG. En ytterligare fördel är att det finns många kontrastmedel tillgängliga för MRI, vilket förstärker gränsen för att skada detektion, med relativt låg toxicitet eller biverkningar. Viktigt, MRI tillåter övervakning i realtid till skillnad från histologisk utvärdering vid tidpunkten för obduktion, som är begränsad i dechiffrera tumörvolym. Andra bildframställning modaliteter, såsom bioluminescerande avbildning, är verkligen effektiva för tidig tumör upptäckt och övervakning över tiden; emellertid, denna metod kräver genetisk manipulation (t.ex. luciferase / GFP märkning) av cellinjer och inte tillåter för volumetriska mätningar. MRI är ytterligare fördelaktigt eftersom det speglar patientens övervakning och nedströms volymetrisk analys av MR-bilderna är känt för att vara starkt korrelerade till histologic tumörstorlek vid obduktion22. Seriell övervakning med MRI screening ökar också den kliniska övervakningen av neurologiska nedskrivningar, om de uppstår.
Sammantaget presenteras metoden för stereotaktisk intrakraniell tumör injektion följt av seriell MRI gör det möjligt för oss att producera tillförlitliga, förutsägbara och mätbara resultat att studera mekanismer för hjärnan metastasering i cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs häri har godkänts av institutionella Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Ohio State University (P.I. Gina Sizemore; protokoll #2007A0120). Alla gnagare överlevnad kirurgi IACUC politik följs, inklusive användning av sterila tekniker, leveranser, instrument, samt päls borttagning och steril beredning av snittet webbplats.
1. Intrakraniell injektion av bröstcancerceller
OBS: Den metod som beskrivs häri utnyttjas DB7 murine bröst tumör cellinje som härrör från en primär MMTV-PyMT tumör23. Tidigare studier har etablerat intrakraniell injektion av DB7 celler som en modell av BCBM med histologi som härmar den av den mänskliga sjukdomen12. Viktigt, immun-kompetentA FVB/N möss används för denna modell som DB7 celler härstammar från denna mus stam. Eftersom detta är en bröstcancermodell används vuxna honmöss för dessa studier.
- Förbered celler.
- I en steril huva, aspirera media från cellkultur plattor med hjälp av standardtekniker.
- Tvätta celler med 1x DPBS och trypsinize med hjälp av tillverkarens protokoll.
- Tillsätt en lämplig volym FBS-innehållande media för att stoppa trypsinreaktionen och bestämma koncentrationen av celler med hjälp av en hemocytometer eller önskad metod.
- Pelletsceller vid 300 x g i 4 min vid 4 °C.
- Aspirera media, tvätta med 1x DPBS, re-spin vid 300 x g i 4 min vid 4 °C.
- Resuspend celler i 1x DPBS till en lämplig koncentration, cirka 50.000 celler per injicerbar volym av 2 μL.
OBS: Cell nummer är beroende av aggressivitet linjen och måste bestämmas av utredaren. Vi använder rutinmässigt 2 μL, men användning av volymer <6 μL rapporteras15,16,17,18,19. Låga volymer är avgörande för att bibehålla precisionen. - Placera återanvända celler på is tills injiceras för att upprätthålla lönsamheten.
- Förbered möss för operation.
- För möss med päls: avlägsna päls från kraniet, antingen genom avhårningskräm/lotion eller genom rakning. Gör detta inom 24-48 h före operationen som utför detta steg för nära kirurgi kan störa hudens kvalitet och sutur styrka.
OBS: Honor FVB/N möss som väger cirka 25 g användes på grund av studien av metastaserande bröstcancer, en övervägande kvinnlig sjukdom. - Administrera smärtstillande medel enligt vad som bestäms av IACUC och gånde veterinär: en subkutan injektion av Buprenorfin SR-LAB (0,05-0,1 mg/kg dos, Buprenorfinlager: 0,5 mg/mL för en dosering av 0,0025-0,088 mL) minst 24 h före operationen för att ge upp till 72 h analgesi, som kan upprepas 48-72 h efter den första dosen, om det behövs. Administrera även NSAID (20% ibuprofen i dricksvatten t.ex. 1 mg/5 mL) minst 24-48 h före operation och fortsätta i 2-7 dagar efter operationen för att ge en minimum 72 h postoperativ analgesi.
OBS: Vid Ohio State University, Buprenorfin SR-LAB administreras av University Lab Animal Resources Veterinärmedicinska personal eftersom det är ett kontrollerat ämne.
- För möss med päls: avlägsna päls från kraniet, antingen genom avhårningskräm/lotion eller genom rakning. Gör detta inom 24-48 h före operationen som utför detta steg för nära kirurgi kan störa hudens kvalitet och sutur styrka.
- Förbered stereotaktiska enheter för operation.
- Slå på alla anestesimaskiner, digitala Vernier-fjäll och digitala spridare.
OBS: Alla kirurgiska verktyg bör rengöras och steriliseras på ett tillfredsställande sätt före operationen. - Utnyttja narkosmaskiner med induktionskammarens fastsättning i ett biologiskt säkerhetsskåp (Bild 1A).
- Se till att alla rör från anestesimaskiner är anslutna till de stereotaktiska ramarna (Bild 1B, inset 1C) och klämmor på rören är öppna för alla enheter som används. Stäng eventuella klämmor på rör går till stereotaktiska ramar som inte kommer att användas för kirurgi.
- Ställ anestesi maskiner till tillverkaren rekommenderade näsa kon flöde baserat på mus vikt (t.ex. 25 g djur vikt: näsa kon flödeshastighet 34 mL/min).
OBS: Huvudhållaren som ingår i denna stereotaktiska uppsättning rekommenderas endast för vuxna möss. Se till att de tillverkarrekommendationer som medföljer stereotaktisk uppsättning upp följs. - Se till att lämplig bedövningsmedel (t.ex. isofluran) förfylld i sprutan fästs på anestesimaskinen (Figur 1B).
OBS: Över-priming sprutan kan orsaka för mycket bedövning som skall levereras till mössen under operation och resultera i en bedövningsmedel överdos. - Förbered borrarna genom att vrida på etapplåset, sätta i en borrskärsadaptor och en borrkrona på 1 mm i varje borr och lås borren genom att manuellt dra åt bit-låset.
- Fäst borrmaskiner på de stereotaktiska ramarna (Bild 1C).
- Rengör Hamilton sprutor med 5 växlande tvättar av 1x DPBS, sedan 70% etanol, sedan återigen i 1x DPBS. Placera åt sidan tills djuret är prepped för injektion.
- Ställ in digital injektor för att leverera med en hastighet av 0,4 μL/min och ett mål på 2 μL. Denna hastighet och volym möjliggör långsam introduktion av tumörceller i hjärnan, vilket minskar trycket och tillhörande skador.
- Slå på alla anestesimaskiner, digitala Vernier-fjäll och digitala spridare.
- Placera möss på stereotaktiska ramar.
- Söva möss (t.ex. isofluran) med hjälp av den tidigare nämnda induktionskammaren.
- Underhåll möss under hela proceduren vid ett djupt bedövningsplan. Den i % anestesi som maskinen administrerar beror på ett antal faktorer, inklusive: flödeshastighet, grad av stimulering, och kroppstemperatur. Övervaka mössen ofta under hela proceduren för djup av anestesi genom att utvärdera för rytmisk andning (djuret är inte flämtar); brist på palpebralt reflex (fladdrande av ögonlocken när stimuleras med en bomull spets applikator); och brist på tå nypa (tillbakadragande av lem på den skadliga stimulans av nypa tårna).
OBS: Olika stammar av möss kommer att ha ett annat svar på anestesi. - Efter möss är på ett lämpligt, djupt bedövningsflygplan, överför mössen till stereotaktisk enhet. Använd en värmeplatta medan musen är på stereotaktisk maskin för att upprätthålla kroppstemperaturen och ett lämpligt anestetika plan.
OBS: För att uppnå låg profil använder vi luftaktiverade handvärmare placerade inom en inverterad pipettspetslåda (musupplysningslåda i figur 1D). - Öppna musens mun och placera tänderna i tråget i munstången som ligger på nosbiten på stereotaktisk ram (Bild 2A). Skjut noskonen över musens näsa/mun (Bild 2B).
- Placera möss med huvudet nivå till mun bar. Öppna försiktigt munnen med den trubbiga änden av en bomullsspets applikator och skjut på plats. Se till att noskonen är helt över musens näsa eller att anestesi inte kommer att levereras på rätt sätt. Noskonen kommer inte att engagera sig med näsan om tänderna inte sitter inom detta spår (Inset Figur 2A).
- Med hjälp av en steril bomullspinne, placera ögonsmörjmedel på var och en av musens ögon. Tillämpning av ögat smörjmedel mildrar torkning av hornhinnan och minskar risken för hornhinnans skador och postoperativa komplikationer relaterade till hornhinnans trauma.
- Stabilisera musens skalle genom att trycka ned vänster öronstång upp mot vänster öras mediala canthus, låsa den på plats med hjälp av skruven på stereotaktisk ram. Skjut sedan höger öronstäng mot höger öras mediala kanthus och skruva åtsittande på stereotaktisk ram (Bild 2B).
OBS: Se till att musens huvud är jämnt och rakt när du placerar öronstänger. Om huvudet är snett eller vinklat, kommer injektionen att vara på fel plats i hjärnan. Öronstängerna ska dras åt ENDAST tills skallen är immobiliserad vid stimulering med måttlig manuell sondering.
- Gör ett kalvarialfönster.
- Förbered och rengör hårbotten med 3x växlande passerar var och en av en betadinlösning och 70% etanol. På grund av den kirurgiska platsens närhet till ögonen, använd betadinlösningen över den kirurgiska skrubben.
- Med hjälp av en steril skalpell, gör ett 3 mm snitt genom huden längs den centrala medianaspekten av kraniet (följer den sagittala suturlinjen). Blödning vid snittet ska vara minimal. Skulle det inträffa, applicera konsekvent, fast tryck på platsen för blödning med en steril bomullsspets applikator för > 30 sekunder.
- Identifiera och orientera borren vinkelrätt mot bregma (Figur 2C), se till att återställa den digitala Vernier-skalan till noll.
- För borren 2 mm lateral till sagittal suturen och 1 mm anterior till koronasuturen (Bild 2C). För reproducerbarhet, säkerställa platsen till vänster eller höger om sagittal suturlinjen förblir konsekvent för alla djur.
- Vänd borren på sin högsta hastighet. Se till att huden flyttas bort från borr för att undvika vävnadsskador orsakade av den roterande biten och försiktigt initiera borren på skallen. Borra ett hål ungefär 0,5 mm djupt genom calvaria, vilket resulterar i kalvarialfönstret. Var noga med att inte sänka borren för långt eller det kommer att borra i hjärnan. Att tappa steril koksaltlösning på borrplatsen medan borren är i rörelse kan uppväga all värme som alstras av maskinen och som kan orsaka termiska skador på den omgivande vävnaden.
- När calvarialfönstret är gjort, försiktigt höja borren och ta bort den från stereotaktisk ram.
- Rengör borrkronorna med hjälp av 70% etanol och ställ åt sidan om den används igen. Om inte, ta bort borrkrons och dränka i 70% etanol.
- Injicera cancerceller i hjärnan
- Fäst den automatiska injektorenheten på stereotaktisk apparat (Bild 1D).
- Dra upp >2 μL celler som noggrant återanvänds i 1x DPBS i en ren Hamilton spruta. Var noga med att återanvända celler omedelbart före påfyllning av sprutan för att minska klumpbildningen och säkerställa en homogen cellslam. Den är idealisk för att dra upp 6-8μL cellvolym för att säkerställa att det inte finns några luftfickor/bubblor.
- Placera Hamilton sprutan på injektorn apparaten, och prime nålen för injektion genom att fördela en liten mängd volym på en disponibel steril drapera för att säkerställa att injektorn fungerar korrekt. Torka sprutan med 70% etanol med en bomullsspets applikator (Figur 1D, inset). Detta tar bort tumörceller från den yttre pipan av nålen skaftet minska risken för tumörcell sådd längs injektionskanalen.
- Rikta nålspetsen till mitten av kalvarialfönstret, nästan vidrör den exponerade storhjärnan.
- Återställ den digitala Vernier-skalan till noll.
- Stick långsamt in nålen till ett djup av 3 mm in i hjärnan och låt nålen stanna kvar i hjärnan i minst 60 sekunder innan du fortsätter. Denna tidsram gör att hjärnan parenkym att överensstämma runt nålen, vilket minskar mottrycket och potentiell utvisning av tumörceller längs nålen tarmkanalen.
- Välj Kör på injektorskärmen för att påbörja leveransen av celler till injektionsstället. Det kommer att ta ungefär 5 min att injicera denna volym. Den långvariga tiden för detta steg är att minska sekundära skador orsakade av injektionskraft på hjärnparenkymet.
- När injektionsprotokollet är klart, låt nålen vila i hjärnan i minst 3 min, återigen tillåter hjärnan parenkym att acklimatisera sig till injektionen.
- Efter minst 3 min, höj nålen från hjärnan med en hastighet av 0,75 mm/min. Gör detta på ett extremt långsamt och konsekvent sätt att minska mottrycket och tumör spåra upp nålen tarmkanalen.
- När nålen har lämnat hjärnan, försiktigt bort Hamilton sprutan från injektor och ren enligt beskrivningen i steg 1.2.8.
- Applicera varmt ben vax på calvarial fönstret med hjälp av en steril bomullspinne. Benvaxet fungerar som en fysisk barriär för att hålla tumören i skallen.
- Stäng snittet (t.ex. 5-0 PDS dissolvable suturer i ett enkelt avbrutet mönster ELLER suturklipp, vilket som är mest bekvämt för kirurgen).
- Stoppa administrering av anestesi och ta bort musen från apparaten genom att låsa upp och glida ut öronstängerna, skjuta näsan konen av musen, och koppla bort tänderna från mun bar.
- Placera musen i en ren bur som är på en varmare inställd på 37 °C för återhämtning. Övervaka möss under återhämtning, vilket vanligtvis sker 10-15 minuter efter att anestesi har upphört.
- När musen har återställts övervakar du för tidiga borttagningskriterier som bestäms av värdinstitutionens IACUC.
2. Magnetisk resonanstomografi
- Administrera Gadoliniumbaserat kontrastmedel (100 μL/20 g kroppsviktsmus med 0,1 M MultiHance) till möss med intraperitoneal standardinjektion24 10- 20 minuter före avbildning. Därefter bedövas med hjälp av en induktionskammare med inhalerat bedövningsmedel (t.ex. isofluran) blandat med 95% O2 och 5% CO2 (dvs. levereras rum luftgas).
- Placera musen på en uppvärmd hållare för att bibehålla kroppstemperaturen. Säkra huvudet med öron stift och en bit bar, och placera innehavaren i 9,4 T magnet utrustad med en mus hjärnyta spole. Behåll anestesi under bildtagningstid, en studie tar vanligtvis ca 20 min per mus. Övervaka andningsfrekvens och puls (~ 70 bpm) under hela proceduren med hjälp av en pneumatisk kudde och smådjurs övervakningssystem.
- Skaffa en localizer-bild och avbilda sedan mushjärnan med hjälp av en T2-viktad RARE-sekvens (TR = 3500-4228 ms, TE=12 ms, RARE Factor = 8, FOV=2,0 x 2,0 cm, matrisstorlek = 256 x 256, 1 mm eller 0,5 mm skivatjocklek, NA=2-4, 15-30 sammanhängande skivor) och efter Gadolinium-baserad kontrast T1-viktad SÄLLSYNT sekvens (TR = 1200 ms, TE=7.5, RARE Factor = 4 , FOV=2,0 x 2,0 cm, matrisstorlek = 256 x 256, 1 mm eller 0,5 mm segmenttjocklek, NA=2-4, 15-30 sammanhängande skivor).
- Post-imaging, placera musen i en bur på en varmare inställd på 37 °C för återhämtning.
3. Volymetriska tumörmätningar
- Erhållande av total tumörvolym
- Öppna MRI DICOM datafil i ImageJ, en bildbehandling programvara tillgänglig som en gratis nedladdning via National Institutes of Health (https://imagej.nih.gov/ij/)25.
OBS: ImageJ tillåter visning av DICOM-filer, vilket krävs för att utnyttja de inbäddade pixeldimensionerna för beräkningar av tumörvolym (se Bild, Egenskaper där "längdenhet" kan ställas in enligt önskemål (t.ex. mm)). - Använd freehandval verktyget för att rita en kontur runt tumören. Utför dessa val i ett mörkt rum för att öka synligheten. Justera inte ljusstyrka/kontrast för att bibehålla överensstämmelsen mellan sessionerna.
- Under fliken Analysera väljer du Mät för att få området i den valda regionen. Om man valde enhet millimeter i steg 3.1.1., kommer area att ges i kubikmillimeter. Om så önskas bäddar du in Markeringen för frihand genom att välja ctrl+D. Ändra utdatafärgen genom att gå till Redigera | Alternativ | Färg. Konvertera bilden till en RGB-bild (Bild | Typ | RGB-färg) innan du sparar som .tif fil.
- Fortsätt med att mäta alla tumörinnehållande skivor för en individuell mus och kopiera värden till ett lämpligt program för dataanalysprogram (t.ex. Microsoft Excel eller GraphPad Prism).
- Summera områdena från varje skiva för att få total tumörvolym. Se till att korrigera området baserat på skivats tjocklek (areal/tjocklek).
- Slutför stegen 3.1.1.-3.1.5. tills alla möss har en total tumörvolym. Med tanke på den något subjektiva karaktären av att beskriva tumörerna, är det idealiskt om samma metod upprepas flera gånger och i genomsnitt för att minska tekniska fel.
- Om du vill ställa in skalningsstaplar öppnar du DICOM-datafil och går till Analysera | Verktyg | Skala Bar. Eftersom måtten redan är inbäddade i DICOM-filen, bara plocka önskad längd / bredd. Förtäcke till en RGB-bild (Bild | Typ | RGB-färg) innan du sparar som .tif fil.
- Öppna MRI DICOM datafil i ImageJ, en bildbehandling programvara tillgänglig som en gratis nedladdning via National Institutes of Health (https://imagej.nih.gov/ij/)25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 översikter tumörvolymen kvantifiering för en enda mus vid två tidpunkter (dag 7 och dag 10) efter injektion av murine bröst tumörceller. För detta experiment, 50.000 DB7 celler injicerades, och djurets hjärna utvärderades av MRI. Vid varje skanning fångades 30 skivor (0,5 mm tjocklek). Utvärdering av de 30 skivor per skanning visade att vid dag 7 efter injektionen uppvisade 5 skivor tumörbörda (Figur 3A) och vid dag 10 efterinsprutningen uppvisade 9 skivor tumörbörda (Figur 3B). Varje bild utvärderades för tumörområde enligt beskrivningen och området för varje ram avbildas i figur 3C. Den totala tumörvolymen bestäms och justeras för skivatjocklek. Figur 4 skildrar de representativa uppgifterna i publikationsformat inklusive representativa bilder (Figur 4A) och ett histogram av tumörvolym över tid (Figur 4B).
Bild 1: Stereotaktiska och anestesisystem. (A) Anestesi induktionskammare setup inom ett biologiskt säkerhetsskåp. (B) Stereotaktisk anestetika leverans setup belysa anestesi slangar från bedövningsmaskinen till näsan konen på stereotaktisk apparat (se inset i (C)). Gröna pilar indikerar levererade anestesigasslangar och blå pilar indikerar rensade gasslangar. (C) Stereotaktisk monter med borrtillsats. Inset visar bedövningsrör (gröna och blå pilar), munstång och öronstänger. (D) Stereotaktisk monter med automatiserad sprutpump och mus upplysningslåda. Lådan är en inverterad pipettspetslåda som innehåller handvärmare som används för att höja musen till lämplig höjd och bibehålla kroppstemperaturen. Inset visar orienteringen av Hamilton sprutan i den automatiserade injektionsapparaten. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Bildframställning av tandplaceringen på en stereotaktisk anordning, plats för öronstänger och kalvarialfönster i förhållande till Bregma. (A) Den bildmässiga av maxillära incisors i tandskåran på näsan kon. (B) Placeringen av vänster och höger öronstänger inom den mediala canthus av respektive öron. (C) En pil anger bregma och en röd prick anger platsen där kalvarialfönstret ska göras (2 mm lateralt till sagittal suturen och 1 mm anterior till koronasuturen). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Exempel på tumörvolymkvantifiering för en enda mus över två tidspunkter efter injektionen. Bilder av skivorna som innehåller tumör vid (A) dag 7 och (B) dag 10 efter injektion. Gul betecknar tumörområde kvantifieras i ImageJ. (C) Segmentyta och total volymetrisk kvantifiering enligt vad som bestäms i ImageJ (*=korrigering för segmenttjocklek (0,5 mm)). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Representativ tumörvolymkvantifiering i publikationsformat. (A) Representativa bilder med skalstreck (=2 mm). (B) Histogram föreställande tumörvolym (mm3) för de två tidspunkterna. Fold förändring noteras. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utnyttjandet av intrakraniell injektion följt av seriell övervakning med MRI ger den unika förmågan att visualisera tumörtillväxt med tumör volym noggrannhet över tiden. Tillämpningen av digital bildframställning analys möjliggör tolkning av hjärnlesioner för tumörvolym, blödning, nekros, och svar på behandling.
Precis som med alla förfaranden finns det viktiga steg som måste följas för framgång. Först är noggrann inställning av stereotaktiska enheter absolut nödvändigt att framgången för denna teknik. På grund av den lilla storleken på murin kraniet, kan liten inkongruens resultera i dramatiskt olika effekter på tumörtillväxthastighet och ta i försöksdjur. Som sådan är det nödvändigt med ordentlig utbildning om användningen av dessa instrument. För det andra, en värmekälla under hela förfarandet säkerställer bedövningsplanet inte sjunker för lågt. Låga kroppstemperaturer placerar djuren i riskzonen för att plötsligt dö under anestesi på grund av minskad läkemedelsmetabolism och oavsiktlig överdos av anestesi och/eller kan förlänga återhämtningstiderna. De prefabricerade värmedynor kan vara skrymmande och svårt att manövrera runt på stereotaktisk maskin, men små, luftaktiverade handvärmare som köps via någon kommersiell leverantör upprätthålla temperaturen och är tillräckligt små för att placeras inom inverterad pipett spets låda används för att höja möss till lämplig nivå för stereotaktisk setup. Slutligen är kvantifiering enkel, men ofta bestämma vad som är tumör kontra vad som inte är tumör kan vara utmanande. Det rekommenderas att utredarna samråder med bildhanteringspersonal för att säkerställa korrekt bedömning. Det är också bra att upprepa tumörvolymmätningar flera gånger för att minska fel. Samt, varje studie bör analyseras av samma person för alla bilder.
Det presenterade protokollet kan ändras beroende på användarens preferenser. Först är användningen av injicerbara anestesi (t.ex. ketamin/xylazine) vanligt och kan säkert utnyttjas i stället för en inhalerad anestesi (t.ex. isofluran) beroende på prövare preferens. Det är dock viktigt att tänka på fördelarna med en inhalerad anestesi: (1) inte ett kontrollerat ämne, (2) nivån av anestesi kan justeras över tiden (jämfört med en upfront dos av ketamin bestäms av animalisk vikt), och (3) återhämtning är relativt snabb jämfört med ketamin / xylazin. För det andra ger användningen av den automatiska borren en hög noggrannhet men lägger tid på förfarandet med tanke på den tid som behövs för att ställa upp och riva ner enheten. Det är verkligen rimligt att använda en fri handing teknik om så önskas.
Detta protokoll utnyttjar både en stereotaktisk setup samt användning av MRI, båda är förknippade med ökad kostnad. Alternativa metoder för intrakraniell injektion har beskrivits tidigare15,16,17,18,19. Några av dessa metoder använder också användning av bioluminescerande avbildning för att övervaka tumörtillväxt under hela studien om det föredras.
Som nämnts ovan, Det är viktigt att bestämma korrekt cellnummer för injektion beroende på modellsystemet studeras. Injektion av murinceller i en immunkompetent värd tenderar att kräva färre celler än injektion av mänskliga celler i en immundeficient värd. Efter injektion tumörbörda övervakning av MRI hjälper till att avgöra om antalet celler som injiceras är lämpligt eftersom det är möjligt att se när tumörer når en viss volym och vid vilken tidpunkt möss börjar nå tidiga avlägsnande kriterier.
Nyttan och den breda tillämpningen av MRI för noninvasiv övervakning har använts av andra i smådjursforskningsstudier26. Medan MRI ger flera fördelar som redan diskuterats, det finns verkligen begränsningar värda att nämna. Först är användning av maskinen beroende av kärnservicepersonal och maskintillgänglighet. Andra, användning kan vara kostsamt. Om detta är oro, användning av bioluminescerande avbildning är ett giltigt alternativ för tumörövervakning17,19. Tredje, kontrast mellan tumör och den omgivande vävnaden (dvs. hjärnan) kan variera mellan olika cellinjer; dock erbjuder denna metod den största chansen att identifiera tumör in vivo i avsaknad av cellmärkning. Slutligen är MRI begränsad i sin upplösning, som kan skeva tumörvolymdata till där det verkar som om det finns exponentiell tillväxt när i själva verket tillväxten är linjär. Det finns också en maximal tumör volym som kan erhållas genom MR imaging, men detta är mindre av ett bekymmer eftersom det är osannolikt en mus skulle kunna överleva en tumör i den övre änden. Tumördetektionsgränsen beror på typ och placering av tumören i hjärnan, om det finns blod-hjärnbarriärläckage, och om tumören är väl avgränsad eller är infiltrera i den omgivande vävnaden. Det är också beroende av om det är en kontrast förbättra tumör och vilken typ av MR imaging protokollet används. Enligt vår erfarenhet, med en i-planet voxel storlek 78x78 μm och en 0,5 mm skiva tjocklek, kan vi observera en 0,5 mm diameter tumör rutinmässigt med en minsta gräns runt 0,3 mm.
Angående intrakraniell injektion finns det flera begränsningar att beakta. Först, intrakraniell injektioner inte spegla den metastaserande kaskad i att de helt kringgå utvecklingen av metastaserande egenskaper inom den primära tumören, intravasation in i blodomloppet, och penetration genom blod-hjärnbarriären11. För det andra, genom att direkt injicera i hjärnan denna metod inducerar inflammation, som kan förvirra resultaten i samband med neuroinflammation. Slutligen, direkt injektion på denna plats kan resultera i snabb tillväxt under en kort tidsperiod. Det är viktigt att övervaka möss för neurologiska symtom inklusive hind lem förlamning, letargi, och ataxi.
Alla anses, injektion direkt i hjärnan möjliggör övervakning av tumör ta takt, som kan informera forskaren om tillväxt specifikt inom denna metastaserande webbplats samt interaktion med hjärnan metastaserande mikromiljö. Vidare, övervakning av tumör börda över tiden tillåter prövaren att direkt jämföra ändrade tumör fenotyper, förändrad microenvironment fenotyper och svar på experimentella terapeutiska strategier. Med tanke på den relativt låga förekomsten av både spontan och experimentell hjärnmetastas i musmodeller är den intrakraniella tekniken verkligen ett värdefullt verktyg.
Cancer metastasering till hjärnan är en katastrofal diagnos med dålig respons på nuvarande behandling strategier1,11,27. Medan bröstcancer är den dominerande orsaken till hjärnmetastas hos kvinnor och fokus häri, lungcancer är den vanligaste orsaken till hjärnmetastas i alla cancerpatienter2. Vidare, hjärnan metastaser har rapporterats hos patienter som diagnostiserats med en rad fasta tumörtyper, och det förväntas att incidensen kommer att fortsätta att öka som terapier fortsätter att förbättra för att behandla extrakraniell sjukdom. Således, medan fokus för detta förslag är på BCBM, intrakraniell cancer injektion och MRI analys är tillämplig på att studera hjärnan metastaser av andra solida tumörtyper samt primära hjärntumörer. Genom att använda den intrakraniella injektionsmodellen av hjärnmetastaser gör det möjligt för forskare att rekapitulera sjukdomen hos stora kohorter av djur för att testa en mängd olika forskningsfrågor i hopp om att bättre patientvård. Genom koppling denna modell med hög upplösning digitala bilder som erhållits genom MRI, är det möjligt att övervaka tumör volym vid flera tidpunkter samt tumör svar på terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga upplysningar.
Acknowledgments
Representativa uppgifter finansierades genom National Cancer Institute (K22CA218472 till G.M.S.). Intrakraniell injektioner utförs i Ohio State University Omfattande Cancer Center Target Validering delad resurs (direktör - Dr Reena Shakya) och MRI är klar i Ohio State University Omfattande Cancer Center Små Djur Imaging Delad resurs (direktör - Dr Kimerly Powell). Båda delade resurser finansieras genom OSUCCC, OSUCCC Cancer Center Support Grant från National Cancer Institute (P30 CA016058), partnerskap med Ohio State University högskolor och avdelningar, och etablerade chargeback system.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Materials | |||
| Betadine | Purdue Products | 19-027132 | Povidone-iodine, 7.5% |
| Bone Wax | Surgical Specialities | 903 | Sterile and malleable beeswax and isopropyl palmitate |
| Buponorphine SR-Lab | ZooPharm | N/A | Long acting injectable analgesic 5 mL (0.5 mg/mL) polymetric formulation |
| Cotton tip applicators | Puritan | 25-806 10WC | Sterile long stemmed cotton tip applicators |
| Eye Ointment | Puralube | 17033-211-38 | Lubricating petrolatum and mineral oil based ophthalmic ointment |
| Handwarmers | Hothands | HH2 | Air-activated heat packs |
| Ibuprofen | Up & Up | 094-01-0245 | 100mg per 5mL in liquid suspension |
| Isoflurane | Henry Schein INC | 1182097 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| Scalpels | Integra Miltex | 4-410 | #10 disposable scalpel blade |
| Skin Glue | Vetbond | 1469SB | Skin safe wounds adhesive |
| Sterile Dressing | TIDI Products | 25-517 | Individually packed sterile drapes |
| Suture | Covidien | SP5686G | 45cm swedged 5-0 monofilament polypropylene suture |
| Stereotaxic Unit | |||
| High Speed Drill (Foredom) | Kopf | Model 1474 | Max of 38,000 RPM |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | Mouth bar with teeth hole and nosecone |
| Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 922 | Ear bars suitable for mouse applications |
| Stereotaxic Instrument | Kopf | Model 940 | Base plate, frame and linear scale assembly with digital readout monitor |
| Injector | |||
| Injector Needle and syringe | Hamilton | 80366 | 26 gauge needle, 51 mm needle length and 10 μL volume syringe |
| Legato 130A automated Syringe Pump | KD Scientific | P/N: 788130 | Programmable touch screen base with automated injector |
| Anesthesia Machine | |||
| SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer | Kent Scientific | SS-01 | Digital anesthesia machine |
| SomnoSuite Starter Kit for mice | Kent Scientific | SOMNO-MSEKIT | Includes induction chamber, 2x anesthesia syringes, 18" tubing, plastic nosecone, 2x waste aneshesia gas canisters |
References
- Lin, X., DeAngelis, L. M.
- Ostrom, Q. T., Wright, C. H., Barnholtz-Sloan, J. S.
- Eichler, A. F., et al. The biology of brain metastases-translation to new therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 8 (6), 344-356 (2011).
- Steeg, P. S., Camphausen, K. A., Smith, Q. R. Brain metastases as preventive and therapeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 352-363 (2011).
- Valiente, M., et al.
- Wang, H., et al. The prognosis analysis of different metastasis pattern in patients with different breast cancer subtypes: a SEER based study. Oncotarget. 8 (16), 26368-26379 (2017).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- Gong, Y., Liu, Y. R., Ji, P., Hu, X., Shao, Z. M. Impact of molecular subtypes on metastatic breast cancer patients: a SEER population-based study. Scientific Reports. 7, 45411 (2017).
- Kim, Y. J., Kim, J. S., Kim, I. A. Molecular subtype predicts incidence and prognosis of brain metastasis from breast cancer in SEER database. Journal of Cancer Researchearch and Clinical Oncology. 144 (9), 1803-1816 (2018).
- Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
- Meisen, W. H., et al. Changes in BAI1 and nestin expression are prognostic indicators for survival and metastases in breast cancer and provide opportunities for dual targeted therapies. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (1), 307-314 (2015).
- Russell, L., et al. PTEN expression by an oncolytic herpesvirus directs T-cell mediated tumor clearance. Nature Communications. 9 (1), 5006 (2018).
- Thies, K. A., et al. Stromal platelet-derived growth factor receptor-beta signaling promotes breast cancer metastasis in the brain. Cancer Research. , (2020).
- Kramp, T. R., Camphausen, K. Combination radiotherapy in an orthotopic mouse brain tumor model. Journal of Visualized Experiments. (61), e3397 (2012).
- Pierce, A. M., Keating, A. K. Creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors. Journal of Visualized Experiments. (91), e52017 (2014).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
- Donoghue, J. F., Bogler, O., Johns, T. G. A simple guide screw method for intracranial xenograft studies in mice. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Fink, J. R., Muzi, M., Peck, M., Krohn, K. A. Multimodality Brain Tumor Imaging: MR Imaging, PET, and PET/MR Imaging. Journal of Nuclear Medicine. 56 (10), 1554-1561 (2015).
- Borges, A. R., Lopez-Larrubia, P., Marques, J. B., Cerdan, S. G. MR imaging features of high-grade gliomas in murine models: how they compare with human disease, reflect tumor biology, and play a role in preclinical trials. American Journal of Neuroradiology. 33 (1), 24-36 (2012).
- Prabhu, S. S., Broaddus, W. C., Oveissi, C., Berr, S. S., Gillies, G. T. Determination of intracranial tumor volumes in a rodent brain using magnetic resonance imaging, Evans blue, and histology: a comparative study. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 47 (2), 259-265 (2000).
- Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical & Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
- Journal of Visualized Experiments. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2020).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J.
- Lee, D., Marcinek, D. Noninvasive in vivo small animal MRI and MRS: basic experimental procedures. Journal of Visualized Experiments. (32), (2009).
- Shah, N., et al. Investigational chemotherapy and novel pharmacokinetic mechanisms for the treatment of breast cancer brain metastases. Pharmacological Research. 132, 47-68 (2018).
