Summary
Die modellierung der intrakraniellen Hirnmetastasen wird durch die Unfähigkeit erschwert, die Tumorgröße und die Reaktion auf die Behandlung mit präzisen und zeitnahen Methoden zu überwachen. Die vorgestellte Methodik koppelt die intrakranielle Tumorinjektion mit einer Magnetresonanztomographie-Analyse, die in Kombination präzise und konsistente Injektionen, eine verbesserte Tierüberwachung und genaue Tumorvolumenmessungen kultiviert.
Abstract
Die metastasierende Ausbreitung von Krebs ist eine unglückliche Folge des Fortschreitens der Krankheit, aggressiver Krebssubtypen und/oder der späten Diagnose. Gehirnmetastasen sind besonders verheerend, schwer zu behandeln und verleihen eine schlechte Prognose. Während die genaue Inzidenz von Hirnmetastasen in den Vereinigten Staaten nach wie vor schwer abzuschätzen ist, wird sie wahrscheinlich zunehmen, da extrakranielle Therapien bei der Behandlung von Krebs immer wirksamer werden. Daher ist es notwendig, neue therapeutische Ansätze zur Behandlung von Metastasen an diesem Standort zu identifizieren und zu entwickeln. Zu diesem Zweck ist die intrakranielle Injektion von Krebszellen zu einer etablierten Methode geworden, um Hirnmetastasen zu modellieren. Bisher war die Unfähigkeit, das Tumorwachstum direkt zu messen, ein technisches Hindernis für dieses Modell; Die Erhöhung der Verfügbarkeit und Qualität von Bildgebungsmodalitäten für Kleintiere, wie z. B. Magnetresonanztomographie (MRT), verbessert jedoch die Fähigkeit, das Tumorwachstum im Laufe der Zeit zu überwachen und während des Versuchszeitraums Veränderungen im Gehirn abzuleiten. Hierbei wird eine intrakranielle Injektion von murinen Brusttumorzellen in immunkompetente Mäuse gefolgt von MRT nachgewiesen. Der vorgestellte Injektionsansatz nutzt isofluranische Anästhesie und ein stereotaktisches Setup mit einer digital gesteuerten, automatisierten Bohr- und Nadelinjektion, um die Präzision zu verbessern und technische Fehler zu reduzieren. MRT wird im Laufe der Zeit mit einem 9,4 Tesla-Instrument in der Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource gemessen. Tumorvolumenmessungen werden zu jedem Zeitpunkt durch die Verwendung von ImageJ demonstriert. Insgesamt ermöglicht dieser intrakranielle Injektionsansatz eine präzise Injektion, eine tägliche Überwachung und genaue Tumorvolumenmessungen, die zusammen den Nutzen dieses Modellsystems erheblich verbessern, um neue Hypothesen über die Treiber von Hirnmetastasen zu testen.
Introduction
Hirnmetastasen sind 10-mal häufiger als erwachsene primäre Zentralnervensystem-Tumoren1und wurden in fast jedem soliden Tumortyp mit Lungenkrebs, Brustkrebs und Melanom mit der höchsten Inzidenzberichtet 2. Unabhängig von der primären Tumorstelle führt die Entwicklung von Hirnmetastasen zu einer schlechten Prognose, die oft mit kognitivem Verfall, anhaltenden Kopfschmerzen, Krampfanfällen, Verhaltens- und/oder Persönlichkeitsveränderungen verbunden ist1,3,4,5. In Bezug auf Brustkrebs gab es viele Fortschritte bei der Prävention und Behandlung der Krankheit. Jedoch, 30% der Frauen mit Brustkrebs diagnostiziert werden weiterhin Metastasen entwickeln, und von denen mit Stadium IV Krankheit, etwa 7% (SEER 2010-2013) haben Gehirnmetastasen6,7. Aktuelle Behandlungsmöglichkeiten für Hirnmetastasen beinhalten chirurgische Resektion, stereotaktische Radiochirurgie und/oder die gesamte Gehirnradiotherapie. Doch selbst bei dieser aggressiven Therapie beträgt das mediane Überleben dieser Patienten kurze 8-11 Monate7,8,9. Diese düsteren Statistiken stützen nachdrücklich die Notwendigkeit der Identifizierung und Umsetzung neuer, wirksamer therapeutischer Strategien. So ist es, wie bei allen Krebsarten, die zum Gehirn metastasieren, wichtig, Brustkrebs im Labor richtig zu modellieren, um signifikante Fortschritte auf dem Gebiet zu gewährleisten.
Bis heute haben Forscher eine Vielzahl von Methoden verwendet, um Mechanismen der Metastasierung zum Gehirn zu studieren, jede mit deutlichen Vorteilen und Einschränkungen10,11. Experimentelle Metastasierungsmethoden wie Schwanzvene und intrakardiale Injektion verbreiten Tumorzellen im ganzen Körper und können je nach injizierten Zellen zu einer immensen Tumorbelastung an anderen metastasierenden Stellen führen. Diese Ergebnisse sind dann verwirrend, wenn speziell Metastasen auf das Gehirn zu studieren. Die intrakarotisierende Arterieninjektionsmethode ist vorteilhaft, da sie speziell auf die Gehirnaussaat von Tumorzellen abzielt, aber begrenzt ist, da sie technisch schwierig durchzuführen sein kann. Orthotopische primäre Tumorresektion wird oft als das klinisch relevanteste Modell der Metastasierung betrachtet, da sie die gesamte metastasierende Kaskade rekapituliert. Dennoch beinhaltet dieser Ansatz längere Wartezeiten für spontane Metastasen mit dramatisch niedrigeren Raten von Hirnmetastasen im Vergleich zu den anderen metastasierenden Stellen wie Lymphknoten, Lunge und Leber. Oft müssen Tiere aufgrund der Tumorbelastung an diesen anderen metastasierenden Stellen vor der Entwicklung einer Hirnmetastasierung aus Den Studien entfernt werden. Andere Methoden mit Gehirn tropischen Zelllinien sind wirksam bei der Metastasierung auf das Gehirn; Diese Modelle sind jedoch insofern begrenzt, als sie Zeit brauchen, um sich zu entwickeln und oft ihren Tropismus mit der Ausbreitung verlieren. Angesichts dieser Einschränkungen haben Forscher routinemäßig die intrakranielle Injektionsmethode verwendet, um Krebsmetastasen im Gehirn zu modellieren11,12,13,14 mit unterschiedlichen Methoden15,16,17,18,19. Es wird anerkannt, dass dieser Ansatz in ähnlicher Weise Einschränkungen hat, vor allem, dass er keine Untersuchung von frühen metastasierenden Schritten einschließlich Intravasation aus dem primären Tumor, Penetranz durch die Blut-Hirn-Schranke und Etablierung im Gehirn zulässt. Es ermöglicht den Forschern jedoch zu testen (1) welche tumorabgeleiteten Faktoren das Wachstum im Gehirn vermitteln (z. B. genetische Manipulation eines onkogenen Faktors in Tumorzellen), (2) wie Veränderungen in der metastasierenden Mikroumgebung das Krebswachstum an dieser Stelle verändern (z. B. Vergleich transgener Mäuse mit veränderten stromalen Komponenten) und (3) Wirksamkeit neuartiger therapeutischer Strategien zum Wachstum etablierter Läsionen.
Angesichts des potenziellen Nutzens des intrakraniellen Injektionsmodells ist es absolut notwendig, technische Fehler während der Injektion zu reduzieren und das Tumorwachstum im Laufe der Zeit genau zu überwachen. Die hier beschriebene Methode beinhaltet die kontinuierliche Eindosierung der inhalativen Gasanästhesie und die direkte Implantation von Tumorzellen in das Gehirnparenchym mittels eines stereotaktischen Bohrers und Injektionsständers. Die Verabreichung von Gasanästhetikum ermöglicht eine Feinabstimmung der Tiefe und Länge der Anästhesie sowie eine schnelle und reibungslose Genesung. Ein digital gesteuertes, automatisiertes Bohr- und Nadelinjektionssystem verbessert die Präzision der Injektionsstelle und reduziert technische Fehler, die häufig durch Bohr- und Freihandinjektionsverfahren entstehen. Der Einsatz von Magnetresonanztomographie (MRT) erhöht die Präzision bei der Überwachung des Tumorwachstums, des Tumorvolumens, der Gewebereaktion, der Tumornekrose und der Reaktion auf die Behandlung weiter. MRT ist die bildgebende Modalität der Wahl für Weichgewebe20,21. Diese bildgebende Technik verwendet keine ionisierende Strahlung und wird der Computertomographie (CT) vorgezogen, insbesondere für mehrere Bildgebungssitzungen während einer Studie. MRT hat viel größere Auswahl an verfügbaren Weichteilkontrast als CT oder Ultraschall-Bildgebung (USG) und präsentiert Anatomie im Detail. Es ist empfindlicher und spezifischer für Anomalien im Gehirn selbst. MRT kann in jeder Bildebene durchgeführt werden, ohne das Motiv physisch bewegen zu müssen, wie dies bei der optischen 2D-USG- oder 2D-Bildgebung der Fall ist. Es ist wichtig zu erwähnen, dass der Schädel das MRT-Signal nicht wie bei anderen bildgebenden Modalitäten dämmelt. MRT ermöglicht die Auswertung von Strukturen, die durch Artefakte aus Knochen in CT oder USG verdeckt werden können. Ein weiterer Vorteil ist, dass es viele Kontrastmittel für DIE MRT gibt, was die Läsionsnachweisgrenze mit relativ geringer Toxizität oder Nebenwirkungen erhöht. Wichtig ist, dass die MRT die Überwachung in Echtzeit im Gegensatz zur histologischen Bewertung zum Zeitpunkt der Nekropsie ermöglicht, die bei der Entschlüsselung des Tumorvolumens begrenzt ist. Andere bildgebende Modalitäten, wie z. B. biolumineszierende Bildgebung, sind in der Tat wirksam für die frühe Erkennung und Überwachung von Tumoren im Laufe der Zeit; Diese Methode erfordert jedoch eine genetische Manipulation (z. B. Luziferase/GFP-Tagging) von Zelllinien und lässt keine volumetrischen Messungen zu. Die MRT ist weiter von Vorteil, da sie die Patientenüberwachung widerspiegelt und die nachgeschaltete volumetrische Analyse der MR-Bilder bekanntermaßen stark mit der histologischen Tumorgröße bei Nekropsie22korreliert. Die serielle Überwachung mit MRT-Screening erhöht auch die klinische Überwachung neurologischer Beeinträchtigungen, falls sie auftreten sollten.
Insgesamt ermöglicht uns die vorgestellte Methode der stereotaktischen intrakraniellen Tumorinjektion, gefolgt von serieller MRT, zuverlässige, vorhersehbare und messbare Ergebnisse, um Mechanismen der Hirnmetastasierung bei Krebs zu untersuchen.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Ohio State University (P.I. Gina Sizemore; Protokoll #2007A0120). Alle Nagetier-Überlebensoperationen IACUC-Richtlinien werden befolgt, einschließlich der Verwendung von sterilen Techniken, Vorräten, Instrumenten, sowie Pelzentfernung und sterile Vorbereitung der Einschnittstelle.
1. Intrakranielle Injektion von Brustkrebszellen
HINWEIS: Die hier beschriebene Methode verwendete die DB7-Murine-Brusttumor-Zelllinie, die von einem primären MMTV-PyMT-Tumor abgeleitet wurde23. Frühere Studien haben die intrakranielle Injektion von DB7-Zellen als Modell der BCBM mit Histologie etabliert, die die der menschlichen Krankheit nachahmt12. Wichtig ist, dass immunkompetente FVB/N-Mäuse für dieses Modell verwendet werden, da DB7-Zellen von diesem Mausstamm abgeleitet wurden. Da es sich um ein Brustkrebsmodell handelt, werden für diese Studien erwachsene weibliche Mäuse verwendet.
- Bereiten Sie Zellen vor.
- In einer sterilen Kapuze, Aspirieren Von Medien aus Zellkulturplatten mit Standardtechniken.
- Waschen Sie Zellen mit 1x DPBS und trypsinize mit dem Hersteller-Protokoll.
- Fügen Sie ein geeignetes Volumen von FBS-haltigen Medien hinzu, um die Trypsin-Reaktion zu stoppen und die Konzentration der Zellen mit einem Hämozytometer oder einer bevorzugten Methode zu bestimmen.
- Pelletzellen bei 300 x g für 4 min bei 4 °C.
- Aspiratmedien mit 1x DPBS waschen, bei 300 x g für 4 min bei 4 °C re-spinen.
- Resuspend Zellen in 1x DPBS auf eine angemessene Konzentration, ca. 50.000 Zellen pro injizierbarem Volumen von 2 l.
HINWEIS: Die Zellnummer hängt von der Aggressivität der Linie ab und muss vom Prüfer bestimmt werden. Wir verwenden routinemäßig 2 l, aber die Verwendung von Volumes <6 l wird berichtet15,16,17,18,19. Niedrige Volumina sind entscheidend, um die Präzision zu erhalten. - Legen Sie resuspendierte Zellen auf Eis, bis sie injiziert werden, um die Lebensfähigkeit zu erhalten.
- Bereiten Sie Mäuse auf eine Operation vor.
- Für Mäuse mit Fell: Pelz aus dem Schädel entfernen, entweder durch Enthaarungscreme/Lotion oder durch Rasur. Tun Sie dies innerhalb von 24-48 h vor der Operation, da die Durchführung dieses Schritts zu nah an der Operation kann die Hautqualität und Nahtfestigkeit stören.
HINWEIS: Weibliche FVB/N-Mäuse mit einem Gewicht von etwa 25 g wurden aufgrund der Untersuchung von metastasierendem Brustkrebs, einer überwiegend weiblichen Erkrankung, verwendet. - Analgetika nach der von der IACUC und dem behandelnden Tierarzt festgelegten Verabreichung: eine subkutane Injektion von Buprenorphin SR-LAB (0,05-0,1 mg/kg Dosis, Buprenorphin-Bestand: 0,5 mg/ml für eine Dosierung von 0,0025-0,088 ml) mindestens 24 h vor der Operation, um bis zu 72 h Analgesie bereitzustellen, die bei Bedarf 48-72 h nach der ersten Dosis wiederholt werden kann. Verabreichen Sie auch NSAIDs (20% Ibuprofen im Trinkwasser z.B. 1 mg/5 ml) mindestens 24-48 h vor der Operation und setzen Sie für 2-7 Tage nach der Operation fort, um eine mindestens 72 h postoperative Analgesie zu gewährleisten.
HINWEIS: An der Ohio State University wird Buprenorphin SR-LAB vom Labortierpersonal der University Lab Animal Resources durchgeführt, da es sich um eine kontrollierte Substanz handelt.
- Für Mäuse mit Fell: Pelz aus dem Schädel entfernen, entweder durch Enthaarungscreme/Lotion oder durch Rasur. Tun Sie dies innerhalb von 24-48 h vor der Operation, da die Durchführung dieses Schritts zu nah an der Operation kann die Hautqualität und Nahtfestigkeit stören.
- Bereiten Sie stereotaktische Einheiten für die Operation vor.
- Schalten Sie alle Anästhesiemaschinen, digitalen Vernier-Waagen und digitalen Injektoren ein.
HINWEIS: Alle chirurgischen Werkzeuge sollten vor der Operation ausreichend gereinigt und sterilisiert werden. - Verwenden Sie Anästhesiemaschinen mit Induktionskammeraufsatz in einem biologischen Sicherheitsschrank (Abbildung 1A).
- Stellen Sie sicher, dass alle Rohre von Anästhesiemaschinen mit den stereotaktischen Rahmen verbunden sind (Abbildung 1B, Einset 1C) und die Klemmen an den Rohren für alle verwendeten Einheiten offen sind. Schließen Sie alle Klemmen an Röhren, die zu stereotaktischen Rahmen gehen, die nicht für eine Operation verwendet werden.
- Anästhesiemaschinen auf Hersteller empfohlene Nasenkegeldurchfluss basierend auf dem Mausgewicht einstellen (z. B. 25 g Tiergewicht: Nasenkegeldurchfluss 34 ml/min).
HINWEIS: Der in dieser stereotaktischen Einrichtung enthaltene Kopfhalter wird nur für erwachsene Mäuse empfohlen. Stellen Sie sicher, dass die im Stereotaktischen Setup enthaltenen Herstellerempfehlungen befolgt werden. - Stellen Sie sicher, dass das in der Spritze vorgefüllte entsprechende Anästhetikum (z. B. Isofluran) an der Anästhesiemaschine befestigt ist (Abbildung 1B).
HINWEIS: Eine Übergrundierung der Spritze kann dazu führen, dass zu viel Anästhesie während der Operation an die Mäuse abgegeben wird und zu einer Anästhesie-Überdosierung führt. - Bereiten Sie die Bohrer vor, indem Sie das Stufenschloss verdrehen, einen Bohreradapter und einen 1 mm Bohrer in jeden Bohrer einstecken und den Bohrer durch manuelles Anziehen des Bitschlosses verriegeln.
- Bohrer an den stereotaktischen Rahmen anbringen (Abbildung 1C).
- Reinigen Sie Hamilton Spritzen mit 5 abwechselnden Wäresungen von 1x DPBS, dann 70% Ethanol, dann wieder in 1x DPBS. Beiseite legen, bis das Tier zur Injektion vorbereitet ist.
- Stellen Sie den digitalen Injektor auf eine Rate von 0,4 l/min und ein Ziel von 2 l ein. Diese Rate und Volumen ermöglichen eine langsame Einführung von Tumorzellen in das Gehirn, die Druck und damit verbundene Schäden reduziert.
- Schalten Sie alle Anästhesiemaschinen, digitalen Vernier-Waagen und digitalen Injektoren ein.
- Platzieren Sie Mäuse auf stereotaktischen Rahmen.
- Anästhesisieren Sie Mäuse (z. B. Isofluran) mit der oben genannten Induktionskammer.
- Halten Sie Mäuse während des gesamten Verfahrens auf einer tiefen Anästhesieebene. Die von der Maschine verabreichte % Anästhesie hängt von einer Reihe von Faktoren ab, darunter: Durchflussrate, Stimulationsgrad und Körpertemperatur. Überwachen Sie die Mäuse während des gesamten Verfahrens häufig auf die Tiefe der Anästhesie, indem Sie rhythmische Atmungen bewerten (Tier schnappt nicht); Mangel an palpebralen Reflex (Flattern der Augenlider, wenn mit einem Baumwoll-Spitzenapplikator stimuliert); und Mangel an Zehenkneifen (Rückzug der Gliedmaße auf den schädlichen Reiz des Kneifens der Zehen).
HINWEIS: Verschiedene Mäusestämme reagieren anders auf anästhesie. - Nachdem sich Mäuse auf einer geeigneten, tiefen Anästhesieebene befinden, übertragen Sie die Mäuse auf die stereotaktische Einheit. Verwenden Sie ein Heizkissen, während sich die Maus auf der stereotaktischen Maschine befindet, um die Körpertemperatur und eine entsprechende Anästhesieebene aufrechtzuerhalten.
ANMERKUNG: Um ein niedriges Profil zu erreichen, verwenden wir luftaktivierte Handwärmer, die in einer invertierten Pipettenspitzenbox platziert sind (Maus-Hubbox in Abbildung 1D). - Öffnen Sie den Mund der Maus und legen Sie die Zähne in den Trog der Mundstange, die sich auf dem Nasenstück auf dem stereotaktischen Rahmen befindet (Abbildung 2A). Schieben Sie den Nasenkegel über die Nase/Mund der Maus (Abbildung 2B).
- Mäuse mit ihren Köpfen ebenerstufen auf die Mundstange stellen. Öffnen Sie den Mund vorsichtig mit dem stumpfen Ende eines Baumwollspitzenapplikators und gleiten Sie an Ort und Stelle. Stellen Sie sicher, dass der Nasenkegel vollständig über der Nase der Maus liegt oder die Anästhesie nicht ordnungsgemäß geliefert wird. Der Nasenkegel greift nicht mit der Nase ein, wenn die Zähne nicht in dieser Nut sitzen (Inset Abbildung 2A).
- Mit einem sterilen Wattestäbchen, legen Sie Augenschmierstoff auf jedem der Augen der Maus. Die Anwendung von Augenschmierstoff mildert die Trocknung der Hornhaut und reduziert das Risiko von Hornhautschäden und postoperativen Komplikationen im Zusammenhang mit Hornhauttrauma.
- Stabilisieren Sie den Schädel der Maus, indem Sie die linke Ohrleiste gegen den medialen Canthus des linken Ohrs drücken und ihn mit der Schraube am stereotaktischen Rahmen verriegeln. Dann schieben Sie die rechte Ohrleiste gegen die mediale Canthus des rechten Ohres und schrauben Sie fest am stereotaktischen Rahmen(Abbildung 2B).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Kopf der Maus eben und gerade ist, wenn Sie Ohrstangen platzieren. Wenn der Kopf schief oder abgewinkelt ist, wird die Injektion an der falschen Stelle im Gehirn sein. Die Ohrbügel sollten NUR so lange angezogen werden, bis der Schädel bei Stimulation mit moderater manueller Sondierung immobilisiert wird.
- Erstellen Sie ein calvariales Fenster.
- Bereiten und reinigen Sie die Kopfhaut mit 3x abwechselnden Pässen jeder Betadinlösung und 70% Ethanol. Aufgrund der Nähe der chirurgischen Stelle zu den Augen, verwenden Sie die Betadin-Lösung über dem chirurgischen Peeling.
- Mit einem sterilen Skalpell, machen Sie einen 3 mm Schnitt durch die Haut entlang der zentralen Median-Aspekt des Schädels (nach der sagittalen Nahtlinie). Blutungen am Schnitt sollten minimal sein. Sollte es auftreten, tragen Sie einen gleichmäßigen, festen Druck an der Blutungsstelle mit einem sterilen Baumwollspitzenapplikator für >30 Sekunden auf.
- Identifizieren und richten Sie den Bohrer senkrecht zum Bregma aus (Abbildung 2C), stellen Sie sicher, dass die digitale Vernier-Skala auf Null zurückgesetzt wird.
- Bewegen Sie den Bohrer 2 mm seitlich zur sagittalen Naht und 1 mm vor der koronalen Naht(Abbildung 2C). Um reproduzierbar zu sein, stellen Sie sicher, dass der Standort links oder rechts der sagittalen Nahtlinie für alle Tiere konsistent bleibt.
- Drehen Sie den Bohrer auf die höchste Geschwindigkeit. Stellen Sie sicher, dass die Haut vom Bohrer wegbewegt wird, um Gewebeschäden zu vermeiden, die durch das rotierende Bit verursacht werden, und initiieren Sie vorsichtig den Bohrer auf den Schädel. Bohren Sie ein Loch etwa 0,5 mm tief durch die Calvaria, was zu dem Kalvarifenster führt. Achten Sie darauf, den Bohrer nicht zu weit zu senken, oder es wird in das Gehirn bohren. Das Ablegen steriler Saline an der Bohrstelle, während der Bohrer in Bewegung ist, kann jede von der Maschine erzeugte Wärme ausgleichen, die thermische Schäden am umgebenden Gewebe verursachen kann.
- Sobald das Calvarialfenster gemacht ist, heben Sie den Bohrer vorsichtig an und entfernen Sie ihn aus dem stereotaktischen Rahmen.
- Reinigen Sie die Bohrer mit 70% Ethanol und legen Sie beiseite, wenn sie wieder verwendet werden. Wenn nicht, bohren Sie Bohrer und tauchen Sie in 70% Ethanol.
- Injektion von Krebszellen in das Gehirn
- Befestigen Sie die automatische Injektoreinheit am Stereotaktikgerät (Abbildung 1D).
- Ziehen Sie >2 L der Zellen gründlich in 1x DPBS in einer sauberen Hamilton Spritze resuspendiert. Achten Sie darauf, zellenunmittelbar vor dem Befüllen der Spritze wieder auszusetzen, um die Verklumpbildung zu reduzieren und eine homogene Zellschlämme zu gewährleisten. Es ist ideal, um 6-8 l Zellvolumen zu ziehen, um sicherzustellen, dass es keine Lufttaschen / Blasen.
- Legen Sie die Hamilton-Spritze auf das Injektorgerät und grundieren Sie die Injektionsnadel, indem Sie eine kleine Menge Volumen auf einen Sterileinweg-Drap aufgeben, um sicherzustellen, dass der Injektor ordnungsgemäß funktioniert. Wischen Sie die Spritze mit 70% Ethanol mit einem Baumwollspitzenapplikator ab (Abbildung 1D, Inset). Dadurch werden Tumorzellen aus dem äußeren Lauf der Nadelwelle entfernt und das Risiko einer Tumorzellaussaat entlang des Injektionstraktes verringert.
- Richten Sie die Nadelspitze in die Mitte des Kalvarifensters aus und berühren Sie fast das freiliegende Großhirn.
- Setzen Sie die digitale Vernier-Skala auf Null zurück.
- Setzen Sie die Nadel langsam in eine Tiefe von 3 mm in das Gehirn ein und lassen Sie die Nadel mindestens 60 Sekunden im Gehirn verbleiben, bevor Sie fortfahren. Dieser Zeitrahmen ermöglicht es dem Gehirn Parenchym um die Nadel zu entsprechen, die Rückdruck und mögliche Ableitung von Tumorzellen entlang des Nadeltraktreduziert reduziert.
- Wählen Sie Ausführen auf dem Injektorbildschirm aus, um mit der Bereitstellung von Zellen an die Injektionsstelle zu beginnen. Es dauert ca. 5 min, um dieses Volumen zu injizieren. Die verlängerte Zeit für diesen Schritt ist es, sekundäre Schäden durch Injektionskraft auf das Gehirn Parenchym verursacht zu reduzieren.
- Sobald das Injektionsprotokoll fertig ist, lassen Sie die Nadel im Gehirn für mindestens 3 min ruhen, wieder so dass das Gehirn Parenchym an die Injektion zu akklimatisieren.
- Nach mindestens 3 min die Nadel aus dem Gehirn mit einer Rate von 0,75 mm/min anheben. Tun Sie dies auf eine extrem langsame und konsistente Art und Weise, um Den Rückendruck und Tumor-Tracking bis zum Nadeltrakt zu reduzieren.
- Sobald die Nadel das Gehirn verlassen hat, entfernen Sie vorsichtig die Hamilton-Spritze aus dem Injektor und reinigen Sie, wie in Schritt 1.2.8 beschrieben.
- Mit einem sterilen Wattestäbchen warmes Knochenwachs auf das Kalvarifenster auftragen. Das Knochenwachs wirkt als physische Barriere, um den Tumor im Schädel zu halten.
- Schließen Sie den Schnitt (z.B. 5-0 PDS auflösbare Nähte in einem einfachen unterbrochenen Muster ODER Nahtclips, je nach bestem Wetter für den Chirurgen).
- Stoppen Sie die Verabreichung der Anästhesie und entfernen Sie die Maus aus dem Gerät, indem Sie die Ohrstangen entriegeln und herausschieben, den Nasenkegel von der Maus schieben und die Zähne von der Mundstange lösen.
- Legen Sie die Maus in einen sauberen Käfig, der sich auf einem wärmeren Set auf 37 °C für die Wiederherstellung befindet. Überwachen Sie Mäuse während der Genesung, die in der Regel 10-15 Minuten nach dem Absetzen der Anästhesie auftritt.
- Nachdem die Maus wiederhergestellt wurde, überwachen Sie die Kriterien für die frühzeitige Entfernung, die vom IACUC der Gastinstitution festgelegt werden.
2. Magnetresonanztomographie
- Verabreichen Sie Den Mäusen gadolinium-basiertes Kontrastmittel (100 l/20 g Körpergewichtsmaus von 0,1 M MultiHance)24 10-20 Minuten vor der Bildgebung durch eine intraperitoneale Injektion an Mäuse. Anschließend wird mit einer Induktionskammer mit einem inhalierten Anästhetikum (z.B. Isofluran) gemischt mit 95%O2 und 5%CO2 (d.h. zugeführtem Raumluftgas) anentäthet.
- Platzieren Sie die Maus auf einem beheizten Halter, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Sichern Sie den Kopf mit Ohrzangen und einem Bissbalken und platzieren Sie den Halter im 9,4 T Magneten, der mit einer Maus-Gehirn-Oberflächenspule ausgestattet ist. Halten Sie anästhesie während der Bildgebungzeit, eine Studie dauert in der Regel etwa 20 min pro Maus. Überwachen Sie die Atemfrequenz und die Herzfrequenz (ca. 70 bpm) während des gesamten Verfahrens mit einem pneumatischen Kissen und einem Kleintierüberwachungssystem.
- Rufen Sie ein Lokalisatorbild ab, und bilden Sie dann das Maushirn mit einer T2-gewichteten SELTEN-Sequenz (TR = 3500-4228 ms, TE=12 ms, RARE Factor = 8, FOV=2,0 x 2,0 cm, Matrixgröße = 256 x 256, 1 mm oder 0,5 mm Scheibendicke, NA=2-4, 15-30 zusammenhängende Scheiben) und post Gadolinium-basierter Kontrast T1-gewichtete SELTEN-Sequenz (TR = 1200 ms, TE=7,5 ms, SELTENERFaktor = 4 , FOV=2,0 x 2,0 cm, Matrixgröße = 256 x 256, 1 mm oder 0,5 mm Scheibendicke, NA=2-4, 15-30 zusammenhängende Scheiben).
- Nach der Bildgebung die Maus zur Genesung in einen Käfig auf einem wärmeren Set auf 37 °C legen.
3. Volumetrische Tumormessungen
- Beschaffung des gesamten Tumorvolumens
- Öffnen Sie die MRI DICOM Datendatei in ImageJ, einer Bildverarbeitungssoftware, die als kostenloser Download über die National Institutes of Health (https://imagej.nih.gov/ij/)25verfügbar ist.
HINWEIS: ImageJ ermöglicht die Anzeige von DICOM-Dateien, die erforderlich sind, um die eingebetteten Pixelabmessungen für Tumorvolumenberechnungen zu verwenden (siehe Bild, Eigenschaften, bei denen "Längeneinheit" wie gewünscht eingestellt werden kann (z. B. mm)). - Verwenden Sie das Werkzeug Freihandauswahl, um einen Umriss um den Tumor zu zeichnen. Führen Sie diese Auswahl in einem dunklen Raum durch, um die Sichtbarkeit zu verbessern. Passen Sie die Helligkeit/den Kontrast nicht an, um die Konsistenz zwischen den Sitzungen aufrechtzuerhalten.
- Wählen Sie auf der Registerkarte Analysieren die Option Messen aus, um den Bereich der ausgewählten Region abzusuchen. Wenn die Millimetereinheit in Schritt 3.1.1. gewählt wurde, wird die Fläche in Kubikmillimetern angegeben. Falls gewünscht, betten Sie die Freihandauswahl ein, indem Sie strg+Dauswählen. Ändern der Ausgabefarbe, indem Sie zu Bearbeiten | Optionen | Farbe. Konvertieren des Bildes in ein RGB-Bild(Bild | Typ | RGB-Farbe) vor dem Speichern als .tif Datei.
- Fahren Sie mit der Messung aller tumorhaltigen Slices für eine einzelne Maus fort und kopieren Sie Werte in ein entsprechendes Datenanalyse-Softwareprogramm (z. B. Microsoft Excel oder GraphPad Prism).
- Summieren Sie die Bereiche aus jeder Scheibe, um das gesamte Tumorvolumen zu erhalten. Achten Sie darauf, den Bereich basierend auf der Schnittdicke (Fläche/Dicke) zu korrigieren.
- Führen Sie die Schritte 3.1.1.-3.1.5 aus. bis alle Mäuse ein Gesamttumorvolumen haben. Angesichts der etwas subjektiven Art der Darstellung der Tumoren ist es ideal, wenn die gleiche Methode mehrmals wiederholt und gemittelt wird, um technische Fehler zu reduzieren.
- Um Maßstabsleisten festzulegen, öffnen Sie die DICOM-Datendatei, und wechseln Sie zu Analysieren | Werkzeuge | Maßstabsleiste. Da die Abmessungen bereits in die DICOM-Datei eingebettet sind, wählen Sie einfach die gewünschte Länge/Breite aus. Verdeckt zu einem RGB-Bild (Bild | Typ | RGB-Farbe) vor dem Speichern als .tif Datei.
- Öffnen Sie die MRI DICOM Datendatei in ImageJ, einer Bildverarbeitungssoftware, die als kostenloser Download über die National Institutes of Health (https://imagej.nih.gov/ij/)25verfügbar ist.
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Representative Results
Abbildung 3 zeigt die Tumorvolumenquantifizierung für eine einzelne Maus an zwei Zeitpunkten (Tag 7 und Tag 10) nach der Injektion von murinen Brusttumorzellen. Für dieses Experiment wurden 50.000 DB7-Zellen injiziert und das Gehirn des Tieres mittels MRT untersucht. Für jeden Scan wurden 30 Scheiben (0,5 mm Dicke) erfasst. Die Auswertung der 30 Scheiben pro Scan ergab, dass am 7. Tag nach der Injektion 5 Scheiben eine Tumorbelastung aufwiesen (Abbildung 3A) und an Tag 10 nach der Injektion 9 Scheiben eine Tumorbelastung aufwiesen(Abbildung 3B). Jedes Bild wurde wie beschrieben auf tumorbereich ausgewertet und der Bereich für jeden Frame ist in Abbildung 3Cdargestellt. Das gesamte Tumorvolumen wird bestimmt und um die Scheibendicke angepasst. Abbildung 4 zeigt die repräsentativen Daten im Publikationsformat einschließlich repräsentativer Bilder (Abbildung 4A) und eines Histogramms des Tumorvolumens im Zeitverlauf (Abbildung 4B).
Abbildung 1: Stereotaktische und Anästhesiesysteme. (A) Anästhesie-Induktionskammer-Einrichtung in einem biologischen Sicherheitsschrank. (B) Stereotaktische Anästhesie-Bereitstellungseinrichtung, die Anästhesieschläuche von der Anästhesiemaschine bis zum Nasenkegel auf dem stereotaktischen Apparat hervorhebt (siehe Einset in (C)). Grüne Pfeile zeigen gelieferte Anästhesiegasschläuche an, und blaue Pfeile weisen auf auf geschaufelte Gasschläuche hin. (C) Stereotaktischer Ständer mit Bohrbefestigung. Inset zeigt Anästhesieschläuche (grüne und blaue Pfeile), Mundleiste und Ohrleisten. (D) Stereotaktischer Ständer mit automatischer Spritzenpumpe und Maus-Hubbox. Die Box ist eine invertierte Pipettenspitzenbox mit Handwärmern, die verwendet werden, um die Maus auf die entsprechende Höhe zu heben und die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Inset zeigt die Ausrichtung der Hamilton-Spritze im automatisierten Injektionsapparat an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bilddarstellung der Zahnplatzierung auf einem stereotaktischen Gerät, Position der Ohrbügel und Kalvarialfenster relativ zu Bregma. (A) Das Bild der Kieferschneidezähne in der Zahnkerbe am Nasenkegel. (B) Die Lage der linken und rechten Ohrstangen innerhalb des medialen Canthus der jeweiligen Ohren. (C) Ein Pfeil zeigt die Bregma und ein roter Punkt zeigt die Stelle an, an der das Kalvarifenster gemacht werden soll (2 mm seitlich zur sagittalen Naht und 1 mm vordere zur koronalen Naht). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Beispiel für die Quantifizierung des Tumorvolumens für eine einzelne Maus über zwei Zeitpunkte nach der Injektion. Bilder der Tumor-Schnitte amTag7 und (B) Tag 10 nach der Injektion. Gelb bezeichnet Tumorbereich quantifiziert in ImageJ. (C) Slice-Fläche und gesamtvolumetrische Quantifizierung gemäß ImageJ (*=Korrektur für Die Dicke der Scheibe (0,5 mm)). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Tumorvolumenquantifizierung im Publikationsformat. (A) Repräsentative Bilder mit Skalenbalken (=2 mm). (B) Histogramm, das das Tumorvolumen (mm3) für die beiden Zeitpunkte darstellt. Faltenwechsel wird festgestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Nutzung der intrakraniellen Injektion, gefolgt von einer seriellen Überwachung mit MRT, bietet die einzigartige Möglichkeit, das Tumorwachstum mit Tumorvolumengenauigkeit im Laufe der Zeit zu visualisieren. Die Anwendung der digitalen Bildgebungsanalyse ermöglicht die Interpretation von Hirnläsionen für Tumorvolumen, Blutungen, Nekrose und Reaktion auf die Behandlung.
Wie bei jedem Verfahren gibt es wichtige Schritte, die für den Erfolg befolgt werden müssen. Erstens ist eine sorgfältige Einrichtung der stereotaktischen Geräte für den Erfolg dieser Technik unerlässlich. Aufgrund der geringen Größe des murinen Schädels können leichte Inkongruenzen zu dramatisch unterschiedlichen Auswirkungen auf die Tumorwachstumsrate und die Aufnahme von Versuchstieren führen. Daher ist eine angemessene Schulung über den Einsatz dieser Instrumente erforderlich. Zweitens stellt eine Heizquelle während des gesamten Verfahrens sicher, dass die Anästhesieebene nicht zu niedrig fällt. Niedrige Körpertemperaturen setzen das Risiko ein, aufgrund des verminderten Arzneimittelstoffwechsels und einer unbeabsichtigten Überdosierung der Anästhesie plötzlich unter Anästhesie zu sterben und/oder die Erholungszeiten verlängern zu können. Die vorgefertigten Heizkissen können sperrig und schwer zu manövrieren auf der stereotaktischen Maschine sein, aber kleine, luftaktivierte Handwärmer, die von jedem kommerziellen Anbieter gekauft werden, halten die Temperatur aufrecht und sind klein genug, um innerhalb der invertierten Pipettenspitzenbox platziert zu werden, die verwendet wird, um die Mäuse auf das entsprechende Niveau für das stereotaktische Setup zu erhöhen. Schließlich ist die Quantifizierung einfach, aber oft bestimmen, was Tumor im Vergleich zu dem, was nicht Tumor ist, kann herausfordernd sein. Es wird empfohlen, dass sich die Ermittler mit dem Bildgebungspersonal beraten, um eine genaue Bewertung zu gewährleisten. Es ist auch hilfreich, Tumorvolumenmessungen mehrmals zu wiederholen, um Fehler zu reduzieren. Außerdem sollte jede Studie von derselben Person für alle Bilder analysiert werden.
Das vorgestellte Protokoll kann je nach Benutzereinstellungen geändert werden. Erstens ist die Verwendung von injizierbarer Anästhesie (z. B. Ketamin/Xylazin) üblich und kann je nach Vorliebe des Prüfers sicherlich anstelle einer inhalierten Anästhesie (z. B. Isofluran) verwendet werden. Es ist jedoch wichtig, die Vorteile einer inhalierten Anästhesie zu berücksichtigen: (1) keine kontrollierte Substanz, (2) anästhesieaniskann im Laufe der Zeit angepasst werden (im Vergleich zu einer Vordosis Ketamin, die durch das Tiergewicht bestimmt wird), und (3) die Erholung ist relativ schnell im Vergleich zu Ketamin/Xylazin. Zweitens bietet die Verwendung des automatischen Bohrers ein hohes Maß an Genauigkeit, erhöht jedoch die Zeit für das Verfahren, da die Zeit für das Auf- und Abreißen des Geräts benötigt wird. Es ist sicherlich sinnvoll, eine kostenlose Handing-Technik zu verwenden, wenn gewünscht.
Dieses Protokoll nutzt sowohl ein stereotaktisches Setup als auch die Verwendung von MRT, beide sind mit erhöhten Kosten verbunden. Alternative Methoden zur intrakraniellen Injektion wurden zuvor beschrieben15,16,17,18,19. Einige dieser Methoden verwenden auch die Verwendung von biolumineszierender Bildgebung, um das Tumorwachstum während der gesamten Studie zu überwachen, wenn dies bevorzugt wird.
Wie oben erwähnt, ist es wichtig, die richtige Zellnummer für die Injektion in Abhängigkeit von dem Modellsystem zu bestimmen, das untersucht wird. Die Injektion von murinen Zellen in einen immunkompetenten Wirt erfordert tendenziell weniger Zellen als die Injektion menschlicher Zellen in einen immundefizienten Wirt. Die Überwachung der Tumorbelastung nach der Injektion durch MRT hilft festzustellen, ob die Anzahl der injizierten Zellen angemessen ist, da es möglich ist, zu sehen, wann Tumore ein bestimmtes Volumen erreichen und an welchem Punkt Mäuse beginnen, früh entfernungsbezogene Kriterien zu erreichen.
Der Nutzen und die breite Anwendung der MRT für die nichtinvasive Überwachung wurde von anderen in Kleintierforschungsstudien26verwendet. Während die MRT, wie bereits diskutiert, mehrere Vorteile bietet, gibt es in der Tat Einschränkungen, die es wert sind, erwähnt zu werden. Erstens ist der Einsatz der Maschine von Kernservicepersonal und Maschinenverfügbarkeit abhängig. Zweitens kann die Verwendung kostspielig sein. Wenn dies Bedenken sind, ist die Verwendung von biolumineszierender Bildgebung eine gültige Alternative für die Tumorüberwachung17,19. Drittens kann der Kontrast zwischen Tumor und dem umgebenden Gewebe (d. h. Gehirn) zwischen verschiedenen Zelllinien variieren; Diese Methode bietet jedoch die größte Chance, Tumor in vivo in Ermangelung einer Zellbeschriftung zu identifizieren. Schließlich ist die MRT in ihrer Auflösung begrenzt, die Tumorvolumendaten dorthin verzerren kann, wo es scheint, als gäbe es ein exponentielles Wachstum, wenn das Wachstum tatsächlich linear ist. Es gibt auch ein maximales Tumorvolumen, das durch MR-Bildgebung erhalten werden kann, aber dies ist weniger besorgniserregend, weil es unwahrscheinlich ist, dass eine Maus einen Tumor am oberen Ende überleben könnte. Die Tumornachweisgrenze hängt von der Art und Lage des Tumors im Gehirn ab, ob es eine Leckage in der Bluthirnschranke gibt und ob der Tumor gut umschrieben ist oder in das umgebende Gewebe eindringt. Es hängt auch davon ab, ob es sich um einen kontrastverstärkenden Tumor handelt und welche Art des MR-Bildgebungsprotokolls verwendet wird. Nach unserer Erfahrung können wir mit einer In-Plane-Voxelgröße von 78x78 'm und einer Schnittdicke von 0,5 mm einen Tumor mit einem Durchmesser von 0,5 mm routinemäßig mit einer Mindestgrenze von etwa 0,3 mm beobachten.
In Bezug auf intrakranielle Injektion, Es gibt mehrere Einschränkungen zu berücksichtigen. Erstens spiegeln intrakranielle Injektionen die metastasierende Kaskade nicht insofern wider, als sie die Entwicklung metastasierender Eigenschaften innerhalb des Primärtumors, die Intravasation in den Blutkreislauf und das Eindringen durch die Bluthirnschranke vollständig umgehen11. Zweitens, durch direkte Injektion in das Gehirn induziert diese Methode Entzündungen, die Befunde im Zusammenhang mit Neuroinflammation verwirren können. Schließlich kann eine Direkteinspritzung an dieser Stelle zu einem schnellen Wachstum über einen kurzen Zeitraum führen. Es ist wichtig, Mäuse auf neurologische Symptome wie Lähmung der Hinterbeine, Lethargie und Ataxie zu überwachen.
Alles in Betracht gezogen, Injektion direkt in das Gehirn ermöglicht die Überwachung der Tumor-Aufnahmerate, die den Forscher über das Wachstum speziell innerhalb dieser metastasierenden Stelle sowie Interaktion mit dem Gehirn metastasierenden Mikroumgebung informieren kann. Darüber hinaus ermöglicht die Überwachung der Tumorbelastung im Laufe der Zeit dem Prüfer, veränderte Tumorphänotypen, veränderte Mikroumwelt-Phänotypen und Reaktionen auf experimentelle therapeutische Strategien direkt zu vergleichen. Angesichts der relativ geringen Inzidenz sowohl spontaner als auch experimenteller Hirnmetastasen in Mausmodellen ist die intrakranielle Technik in der Tat ein wertvolles Werkzeug.
Krebsmetastasierung im Gehirn ist eine katastrophale Diagnose mit schlechter Reaktion auf aktuelle Behandlungsstrategien1,11,27. Während Brustkrebs die vorherrschende Ursache für Hirnmetastasen bei Frauen ist und der Schwerpunkt hierin liegt, ist Lungenkrebs die häufigste Ursache für Hirnmetastasen bei allen Krebspatienten2. Darüber hinaus wurden Hirnmetastasen bei Patienten berichtet, bei denen eine Reihe von soliden Tumortypen diagnostiziert wurden, und es wird erwartet, dass die Inzidenz weiter zunehmen wird, da sich die Therapien zur Behandlung von extrakraniellen Erkrankungen weiter verbessern. Während also der Schwerpunkt dieses Vorschlags auf BCBM liegt, ist die intrakranielle Krebsinjektion und MRT-Analyse auf die Untersuchung von Hirnmetastasen anderer solider Tumortypen sowie primärer Hirntumoren anwendbar. Die Verwendung des intrakraniellen Injektionsmodells der Hirnmetastasierung ermöglicht es Forschern, Krankheiten in großen Tierkohorten zu rekapitulieren, um eine Vielzahl von Forschungsfragen zu testen, in der Hoffnung, die Patientenversorgung besser zu erhalten. Durch die Kopplung dieses Modells mit hochauflösenden digitalen Bildern, die durch MRT erhalten werden, ist es möglich, das Tumorvolumen an mehreren Zeitpunkten sowie das Tumorverhalten auf die Therapie zu überwachen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Angaben.
Acknowledgments
Repräsentative Daten wurden über das National Cancer Institute (K22CA218472 bis G.M.S.) finanziert. Intrakranielle Injektionen werden in der Ohio State University Comprehensive Cancer Center Target Validation Shared Resource (Direktorin – Dr. Reena Shakya) durchgeführt und das MRT wird im Ohio State University Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource (Direktor – Dr. Kimerly Powell) abgeschlossen. Beide gemeinsamen Ressourcen werden über das OSUCCC, das OSUCCC Cancer Center Support Grant vom National Cancer Institute (P30 CA016058), Partnerschaften mit den Colleges und Abteilungen der Ohio State University und etablierte Chargeback-Systeme finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Materials | |||
| Betadine | Purdue Products | 19-027132 | Povidone-iodine, 7.5% |
| Bone Wax | Surgical Specialities | 903 | Sterile and malleable beeswax and isopropyl palmitate |
| Buponorphine SR-Lab | ZooPharm | N/A | Long acting injectable analgesic 5 mL (0.5 mg/mL) polymetric formulation |
| Cotton tip applicators | Puritan | 25-806 10WC | Sterile long stemmed cotton tip applicators |
| Eye Ointment | Puralube | 17033-211-38 | Lubricating petrolatum and mineral oil based ophthalmic ointment |
| Handwarmers | Hothands | HH2 | Air-activated heat packs |
| Ibuprofen | Up & Up | 094-01-0245 | 100mg per 5mL in liquid suspension |
| Isoflurane | Henry Schein INC | 1182097 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| Scalpels | Integra Miltex | 4-410 | #10 disposable scalpel blade |
| Skin Glue | Vetbond | 1469SB | Skin safe wounds adhesive |
| Sterile Dressing | TIDI Products | 25-517 | Individually packed sterile drapes |
| Suture | Covidien | SP5686G | 45cm swedged 5-0 monofilament polypropylene suture |
| Stereotaxic Unit | |||
| High Speed Drill (Foredom) | Kopf | Model 1474 | Max of 38,000 RPM |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | Mouth bar with teeth hole and nosecone |
| Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 922 | Ear bars suitable for mouse applications |
| Stereotaxic Instrument | Kopf | Model 940 | Base plate, frame and linear scale assembly with digital readout monitor |
| Injector | |||
| Injector Needle and syringe | Hamilton | 80366 | 26 gauge needle, 51 mm needle length and 10 μL volume syringe |
| Legato 130A automated Syringe Pump | KD Scientific | P/N: 788130 | Programmable touch screen base with automated injector |
| Anesthesia Machine | |||
| SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer | Kent Scientific | SS-01 | Digital anesthesia machine |
| SomnoSuite Starter Kit for mice | Kent Scientific | SOMNO-MSEKIT | Includes induction chamber, 2x anesthesia syringes, 18" tubing, plastic nosecone, 2x waste aneshesia gas canisters |
References
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