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Biochemistry

थर्मोटोगा मारिटिमा M42 अमीनोपेप्टिडेस TmPep1050 के ओलिगोमेरिक राज्य संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी

Published: May 13, 2020 doi: 10.3791/61288
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 1
1Laboratory of Microbiology, Department of Molecular Biology, Université Libre de Bruxelles, 2Labiris Institut de Recherche

Summary

इस प्रोटोकॉल को संरचनात्मक स्तर पर TmPep1050, एक M42 अमीनोपेप्टिडेस के डिमर-डोडेकामर संक्रमण का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। यह प्रोटीन शुद्धिकरण से लेकर एक्स-रे डेटा प्रोसेसिंग तक की सीधी पाइपलाइन है । क्रिस्टलोलोजेनेसिस, डेटा सेट इंडेक्सेशन, और आणविक प्रतिस्थापन अध्ययन के एक मामले के माध्यम से जोर दिया गया है, TmPep1050H60A H307A संस्करण ।

Abstract

M42 अमीनोपेपिडेस 12 उपइकाओं से बने कार्यात्मक रूप से सक्रिय परिसर बनाते हैं। उनकी असेंबली प्रक्रिया को उनके धातु आयन कोफैक्टरों द्वारा विनियमित किया जाता है जो एक डिमर-डोडेकेमर संक्रमण को ट्रिगर करते हैं। धातु आयन बाध्यकारी पर, कई संरचनात्मक संशोधन सक्रिय साइट में और इंटरैक्शन इंटरफेस पर होते हैं, जो आत्म-असेंबली को बढ़ावा देने के लिए डिमर्स को आकार देते हैं। इस तरह के संशोधनों का पालन करने के लिए, संरचनात्मक अध्ययन से पहले स्थिर अल्पाधिकार को अलग किया जाना चाहिए। यहां रिपोर्ट की गई एक विधि है जो TmPep1050 के स्थिर द्वादक और डाइमर्स के शुद्धिकरण की अनुमति देती है, टी मैरिटिमाका एक M42 अमीनोपेप्टिडेस, और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी द्वारा उनकी संरचना निर्धारण। एक चेटिंग एजेंट के साथ धातु आयनों को हटाकर दशमलव से डिमर्स तैयार किए गए थे। उनके कोफैक्टर के बिना, द्वादश कम स्थिर हो गए और गर्म करने पर पूरी तरह से अलग हो गए। ओलिगोमेरिक संरचनाओं को सीधा आणविक प्रतिस्थापन दृष्टिकोण द्वारा हल किया गया था। कार्यप्रणाली को समझाने के लिए, धातु आयन बाध्यकारी में पूरी तरह से बिगड़ा एक TmPep1050 संस्करण की संरचना, मोनोमर के लिए dimers के आगे कोई टूटने दिखा प्रस्तुत किया है ।

Introduction

ओलिगोमेराइजेशन एक प्रमुख प्रक्रिया है जो कई प्रोटीन के जैविक कार्यों को तय करती है। एस्चेरिचिया कोलाईमें यह अनुमान लगाया गया है कि केवल 35% प्रोटीन मोनोमेरिक1हैं । कुछ प्रोटीन, जिन्हें मॉर्फीिन कहा जाता है, यहां तक कि प्रत्येक अल्पाधिकारी राज्य2में अलग संरचना वाले उपइकाओं के साथ कई ओलिगोमेरिक राज्यों को भी अपना सकते हैं। उनके अल्पाधिकारी राज्यों के बीच संक्रमण अक्सर प्रोटीन गतिविधि को विनियमित करने का मतलब होता है क्योंकि प्रत्येक अल्पाधिकारी राज्य में एक अलग विशिष्ट गतिविधि या कार्य हो सकता है। अफ़रीद के कई उदाहरण साहित्य में अच्छी तरह से प्रलेखित किए गए हैं, विशेष रूप से पोर्फोबिलिनोजेन सिंथेस3,एचपीआर किनेस/फॉस्फेट4,लोन प्रोटीज5,लैक्टेट डेहाइड्रोजनेज़6,ग्लाइसेरल्डिहाइड-3-फॉस्फेट डेहाइड्रोजेज7,पायरुवेट किनेस8,साइट्रेट सिंथाज9,और रिबोक्लेशिकेस ए10। हाल ही में, हमने M42 aminopeptidase TmPep1050 का वर्णन किया, जो मॉर्फीिन जैसे व्यवहार के साथ एंजाइम का एक और उदाहरण है, जिसकी गतिविधि इसके ओलिगोमेरिक राज्यों पर निर्भर करती है11। इसके अल्पाधिकारी राज्यों के बीच संक्रमण इसके धातु सहकारकों द्वारा मध्यस्थता की जाती है जो उपइकाओं के कई संरचनात्मक संशोधनों को प्रेरित करते हैं।

एम42 अमीनोपेपिडेस परिवार एमएच कबीले12,13से संबंधित है और यह बैक्टीरिया और आर्चिया14के बीच व्यापक रूप से वितरित किया जाता है । एम42 अमीनोपेपिडेस वास्तविक डिस्यूक्लियर एंजाइम हैं जो पेप्टाइड्स को15लंबाई में 35 अमीनो एसिड अवशेषों तक अपमानजनक करते हैं। वे एक अजीब टेट्राहेड्रॉन के आकार की संरचना को अपनाते हैं जो 12 उपइकाओं से बना है, जिसमें उनकी सक्रिय साइटें एक आंतरिक गुहा की ओर उन्मुख होती हैं। इस तरह की व्यवस्था को अक्सर अनियंत्रित प्रोटेओलिसिस से बचने के लिए गतिविधि के नैनो-कंपार्टमेंट के रूप में वर्णित किया जाता है। एम 42 अमीनोपेपिडेस का शारीरिक कार्य प्रोटीन क्षरण16, 17के परिणामस्वरूप प्रोटेसोम, हाइड्रोलिजिंग पेप्टाइड्स से जुड़ा हो सकता है। पायरोकोकस होरीकोशिई के पास चार एम 42 अमीनोपेपिडेस होते हैं, जिनमें से प्रत्येक अलग लेकिन पूरक विशिष्टताएं18,19,20,21पेश करते हैं। पी होरिकोशिमें दो अलग-अलग प्रकार की उपइकाइकों से बने हेट्रोकॉम्प्लेक्स का वर्णन किया गया है, जो पेप्टिडासोम कॉम्प्लेक्स22,23के अस्तित्व का सुझाव देते हैं।

साहित्य 11 , 16 , 18 ,19, 20 , 24,25,26में एम42अमीनोपेपिडेस की कई संरचनाओं का वर्णन किया गया है । सबयूनिट दो अलग-अलग डोमेन, एक उत्प्रेरक डोमेन और एक डाइमराइजेशन डोमेन से बना है। उत्प्रेरक डोमेन पूरे एमएच कबीले में संरक्षित एक आम α/β गुना को अपनाता है, ठेठ उत्प्रेरक डोमेन विब्रियो प्रोटेओलिटिकस27का एमिओपेप्टिडेस एपी1 है। डिमराइजेशन डोमेन पीडीजेड-जैसे गुना16 को अपनाता है और हो सकता है कि अल्पाधिकार में इसकी भूमिका के अलावा, सब्सट्रेट एक्सेस को नियंत्रित करने और आंतरिक गुहा11में बाध्यकारी होने में भूमिका हो। चूंकि बुनियादी बिल्डिंग ब्लॉक एक डाइमर है, इसलिए डोडेकेमर को अक्सर छह डाइमर के संघ के रूप में वर्णित किया जाता है, प्रत्येक डाइमर को टेट्राहेड्रॉन16के प्रत्येक किनारे पर तैनात किया जाता है। M42 अमीनोपेप्टिडास का अल्पाधिकार इसके धातु कोफैक्टरों की उपलब्धता पर निर्भर करता है। डिवेलेंट मेटल आयन, अक्सर जेडएन2 + और सीओ2 +,पेप्टाइड बाइंडिंग और हाइड्रोलिसिस में उत्प्रेरक रूप से शामिल होते हैं। वे दो अलग-अलग बाध्यकारी साइटों, अर्थात् एम 1 और एम 2 साइटों में पाए जाते हैं। दो धातु आयनों को भी ड्राइव और बारीकी से के रूप में PhTET2, PhTET3, PfTET3, और TmPep105011,24, 28,29के लिए प्रदर्शन के रूप में अल्पाधिकार धुन । जब धातु कोफैक्टर समाप्त हो जाते हैं, तो द्वादश डिमर्स में अलग हो जाता है, जैसे PhTET2, PhTET3, और TmPep105011,16,28,या यहां तक कि मोनोमर, जैसे PhTET2 और PfTET324, 29।

यहां प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल है जो TmPep1050 अल्पाधिकार की संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है। यह प्रोटोकॉल प्रोटीन शुद्धिकरण, प्रोटियोलिटिक गतिविधि स्क्रीनिंग, क्रिस्टलीकरण, एक्स-रे विवर्तन और आणविक प्रतिस्थापन सहित सामान्य तरीकों का एक सेट है। धातु, प्रोटीन ओलिगोमेराइजेशन, प्रोटीन क्रिस्टलीकरण और आणविक प्रतिस्थापन से निपटने के लिए निहित बारीकियों पर जोर दिया जाता है। अध्ययन का एक मामला यह दिखाने के लिए भी प्रस्तुत किया जाता है कि क्या TmPep1050 द्वादशों को मोनोमर में और अलग कर सकते हैं या नहीं । इस प्रश्न का समाधान करने के लिए, एक TmPep1050 संस्करण, TmPep1050H60A H307A,जिसका धातु बाध्यकारी साइटों अपने-६० (M2 साइट) और उसके-३०७ (M1 साइट) अला अवशेषों को उत्परिवर्तन द्वारा बिगड़ा हुआ है अध्ययन किया गया है । इस प्रोटोकॉल को अन्य M42 अमीनोपेप्टिडेस या मॉर्फीिन जैसे व्यवहार के साथ किसी भी धातुलोएंज़ीम का अध्ययन करने के लिए समायोजित किया जा सकता है।

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Protocol

1. पुनर्संयोजन TmPep1050 का उत्पादन और शुद्धिकरण

नोट: इसके बाद क्लोनिंग प्रक्रिया और जंगली प्रकार TmPep1050 की शुद्धि एक पिछले अध्ययन11से अनुकूलित वर्णित हैं । वैकल्पिक रूप से, क्लोनिंग एक सिंथेटिक जीन का उपयोग किया जा सकता है। TmPep1050 वेरिएंट उत्पन्न करने के लिए, साइट निर्देशित म्यूटेनेसिस के बाद किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, समानांतर प्रोटोकॉल (SPRINP) विधि30में एकल-प्राइमर प्रतिक्रियाएं। शुद्धिकरण प्रोटोकॉल TmPep1050 वेरिएंट के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उसके टैग के उपयोग से बचा जाना चाहिए क्योंकि यह धातु आयन बाध्यकारी के साथ हस्तक्षेप करता है।

  1. अभिव्यक्ति वेक्टर डिजाइन
    1. थर्मोटोगा मैरीटिमा एमएसबी8 (एटीसीसी 43589) या टीएमसीडी00089984 (ज्वाइंट सेंटर फॉर स्ट्रक्चरल जीनोमिक्स) का जीनोमिक डीएनए प्राप्त करें।
    2. जीनोमिक डीएनए या टेम्पलेट प्लाज्मिड का उपयोग करके TM_1050 ओपन रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ) को बढ़ाना, एक उच्च निष्ठा डीएनए बहुलक, और निम्नलिखित प्राइमर: ocej419 (5'-TTTAACTTTAAGAAGAGATATAATAATACCCATGAAGGATCAAGAAGCTCTG) और ocej420 (5'-ATCCGCCAAAACCAAGACAGATGATAGAAGACCGTTTTACCCCCCCCCCC निम्नलिखित योजना के अनुसार पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) स्क्रीनिंग चलाएं: 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट, 3 चरणों के 30 चक्र (95 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस, 55 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस, 72 डिग्री सेल्सियस पर 90 एस), और अंतिम चरण के रूप में 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट।
    3. एनएलआईईसीई प्रोटोकॉल31के अनुसार ई कोलाई में समरूप पुनर्संयोजन(चित्रा 1)द्वारा पीसीआर के टुकड़े को उपयुक्त अभिव्यक्ति वेक्टर(सामग्रीकी तालिका) में क्लोन करें । रैखिक वेक्टर के 50 एनजी करने के लिए, वेक्टर के लिए टुकड़ा के एक 10:1 मोलर अनुपात में पीसीआर टुकड़ा जोड़ें, पीपीवाई स्ट्रेन एक्सट्रैक्ट के 1 माइक्रोन, 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.5, 100 एमएमएम एमजीसीएल2,10 एमएम एटीपी, और 10 एमएम डिथिओथ्रेइटॉल (डीटीटी) 10 माइक्रोन के रिएक्शन वॉल्यूम के लिए। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    4. रीकॉम्बिनेशन प्रतिक्रिया के 1 μL के साथ रासायनिक रूप से सक्षम ई. कोलाई XL1 नीले तनाव (या किसी भी आरईसीए- उपयुक्त तनाव) को बदलें। एलबी माध्यम पर कोशिकाओं को प्लेट करें जिसमें 100 μg/mL एम्पीसिलिन होता है। प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. 100 μg/mL एम्पीसिलिन के साथ ताजा पौंड प्लेटों पर कालोनियों उठाओ। कम से कम 8 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
    6. उपयुक्त प्राइमर जोड़ी (5'- एटीजीसीएटीएटटीसीटीसीसी और 5'- एटीटीएटीजीटीटीसीजीजीसी का उपयोग करके कॉलोनी पीसीआर द्वारा सकारात्मक उम्मीदवारों के लिए स्क्रीन यदि सामग्री तालिका में सूचीबद्ध अनुशंसित वेक्टर का उपयोग करते हैं)। एक माइक्रोटिप अंत के साथ, एक उठाया कॉलोनी खरोंच और प्रत्येक प्राइमर के 0.5 माइक्रोन युक्त प्रतिक्रिया मिश्रण के 20 माइक्रोन के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित करने और एक वाणिज्यिक Taq डीएनए बहुलक मिश्रण के 10 μL युक्त।
    7. निम्नलिखित योजना के अनुसार पीसीआर स्क्रीनिंग चलाएं: 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट, 3 चरणों के 30 चक्र (95 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस, 55 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस, 72 डिग्री सेल्सियस पर 90 एस), और अंतिम चरण के रूप में 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट।
      नोट- पीसीआर की प्रतिक्रियाओं को पीसीआर मशीन में रात भर 12 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है।
    8. ट्रिस-एसीटेट-ईडीए (टीएई) बफर में तैयार 0.8% एगर उठे जेल पर प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया का 10 माइक्रोन लोड करें। 100 वी पर 25 मिनट के लिए इलेक्ट्रोफोरेसिस चलाएं।
      नोट: एक 1.1 केबीपी एम्प्लिकॉन की उम्मीद है।
    9. एक वाणिज्यिक किट(सामग्री की तालिका)का उपयोग कर उंमीदवारों से प्लाज्मिड निकालें और उन्हें एक ही प्राइमर जोड़ी चरण 1.1.6 में इस्तेमाल का उपयोग कर अनुक्रम।
  2. सेल संस्कृति
    नोट: जब किसी उपयुक्त उम्मीदवार की पहचान अनुक्रमण द्वारा की गई है, तो क्लोन का उपयोग सीधे अभिव्यक्ति के रूप में किया जा सकता है यदि अनुशंसित वेक्टर(सामग्रियों की तालिका) काउपयोग किया जाता है। उस मामले में, अभिव्यक्ति अरबिनोस-अक्षुण्ण पीखराब प्रमोटर32द्वारा नियंत्रित की जाती है।
    1. उम्मीदवार के साथ 100 माइक्रोग्राम/एमएल एम्पीसिलिन युक्त एलबी माध्यम के 10 एमएल का टीका करें और कक्षीय झटकों के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्रीकल्चर को इनक्यूबेट करें। 100 μg/mL एम्पीसिलिन के साथ एलबी माध्यम के 1 एल करने के लिए प्रीकल्चर के 5 एमएल जोड़ें। 3 के तरल अनुपात के लिए एक हवा का सम्मान करने के लिए मन ।
    2. कक्षीय झटकों के तहत कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने दें। 660 एनएम (ओडी 660) पर ऑप्टिकल घनत्व की निगरानी।
    3. जब ओडी660 0.5−0.6 तक पहुंच गया है, तो बर्फ पर 5 मिनट के लिए संस्कृति को तेजी से ठंडा करें और इसे 18 डिग्री सेल्सियस तक सेट करने के लिए एक इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
    4. जीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए 0.2 ग्राम/एल अरबिनोज़ जोड़ें और 18 डिग्री सेल्सियस पर 12−18 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 6,000 x ग्राम पर संस्कृति अपकेंद्रित्र द्वारा फसल कोशिकाओं। सुपरनेटेंट और वॉश सेल को 09% (w/v) एनएसीएल के 100 एमएल के साथ डिस्कार्ड करें।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 6,000 x g पर फिर से सेंट्रलाइज करें और सुपरनैंट को त्यागें।
      नोट: सेल छर्रों का उपयोग सीधे प्रोटीन निष्कर्षण के लिए किया जा सकता है या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. प्रोटीन शुद्धि
    1. 50 एमएल एमओपीएस, 1 एमएमएम कोसीएल2,पीएच 7.2 के 40 एमएल में सेल छर्रों को फिर से रीसुस्पेंड करें। 25 यू/μL डीएनए/आरएनए एंडो न्यूक्लियीज के 1 माइक्रोन और प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल की एक गोली जोड़ें जिसमें EDTA नहीं है । 30 मिनट के लिए कूलिंग के तहत पल्स मोड में निलंबन को सोनिकेट करें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 20,000 x ग्राम पर क्रूड निकालने का सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को इकट्ठा करें और इसे 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में गर्म करें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 20,000 x ग्राम पर विकृत सेल निकालने को अपकेंद्रित्र करें और शुद्धिकरण के लिए सुपरनेट इकट्ठा करें।
    4. मात्रा के ~ 15 एमएल के कॉलम में पैक उपयुक्त एनियन एक्सचेंज राल(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग करें। काम प्रवाह दर और कॉलम दबाव सीमा के लिए निर्माता की सिफारिशों को देखें। 50 एमएमएम एमओपी, 1 एमएमएम कोसीएल2, पीएच 7.2के साथ राल को बराबर करें।
    5. चरण 1.3.3 से एकत्र किए गए सुपरनेट को कॉलम में लोड करें। 280 एनएम पर एलुएट के अवशोषण की निगरानी करें। जब यह बेसलाइन पर पहुंच गया है, तो एल्यूशन पर आगे बढ़ें।
    6. 50 m MOPS में 0 से 0.5 एम एनएसीएल, 1 mM CoCl2,पीएच 7.2 में 5 कॉलम वॉल्यूम (सीवी) के लिए एक ढाल लागू करें। चालकता स्थिर होने तक प्रतीक्षा करें और अवशोषण बेसलाइन तक पहुंच गया है।
    7. 1 सीवी के लिए 50 एमएम एमओपी, 1 एमएमएम कोसीएल2,पीएच 7.2 में 0.5 से 1 एम एनएसीएल तक अंतिम ढाल लागू करें।
    8. सोडियम डॉडेकाइल सल्फेट पॉलीएक्रेमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) द्वारा कुछ अंशों (मार्गदर्शन के लिए चित्रा 2 ए देखें) का विश्लेषण करें।
      नोट: TmPep1050 Coomassie धुंधला के बाद एक ३६ केडीए बैंड के रूप में प्रकट होता है । वैकल्पिक रूप से, TmPep1050 की उपस्थिति गतिविधि परख द्वारा पुष्टि की जा सकती है (धारा 2.1 देखें)। इस चरण में, अंशों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    9. टीएमपेप 1050 वाले अंशों को पूल करें और1.5एम (एनएच 4)2एसओ 4 की सांद्रता प्राप्त करने के लिए (एनएच4) 2एसओ4का बारीक जमीन पाउडर जोड़ें। ट्यूब को पूर्ण विघटन तक उल्टा करके धीरे-धीरे मिलाएं।
    10. मात्रा के ~ 30 एमएल के कॉलम में पैक हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन राल(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग करें। काम प्रवाह दर और कॉलम दबाव सीमा के लिए निर्माता की सिफारिशों को देखें। 50 एमएम एमओपी, 1.5 एम (एनएच4)2 एसओ4,1 एमएम कोसीएल2,पीएच 7.2 के साथ राल को इक्विलिब्रेट करें।
    11. नमूना को कॉलम पर लोड करें और 280 एनएम पर एलुएट के अवशोषण की निगरानी करें। जब अवशोषण बेसलाइन तक पहुंच गया है, तो 50 M MOPS में 1.5 मीटर से 0 मीटर (एनएच4) 2एसओ4, 1 एमएमएम कोसीएल2,पीएच 7.2 में 5 सीवी के लिए ढाल लगाकर एल्यूट बाउंड प्रोटीन।
    12. एसडीएस-पेज द्वारा कुछ अंशों का विश्लेषण करें (मार्गदर्शन के लिए चित्रा 2B देखें) ।
      नोट: TmPep1050 Coomassie धुंधला के बाद एक ३६ केडीए बैंड के रूप में प्रकट होता है । वैकल्पिक रूप से, TmPep1050 की उपस्थिति गतिविधि परख द्वारा पुष्टि की जा सकती है (धारा 2.1 देखें)। इस चरण में, अंशों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    13. TmPep1050 युक्त अंशों को पूल करें और 30 केडीए कटऑफ(सामग्री की तालिका)के साथ अल्ट्राफिल्ट्रेशन इकाइयों का उपयोग करके 2 एमएल पर ध्यान केंद्रित करें। आणविक वजन निर्धारित करने के लिए धारा 1.4 पर आगे बढ़ें।
  4. आकार बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी
    1. मात्रा के ~ 120 एमएल के कॉलम में पैक आकार अपवर्जन राल(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग करें। काम प्रवाह दर और कॉलम दबाव सीमा के लिए निर्माता की सिफारिशों को देखें। 50 एमएम एमओपी, 0.5 एम (एनएच4)2 एसओ4,1 एमएमएम सीओसीएल2,पीएच 7.2 के साथ राल को इक्विलिब्रेट करें।
    2. नमूना को कॉलम पर लोड करें और 280 एनएम पर एलुएट के अवशोषण की निगरानी करें। एल्यूशन (1 सीवी) के अंत तक कॉलम डेड वॉल्यूम (~ 0.33 सीवी) से अलग हो जाते हैं।
    3. प्रत्येक मनाया चोटी के लिए एल्यूशन मात्रा को मापने।
      नोट: मार्गदर्शन के लिए, वर्तमान प्रायोगिक परिस्थितियों में ~ 82 एमएल(चित्रा 3A)पर dodecameric TmPep1050 elutes, जबकि dimeric TmPep1050, जैसे TmPep1050H60A H307A संस्करण, ~ 95 mL(चित्रा 3B)पर elutes। कुछ TmPep1050 दोनों ओलिगोमेरिक रूपों को अपना सकते हैं, जैसे TmPep1050H60A (चित्रा 3C)।
    4. एसडीएस-पेज का उपयोग करके मनाए गए चोटियों की मैक्सिमा और पूंछ के अनुरूप अंशों का विश्लेषण करें।
      नोट: TmPep1050 Coomassie धुंधला के बाद एक ३६ केडीए बैंड के रूप में प्रकट होता है ।
    5. प्रत्येक चोटी के अंशों को पूल करें और ~ 300 माइक्रोन की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 30 केडीए कटऑफ(सामग्री की तालिका)के साथ अल्ट्राफिल्ट्रेशन इकाइयों का उपयोग करके ध्यान केंद्रित करें।
    6. नैनो-वॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर 280 एनएम पर अवशोषण को मापें और 18,910 एम-1 सेमी-1 के आणविक विलुप्त होने के गुणांक का उपयोग करके एकाग्रता की गणना करें।
    7. शुद्ध प्रोटीन को -18 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    8. आणविक वजन निर्धारित करने के लिए, आणविक वजन मानकों(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग करके आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी (एसईसी) कॉलम को कैलिब्रेट करें। रनिंग बफर के रूप में 50 एमएम एमओपी, 0.5 एम (एनएच4)2एसओ4,1 एमएमएम कोसीएल 2 पीएच7.2 का उपयोग करके मानकों का विश्लेषण करें।

2. गतिविधि परख और एपीओ-एंजाइम तैयारी

नोट: मूल रूप से, एपो-एंजाइम 2.1 एम मैलिक एसिड पीएच 7.0 के 10 वॉल्यूम में TmPep1050 की 1 मात्रा को कमजोर करके तैयार किया गया था और डायलिसिस 11 से पहले1वॉल्यूम पर वापस ध्यान केंद्रित कर रहा था। नीचे 1,10-फेनथ्रोलिन, एक धातु आयन चेलेटर का उपयोग करके एक वैकल्पिक प्रक्रिया प्रस्तुत की गई है। यह प्रक्रिया प्रोटीन हानि को कम करती है और पहले प्रकाशित विधि की तुलना में समान परिणाम देती है।

  1. गतिविधि परख
    1. मेथनॉल में 100 m M L-Leucine-p-नाइट्रोनेलाइड(सामग्री की तालिका) कास्टॉक समाधान तैयार करें।
    2. 50 एमएम एमओपीएस, 250 माइक्रोनसीओसीएल2, पीएच 7.2, 10% मेथनॉल के 965 माइक्रोन में 100 एमएमएल-ल्यूसिन-पी-नाइट्रोनेलाइडके 25 माइक्रोन जोड़ें। ड्राई बाथ में रिएक्शन मिक्स को 75 डिग्री सेल्सियस पर प्रीइनक्यूबेट करें।
    3. एंजाइम को 50 m M MOPS पीएच 7.2 में 1 माइक्रोएम की एकाग्रता में पतला करें। 75 डिग्री सेल्सियस पर रिएक्शन मिक्स, भंवर और इनक्यूबेट में 10 माइक्रोन जोड़ें या तो जब तक कि यह पीला न हो जाए या 1 घंटे के लिए।
    4. 20% एसिटिक एसिड के 1 मिलील जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करें। भंवर अच्छी तरह से और इसे कमरे के तापमान को ठंडा करने दें।
    5. रिएक्शन मिक्स को स्पेक्ट्रोफोटोमीटर सेल में ट्रांसफर करें। नकारात्मक नियंत्रण (एंजाइम के बिना इनक्यूबेटेड रिएक्शन मिक्स) के खिलाफ 410 एनएम पर अवशोषण पढ़ें।
  2. एपीओ-एंजाइम तैयारी
    1. इथेनॉल में 1 एम 1,10-फेनथ्रोलिन का स्टॉक समाधान तैयार करें। 1,10-फेनथ्रोलिन स्टॉक समाधान के 10 माइक्रोन को 50 एमएम एमओपीएस, 0.5 एम (एनएच4)2 एसओ4,पीएच 7.2 के 890 माइक्रोन में जोड़ें। शुद्ध TmPep1050 (300 μM−1 m एकाग्रता) के 100 μL जोड़ें।
    2. प्रतिक्रिया मिश्रण मेंCoCl 2 जोड़ने के बिना धारा 2.1 में वर्णित गतिविधि परख का उपयोग कर गतिविधि हानि की जांच करें।
    3. सैंपल को डायलिसिस ट्यूब में ट्रांसफर करें। 50 एम एमयूपी के 200 एमएल, 0.5 एम (एनएच4) 2एसओ4,पीएच 7.2 के मुकाबले 4 डिग्री सेल्सियस पर डायलाइज़। 48 घंटे डायलिसिस के दौरान ताजा बफर के साथ तीन बार डायलास का आदान-प्रदान करें।
    4. डायलिसिस ट्यूब से नमूना लें और 30 केडीए कटऑफ(सामग्री की तालिका)के साथ अल्ट्राफिल्ट्रेशन इकाइयों का उपयोग करके 100 माइक्रोन पर वापस ध्यान केंद्रित करें। नैनो-वॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 280 एनएम पर अवशोषण पढ़कर एकाग्रता की जांच करें।
  3. डिमर तैयारी
    1. 50 एमएम एमओपी, 0.5 एम (एनएच4)2 एसओ4,पीएच7.2 में 1 माइक्रोन की सांद्रता के लिए एपो-एंजाइम को पतला करें। सूखे स्नान में 75 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, फिर नमूना को कमरे के तापमान तक ठंडा होने दें।
    2. नमूने को कम से कम 50 माइक्रोन की एंजाइम एकाग्रता पर केंद्रित करें। एसईसी द्वारा आणविक वजन की जांच करें (धारा 1.4 देखें)। एल्यूशन पीक ~ 82 एमएल से ~ 95 एमएल (वर्तमान प्रायोगिक परिस्थितियों में) में स्थानांतरित होना चाहिए।

3. TmPep1050 क्रिस्टलीकरण

नोट: प्रोटीन क्रिस्टलीकरण एक अनुभवजन्य विज्ञान बना हुआ है क्योंकि यह एक बहुकार्यात्मक घटना33है । जबकि कुछ मापदंडों की पहचान और नियंत्रण किया जा सकता है (जैसे तापमान, पीएच, वर्षा एजेंट एकाग्रता), अन्य क्रिस्टलीकरण (जैसे प्रोटीन और रासायनिक शुद्धता, प्रोटियोलिसिस, नमूना इतिहास) को मायावी रूप से प्रभावित कर सकते हैं। आजकल प्रोटीन क्रिस्टलीकरण वाणिज्यिक क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग शर्तों और स्वचालन का एक गुच्छा करने के लिए एक तर्कसंगत और व्यवस्थित तरीके से हल किया जाता है। हालांकि, क्रिस्टलीकरण की स्थिति का अनुकूलन ज्यादातर परीक्षण और त्रुटि दृष्टिकोण पर निर्भर करता है। इसके बाद प्रोटीन को क्रिस्टलाइज करने के लिए एक खाका और क्रिस्टलीकरण की स्थिति को अनुकूलित करने के लिए कई सुझावों का वर्णन किया जाता है।

  1. क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग
    नोट: वाणिज्यिक क्रिस्टलीकरण किट का उपयोग करते हुए, डोडेकैमरानिक टीएमपीपी1050 के क्रिस्टल 2.2 एम डीएल-मैलिक एसिड पीएच 7.0, 0.1 एम बीआईएस-ट्रिज़ प्रोपेन पीएच 7.0 और 0.18 एम त्रि-अमोनियम साइट्रेट, 20% पॉलीएथिलीन ग्लाइकोल (खूंटी) 3350 में प्राप्त किए गए हैं। 0.1 मीटर सोडियम साइट्रेट पीएच 5.6, 0.2 मीटर अमोनियम एसीटेट, 30% PEG4000 में डाइमेरिक टीएमपीपी1050 के क्रिस्टल प्राप्त किए गए हैं। द्वादशों के क्रिस्टल एक सप्ताह के भीतर दिखाई देते हैं और एक महीने में अपने पूरे आकार तक पहुंच जाते हैं। डाइमर्स के क्रिस्टल आमतौर पर 24 घंटे के भीतर दिखाई देते हैं और एक सप्ताह में पूर्ण आकार में बढ़ते हैं।
    1. कई वाणिज्यिक क्रिस्टलीकरण किट प्राप्त करें (उदाहरणों के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
    2. हैंगिंग ड्रॉप विधि के लिए क्रिस्टलीकरणप्लेटें (सामग्री की तालिका)सेट करें। एक क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग किट के प्रत्येक समाधान के 500 μL के साथ कुओं को भरें।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से, एक क्रिस्टलीकरण समर्थन स्थापित करें। समर्थन पर, शुद्ध प्रोटीन की 1 माइक्रोन ड्रॉप (आमतौर पर ~ 10 मिलीग्राम/एमएल) जमा करें।
    4. तुरंत कुएं से क्रिस्टलीकरण समाधान के 1 माइक्रोन पाइप। इसे प्रोटीन ड्रॉप में सावधानी से जोड़ें और तीन बार उल्टा पाइपिंग करके धीरे-धीरे मिलाएं। ड्रॉप को बिना किसी बुलबुले के अर्धमंडलीय रहना चाहिए।
    5. इसी अच्छी तरह से के शीर्ष पर समर्थन पेंच। पूरी किट के लिए ऑपरेशन दोहराएं।
    6. प्लेटों को स्थापित करने के बाद, प्रत्येक बूंद को दूरबीन के साथ देखें। व्याख्या के लिए क्रिस्टलीकरण किट उपयोगकर्ता गाइड (स्पष्ट ड्रॉप, चरण जुदाई, तेज़, सुई, आदि) को देखें।
    7. प्लेटों को 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। पहले सप्ताह के दौरान प्रति दिन एक बार प्लेटों की जांच करें और प्रति सप्ताह एक बार बाद में।
    8. स्कोर शीट और क्रिस्टलीकरण किट के साथ प्रदान की उपयोगकर्ता गाइड का उपयोग कर प्रत्येक अच्छी तरह से स्कोर।
  2. क्रिस्टलीकरण अनुकूलन
    नोट: dodecameric TmPep1050 की प्रारंभिक क्रिस्टलीकरण स्थितियों को 2.1 एम डीएल-मैलिक एसिड पीएच 6.75 और 0.18 एम त्रि-अमोनियम सिट्रेट पीएच 7.5, के लिए अनुकूलित किया गया है 40% (w/v) PEG3350 जबकि मंद TmPep1050 के क्रिस्टलीकरण की स्थिति को 0.1 एम सोडियम साइट्रेट पीएच 6.0, 10% (w/v) PEG3350 में स्थानांतरित कर दिया गया है। क्रिस्टलसिटी में सुधार के लिए सीडिंग का एक चक्र जरूरी किया गया है। इसके बाद बताया गया है कि कैसे TmPep1050H60A H307A संस्करण के क्रिस्टलीकरण को अनुकूलित किया गया है ।
    1. विभिन्न पीएच (4.5, 5.2, और 6.0) पर 0.5 एम सोडियम साइट्रेट बफर के स्टॉक समाधान तैयार करें, और 50% (w/v) PEG3350 समाधान।
    2. पीएच बनाम वर्षा एजेंट के मैट्रिक्स के रूप में एक क्रिस्टलीकरण प्लेट स्थापित करें (चित्रा 4Aदेखें)।
    3. थाली को 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक सप्ताह के दौरान प्रति दिन एक बार दूरबीन के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से निरीक्षण करें।
    4. क्रिस्टल आकार और आकार के अनुसार प्रत्येक अच्छी तरह से स्कोर करें। कम से कम 50 माइक्रोन के क्रिस्टल देने वाली स्थिति का चयन करें। माइक्रोबीजिंग के लिए आगे बढ़ें।
  3. माइक्रोबीजिंग
    नोट: माइक्रोसीडिंग प्रोटीन क्रिस्टल34के आकार, आकार और क्रिस्टलिनिटी में सुधार करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। एक तेजी से सीडिंग दृष्टिकोण एक बिल्ली मूंछ का उपयोग कर लकीर बोने है। चित्रा 4 को एक उदाहरण के रूप में देखें कि कैसे क्रिस्टलीकरण अनुकूलन और माइक्रोसीडिंग ने TmPep1050H60A H307Aके लिए क्रिस्टल आकार और आकार में सुधार किया है।
    1. चरण 3.2.4 में चयनित अच्छी तरह से उपयोग कर बीज तैयार करें।
    2. कुएं से क्रिस्टलीकरण समाधान जोड़कर क्रिस्टल युक्त बूंद की मात्रा को 10 माइक्रोल तक बढ़ाएं। ड्रॉप को पिपेट करें और कुएं से क्रिस्टलीकरण समाधान के 90 माइक्रोन जोड़ें। भंवर अच्छी तरह से और बर्फ पर बीज रखें।
    3. बीजों के कई कमजोर पड़ने तैयार करें: 1x, 10x, 25x, और 100x। भंवर अच्छी तरह से पिपटिंग से पहले बीज। कमजोर पड़ने को बर्फ पर रखें।
    4. प्रत्येक बीज कमजोर पड़ने के लिए, पीएच बनाम वर्षा एजेंट के मैट्रिक्स के रूप में एक क्रिस्टलीकरण प्लेट स्थापित करें (चित्रा 4Bदेखें)। चरण 3.2.1 में तैयार स्टॉक समाधानों का उपयोग करें।
    5. ड्रॉप बनाते समय, 2 माइक्रोल ड्रॉप के लिए 0.2 माइक्रोन बीज जोड़ें। थाली को 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक सप्ताह के दौरान प्रति दिन एक बार दूरबीन के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से निरीक्षण करें।
      नोट: क्रिस्टल आकार वितरण और आकार में सुधार किया जाना चाहिए, TmPep1050H60A H307Aके लिए एक उदाहरण के रूप में चित्रा 4C देखें । आगे के उपयोग के लिए, बीज -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. एक्स-रे विवर्तन

  1. क्रिस्टल उठा
    नोट: नमूना तैयार करना एक्स-रे स्रोत सुविधा (घर की सुविधा बनाम सिंक्रोट्रॉन) पर निर्भर करता है। तदनुसार भंडारण उपकरणों (शीशी और शीशी धारक टोकरी) का उपयोग करें। नमक/वर्षा एजेंट एकाग्रता के आधार पर क्रायोप्रोटेक्टेंट (जैसे ग्लिसरोल) के अलावा आवश्यक हो सकता है। TmPep1050 क्रिस्टल के लिए, एक क्रायोप्रोटेक्टेंट आवश्यक नहीं है क्योंकि खूंटी या बफर एकाग्रता पानी क्रिस्टल से बचने के लिए पर्याप्त है।
    1. तरल नाइट्रोजन से भरा स्नान तैयार करें, नमूना हैंडलिंग के लिए उपयोग की जाने वाली किसी भी शीशियों या टोकरी को डुबकी दें।
    2. विभिन्न आकारों के नमूना चुनने वाले लूप सेट करें: 100, 150, और 200 माइक्रोन(सामग्री की तालिका)। क्रिस्टल साइज के हिसाब से साइज चुनें।
    3. दूरबीन का उपयोग करके, क्रिस्टल युक्त बूंद की जांच करें और अलग क्रिस्टल (लेने के लिए सबसे आसान) रखें। एक पाश के साथ, धीरे से नीचे से एक क्रिस्टल उठाओ । तुरंत तरल नाइट्रोजन में पाश डुबकी और एक उपयुक्त शीशी में पाश जगह है।
  2. डेटा संग्रह
    नोट: एक्स-रे स्रोत (होम फैसिलिटी बनाम सिंक्रोट्रॉन) और डिटेक्टर संवेदनशीलता के आधार पर डेटा संग्रह बहुत भिन्न हो सकता है। संकल्प, स्पॉट तीव्रता, अंतरिक्ष समूह आदि के आधार पर संग्रह रणनीति भी एक नमूने से दूसरे में बहुत भिन्न हो सकती है। इस विषय की बड़े पैमाने पर समीक्षा डाउटर35द्वारा की गई है।
    1. डिफ्रैक्टोमीटर के गोनियोमीटर सिर पर क्रिस्टल ले जाने वाले लूप को माउंट करें।
    2. एक्स-रे बीम पथ के साथ क्रिस्टल संरेखित करने के लिए XYZ कुल्हाड़ियों के साथ गोनियोमीटर सिर ट्यून करें।
    3. 0.98 Å करने के लिए तरंग दैर्ध्य सेट करें और संकल्प के 2 Å पाने के लिए डिटेक्टर ले जाएं।
    4. कम से कम दो अलग-अलग क्रिस्टल झुकाव में छवियों को प्राप्त करके एक छोटा डेटा संग्रह शुरू करें। 0 डिग्री और 90 डिग्री पर 10 छवियों (0.1 डिग्री प्रति 1 छवि) ले लो।
    5. उपयुक्त सॉफ्टवेयर (जैसे, ADXV, XDS-व्यूअर या अलबुला व्यूअर) के साथ एकत्र छवियों की जांच करें। स्पॉट तीव्रता और उच्चतम संकल्प निर्धारित करें जहां धब्बे देखे जाते हैं। मोनोक्रिस्टेलिनिटी और स्पॉट सेपरेशन की भी जांच करें।
    6. अंततः, उच्च या निम्न संकल्प के लिए डिटेक्टर की स्थिति और अवलोकन के अनुसार एक्सपोजर समय को बदलकर 4.2.3−4.2.5 कदम दोहराएं।
    7. 0.1 डिग्री प्रति 1 छवि के साथ 360 डिग्री के आसपास डेटा संग्रह शुरू करें। डिटेक्टर की स्थिति और एक्सपोजर समय को बेहतर ढंग से सेट करना याद रखें।

5. इंडेक्सेशन, आणविक प्रतिस्थापन और मॉडल बिल्डिंग

  1. सूचीकरण
    नोट: इंडेक्सेशन विवर्तन स्पॉट तीव्रता को मापने के लिए एक विधि है, जिससे संरचना कारकों के आयाम36मिलते हैं। एकत्रित छवियों को संसाधित करने के लिए आमतौर पर चार सॉफ्टवेयर पैकेजों का उपयोग किया जाता है: Mosflm37,HKL200038,DIALS39,और XDS40। बाद TmPep1050 क्रिस्टल विवर्तन से प्राप्त डेटा सेट अनुक्रमण के लिए इस्तेमाल किया गया है ।
    1. XDS पैकेज और XDSME41 स्थापितकरें। यदि HDF5 फ़ाइलों को संसाधित करते हैं, तो XDS Neggia प्लगइन (डेट्रास वेबसाइट पर उपलब्ध) स्थापित करें। अधिक जानकारी के लिए, https://github.com/legrandp/xdsme XDS विकी वेब पेज https://strucbio.biologie.uni-konstanz.de/xdswiki/index.php/Main_Page और XDSME वेब पेज पर जाएं।
    2. डाटा प्रोसेस करने से पहले एक फोल्डर बनाएं, जहां से एक्सडीएस चलाया जाएगा। छवियों के लिए रास्ता पता लगाएं।
    3. XDSME चलाने के लिए, एक टर्मिनल विंडो में xdsme/path_to_images/image.extension टाइप करें ।
    4. एक्सडीएस के बाद नौकरी खत्म हो गई है, सही जांचें। एलपी फाइल। अंतरिक्ष समूह निर्धारण, डेटा पूर्णता, उच्चतम संकल्प, क्रिस्टल मोज़ेकता, और डेटा गुणवत्ता की संभावना पर ध्यान दें। अंतरिक्ष समूहों की संभावना प्राप्त करने के लिए भी XDS_pointless.log की जांच करें ।
      नोट: आउटपुट के उदाहरण के रूप में चित्र 5 देखें।
    5. पिछली प्रक्रिया को ओवरराइटिंग से बचने के लिए एक्सडीएस द्वारा अलग-अलग फ़ोल्डर में प्रस्तावित विभिन्न अंतरिक्ष समूह समाधानों के साथ XDSME को फिर से चलाएं। टाइप xdsme-s space_group_name-सी "unit_cell_parameters" /path_to_images/image.extension (जैसे, xdsme-s P21-c "43.295 137.812 61.118 90.000 110.716 90.000)।
    6. सही जांच करें। एलपी फ़ाइलें और डेटा आंकड़ों के आधार पर सबसे अच्छा समाधान चुनें।
    7. xscale.py XDS_ASCII टाइप करके XSCALE चलाएं। एचकेएल। XSCALE xdsconv.py टाइप करके XDSCONV चलाएं। एचकेएल सीसीपी4।
      नोट: कुछ मामलों में, XDSME अंतरिक्ष समूह की पहचान करने में विफल रहता है या संकल्प सीमा को ठीक से काटने में विफल रहता है या अजीब डेटा आंकड़े उत्पन्न करता है। यदि ऐसी समस्या का सामना करना पड़ता है, तो मूल रूप से XDS चलाने के लायक है। एक्सडीएस में कई पैरामीटर पेश किए जाने चाहिए। आईएनपी दीक्षा फ़ाइल (XDS विकी पेज देखें)। XDS का उपयोग करते समय, सीसीपी 4 पैकेज42के हिस्से, व्यर्थ का उपयोग करके संभावित अंतरिक्ष समूहों की संभावना की जांच की जा सकती है। डेटा सेट रिज़ॉल्यूशन में कटौती करने के लिए, आरमीस एंड एलटी; 60% और आई/σ ~ 2 को आमतौर पर उच्चतम संकल्प43निर्धारित करने के लिए स्वीकार किया जाता है। हालांकि, आणविक प्रतिस्थापन और मॉडल शोधन को I/σ ~ 0.5−1.5 और सीसी1/2 नीचे 0.2−0.444तक संकल्प का विस्तार करके सुधारा जा सकता है।
  2. आणविक प्रतिस्थापन
    नोट: प्रायोगिक डेटा संरचनात्मक कारकों के आयाम तक पहुंच देते हैं, लेकिन, चरण को जाने बिना, वे बेकार हैं। चरण को प्रायोगिक रूप से एक असंगत संकेत (उदाहरण के लिए भारी परमाणु से)45पर निर्भर विभिन्न तरीकों से निर्धारित किया जा सकता है। आणविक प्रतिस्थापन एक असंगत बिखरने वाले परमाणु46,47के बिना चरण का निर्धारण करने के लिए एक और तरीका है । यह विधि चरण को पुनः खोजने और बेहतर बनाने के लिए संबंधित अणु के निर्देशांक का उपयोग करती है। हम आणविक प्रतिस्थापन के लिए फेनिक्स जीयूआई49 में फेजर48 का उपयोग करते हैं।
    1. 4P6Y निर्देशांक का उपयोग कर आणविक प्रतिस्थापन के लिए शुरुआती मॉडल तैयार करें। पीडीबी फाइल से, मोनोमर ए निकालें और फेनिक्स (मॉडल टूल टैब के नीचे) में पीडीबी फाइल एडिटर का उपयोग करके एलनिन में अपने अमीनोएसिड को काटें।
    2. XDSCONV (5.1.9) द्वारा उत्पन्न प्रतिबिंब फ़ाइल और इनपुट के रूप में अनुक्रम के साथ फेनिक्स (डेटा विश्लेषण टैब के तहत) में Xtriage चलाएं।
    3. Xtriage से लॉग फाइल की जांच करें। पूर्णता, असममित इकाई में उपइकानों की संख्या, एनिसोट्रोपी, बर्फ के छल्ले की उपस्थिति, और ट्विनिंग घटना पर ध्यान दें।
    4. प्रतिबिंब फ़ाइल, अनुक्रम और शुरुआती 4P6Y मॉडल का उपयोग करके आणविक प्रतिस्थापन के लिए फेनिक्स में फेजर-एमआर चलाएं पॉली एलेनिन (चरण 5.2.1)।
    5. पूरा होने पर, जांच करें कि क्या एक मॉडल पाया गया है और आणविक प्रतिस्थापन का स्कोर। कम से कम 8 का अनुवाद कारक जेड-स्कोर (टीएफजेड) इंगित करता है कि समाधान निश्चित रूप से सही है।
  3. मॉडल बिल्डिंग
    नोट: आणविक प्रतिस्थापन द्वारा चरण का निर्धारण करने के बाद, मॉडल का निर्माण और परिष्कृत किया जाना चाहिए। यह प्रोटोकॉल स्वचालित निर्माण और पुनरावर्तन शोधन के लिए फेनिक्स जीयूआई49 और मैनुअल संरचना निर्माण और शोधन के लिएकूट 50 का उपयोग करता है।
    1. फेनिक्स में चरण-एमआर का उपयोग करके आणविक प्रतिस्थापन के बाद, रन ऑटोबिल्डका चयन करें। सभी जरूरी फाइलें अपने आप जुड़ जाएंगी। बस ऑटोबिल्ड शुरू करने के लिए रन दबाएं।
    2. पूरा होने पर, कूट में मॉडल की जांच करें। कूट में इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र के अनुसार मॉडल को मैन्युअल रूप से बनाएं और परिष्कृत करें।
    3. मॉडल, अनुक्रम और विवर्तन डेटा को इनपुट के रूप में उपयोग करके फेनिक्स (परिष्करण टैब में) में मैन्युअल रूप से क्यूरेट किए गए मॉडल को परिष्कृत करें। सही रणनीति चुनने के लिए फेनिक्स मदद का उल्लेख करें।
    4. शोधन के बाद, परिणामों की जांच करें: आरफ्री और आरकाम में कमी आनी चाहिए, मोलप्रोबिटी51 संकेतकों का सम्मान किया जाना चाहिए, और कम वास्तविक अंतरिक्ष सहसंबंध वाले आउटलर्स को सीमित किया जाना चाहिए।
    5. सबसे अच्छा परिष्कृत मॉडल उत्पन्न होने तक चरण 5.3.2−5.3.4 दोहराएं।
    6. सर्वर पर मोलप्रोबिटी चलाएं: http://molprobity.biochem.duke.edu/। मोलप्रोबिटी द्वारा पहचाने गए किसी भी आउटलर्स की जांच करें।
    7. सबसे अच्छा परिष्कृत मॉडल प्राप्त होने तक अंततः चरण 5.3.2−5.3.6 दोहराएं।

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Representative Results

TmPep1050 में मोनोमर में एक संभावित द्वादश वियोजन का अध्ययन करने के लिए, उनके-60 और उनके-307 कोडन को सिंथेटिक जीन का उपयोग करके एलेनिन कोडन द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था। तब इस जीन को इसी TmPep1050 संस्करण की अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए pBAD वेक्टर में क्लोन किया गया था जिसे बाद में TmPep1050H60A H307Aनाम दिया गया था । आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी(चित्रा 3 बी)से पता चला है कि शुद्ध प्रोटीन का स्पष्ट आणविक वजन 56 केडीए (मोनोमर का आणविक वजन 36.0 केडीए) था। इसी तरह के एक स्पष्ट आणविक वजन, ५२ केडीए, TmPep1050 dimer11के लिए सूचित किया गया है । इसलिए, TmPep1050H60A H307A के अल्पाधिकारी राज्य को मंद के रूप में अनुमानित किया जा सकता है। अपनी विशिष्ट गतिविधि के बारे में, TmPep1050H60A H307A एल-Leu-p NA पर सब्सट्रेट के रूप में पूरी तरह से निष्क्रिय था, यहां तक कि कोबाल्ट आयनों की उपस्थिति में । इस परिणाम दृढ़ता से पता चलता है कि वेरिएंट किसी भी धातु आयनों बांध नहीं कर सकते ।

TmPep1050H60A H307A की क्रिस्टलीकरण स्थिति को डिमर(यानी, 0.1मीटर सोडियम साइट्रेट पीएच 6.0 10% PEG3350) की स्थिति के आसपास पीएच बनाम खूंटी एकाग्रता (चित्रा 4) द्वारा अनुकूलित किया गया था। TmPep1050H60A H307A के सर्वश्रेष्ठ क्रिस्टल 0.1 एम सोडियम साइट्रेट पीएच 5.2 20% PEG3350 में मोनोक्रिस्टलिनिटी में सुधार के लिए माइक्रोसीडिंग के एक चक्र के साथ प्राप्त किए गए थे। एक संकल्प 2.36 Å(तालिका 1)पर प्रोक्सिमा 2 बीमलाइन (SOLEIL synchrotron) पर एक पूरा डेटा सेट एकत्र किया गया था। डेटा इंडेक्सेशन से पता चला है कि TmPep1050H60A H307A क्रिस्टल का अंतरिक्ष समूह C2221 है लेकिन XDS ने एक और समाधान का प्रस्ताव रखा, एमपी स्पेस ग्रुप (चित्रा 5देखें)। व्यर्थ के अनुसार, C2221 और P21 अंतरिक्ष समूहों की संभावना क्रमशः ०.७११ और ०.१४९ थे । डाटा क्वालिटी एनालिसिस के मुताबिक असममित यूनिट में दो मोनोमर पाए जाते हैं। Xtriage द्वारा विश्लेषण से पता चला है कि डेटा सेट शायद जुड़वां है, लेकिन C2221 अंतरिक्ष समूह में यमलन५२की संभावना नहीं है । ट्विनिंग क्रिस्टल विकास विसंगति से परिणाम है जहां कई निश्चित डोमेन एक दूसरे के समानांतर उनकी जाली दिशाओं में से कुछ है५३। ट्विनिंग का परिणाम उच्च क्रिस्टल समरूपता से भी हो सकता है, जो एक गलत डेटा इंडेक्सेशन का संकेत देता है। इसलिए, एक छद्म-merohedral जुड़वां मौजूद हो सकता है ताकि एक P21 क्रिस्टल जाली एक C222 1 कीतरहलग रहा है । डेटा सेट बाद में अंतरिक्ष समूह P2 1 में अनुक्रमित और आणविकप्रतिस्थापन में परीक्षण किया गया था । पी2 1 में अनुक्रमित डेटा सेट के Xtriage विश्लेषण एक जुड़वां कानून एच,-कश्मीर,-एच-एलके बाद एक छद्म-merohedral जुड़वां से पता चला ।

dodecameric TmPep1050 (PDB कोड 4P6Y) से एक मोनोमर के निर्देशांक का उपयोग करना, 28.9 के टीएफजेड स्कोर के साथ केवल पी2 1 में अनुक्रमित डेटा सेट के लिए एक आणविक प्रतिस्थापन समाधान पाया गया था। इसलिए, विवर्तन डेटा को मॉडल निर्माण के लिए एक ट्विन्ड डेटा सेट के रूप में माना जाता था। आणविक प्रतिस्थापन के पूर्वाग्रह को कम करने के लिए, फेनिक्स.ऑटोबिल्ड54, 55का उपयोग करके एक पहला मॉडल बनाया गया था। TmPep10AH307A की संरचना फेनिक्स और कूट(तालिका 1 और चित्रा 6A)में स्वचालित और मैनुअल शोधन के कई चक्रों के बाद पूरी हुई थी। संरचना ने दोनों मोनोमर और पीडीबी पीसा56द्वारा गणना किए गए -16.2 किलो कैलोरी मोल -1 के बीच 1,710 Å2 की इंटरफ़ेस सतह के साथ ओलिगोमेरिक स्थिति की पुष्टि की। इसकी तुलना में,इंटरफ़ेससतह और डिमेरिक टीएमपीपी10502-मेर का एफेफ़ेस सतह क्रमशः 1,673 Å2 और -16.7 किलो कैलोरी मोल-1है।

TmPep10AH307A की संरचना संरेखण पर 0.774 Å के आरएमएस के साथ जंगली प्रकार के डिमर संरचना के समान है। महत्वपूर्ण बात, दोनों संरचना में एक ही संरचनात्मक संशोधन देखा जाता है: α8 और α10 हेलीक्लीज का उच्च लचीलापन, अव्यवस्थित सक्रिय साइट जीएलएन-196-वैल-202, और Lys-229-Ala-235 और Lys-247-Ser 254 का विस्थापन। इन संशोधनों को पहले अपने धातु कोफैक्टर11के अभाव में द्वादश गठन की बाधा के साथ सहसंबद्ध किया गया था । हालांकि उनके-60 और उनके-307 के दो म्यूटेशन का एएसपी-168 और एएसपी-62 की साइड चेन पर थोड़ा असर पड़ा। वे जंगली प्रकार के डिमर(चित्रा 6B)से अलग संरचना में बंद दिखाई दिए। एएसपी-168 कार्बोक्सिलेट को उनकी-60 और उनकी-307 की अनुपस्थिति के कारण 40 डिग्री तक घुमाया जाता है। इसलिए दोनों हिस्टिडीन अवशेष दो धातु आयनों को पाटने के लिए एएसपी-168 कार्बोक्सिलेट को सही ढंग से तैनात करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। एएसपी-62 साइड चेन उत्प्रेरक स्थल के बाहर ग्लू-18 कार्बोक्सिलेट की ओर उन्मुख है। उत्प्रेरक में एएसपी-62 की महत्वपूर्ण भूमिका हो सकती है क्योंकि इसे उनके-60 के पीकेए को मिलाना माना जाता है और इस प्रकार, एम 2 साइट में धातु आयन बाध्यकारी को प्रभावित करते हैं। इसके अलावा, यह धातु आयन बाध्यकारी पर उत्प्रेरक साइट के स्थिरीकरण में संरचनात्मक रूप से फंसाया जा सकता है, द्वादश के गठन के पक्ष में ।

Figure 1
चित्रा 1: TM_1050 ओआरएफ क्लोनिंग का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व पीबैड वेक्टर में समरूप पुनर्संयोजन द्वारा।
ओआरएफ दो 30 बीपीएस अनुक्रमों प्रमोटर बुरा अंत और अनुक्रम अपस्ट्रीम Pmeमैं प्रतिबंध साइट के अनुरूप है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: TmPep1050 शुद्धिकरण के क्रोमाटोग्राम।
(ए)एनियन एक्सचेंज क्रोमेटोग्राफी। (ख)हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन क्रोमेटोग्राफी। अवशोषण (एमयूए) की मिलीयूनिट्स में व्यक्त अवशोषण (एब्स) को सादे रेखा में दिखाया गया है। सीएमएस सीएम-1में व्यक्त की गई चालकता को धराशायी लाइन में दिखाया गया है । ग्रे बॉक्स इंगित करता है जहां TmPep1050 क्रोमेटोग्राम पर eluates । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: आकार बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी (ए) TmPep1050 dodecamer, (B) TmPep1050H60A H307A,और (C) TmPep1050H60A।
नमूनों का विश्लेषण एसईसी राल का उपयोग करके 120 एमएल कॉलम में पैक किया गया था। अवशोषण (एब्स) अवशोषण (एमयूए) की मिलीयूनिट्स में व्यक्त किया जाता है। (घ)थायरोग्लोबुलिन (टी), फेरिटिन (एफ), एल्डोलेज (एएलडी), कोनलबुमिन (सी), और एल्बुमिन (अल्ब) का उपयोग करके एसईसी कॉलम का अंशांकन मानकों के रूप में । सापेक्ष द्रव्यमान और एल्यूशन वॉल्यूम के लॉगरिथम के बीच सहसंबंध0.91 के आर 2 के साथ रैखिक है। 95% आत्मविश्वास अंतराल डॉट्स के रूप में दर्शाए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: TmPep1050H60A H307A क्रिस्टलीकरण का अनुकूलन।
(क)पहली अनुकूलन रणनीति में अलग-अलग पीएच (4.5 और 6.0 के बीच) बनाम PEG3350 एकाग्रता (5% और 25% के बीच) शामिल हैं। क्रिस्टलीकरण प्लेट को स्केमिट किया जाता है, और कुओं को रंग कोडित किया जाता है: उपजी के लिए लाल, पॉलीक्रिस्टल के लिए पीला, और मोनोक्रिस्टल के लिए हरा। (ख)दूसरी अनुकूलन रणनीति में पीएच बनाम PEG3350 के संकरा भिन्नता के साथ 25x पतला बीजों का उपयोग शामिल है । (ग)क्रिस्टल आकार और आकार से पहले (ऊपरी छवि) और बाद (कम छवि) क्रिस्टलीकरण अनुकूलन और माइक्रोबीजिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: लॉग आउटपुट सही से कुछ अंशः। XDS द्वारा TmPep1050H60A H307A डेटा इंडेक्सेशन का एलपी।
ऊपरी पैनल, संभावित ब्रावाइस जाली, सबसे अधिक संभावना एमसी, एमपी, और ओसी मध्य पैनल, C2221 अंतरिक्ष समूह में अनुक्रमित डेटा के समग्र आंकड़े जा रहा है । लोअर पैनल, पी 21 अंतरिक्ष समूह में अनुक्रमित डेटा के समग्र आंकड़े। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: TmPep1050H60A H307A कीसंरचना ।
(A)एक TmPep1050H60A H307A सबयूनिट (लाल, पीडीबी कोड 5NE9) बनाम एक डोडेकामर सबयूनिट (सफेद, पीडीबी कोड 6NW5) और एक मंद सबयूनिट (नीला, पीडीबी कोड 5NE6) का संरचनात्मक संरेखण। तीर द्वादशों और डाइमर्स के बीच संरचनात्मक विसंगतियों का संकेत देते हैं। (ख)TmPep1050H60A H307A सक्रिय साइट (लाल) के बंद टीएमपी 1050 डिमर (नीला) और dodecamer (सफेद) की सक्रिय साइट की तुलना में । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

TmPep1050H60A H307A
डेटा संग्रह
तापमान (कश्मीर) 100
विकिरण स्रोत सोलिल प्रॉक्सिमा 2
तरंगदैर्ध्य (Å) 0.9801
वेक्षक डेट्रास ईगर एक्स 9M
दोलन रेंज (°) 0.1
एक्सपोजर समय (एस) 0.025
अंतरिक्ष समूह पी 1 21 1
यूनिट सेल पैरामीटर
α, β, γ (°) 90.00, 110.69, 90.00
ए, बी, सी (Å) 43.24, 137.79, 61.11
संकल्प 43.99 – 2.37 (2.52-2.37)
अद्वितीय प्रतिबिंब 26.902
आरमर्जे (%) 0.14
अतिरेक 6,815
8.64 (2.12)
पूर्णता (%) 99.6 (97.9)
सीसी1/2 (%) 99.2 (84.1)
शोधन
संकल्प 43.99 – 2.37
प्रतिबिंब 26.9
आरफ्री सेट टेस्ट काउंट 1345
आरकाम/आरमुक्त 0.206/0.234
एएसयू प्रति प्रोटीन अणु 2
वीएम (Å3/Da) 2.37
सॉल्वेंट कंटेंट (%) 49.0
प्रोटीन/सॉल्वेंट परमाणु 4,559/96
आर.m.s.d. बांड लंबाई (Å) 0.31
आर.m.s.d. बांड कोण (°) 0.51
औसत बी कारक (Å2) 57.0
इष्ट/अस्वीकृत रामचंद्रन φ/ψ (%) 95.02 / 0.17
ट्विन लॉ ज,-कश्मीर, -h-l
पीडीबी कोड 5NE9

तालिका 1: डेटा संग्रह और परिष्करण के आंकड़े। कोष्ठक में मान उच्चतम संकल्प खोल के लिए कर रहे हैं ।

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Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल संरचनात्मक स्तर पर TmPep1050 के मंद-द्वादक संक्रमण को समझने की अनुमति देता है। इस पद्धति का अनुभव पहले टीएमपेप1050 ओलिगोमर दोनों की संरचना निर्धारित करनेकेलिए किया गया था । सबसे चुनौतीपूर्ण कदम के लिए स्थिर dimers में dodecamers के वियोजन को बढ़ावा देने की शर्तों को खोजने के लिए किया गया था । इस तरह की स्थितियों को काफी हल्का होना पड़ा जब धातु आयन कोफैक्टर जोड़ा गया था जब dodecamers में dimers के पुनर्संस्करण की अनुमति थी । ओलिगोमर का पृथक्करण भी एक महत्वपूर्ण कदम था क्योंकि यह संरचनात्मक अध्ययनों और आगे जैव रासायनिक लक्षण वर्णन की स्थिति रखता है (उदाहरण के लिए, सीओ2 +की विभिन्न खुराकों में द्वादश पुनर्गठन का अध्ययन करना)। आणविक प्रतिस्थापन, चरण निर्धारण के लिए एक सिद्ध विधि, TmPep1050 अल्पाधिकार और इसके वेरिएंट की संरचनाओं को हल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। प्रस्तावित प्रोटोकॉल को अन्य धातु-एंजाइमों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जिनके अल्पाहार राज्य अपने धातु कोफैक्टरों की उपलब्धता पर निर्भर करते हैं।

प्रोटोकॉल को समझाने के लिए, अध्ययन का एक मामला प्रस्तुत किया गया था, TmPep10AH307A जिनकी धातु बाध्यकारी साइटों को अपने-६० और उसके-३०७ को एलनिन को रूपांतरित करके बिगड़ा हुआ था । ये अवशेष क्रमशः एम 2 और एम 1 साइटों पर सीओ2 + को बांधते हैं। धातु बाध्यकारी में हस्तक्षेप करने से अल्पाहार राज्य बेफिक्र हो सकता था और मोनोमर में पूरी तरह से वियोजन हो सकता था। इस तरह की घटना के साक्ष्य PhTET2 और PfTET3, पी होरिकोशि और पी फरिओसससे दो M42 अमीनोपेपिडास, क्रमशः24,29केलिए सूचित किए गए हैं । TmPep1050H60A H307A ने उम्मीद के अनुसार व्यवहार नहीं किया क्योंकि इस संस्करण ने केवल dimers का गठन किया था। इसकी संरचना ने जंगली प्रकार के डाइमर के समान संशोधन दिखाए लेकिन दो छोटे अपवादों के साथ। दरअसल, एएसपी-168 और एएसपी-62 की साइड चेन सक्रिय स्थल के स्थिरीकरण को रोकने के लिए एक अपरंपरागत अभिविन्यास में बंद दिखाई दिया । उनका अभिविन्यास उनके-60 और उनके-307 द्वारा लगाया जा रहा था क्योंकि इस तरह के संशोधन एकल बिंदु उत्परिवर्तन वेरिएंट में नहीं देखे गए थे।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस पेपर को प्रूफरीडिंग करने और रचनात्मक टिप्पणियां देने के लिए मार्टीन रोबर्स को धन्यवाद देते हैं । प्रोक्सिमा 2 बीमलाइन (SOLEIL सिंक्रोट्रॉन) तक पहुंच ब्लॉक आवंटन समूह 20151139 के भीतर थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,10-phenanthroline Sigma-Aldrich 13, 137-7
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC503096
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC903024
Benzonase Nuclease Merck Millipore 70664-3
CCP4 N/A visit http://www.ccp4.ac.uk/
cOmplete EDTA-free Roche 5056489001
Coot N/A visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Crystal Screen I Hampton Research HR2-110
Crystal Screen II Hampton Research HR2-112
DreamTaq Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific K1082
EasyXtal 15-well tool NeXtal 132007
Escherichia coli PPY strain N/A see reference 31
Escherichia coli XL1 blue strain Agilent 200249
Gel Filtration Calibration Kit HMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-42
Gel Filtration Calibration Kit LMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-41
Gel Filtration Standard Biorad 1511901
GeneJET Plasmid Miniprep Kit ThermoFisher Scientific K0503
Index Hampton Research HR2-144
Litholoops Molecular Dimensions
L-leucine-p-nitroanilide Bachem AG 40010720025
Natrix 1 Hampton Research HR2-116
Natrix 2 Hampton Research HR2-117
Neggia plugin Dectris N/A visit https://www.dectris.com/
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I NeXtal 130724
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II NeXtal 130725
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III NeXtal 130726
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV NeXtal 130727
pBAD-TOPO ThermoFisher Scientific K430001
Phenix N/A visit https://www.phenix-online.org/
Phusion High-Fidelity DNA polymerase ThermoFisher Scientific F-530L
Salt RX 1 Hampton Research HR2-107
Salt RX 2 Hampton Research HR2-109
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO ThermoFisher Scientific 88242
Source 15Phe GE Healthcare Life Sciences 17014702
Source 15Q GE Healthcare Life Sciences 17094705
Superdex 200 prep grade GE Healthcare Life Sciences 17104301
Thermotoga maritima MSB8 strain American Type Culture Collection ATCC 43589
TmCD00089984 DNASU Plasmid Repository N/A
XDS N/A visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/
xdsme N/A visit https://github.com/legrandp/xdsme

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<em>थर्मोटोगा मारिटिमा</em> M42 अमीनोपेप्टिडेस TmPep1050 के ओलिगोमेरिक राज्य संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी
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Dutoit, R., Brandt, N., Van Elder,… More

Dutoit, R., Brandt, N., Van Elder, D., Droogmans, L. X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050. J. Vis. Exp. (159), e61288, doi:10.3791/61288 (2020).

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