Summary
En este trabajo, proporcionamos un protocolo para biofuncionalizar nanomateriales magnéticos con anticuerpos para la diana celular específica. Como ejemplos, utilizamos nanocables de hierro para atacar las células cancerosas.
Abstract
Los nanomateriales magnéticos han recibido gran atención en diferentes aplicaciones biomédicas. La biofuncionalización de estos nanomateriales con agentes específicos es un aspecto crucial para mejorar su eficacia en diagnósticos y tratamientos, al tiempo que se minimizan los efectos secundarios. La ventaja de los nanomateriales magnéticos en comparación con los no magnéticos es su capacidad para responder a los campos magnéticos sin contacto y a grandes distancias. Esto permite guiarlos o acumularlos, a la vez que también pueden ser monitorizados. Recientemente, se desarrollaron nanocables magnéticos (NW) con características únicas para aplicaciones biomédicas. El gran momento magnético de estos NW permite un control remoto más eficiente de su movimiento mediante un campo magnético. Esto se ha utilizado con gran éxito en el tratamiento del cáncer, la administración de fármacos, el rastreo de células, la diferenciación de células madre o la resonancia magnética. Además, la fabricación de NW por deposición electroquímica asistida por plantilla proporciona un método versátil con un estricto control sobre las propiedades de NW. Especialmente los NW de hierro y los NW de óxido de hierro-hierro (núcleo-capa) son adecuados para aplicaciones biomédicas, debido a su alta magnetización y baja toxicidad.
En este trabajo, proporcionamos un método para biofuncionalizar NWs de hierro/óxido de hierro con anticuerpos específicos dirigidos contra un marcador específico de la superficie celular que está sobreexpresado en un gran número de células cancerosas. Dado que el método utiliza las propiedades de la superficie de óxido de hierro, también es aplicable a nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro. Los NW se recubren primero con 3-aminopropil-tri-etoxi-silano (APTES) que actúa como enlazador, al que se unen covalentemente los anticuerpos. El recubrimiento APTES y la biofuncionalización de anticuerpos se prueban mediante espectroscopia de pérdida de energía de electrones (EELS) y mediciones de potencial zeta. Además, se comprueba la antigenicidad de los anticuerpos en los NW mediante inmunoprecipitación y Western blot. La focalización específica de los NWs biofuncionalizados y su biocompatibilidad se estudian mediante microscopía confocal y un ensayo de viabilidad celular.
Introduction
Una propiedad única de los nanomateriales magnéticos es su capacidad para responder a los campos magnéticos1, que se puede utilizar de manera beneficiosa para accionarlos de muchas maneras, mientras que también se pueden monitorear, por ejemplo, mediante imágenes de resonancia magnética (MRI). Al aplicar un campo magnético alterno a alta frecuencia, pueden generar calor, lo que puede inducir hipertermia, proporcionando una opción terapéutica1. Otro enfoque es el tratamiento fototérmico, que se puede realizar con un láser de infrarrojo cercano (NIR) 2,3.
Entre el gran número de nanomateriales magnéticos, el óxido de hierro ha recibido la mayor atención en aplicaciones biológicas como la separación magnética, la hipertermia 2,4, la guía celular5, la administración de fármacos 6,7,8 y como agente de contraste en la resonancia magnética 9,10. Esto se debe a su alta biocompatibilidad 11,12, gran magnetización 11,12, capacidad de ser recubierto 9,13,14,15, capacidad de transportar fármacos 2,16, capacidad de funcionalización con fármacos2,16 y/o agentes dirigidos12,13,17,18, y la capacidad de convertir la energía óptica en calor2. Recientemente, MagForce ha iniciado ensayos clínicos en pacientes con cáncer utilizando nanopartículas de óxido de hierro para el tratamiento de la hipertermia19.
Últimamente, los nanohilos magnéticos (NWs) han sido cada vez más explotados para aplicaciones biomédicas 3,11,16,20,21,22. Tienen propiedades similares a las nanoperlas magnéticas, pero ofrecen una forma anisotrópica y un momento magnético muy grande, lo que permite un control remoto muy eficiente mediante un campo magnético23,24, incluida la actuación de baja frecuencia para inducir efectos magnetomecánicos 25,26,27,28,29. Como consecuencia, los NW se han implementado para diferentes aplicaciones biológicas como el aislamiento de exosomas30, el seguimiento celular 21, el tratamiento del cáncer 3,11,16, la administración de fármacos 16,31,32 y como agente de contraste para la resonancia magnética 33.
Los nanomateriales magnéticos biofuncionalizados con capacidad específica de focalización celular tienen un gran potencial para aplicaciones biomédicas y en medicina de precisión34,35. Para unir estos agentes dirigidos, se requiere una modificación de la superficie de los nanomateriales. Por lo general, necesitan un recubrimiento que proporcione un grupo funcional, que facilite la unión de los agentes tratantes. En la literatura, existe una gran cantidad de recubrimientos orgánicos e inorgánicos para nanomateriales magnéticos. En función del grupo funcional que se puede inmovilizar al nanomaterial, estos recubrimientos se pueden clasificar en cuatro grupos principales: moléculas basadas en grupos ácido carboxílico, polímeros, histidina y moléculas basadas en grupos silano.
Las moléculas basadas en grupos de ácido carboxílico son uno de los métodos de modificación de superficies. Utiliza la alta afinidad
entre el grupo ácido carboxílico negativo en el recubrimiento y la carga positiva en los nanomateriales magnéticos36,37,38. El proceso de unión de un ácido carboxílico a una superficie metálica puede implicar la generación de sales de carboxilato metálico o la adhesión del grupo carboxilo al metal. Sin embargo, en el caso de los NW multisegmentados, como los NW de hierro/oro o níquel/oro, que tienen excelentes propiedades para las bioaplicaciones39,40, este tipo de recubrimiento no se puede aplicar fácilmente. Requiere dos recubrimientos diferentes al mismo tiempo: grupos tiol para modificar los segmentos de oro y grupos carboxilo para segmentos magnéticos (hierro o níquel)38. Algunos ejemplos de moléculas basadas en grupos carboxilo son la hematoporfirina, el ácido pimélico, el ácido palmítico y el ácido 3-[(2-aminoetil) ditio] propiónico (AEDP)38. Las modificaciones superficiales de los nanomateriales magnéticos utilizando polímeros ofrecen algunas ventajas distintivas. Debido al gran peso molecular de los polímeros, mejora la estabilidad del nanomaterial magnético en una solución38. Sin embargo, aumentará significativamente el tamaño del nanomaterial38. La polivinilpirrolidona (PVP), la polietileneimina (PEI), el ácido aspártico arginina-glicina-D (RGD) y el polietilenglicol (PEG) son algunos ejemplos de los polímeros más utilizados para modificaciones superficiales. Cada uno tiene sus propias características y utiliza38. El tercer método de modificación de la superficie es el uso de un recubrimiento de histidina. La histidina es una proteína con una cadena lateral de aminoácidos histidina que tiene una alta afinidad con un número limitado de nanomateriales magnéticos como el níquel38. Se puede emplear para procesos de purificación de proteínas 38,41,42. También se puede aplicar un recubrimiento de histidina a NW multisegmentados, como NW de níquel/oro38. La silanización de la superficie de un nanomaterial es un proceso bien establecido 38,43,44. Se basa en un átomo de silicio unido a cualquier superficie de óxido metálico a través de tres enlaces simples, y al mismo tiempo este átomo de silicio se une al grupo funcional al final a través de una cadena de alquilo 38,43,44. La ventaja de este recubrimiento es que proporciona grupos amina libres, y tiene la capacidad de recubrir materiales magnéticos y no magnéticos38,45, como el níquel y el oro, respectivamente. Por lo tanto, el uso de moléculas basadas en el grupo salino es una ruta práctica para biofuncionalizar NW multisegmentados. Algunos ejemplos de moléculas basadas en grupos silano son el (3-aminopropil) trietoxisilano (APTES) y el (3-aminopropil) trimetoxisilano (APTMS)38,45.
La adición de un agente dirigido al recubrimiento puede desempeñar un papel importante tanto en el diagnóstico como en el tratamiento de las células enfermas y, al mismo tiempo, minimizar los efectos secundarios en los tejidos sanos46,47. La adición de un agente dirigido en la superficie de los nanomateriales mejora tanto la unión selectiva celular como la internalización a través de los receptores de endocitosis7. Sin estos ligandos dirigidos, los nanomateriales interactúan de forma inespecífica con las membranas celulares, que se unen a una velocidad menor en comparación con los nanomateriales con los ligandos48. Uno de los desafíos de atacar los tejidos cancerosos es su similitud característica con los tejidos sanos. Por lo tanto, el éxito de la focalización depende principalmente de determinar el ligando apropiado para utilizar como diana biológica49,50. Se han empleado varios agentes dirigidos para dirigir nanomateriales a las células cancerosas48,51 (por ejemplo, CD44, debido a su alta expresión en las células cancerosas en comparación con las células sanas52,53,54,55).
Los agentes dirigidos se pueden clasificar en tres grupos principales, según los componentes que los componen y su complejidad: dirigidos basados en aptámeros, dirigidos basados en ligandos y dirigidos basados en anticuerpos. Los aptámeros son hebras cortas sintetizadas químicamente de ADN u oligonucleótidos de ARN que se pliegan en estructuras bidimensionales y tridimensionales, lo que los hace capaces de dirigirse a un antígeno específico, con mayor frecuencia proteínas56. La focalización basada en ligandos incluye péptidos y cadenas cortas de aminoácidos57. La focalización basada en anticuerpos implica el uso de un anticuerpo completo o fragmentos de anticuerpos, como fragmentos variables de cadena simple o fragmentos de unión a antígenos51. El uso de este método tiene la ventaja de poseer dos sitios de unión con una alta afinidad de unión a su antígeno diana específico, lo que le da una selectividad extremadamente alta58. Los sitios de unión son análogos a una cerradura y el antígeno a una llave58.
En este trabajo, los NW utilizados se fabricaron por electrodeposición sobre membranas de óxido de aluminio, método descrito en detalle en una publicación anterior59. El objetivo aquí es liberar estos NW de óxido de hierro (núcleo-caparazón) de las membranas y biofuncionalizarlos con anticuerpos específicos para proporcionar una capacidad de orientación. Los anticuerpos no pueden unirse directamente a los NW de óxido de hierro-hierro y requieren un enlazador. El recubrimiento de los NW con APTES proporciona grupos amina libres, lo que permite la unión covalente a través del grupo carboxilo en los anticuerpos (Figura 1). La ventaja del recubrimiento APTES es su capacidad para trabajar tanto para materiales magnéticos21 como no magnéticos60 , como hierro/oro o níquel/oro NW45. Todos los pasos de recubrimiento y biofuncionalización explicados en este protocolo se pueden utilizar con cualquier nanomaterial de hierro/óxido de hierro, en general. Aquí se utilizaron como ejemplo los NW de hierro/óxido de hierro. Los resultados muestran que los NW funcionalizados con anticuerpos tienen una alta antigenicidad frente a receptores específicos de la superficie celular, que pueden ser utilizados para diferentes aplicaciones. Algunos ejemplos son la separación celular, la administración de fármacos, el tratamiento específico de células cancerosas mediante tratamientos fototérmicos y/o magnetomecánicos.
Protocol
PRECAUCIÓN: Consulte siempre todas las hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS) relevantes antes de usar. Use todas las prácticas de seguridad apropiadas y equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos, zapatos cerrados). Realice todas las reacciones biológicas en la campana de extracción biológica.
NOTA: Este protocolo está destinado a producir 2 x10 10 NW biofuncionalizados/mL equivalentes a 0,36 mg de hierro/mL recubiertos con anticuerpos anti-CD44 con una densidad de 3 x 104 anticuerpos/NW. Los NW de óxido de hierro-hierro (núcleo-capa) miden 2,5 μm de largo y tienen un diámetro de 41,5 nm.
1. Liberación de nanocables de hierro
NOTA: El proceso de fabricación de los NW de hierro/óxido de hierro se explicó en detalle en una publicación anterior59.
- En un tapete de corte, corte los discos de aluminio (Al) (Figura 2A) en trozos pequeños (Figura 2B) con una cuchilla de un solo filo y un martillo pequeño para que quepan en un tubo de 2 ml. Use pinzas para transferir los trozos pequeños de Al al tubo.
- Llene el tubo de 2 ml, que contiene los trozos pequeños de Al, con 1 ml de hidróxido de sodio (NaOH) 1 M. Asegúrese de que todas las piezas de Al estén cubiertas con NaOH.
- Deje actuar la solución durante 30 minutos a temperatura ambiente dentro de una campana extractora química.
- Retire solo las piezas de Al con la pinza y mantenga los NW liberados (grupos negros, Figura 3A) en la solución de NaOH durante 30 minutos más. No cambie la solución de NaOH.
- Recoja los NW colocando el tubo de 2 ml en una rejilla magnética y espere 2 minutos antes de retirar la solución vieja de NaOH de 1 M. Reemplácelo con una solución nueva de NaOH.
- Sonicar el tubo de 2 ml que contiene los NW durante 30 s y dejarlo durante 1 h dentro de una campana de gases químicos.
- Repita los pasos 1.5 y 1.6 al menos cuatro veces.
- Lave los NW colocando el tubo de 2 ml en la rejilla magnética y espere 2 min.
- Deseche la solución de NaOH y reemplácela con 1 ml de etanol absoluto.
- Sonicar el tubo durante 30 s.
- Coloque el tubo de 2 ml en la rejilla magnética y espere 2 min.
- Deseche la solución de etanol absoluto vieja y reemplácela con 1 ml de etanol absoluto fresco y sonique durante 30 s.
- Repita los pasos 1.11 y 1.12 al menos cuatro veces.
- Mantenga los NW en 1 ml de etanol absoluto a temperatura ambiente hasta que se necesiten.
- Mida la concentración de hierro y, por lo tanto, los NW mediante espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS).
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Sin embargo, para el almacenamiento prolongado, no libere los NW de la plantilla de Al hasta que los necesite. Mantener los NW liberados precipitando en el etanol durante mucho tiempo sin sonicación frecuente creará agregaciones que necesitarán tiempos de sonicación más largos para separarse.
2. Recubriendo los nanocables con APTES
NOTA: En este protocolo, 100 μL de solución APTES (densidad de 0,946 g/mL61) es suficiente para recubrir 1,6 x 107 m2/g de NWs. Si se produce un cambio en la proporción o la masa del nanomaterial, el volumen de APTES debe ajustarse en consecuencia.
- Transfiera los NW del paso 1.14 a un tubo de vidrio de 5 ml con una pipeta de 1 ml.
- Para recoger los NW que queden en el tubo de 2 ml, lave el tubo vacío de 2 ml dos veces añadiendo 1 ml de etanol absoluto y transfiéralo al tubo de vidrio de 5 ml con una pipeta de 1 ml.
- Utilizando la pipeta, tome 100 μL de APTES y agréguelos directamente a la solución NW.
- Agite el tubo de vidrio de 5 ml durante 10 s.
- Ajuste el tubo de vidrio de 5 ml en la abrazadera de un soporte de retorta de laboratorio.
- Coloque la mitad del tubo de vidrio de 5 ml dentro del agua del baño ultrasónico y sonique durante 1 h.
- Saque el tubo de vidrio de 5 ml del baño ultrasónico y agregue 400 μL de agua desionizada (DI) seguida de 20 μL de NaOH (catálisis básica) de 1 M.
PRECAUCIÓN: Es importante agregar primero el agua desionizada. - Ajuste el tubo de vidrio de 5 ml, como se explica en los pasos 2.5-2.6, y sonique durante 1 h más.
- Saque el tubo de vidrio de 5 ml del baño ultrasónico.
- Coloque un imán junto al tubo de vidrio durante 5 minutos para recoger los NW.
- Sustituya el sobrenadante por 1 ml de etanol absoluto fresco y sonique durante 10 s.
- Repita los pasos 2.10 y 2.11 cuatro veces.
- Transfiera todo el etanol suspendido de NW a un nuevo tubo de vidrio de 5 ml con una pipeta de 1 ml.
NOTA: Los NW recubiertos con APTES se pueden almacenar en un tubo de vidrio con etanol hasta que se necesiten. El protocolo se puede pausar aquí.
3. Biofuncionalización de los nanohilos
- Activación de los anticuerpos
NOTA: Para lograr aproximadamente 3 x 104 partes de anticuerpo/NW, use 30 μL de anticuerpo (1 mg/mL) por 0.1 mg de hierro.- En un tubo de 2 ml, disolver 0,4 mg de 3-3-dimetil-aminopropilcarbodiimida (EDC) y 1,1 mg de sulfo-N-hidroxisulfosuccinimida (Sulfo-NHS) en 1 ml de hidrato de ácido etanosulfónico 2-N-morfolino (MES) (pH 4,7).
NOTA: La mezcla EDC/sulfo-NHS debe estar fresca y preparada antes de usarla. - En un tubo nuevo de 2 ml, añadir 30 μl de anticuerpo anti-CD44 (1 mg/ml), 960 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7) y 10 μl de mezcla EDC/sulfo-NHS (preparada en el paso 3.1.1), respectivamente.
- Coloque el tubo de 2 ml en un agitador de tubos a 10 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- En un tubo de 2 ml, disolver 0,4 mg de 3-3-dimetil-aminopropilcarbodiimida (EDC) y 1,1 mg de sulfo-N-hidroxisulfosuccinimida (Sulfo-NHS) en 1 ml de hidrato de ácido etanosulfónico 2-N-morfolino (MES) (pH 4,7).
- Preparación de los nanohilos recubiertos de APTES
- Durante los 15 minutos de incubación en el paso 3.1.3, lave los NW colocando un imán junto al tubo de NW recubierto con APTES (a partir del paso 2.13) durante 2 min para recoger los NW.
- Deseche el etanol y reemplácelo con 1 mL de PBS 0.1 M (pH 7), y luego sonique durante 10 s.
- Repita los pasos 3.2.1-3.2.2 cuatro veces.
- Recoja los NW, como se explica en el paso 3.2.1, y descarte los 0,1 M PBS. Mantenga los NW en el tubo sin ninguna solución.
- Adhesión de los anticuerpos
- Transferir toda la solución de anticuerpos activados (preparada en el paso 3.1.3) al tubo de NWs (preparado en 3.2.4) y sonicar durante 10 s.
- Coloque el tubo de vidrio en el rotador durante la noche a 4 °C.
- Recoja los NW con un imán como en el paso 3.2.1 y deseche el sobrenadante.
- Añadir 1 ml de solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 2% durante 1 h a 4 °C para bloquear la reacción.
- Comprobar la antigenicidad de los NW funcionalizados con anticuerpos, por ejemplo, mediante ensayos de inmunoprecipitación (IP) y Western blot (WB).
NOTA: Para obtener mejores resultados, utilice los NW biofuncionalizados en el ensayo de IP, WB o biocompatibilidad inmediatamente después del paso de bloqueo.
4. Ensayo de biocompatibilidad
NOTA: Para estudiar la biocompatibilidad de los NW, se pueden emplear varios ensayos de viabilidad celular y diferentes líneas celulares. La concentración de los NW utilizados aquí se basa en una publicación anterior16. La siembra celular debe realizarse un día antes de la biofuncionalización del NW.
PRECAUCIÓN: Todos los pasos a continuación deben realizarse debajo del gabinete de bioseguridad.
- En una placa de 96 pocillos, siembre nueve pocillos con 4 x 104 de células de cáncer de colon (línea celular HCT116) suspendidas en medios de cultivo celular de McCoy (100 μL/pocillo) y colóquelas dentro de la incubadora durante la noche a 37 °C y 5% de dióxido de carbono (CO2).
- Lave los NW (a partir del paso 3.3.4) con PBS recogiéndolos con un imán como en el paso 3.2.1 y sustituya la solución antigua por 1 ml de 0,01 M de PBS (pH 7). Repita este paso tres veces.
- Lave los NW (a partir del paso 4.2) con medios McCoy's calentados recogiéndolos con un imán como en el paso 3.2.1 y sustituya el PBS antiguo por 1 ml de medios McCoy's calentados. Repita este paso tres veces.
- Recoger los NW (del paso 4.3) utilizando un imán como en el paso 3.2.1 y sustituir 1 ml de medios de McCoy calentados por 900 μl de medios de McCoy calentados. La concentración de NWs debe ser de 0,02 mg de NWs por mL.
- Lleve la placa de 96 pocillos (del paso 4.1) de la incubadora al gabinete de bioseguridad.
- Debajo de la cabina de bioseguridad, deseche los medios viejos de las células y reemplácelos con 100 μL de NW suspendidos (preparados en el paso 4.4).
- Agitar la placa (preparada en el paso 4.6) a mano e incubarla durante 24 h dentro de la incubadora a 37 °C y 5% deCO2.
- Al día siguiente, saque la placa de 96 pocillos (preparada en el paso 4.7) de la incubadora. Debajo de la cabina de bioseguridad, agregue 11 μL del reactivo de viabilidad celular (Tabla de materiales) a cada pocillo utilizando la pipeta multipared.
- Agite el plato con el agitador de platos a una velocidad de 10 x g durante 10 s.
- Incubar la placa durante 1 h en la incubadora.
- Saque la placa de 96 pocillos (preparada en el paso 4.10) de la incubadora. Lea la placa en el lector de microplacas (Tabla de materiales) midiendo la absorbancia del reactivo de viabilidad celular (excitación 540 nm, emisión 590 nm).
Representative Results
Es importante cortar los discos de aluminio (Al) (Figura 2A) en trozos pequeños (Figura 2B) para que quepan en el tubo utilizado. Después de agregar 1 M de NaOH a las piezas de Al, debe comenzar inmediatamente una reacción, que se observa por la creación de burbujas. Si no se produce ninguna reacción en 1 minuto o si la reacción es muy rápida y la solución se vuelve completamente turbia con una nube blanca, retire inmediatamente la solución vieja de NaOH y reemplácela con una solución nueva. Compruebe el valor de pH de la solución de NaOH. Debe ser pH>12. Cuando los NW se liberan de las piezas de Al en los primeros 30 minutos con NaOH, los NW (grupos negros, Figura 3A) estarán flotando dentro de la solución de NaOH. En el último paso de liberación de los NW, la solución debe ser homogénea. No debe haber ningún grupo de NW (Figura 3B). Si se recolectaron NW con un imán durante 3 minutos, la solución debe ser transparente y el gránulo de NW debe ser negro (Figura 3C). Si el gránulo era gris, deseche el tubo y comience de nuevo con una nueva muestra de Al.
Durante el proceso de liberación, los NW obtienen una capa nativa de óxido de hierro con un espesor de alrededor de 5 nm, que es similar a los reportes anteriores11,16,20. Esta capa de óxido tiene una importante contribución a la biocompatibilidad 16, funcionalización16,18 y propiedades magnéticas20 de los NWs. Sin embargo, mantener los NW en su plantilla (es decir, no liberarlos) hasta que sea necesario evitará que sufran efectos ambientales sobre ellos. El diámetro y la longitud promedio de los NW después del proceso de liberación fueron de 2,5 μm y 41,5 nm, respectivamente. La masa de un solo NW puede calcularse como se explica en la Tabla 1 y se confirma mediante espectroscopia de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). Aquí, cada disco de alúmina contenía alrededor de 0,3 mg de hierro.
Para reducir la agregación de los NW después de la liberación y permitir una mayor funcionalización, los NW se recubrieron con APTES. Este recubrimiento proporciona grupos amina libres y tiene la capacidad de recubrir materiales magnéticos y no magnéticos39,45, lo que lo hace adecuado para recubrir NW multisegmentados como NW de hierro/oro. Durante el recubrimiento de nanocables, es importante centrarse en dos cosas. En primer lugar, calcule el volumen necesario a partir de las moléculas APTES62 en función de la superficie y la masa de los NW. Estos cálculos se presentaron en la Tabla 2. En segundo lugar, mantener los nanocables en un movimiento continuo para evitar su aglomeración y el bloqueo de algunas partes de las superficies NW por el recubrimiento APTES. Por ejemplo, en este protocolo, los nanocables se incubaron bajo el baño ultrasónico y el rotador durante el recubrimiento APTES y la funcionalización de anticuerpos, respectivamente. Cada molécula de APTES contiene un átomo de silicio y un grupo amina funcional terminal21. Por lo tanto, los mapas de espectroscopia de pérdida de energía de electrones (EELS) se pueden utilizar para confirmar la presencia del recubrimiento APTES mostrando átomos de silicio (color rosa) en la superficie NW (Figura 4A). Por el contrario, los NW no recubiertos muestran los átomos de hierro en azul corteza (Figura 4B) y los átomos de mezcla de hierro/oxígeno en azul claro (Figura 4B). El mapeo EELS correspondiente de NW no recubiertos (Figura 4C, 4D) muestra una mayor intensidad de hierro frente a oxígeno en el centro (Figura 4C) que en la superficie (Figura 4D), lo que indica una estructura de óxido de hierro-hierro (núcleo-capa). En el mapeo de EELS (Figura 4 C,4D) se identificó que la capa de óxido de hierro en los NW es Fe 3 O4 más que Fe2O3, lo cual es similar a una publicación anterior20.
La antigenicidad de los anticuerpos adheridos puede confirmarse mediante los ensayos IP y WB, en los que se puede observar una banda en la muestra positiva pero no en los controles negativos (Figura 5). Tenga en cuenta que para observar una banda clara, no use menos de 0,1 mg de NWs/10 x 106 células. Se utilizó el ensayo BCA (Tabla de Materiales) en combinación con algunos cálculos presentados en la Tabla 3 para cuantificar el número de anticuerpos en el NW.
Además, se utilizó la medición del potencial zeta para dilucidar la funcionalización de la superficie. El grupo amina terminal en APTES redujo la carga negativa de los NW no recubiertos, como se muestra en la Figura 6. Los NW funcionalizados con anticuerpos también cambiaron la carga en comparación con los NW recubiertos de APTES (Figura 6). Todas las mediciones del potencial zeta se realizaron a pH 7.
La diana celular específica de los NW funcionalizados con anticuerpos puede confirmarse mediante microscopía confocal (Figura 7). La biocompatibilidad de cualquier nanomaterial nuevo debe probarse antes de iniciar cualquier aplicación. Por lo tanto, se utilizó el ensayo de viabilidad celular, que confirmó que los NW no recubiertos, recubiertos de APTES y recubiertos de anticuerpos eran biocompatibles incluso con una alta concentración (Figura 8).
Figura 1: El esquema representa el método de recubrimiento y biofuncionalización de los nanocables. (A) Recubrimiento de hierro NW con APTES. (B) Activación de los anticuerpos mediante el uso de EDC + Sulfo-NHS, para tener al final (C) un nanocable funcionalizado de anticuerpos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Disco de aluminio depositado en hierro. (A) El disco de aluminio antes del corte. (B) Las líneas rojas mostraban dónde cortar el disco. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Pasos de liberación de nanocables. (A) Grupos de nanocables flotan en una solución de NaOH. La imagen fue tomada 10 min después de añadir el NaOH y después de retirar la membrana de Al. (B) Nanohilos suspendidos en etanol. La foto fue tomada en el último paso de liberación, inmediatamente después del paso de sonicación. (C) Pellet de nanocable negro recogido por un imán. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Mapa de espectroscopía de pérdida de energía de electrones (EELS). (A) Nanocable recubierto de APTES (APTES-NW). Los colores azul y rosa representan átomos de hierro y silicio, respectivamente. (B) Nanocable no recubierto (NW). Los colores azul de la corteza y azul claro representan el mapeo de la mezcla de hierro y hierro/oxígeno, respectivamente. El mapeo EELS correspondiente de (C) el núcleo y (D) la capa de los NW no recubiertos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Confirmación de la funcionalización y actividad de los nanocables conjugados con anticuerpos. La antigenicidad de los CD44-NW se confirmó mediante inmunoprecipitación (IP) y Western blot (WB). +Ve: representa el control positivo (lisado de células completas). -Ve: representa el control negativo (solo NW no recubierto). – Células CD44: representan células que no expresan el antígeno CD44; + Células CD44: representa las células de cáncer de colon que expresan el antígeno CD44. Esta es una transferencia representativa de n = 3 experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Valores de potencial zeta para NWs, APTES-NWs y anticuerpos. Las barras representan la media ± error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Las imágenes microscópicas confocales muestran el objetivo específico. Los CD44-NW se muestran adheridos (A y C), mientras que los Isotype-NWs (control negativo) no se unieron (B y D). Los colores rojo, azul y verde representan la membrana celular, el núcleo y el grupo de CD44-NW, respectivamente. A y B son las imágenes de campo claro de C y D, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Estudio de viabilidad celular de células de cáncer de colon (HCT116) incubadas con diferentes formulaciones de nanohilos. Las células fueron tratadas con NWs después de 24 h de incubación y luego incubadas durante 24 h con los NWs. Todos los experimentos se llevaron a cabo dentro de una incubadora a 37 °C. Las barras representan la media ± error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Parámetro | Valor | Unidad | ||
| Longitud de Fe NW (h) | 2.6 | μm | ||
| Radio (diámetro/2) (r) | 0.01679231 | μm | ||
| Densidad de Fe (D) | 7.87 | g/cm3 | ||
| 1 Fe NW volumen (V)= π r^2h | 2.30E-15 | cm3 | ||
| 1 Fe Masa NW = V x D | 1.80E-08 | μg | ||
| 1 Fe NW superficie = 2π r^2 + 2πrh | 2.76E-01 | μm2 | 2.8E+05 | NM2 |
Tabla 1: Cálculo de la masa NW del hierro.
| Parámetro | Valor | Unidad |
| Densidad de APTES/100 μL* | 9.50E-01 | g |
| Peso del molécula (MW) de APTES | 2.21E+02 | g/mol |
| Número de moles APTES = masa/MW | 4.29E-03 | Mol |
| Número de moléculas APTES/100 μL** | 2.57E+21 | Moléculas |
| Tamaño de APTES *** | 5.00E-01 | Nm |
| Superficie de APTES | 2.00E-01 | NM2 |
| Superficie NW**** | 2.76E+05 | NM2 |
| Número de NW en 0,3 mg de NW **** | 1.70E+10 | Nws |
| Número de moléculas de APTES necesarias para crear una capa alrededor del NW | 1.38E+06 | Molécula APTES |
| Número de moléculas de APTES necesarias para 0,3 mg de NW | 2.35E+16 | Molécula APTES |
| *Referencia número 61 | ||
| ** Número de moléculas = Número de mol*avogadro (6E+23) | ||
| Referencia número 62 | ||
| De la Tabla 1 | ||
Tabla 2: Cálculo del número de moléculas APTES necesarias para el recubrimiento de NWs.
| Anticuerpo IgG en forma de Y | NW | |
| Masa por un anticuerpo | 2.3E-13 μg | 1,8E-08 μg* |
| Área de superficie para un anticuerpo | 23 nm2 | 2.6E+05 nm2 |
| Basado en el ensayo BCA | 0,3 mg por 1 mg | |
| El número de la molécula de anticuerpo y NW en 0,3 mg de anticuerpo por mg de NW | ~1E+15 anticuerpos ** por ~5.6E+10 NWs | |
| Número de moléculas de anticuerpo por NW | ~2E+04 anticuerpos por 1 NW*** | |
| *Calculado a partir de la tabla 1 | ||
| **El número de anticuerpos en 0,3 mg se calculó dividiendo el número de anticuerpos que recibimos del ensayo BSA (0,3 mg) por el peso molecular medio de los anticuerpos IgG en forma de Y (180 kDa = 3E-16 mg). | ||
| Sobre la base del área superficial de una molécula de anticuerpos IgG en forma de Y (~23 nm2) y el área superficial de un NW (~2,6E+05 nm2), alrededor de 1E+04 anticuerpos serían suficientes para crear una monocapa en el NW. En nuestro caso, la densidad de anticuerpos fue dos veces mayor que la cantidad esperada. Esto puede estar relacionado con el recubrimiento APTES que proporciona más brazos que permite la alta adhesión de los anticuerpos. Este caso asegura que el NW está completamente cubierto con los anticuerpos y la oportunidad de que el anticuerpo se una a un antígeno de superficie celular, independientemente de la orientación de los NW, será alta. Sin embargo, si la densidad de anticuerpos es inferior al número esperado (molécula de anticuerpo 1E+04), entonces la probabilidad de unión entre la célula y los NW será menor. | ||
Tabla 3: Cálculo del número de anticuerpos en el nanohilo.
Discussion
Al igual que con cualquier método de fabricación y recubrimiento de nanomateriales, se requiere una alta calidad de las soluciones utilizadas. Las soluciones de liberación (1 M NaOH) y funcionalización (MES) se pueden reutilizar varias veces. Sin embargo, es muy importante comprobar su valor de pH antes de iniciar un nuevo proceso. En la etapa de liberación, el lavado de los NW con NaOH debe realizarse al menos cuatro veces. Cuanto mejor sea el lavado, mejor será la estabilidad de los NW y menos serán agregados. La capa de óxido mejora la estabilidad de los NW tras la inmersión en etanol o agua63.
El diámetro y la longitud de los NW se vieron afectados después de recubrirlos con APTES y anticuerpos. Aquí, el diámetro aumentó de 41,5 nm a 70 nm, y la longitud disminuyó de 2,5 μm a 1,6 μm, debido a los pasos de sonicación que rompen los NW. Por lo tanto, es esencial caracterizar la morfología de los NW después de la etapa de biofuncionalización.
La unión de los anticuerpos a los NW se basa en la interacción covalente entre el grupo amina (en APTES) y el grupo carboxilo (en el anticuerpo). Por lo tanto, confirmar la presencia del recubrimiento APTES es un paso importante, para lo cual utilizamos el mapeo EELS. El método de recubrimiento es seguro y sencillo. No necesita altas temperaturas ni largos tiempos de incubación. Además, el recubrimiento APTES funciona como un enlazador para permitir la unión covalente de otros anticuerpos o proteínas que tienen un grupo carboxilo.
En el caso de la biofuncionalización de los NW con un anticuerpo, la antigenicidad de los sitios de unión de los anticuerpos después del proceso de biofuncionalización puede verse afectada. El método IP y WB se puede utilizar para investigar este problema. El uso del método de biofuncionalización mencionado en este protocolo permitirá que los anticuerpos se unan a los NW con alta antigenicidad a un receptor celular específico. Además, la biofuncionalización de los NW con anticuerpos añadió la capacidad de dirigirse a las células con el receptor de interés, CD44. Esto fue confirmado por microscopía confocal. A pesar de que la biocompatibilidad de los NWs no recubiertos fue alta (>95%), la adición de recubrimiento APTES o anticuerpos a los NWs mejoró su biocompatibilidad en un 100%.
Además, el protocolo de recubrimiento y biofuncionalización es eficiente, económico y reproducible. Debe ser aplicable a cualquier otro nanomaterial de óxido de hierro-hierro, por lo que la concentración tanto del recubrimiento como de los anticuerpos adheridos debe optimizarse en función de la superficie y la masa del nanomaterial. Este protocolo se puede realizar de forma segura en condiciones ambientales en el laboratorio general. La biofuncionalización ha mejorado significativamente la biocompatibilidad del nanomaterial y su capacidad de orientación. En general, los NW son materiales extremadamente prometedores para aplicaciones nanomédicas (incluidos los tratamientos multimodales o combinatorios, la detección o guía celular y la detección biológica). En combinación con la biofuncionalización, como se describe aquí, se puede lograr una orientación celular específica para aumentar la precisión y la eficacia.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por la Universidad de Ciencia y Tecnología Rey Abdullah (KAUST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL tube (snap-cap Microcentrifuge) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-402-7 | |
| 2-N-Morpholino EthaneSulfonic acid hydrate 99% (MES) | Thermscientific | AC172590250 | Concentration 0.1 M and pH 4.7 |
| 3-3-Dimethyl-aminopropyl Carbodiimide (EDC) | Thermofisher | PG82079 | |
| 3-AminoPropyl-Tri-Ethoxy-Silane (APTES) | Sigma Aldrich | 919302 | |
| 5 mL glass tube | Fisherscientific | 03-339-22C | |
| 96-well plate ( flat bottom) | Sigma Aldrich | CLS3595 | |
| Anti-CD44 antibody | BD Biosciences | 550990 | Clone 515, concentration 1 mg/mL |
| APTES ((3-Aminopropyl)triethoxysilane), 99% | Sigma Aldrich | 919-30-2 | Concentration 99% |
| BCA assay (Pierce BCA Protein Assay Kit) | Thermofisher | 23225 | |
| Bovine Serum Albumin solution (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Concentration 35% |
| Cell incubator | Thermofisher | 50116047 | |
| Cell viability reagent | AlamarBlue,Thermofisher | DAL1025 | |
| Colon cancer cells - HCT116 cell line | ATCC | 430641 | |
| Hardwood Hammer | Any hammer tool can be used, there is no specific brand. | ||
| Inductively coupled plasma Mass Spectrometer (ICP-MS) | Perkin Elmer | ELAN 9000 ICP-MS | The used software is "Elan instrument control session" |
| Laboratory Retort Stand with Clamp | RVFM | 13-0140 | This is used to handle the 5 mL glass tube in the sonicator bath. |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Thermofisher | 12321D | |
| McCoy’s 5A Medium 1x | Gibco | 16600082 | |
| Microplate reader (Bio-Rad xMark Absorbance Spectrophotometer) | Bio-Rad | 1681150 | Microplate Manager 6 software (#168-9520) |
| Phosphate buffered saline (PBS) 10x | Gibco | 14200067 | Concentration 0.1 M (No calcuim, no magnesium) |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 14190136 | Concentration 0.01 M (No calcuim, no magnesium) |
| Plate shaker (Microplate Genie) | Scientific Industries (Genie) | SI-0400 | |
| Single Edge Razor blades | Polysciences | 08410-1 | |
| Sodum hydrixide (NaOH) | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | Concentration 1 M, pH 13 |
| Sulfo-N-HydroxySulfosuccinimide (sulfo-NHS) | Thermofisher | 106627-54-7 | |
| Trypsin | ATCC | 30-2101 | |
| Tube rotator | VWR | 10136-084 | |
| Tube shaker (Eppendorf Thermomixer R Mixer, 2.0 mL) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-400-204 | |
| Ultrasonic bath (2510) | Branson | 2489502 |
References
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