Summary
In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Biofunktionalisierung von magnetischen Nanomaterialien mit Antikörpern für spezifisches Zell-Targeting zur Verfügung. Zum Beispiel verwenden wir Eisen-Nanodrähte, um Krebszellen anzugreifen.
Abstract
Magnetische Nanomaterialien haben in verschiedenen biomedizinischen Anwendungen große Aufmerksamkeit erhalten. Die Biofunktionalisierung dieser Nanomaterialien mit spezifischen Targeting-Wirkstoffen ist ein entscheidender Aspekt, um ihre Wirksamkeit in der Diagnostik und Behandlung zu verbessern und gleichzeitig die Nebenwirkungen zu minimieren. Der Vorteil magnetischer Nanomaterialien gegenüber nichtmagnetischen Nanomaterialien ist ihre Fähigkeit, berührungslos und über große Entfernungen auf Magnetfelder zu reagieren. Dies ermöglicht es, sie zu lenken oder zu akkumulieren, während sie auch überwacht werden können. Kürzlich wurden magnetische Nanodrähte (NWs) mit einzigartigen Eigenschaften für biomedizinische Anwendungen entwickelt. Das große magnetische Moment dieser NWs ermöglicht eine effizientere Fernsteuerung ihrer Bewegung durch ein Magnetfeld. Dies wurde mit großem Erfolg in der Krebsbehandlung, der Verabreichung von Medikamenten, der Zellverfolgung, der Stammzelldifferenzierung oder der Magnetresonanztomographie eingesetzt. Darüber hinaus bietet die NW-Herstellung durch Template-gestützte elektrochemische Abscheidung eine vielseitige Methode mit strenger Kontrolle über die NW-Eigenschaften. Insbesondere Eisen-NWs und Eisen-Eisenoxid-NWs (Kern-Schale) eignen sich aufgrund ihrer hohen Magnetisierung und geringen Toxizität für biomedizinische Anwendungen.
In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur Biofunktionalisierung von Eisen/Eisenoxid-NWs mit spezifischen Antikörpern vor, die gegen einen spezifischen Zelloberflächenmarker gerichtet sind, der in einer großen Anzahl von Krebszellen überexprimiert wird. Da die Methode die Eigenschaften der Eisenoxidoberfläche nutzt, ist sie auch auf superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel anwendbar. Die NWs werden zunächst mit 3-Aminopropyl-Tri-Ethoxy-Silan (APTES) beschichtet, das als Linker fungiert und an das die Antikörper kovalent gebunden sind. Die APTES-Beschichtung und die Antikörper-Biofunktionalisierung werden durch Elektronenenergieverlustspektroskopie (EELS) und Zetapotentialmessungen nachgewiesen. Zusätzlich wird die Antigenität der Antikörper auf den NWs mittels Immunpräzipitation und Western Blot getestet. Das spezifische Targeting der biofunktionalisierten NWs und ihre Biokompatibilität werden mittels konfokaler Mikroskopie und einem Zellviabilitätsassay untersucht.
Introduction
Eine einzigartige Eigenschaft magnetischer Nanomaterialien ist ihre Fähigkeit, auf Magnetfelder1 zu reagieren, die auf vielfältige Weise nutzbringend genutzt werden können, um sie zu aktivieren, während sie beispielsweise auch durch Magnetresonanztomographie (MRT) überwacht werden können. Wenn sie ein magnetisches Wechselfeld mit hoher Frequenz anlegen, können sie Wärme erzeugen, die eine Hyperthermie induzieren kann, was eine therapeutische Optiondarstellt 1. Ein weiterer Ansatz ist die photothermische Behandlung, die mit einem Nahinfrarotlaser (NIR) realisiert werden kann 2,3.
Unter der großen Anzahl magnetischer Nanomaterialien hat Eisenoxid die größte Aufmerksamkeit in biologischen Anwendungen wie Magnettrennung, Hyperthermie2,4, Zellführung5, Medikamentenabgabe 6,7,8 und als Kontrastmittel in der MRT 9,10 erhalten. Dies ist auf ihre hohe Biokompatibilität 11,12, ihre große Magnetisierung 11,12, ihre Fähigkeit, beschichtet zu werden, 9,13,14,15, ihre Fähigkeit, Arzneimittel zu tragen, 2,16, ihre Fähigkeit, mit Arzneimitteln2,16 oder/und Zielmitteln 12,13,17 funktionalisiert zu werden, zurückzuführen,18 und die Fähigkeit, optische Energie in Wärme umzuwandeln2. Vor kurzem hat MagForce mit klinischen Studien an Krebspatienten begonnen, bei denen Eisenoxid-Nanopartikel für die Hyperthermiebehandlung eingesetzt werden19.
In letzter Zeit werden magnetische Nanodrähte (NWs) zunehmend für biomedizinische Anwendungen genutzt 3,11,16,20,21,22. Sie haben ähnliche Eigenschaften wie magnetische Nanoperlen, bieten jedoch eine anisotrope Form und ein sehr großes magnetisches Moment, was eine sehr effiziente Fernsteuerung durch ein Magnetfeld23,24 ermöglicht, einschließlich niederfrequenter Betätigung zur Induktion magnetomechanischer Effekte 25,26,27,28,29. Infolgedessen wurden die NWs für verschiedene biologische Anwendungen eingesetzt, wie z. B. die Isolierung von Exosomen 30 Zellverfolgung 21, die Krebsbehandlung3,11, 16, die Verabreichung von Medikamenten 16,31, 32 und als MRT-Kontrastmittel 33.
Biofunktionalisierte magnetische Nanomaterialien mit spezifischer zellspezifischer Targeting-Fähigkeit haben ein großes Potenzial für biomedizinische Anwendungen und in der Präzisionsmedizin34,35. Um diese Targeting-Wirkstoffe zu binden, ist eine Oberflächenmodifikation an den Nanomaterialien erforderlich. In der Regel benötigen sie eine Beschichtung, die eine funktionelle Gruppe bereitstellt, die das Anheften der Behandlungsmittel erleichtert. In der Literatur gibt es eine Vielzahl von organischen und anorganischen Beschichtungen für magnetische Nanomaterialien. Basierend auf der funktionellen Gruppe, die an das Nanomaterial immobilisiert werden kann, können diese Beschichtungen in vier Hauptgruppen eingeteilt werden: Moleküle auf der Basis von Carbonsäuregruppen, Polymere, Histidin und Moleküle auf Basis von Silangruppen.
Die auf Carbonsäuregruppen basierenden Moleküle sind eine der Methoden zur Oberflächenmodifikation. Es nutzt die hohe Affinität
zwischen der negativen Carbonsäuregruppe auf der Beschichtung und der positiven Ladung auf den magnetischen Nanomaterialien36,37,38. Der Bindungsprozess einer Carbonsäure an eine Metalloberfläche kann die Erzeugung von Metallcarboxylatsalzen oder die Adhäsion der Carboxylgruppe an das Metall beinhalten. Für mehrsegmentierte NWs, wie z. B. Eisen/Gold- oder Nickel/Gold-NWs, die hervorragende Eigenschaften für Bioanwendungen aufweisen39,40, kann diese Art von Beschichtung jedoch nicht einfach aufgetragen werden. Es werden zwei verschiedene Beschichtungen gleichzeitig benötigt: Thiolgruppen zur Modifizierung der Goldsegmente und Carboxylgruppen für magnetische Segmente (Eisen oder Nickel)38. Einige Beispiele für Moleküle, die auf Carboxylgruppen basieren, sind Hämatoporphyrin, Pimelinsäure, Palmitinsäure und 3-[(2-Aminoethyl)dithio]propionsäure (AEDP)38. Oberflächenmodifikationen von magnetischen Nanomaterialien unter Verwendung von Polymeren bieten einige entscheidende Vorteile. Aufgrund des großen Molekulargewichts der Polymere erhöht es die Stabilität des magnetischen Nanomaterials in einer Lösung38. Es wird jedoch die Größe des Nanomaterialsdeutlich vergrößern 38. Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyethylenimin (PEI), Arginin-Glycin-D-Asparaginsäure (RGD) und Polyethylenglykol (PEG) sind einige Beispiele für die am häufigsten verwendeten Polymere für Oberflächenmodifikationen. Jeder hat seine eigenen Funktionen und verwendet38. Die dritte Methode zur Oberflächenmodifikation ist die Verwendung einer Histidin-Beschichtung. Histidin ist ein Protein mit einer Histidin-Aminosäureseitenkette, das eine hohe Affinität zu einer begrenzten Anzahl von magnetischen Nanomaterialien wie Nickel38 aufweist. Es kann für Proteinreinigungsprozesse 38,41,42 eingesetzt werden. Eine Histidinbeschichtung kann auch auf mehrsegmentierte NWs aufgebracht werden, wie z. B. Nickel/Gold-NWs38. Die Silanisierung einer Nanomaterialoberfläche ist ein etabliertes Verfahren 38,43,44. Es basiert auf einem Siliciumatom, das durch drei Einfachbindungen an eine beliebige Metalloxidoberfläche gebunden ist, und gleichzeitig bindet dieses Siliciumatom am Ende über eine Alkylkette 38,43,44 an die funktionelle Gruppe. Der Vorteil dieser Beschichtung besteht darin, freie Amingruppen bereitzustellen, und sie hat die Fähigkeit, sowohl magnetische als auch nichtmagnetische Materialien38,45, wie Nickel bzw. Gold, zu beschichten. Daher ist die Verwendung von Molekülen, die auf der Salzgruppe basieren, ein praktischer Weg zur Biofunktionalisierung von mehrsegmentierten NWs. Einige Beispiele für Moleküle, die auf Silangruppen basieren, sind (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES) und (3-Aminopropyl)trimethoxysilan (APTMS)38,45.
Die Zugabe eines Targeting-Wirkstoffs zur Beschichtung kann sowohl bei der Diagnose als auch bei der Behandlung erkrankter Zellen eine wichtige Rolle spielen und gleichzeitig die Nebenwirkungen auf gesundes Gewebe minimieren46,47. Die Zugabe eines Targeting-Wirkstoffs auf der Oberfläche von Nanomaterialien verbessert sowohl die zellselektive Bindung als auch die Internalisierung durch Endozytoserezeptoren7. Ohne diese Zielliganden interagieren Nanomaterialien unspezifisch mit Zellmembranen, die im Vergleich zu den Nanomaterialien mit den Liganden48 mit einer geringeren Geschwindigkeit binden. Eine der Herausforderungen bei der Bekämpfung von Krebsgewebe ist ihre charakteristische Ähnlichkeit mit gesundem Gewebe. Daher hängt der Erfolg des Targetings hauptsächlich von der Bestimmung des geeigneten Liganden ab, der als biologisches Ziel verwendet werdensoll 49,50. Verschiedene Targeting-Wirkstoffe wurden eingesetzt, um Nanomaterialien zu Krebszellen zu leiten48,51 (z. B. CD44, aufgrund seiner hohen Expression in Krebszellen im Vergleich zu gesunden Zellen52,53,54,55).
Targeting-Wirkstoffe können in drei Hauptgruppen eingeteilt werden, basierend auf den Komponenten, aus denen sie bestehen, und ihrer Komplexität: Aptamer-basiertes Targeting, Liganden-basiertes Targeting und Antikörper-basiertes Targeting. Aptamere sind kurze, chemisch synthetisierte DNA- oder RNA-Oligonukleotide, die zu zwei- und dreidimensionalen Strukturen gefaltet sind, wodurch sie in der Lage sind, auf ein bestimmtes Antigen, meist Proteine,abzuzielen 56. Das ligandenbasierte Targeting umfasst Peptide und kurze Aminosäureketten57. Antikörper-basiertes Targeting beinhaltet die Verwendung eines ganzen Antikörpers oder von Antikörperfragmenten, wie z. B. einkettige variable Fragmente oder Antigen-bindende Fragmente51. Die Verwendung dieses Verfahrens hat den Vorteil, dass zwei Bindungsstellen mit einer hohen Bindungsaffinität zu seinem spezifischen Zielantigen vorhanden sind, was ihm eine außerordentlich hohe Selektivität verleiht58. Die Bindungsstellen sind analog zu einem Schloss und das Antigen zu einem Schlüssel58.
In dieser Arbeit wurden die verwendeten NWs durch elektrolytische Abscheidung auf Aluminiumoxidmembranen hergestellt, ein Verfahren, das in einer früheren Veröffentlichung59 ausführlich beschrieben wurde. Der Fokus liegt dabei auf der Freisetzung dieser Eisen-Eisenoxid-NWs (Kern-Schale) aus den Membranen und ihrer Biofunktionalisierung mit spezifischen Antikörpern, um eine Targeting-Fähigkeit zu erreichen. Die Antikörper können nicht direkt an die Eisen-Eisenoxid-NWs binden und benötigen einen Linker. Die Beschichtung der NWs mit APTES liefert freie Amingruppen, die die kovalente Bindung über die Carboxylgruppe an die Antikörper ermöglichen (Abbildung 1). Der Vorteil der APTES-Beschichtung besteht darin, dass sie sowohl für magnetische21 - als auch für nichtmagnetische60-Materialien wie Eisen/Gold oder Nickel/Gold NWs45 geeignet ist. Alle in diesem Protokoll erläuterten Beschichtungs- und Biofunktionalisierungsschritte können im Allgemeinen mit jedem Eisen/Eisenoxid-Nanomaterial verwendet werden. Als Beispiel wurden hier Eisen/Eisenoxid-NWs verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass die Antikörper-funktionalisierten NWs eine hohe Antigenität gegenüber spezifischen Zelloberflächenrezeptoren aufweisen, die für verschiedene Anwendungen genutzt werden können. Beispiele hierfür sind die Zelltrennung, die Verabreichung von Medikamenten und die Behandlung spezifischer Krebszellen mit photothermischen und/oder magnetomechanischen Behandlungen.
Protocol
ACHTUNG: Konsultieren Sie vor der Verwendung immer alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS). Verwenden Sie alle geeigneten Sicherheitsmaßnahmen und persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Laborkittel, lange Hosen, geschlossene Schuhe). Führen Sie alle biologischen Reaktionen im biologischen Abzug durch.
HINWEIS: Dieses Protokoll ist für die Herstellung von 2 x 10 10 biofunktionalisierten NWs/ml vorgesehen, die 0,36 mg Eisen/ml entsprechen, die mit Anti-CD44-Antikörpern mit einer Dichte von 3 x10 4 Antikörpern/NW beschichtet sind. Die Eisen-Eisenoxid-NWs (Kern-Schale) sind 2,5 μm lang und haben einen Durchmesser von 41,5 nm.
1. Freisetzung von Eisen-Nanodrähten
ANMERKUNG: Der Herstellungsprozess der Eisen/Eisenoxid-NWs wurde in einer früheren Veröffentlichung59 ausführlich erläutert.
- Schneiden Sie die Aluminiumscheiben (Al) (Abbildung 2A) auf einer Schneidematte mit einer einschneidigen Klinge und einem kleinen Hammer in kleine Stücke (Abbildung 2B), damit sie in ein 2-ml-Röhrchen passen. Verwende eine Pinzette, um die kleinen Al-Stücke in das Röhrchen zu übertragen.
- Füllen Sie das 2-ml-Röhrchen, das die kleinen Al-Stücke enthält, mit 1 ml 1 M Natronlauge (NaOH). Stellen Sie sicher, dass alle Al-Stücke mit dem NaOH bedeckt sind.
- Lassen Sie die Lösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einem chemischen Abzug einwirken.
- Entfernen Sie nur die Al-Stücke mit der Pinzette und halten Sie die freigesetzten NWs (schwarze Cluster, Abbildung 3A) für weitere 30 Minuten in der NaOH-Lösung. Wechseln Sie die NaOH-Lösung nicht.
- Sammeln Sie die NWs, indem Sie das 2-ml-Röhrchen in ein magnetisches Gestell legen und 2 Minuten warten, bevor Sie die alte 1-M NaOH-Lösung entfernen. Ersetzen Sie es durch eine frische NaOH-Lösung.
- Beschallen Sie das 2-ml-Röhrchen mit den NWs 30 s lang und lassen Sie es 1 Stunde lang in einem chemischen Abzug.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.5 bis 1.6 mindestens viermal.
- Waschen Sie die NWs, indem Sie das 2-ml-Röhrchen in das Magnetgestell legen und 2 Minuten warten.
- Verwerfen Sie die NaOH-Lösung und ersetzen Sie sie durch 1 ml absolutes Ethanol.
- Beschallen Sie das Röhrchen 30 s lang.
- Legen Sie das 2-ml-Röhrchen in das magnetische Gestell und warten Sie 2 Minuten.
- Verwerfen Sie die alte absolute Ethanollösung und ersetzen Sie sie durch 1 ml frisches absolutes Ethanol und beschallen Sie sie 30 s lang.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.11 und 1.12 mindestens viermal.
- Bewahren Sie die NWs in 1 ml absolutem Ethanol bei Raumtemperatur auf, bis sie benötigt werden.
- Messung der Eisenkonzentration und damit der NWs mittels induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS).
HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Für die Langzeitspeicherung sollten Sie die NWs jedoch erst dann aus der Al-Vorlage freigeben, wenn sie benötigt werden. Wenn die freigesetzten NWs über einen längeren Zeitraum ohne häufige Beschallung im Ethanol ausfallen, entstehen Aggregationen, die längere Beschallungszeiten benötigen, um getrennt zu werden.
2. Beschichtung der Nanodrähte mit APTES
HINWEIS: In diesem Protokoll reichen 100 μl APTES-Lösung (Dichte von 0,946 g/ml61) aus, um 1,6 x 107 m2/g NWs zu beschichten. Wenn sich das Verhältnis oder die Masse des Nanomaterials ändert, sollte das APTES-Volumen entsprechend angepasst werden.
- Die NWs aus Schritt 1.14 werden mit einer 1-ml-Pipette in ein 5-ml-Glasröhrchen überführt.
- Um alle im 2-ml-Röhrchen verbliebenen NWs aufzufangen, waschen Sie das leere 2-ml-Röhrchen zweimal, indem Sie 1 ml absolutes Ethanol hinzufügen und es mit einer 1-ml-Pipette in das 5-ml-Glasröhrchen überführen.
- Nehmen Sie mit der Pipette 100 μl APTES und geben Sie es direkt in die NW-Lösung.
- Das 5-ml-Glasröhrchen 10 s lang vortexen.
- Stellen Sie das 5-ml-Glasröhrchen an der Klemme eines Labor-Retortenständers ein.
- Legen Sie die Hälfte des 5-ml-Glasröhrchens in das Wasser des Ultraschallbades und beschallen Sie es 1 Stunde lang.
- Nehmen Sie das 5-ml-Glasröhrchen aus dem Ultraschallbad und fügen Sie 400 μl deionisiertes (DI) Wasser hinzu, gefolgt von 20 μl 1 M NaOH (basische Katalyse).
ACHTUNG: Es ist wichtig, zuerst das DI-Wasser hinzuzufügen. - Stellen Sie das 5-ml-Glasröhrchen ein, wie in den Schritten 2.5-2.6 beschrieben, und beschallen Sie es weitere 1 Stunde lang.
- Nehmen Sie das 5 mL Glasröhrchen aus dem Ultraschallbad.
- Platzieren Sie einen Magneten für 5 Minuten neben dem Glasröhrchen, um die NWs zu sammeln.
- Ersetzen Sie den Überstand durch 1 ml frisches absolutes Ethanol und beschallen Sie ihn 10 s lang.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.10-2.11 viermal.
- Alle NWs suspendiertes Ethanol mit einer 1-ml-Pipette in ein neues 5-ml-Glasröhrchen überführen.
HINWEIS: Die APTES-beschichteten NWs können in einem Glasröhrchen mit Ethanol gelagert werden, bis sie benötigt werden. Hier kann das Protokoll pausiert werden.
3. Biofunktionalisierung der Nanodrähte
- Aktivierung der Antikörper
HINWEIS: Um ca. 3 x 104 Teile Antikörper/NW zu erreichen, verwenden Sie 30 μl Antikörper (1 mg/ml) pro 0,1 mg Eisen.- In einem 2-ml-Röhrchen werden 0,4 mg 3-3-Dimethylaminopropylcarbodiimid (EDC) und 1,1 mg Sulfo-N-hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS) in 1 ml 2-N-Morpholino-Ethansulfonsäurehydrat (MES) (pH 4,7) gelöst.
HINWEIS: Das EDC/Sulfo-NHS-Gemisch sollte vor der Verwendung frisch und zubereitet sein. - In ein neues 2-ml-Röhrchen werden 30 μl Anti-CD44-Antikörper (1 mg/ml), 960 μl 0,1 M phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7) und 10 μl EDC/Sulfo-NHS-Gemisch (hergestellt in Schritt 3.1.1) gegeben.
- Geben Sie das 2-ml-Röhrchen in einen Röhrchenschüttler bei 10 x g für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
- In einem 2-ml-Röhrchen werden 0,4 mg 3-3-Dimethylaminopropylcarbodiimid (EDC) und 1,1 mg Sulfo-N-hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS) in 1 ml 2-N-Morpholino-Ethansulfonsäurehydrat (MES) (pH 4,7) gelöst.
- Herstellung der APTES-beschichteten Nanodrähte
- Während der 15-minütigen Inkubation in Schritt 3.1.3 werden die NWs gewaschen, indem ein Magnet 2 Minuten lang neben das APTES-beschichtete NWs-Röhrchen (aus Schritt 2.13) gelegt wird, um die NWs aufzufangen.
- Verwerfen Sie das Ethanol und ersetzen Sie es durch 1 ml 0,1 M PBS (pH 7) und beschallen Sie es dann 10 s lang.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1-3.2.2 viermal.
- Sammeln Sie die NWs, wie in Schritt 3.2.1 beschrieben, und verwerfen Sie die 0,1 M PBS. Halten Sie die NWs ohne Lösung in der Röhre.
- Anheftung der Antikörper
- Die gesamte aktivierte Antikörperlösung (hergestellt in Schritt 3.1.3) wird in das NWs-Röhrchen (hergestellt in 3.2.4) überführt und 10 s lang beschallt.
- Stellen Sie das Glasröhrchen über Nacht bei 4 °C in den Rotator.
- Sammeln Sie die NWs mit einem Magneten wie in Schritt 3.2.1 und entsorgen Sie den Überstand.
- Zugabe von 1 ml 2%iger Rinderserumalbuminlösung (BSA) für 1 h bei 4 °C, um die Reaktion zu blockieren.
- Überprüfung der Antigenität der antikörperfunktionalisierten NWs, z. B. mit Hilfe von Immunpräzipitations- (IP) und Western-Blot-Assays (WB).
HINWEIS: Um bessere Ergebnisse zu erzielen, verwenden Sie die biofunktionalisierten NWs im IP-, WB- oder Biokompatibilitätsassay unmittelbar nach dem Blockierungsschritt.
4. Biokompatibilitäts-Assay
HINWEIS: Um die Biokompatibilität der NWs zu untersuchen, können verschiedene Zellviabilitätsassays und verschiedene Zelllinien verwendet werden. Die hier verwendete Konzentration der NWs beruht auf einer früheren Veröffentlichung16. Die Zellaussaat sollte einen Tag vor der NW-Biofunktionalisierung erfolgen.
VORSICHT: Alle folgenden Schritte sollten unter der Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden.
- In einer 96-Well-Platte werden neun Wells mit 4 x 104 Dickdarmkrebszellen (HCT116-Zelllinie) besiedelt, die in McCoys Zellkulturmedium (100 μl/Well) suspendiert sind, und über Nacht bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid (CO2) in den Inkubator gegeben.
- Die NWs (aus Schritt 3.3.4) werden mit PBS gewaschen, indem sie wie in Schritt 3.2.1 mit einem Magneten aufgefangen werden, und die alte Lösung durch 1 ml 0,01 M PBS (pH 7) ersetzen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
- Waschen Sie die NWs (aus Schritt 4.2) mit erwärmtem McCoy's-Medium, indem Sie sie mit einem Magneten wie in Schritt 3.2.1 auffangen, und ersetzen Sie das alte PBS durch 1 ml erwärmtes McCoy's-Medium. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
- Sammeln Sie die NWs (aus Schritt 4.3) mit einem Magneten wie in Schritt 3.2.1 und ersetzen Sie die 1 ml erwärmtes McCoy-Medium durch 900 μl erwärmtes McCoy-Medium. Die NWs-Konzentration sollte 0,02 mg NWs pro ml betragen.
- Nehmen Sie die 96-Well-Platte (aus Schritt 4.1) aus dem Inkubator in die Biosicherheitswerkbank.
- In der Biosicherheitswerkbank das alte Medium aus den Zellen entsorgen und durch 100 μl suspendierte NWs ersetzen (hergestellt in Schritt 4.4).
- Die Platte (vorbereitet in Schritt 4.6) wird von Hand geschüttelt und anschließend 24 Stunden lang im Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
- Nehmen Sie am nächsten Tag die 96-Well-Platte (vorbereitet in Schritt 4.7) aus dem Inkubator. Geben Sie in der Biosicherheitswerkbank 11 μl des Zellviabilitätsreagenzes (Materialtabelle) mit der mehrwandigen Pipette in jede Vertiefung.
- Schütteln Sie die Platte mit dem Tellerschüttler bei einer Geschwindigkeit von 10 x g für 10 s.
- Inkubieren Sie die Platte für 1 Stunde im Inkubator.
- Nehmen Sie die 96-Well-Platte (vorbereitet in Schritt 4.10) aus dem Inkubator. Lesen Sie die Platte im Mikroplatten-Reader (Materialtabelle) ab, indem Sie die Absorption des Zellviabilitätsreagenzes messen (Anregung 540 nm, Emission 590 nm).
Representative Results
Es ist wichtig, die Aluminiumscheiben (Abbildung 2A) in kleine Stücke (Abbildung 2B) zu schneiden, damit sie in das verwendete Rohr passen. Nach Zugabe von 1 M NaOH zu den Al-Stücken sollte sofort eine Reaktion beginnen, die durch die Bildung von Blasen beobachtet wird. Wenn innerhalb von 1 min keine Reaktion stattfindet oder die Reaktion sehr schnell ist und die Lösung völlig trüb wird und eine weiße Wolke bildet, entfernen Sie sofort die alte NaOH-Lösung und ersetzen Sie sie durch eine frische Lösung. Überprüfen Sie den pH-Wert der NaOH-Lösung. Er sollte pH>12 betragen. Wenn die NWs in den ersten 30 Minuten mit NaOH aus den Al-Stücken freigesetzt werden, schweben die NWs (schwarze Cluster, Abbildung 3A) in der NaOH-Lösung. Im letzten Schritt der Freisetzung der NWs sollte die Lösung homogen sein. Es sollte keine Anhäufung von NWs vorhanden sein (Abbildung 3B). Wenn NWs 3 Minuten lang mit einem Magneten gesammelt wurden, sollte die Lösung klar sein und das NW-Pellet sollte schwarz sein (Abbildung 3C). Wenn das Pellet grau war, entsorgen Sie das Röhrchen und beginnen Sie erneut mit einer neuen Al-Probe.
Während des Freisetzungsprozesses erhalten die NWs eine native Eisenoxidschicht mit einer Dicke von etwa 5 nm, was den früheren Berichten 11,16,20 ähnelt. Diese Oxidschicht leistet einen wichtigen Beitrag zur Biokompatibilität 16, Funktionalisierung16,18 und magnetischen Eigenschaften20 der NWs. Wenn Sie jedoch die NWs in ihrer Vorlage belassen (d. h. sie nicht freigeben), bis sie benötigt werden, werden sie vor Umweltauswirkungen auf sie bewahrt. Der durchschnittliche Durchmesser und die Länge der NWs nach dem Freisetzungsprozess betrugen 2,5 μm bzw. 41,5 nm. Die Masse eines einzelnen NW kann, wie in Tabelle 1 erläutert, berechnet und durch induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektroskopie (ICP-MS) bestätigt werden. Hier enthielt jede Aluminiumoxidscheibe etwa 0,3 mg Eisen.
Um die Aggregation der NWs nach der Freisetzung zu reduzieren und eine weitere Funktionalisierung zu ermöglichen, wurden die NWs mit APTES beschichtet. Diese Beschichtung liefert freie Amingruppen und hat die Fähigkeit, sowohl magnetische als auch nichtmagnetische Materialien39,45 zu beschichten, wodurch sie für die Beschichtung von mehrsegmentierten NWs wie Eisen/Gold-NWs geeignet ist. Bei der Beschichtung von Nanodrähten ist es wichtig, sich auf zwei Dinge zu konzentrieren. Berechnen Sie zunächst das benötigte Volumen aus APTES-Molekülen62 basierend auf der Oberfläche und der Masse der NWs. Diese Berechnungen sind in Tabelle 2 dargestellt. Zweitens müssen die Nanodrähte in ständiger Bewegung gehalten werden, um ihre Agglomeration und das Blockieren einiger Teile der NW-Oberflächen durch die APTES-Beschichtung zu verhindern. In diesem Protokoll wurden die Nanodrähte beispielsweise während der APTES-Beschichtung bzw. der Antikörperfunktionalisierung unter dem Ultraschallbad und dem Rotator inkubiert. Jedes APTES-Molekül enthält ein Siliziumatom und eine terminale funktionelle Amingruppe21. Daher können Elektronenenergieverlustspektroskopie-Karten (EELS) verwendet werden, um das Vorhandensein der APTES-Beschichtung zu bestätigen, indem Siliziumatome (rosa Farbe) auf der NW-Oberfläche angezeigt werden (Abbildung 4A). Im Gegensatz dazu zeigen die unbeschichteten NWs die Eisenatome in Rindenblau (Abbildung 4B) und die Eisen/Sauerstoff-Mischungsatome in Hellblau (Abbildung 4B). Die entsprechende EELS-Kartierung von unbeschichteten NWs (Abbildung 4C,4D) zeigt eine höhere Intensität von Eisen gegenüber Sauerstoff im Zentrum (Abbildung 4C) als auf der Oberfläche (Abbildung 4D), was auf eine Eisen-Eisenoxid-Struktur (Kern-Schale) hindeutet. Die EELS-Kartierung (Abbildung 4C,4D) ergab, dass die Eisenoxidschicht auf den NWsFe3O4mehr alsFe2O3beträgt, was einer früheren Veröffentlichung20 ähnelt.
Die Antigenität der gebundenen Antikörper kann mit den IP- und WB-Assays bestätigt werden, wobei eine Bande auf der positiven Probe, aber nicht auf den Negativkontrollen beobachtet werden kann (Abbildung 5). Beachten Sie, dass Sie nicht weniger als 0,1 mg NWs/10 x 106 Zellen verwenden sollten, um eine klare Bande zu beobachten. Der BCA-Assay (Table of Materials) wurde in Kombination mit einigen in Tabelle 3 dargestellten Berechnungen verwendet, um die Anzahl der Antikörper auf dem NW zu quantifizieren.
Des Weiteren wurde die Zeta-Potential-Messung zur Aufklärung der Oberflächenfunktionalisierung eingesetzt. Die terminale Amingruppe auf APTES reduzierte die negative Ladung der unbeschichteten NWs, wie in Abbildung 6 dargestellt. Die Antikörper-funktionalisierten NWs veränderten auch die Ladung im Vergleich zu den APTES-beschichteten NWs (Abbildung 6). Alle Zetapotentialmessungen wurden bei pH 7 durchgeführt.
Das spezifische Zell-Targeting der Antikörper-funktionalisierten NWs kann mittels konfokaler Mikroskopie bestätigt werden (Abbildung 7). Die Biokompatibilität jedes neuen Nanomaterials sollte vor Beginn einer Anwendung getestet werden. Daher wurde der Zellviabilitätsassay verwendet, der bestätigte, dass die unbeschichteten, APTES- und Antikörper-beschichteten NWs auch bei einer hohen Konzentration biokompatibel waren (Abbildung 8).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Beschichtungs- und Biofunktionalisierungsmethode der Nanodrähte. (A) Beschichtung von Eisen NWs mit APTES. (B) Aktivierung der Antikörper unter Verwendung von EDC + Sulfo-NHS, um am Ende (C) einen Antikörper funktionalisierten Nanodraht zu haben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Mit Eisen abgeschiedene Aluminiumscheibe. (A) Die Aluminiumscheibe vor dem Schneiden. (B) Die roten Linien zeigten, wo die Scheibe geschnitten werden musste. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Schritte zur Freisetzung von Nanodrähten. (A) Cluster von Nanodrähten schwimmen in NaOH-Lösung. Das Bild wurde 10 Minuten nach Zugabe der NaOH und nach Entfernung der Al-Membran aufgenommen. (B) Nanodrähte, die in Ethanol suspendiert sind. Das Foto wurde im letzten Freigabeschritt, unmittelbar nach dem Beschallungsschritt, aufgenommen. (C) Schwarzes Nanodraht-Pellet, das von einem Magneten gesammelt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Karte der Elektronenenergieverlustspektroskopie (EELS). (A) APTES-beschichteter Nanodraht (APTES-NW). Die blauen und rosa Farben stehen für Eisen- bzw. Siliziumatome. (B) Unbeschichteter Nanodraht (NW). Die Farben Rindenblau und Hellblau stellen die Eisen- bzw. Eisen-Sauerstoff-Mischungszuordnung dar. Die entsprechende EELS-Kartierung von (C) dem Kern und (D) der Hülle der unbeschichteten NWs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Bestätigung der Funktionalisierung und Aktivität von Antikörper-konjugierten Nanodrähten. Die Antigenität von CD44-NWs wurde mittels Immunpräzipitation (IP) und Western Blot (WB) bestätigt. +Ve: stellt die Positivkontrolle (Vollzelllysat) dar. -Ve: stellt die Negativkontrolle dar (nur unbeschichteter NW). – CD44-Zellen: stellen Zellen dar, die kein CD44-Antigen exprimieren; + CD44-Zellen: repräsentieren Darmkrebszellen, die das CD44-Antigen exprimieren. Dies ist ein repräsentativer Blot von n = 3 unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Zetapotentialwerte für NWs, APTES-NWs und Antikörper. Die Balken stellen den Mittelwert ± Standardfehlers dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Konfokalmikroskopische Aufnahmen zeigen das spezifische Targeting. CD44-NWs sind anhaftend (A und C) dargestellt, während die Isotyp-NWs (Negativkontrolle ) nicht andockten (B und D). Die Farben Rot, Blau und Grün stehen für die Zellmembran, den Zellkern bzw. den Cluster von CD44-NWs. A und B sind die Hellfeldbilder von C bzw. D. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Zelllebensfähigkeitsstudie von Dickdarmkrebszellen (HCT116), die mit verschiedenen Formulierungen von Nanodrähten inkubiert wurden. Die Zellen wurden nach 24 Stunden Inkubation mit NWs behandelt und dann 24 Stunden lang mit den NWs inkubiert. Alle Experimente wurden in einem Inkubator bei 37 °C durchgeführt. Die Balken stellen den Mittelwert ± Standardfehlers dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Parameter | Wert | Einheit | ||
| Länge von Fe NW (h) | 2.6 | μm | ||
| Radius (Durchmesser/2) (r) | 0.01679231 | μm | ||
| Fe-Dichte (D) | 7.87 | g/cm3 | ||
| 1 Fe NW Lautstärke (V)= π r^2h | 2.30E-15 | 3 cm | ||
| 1 Fe NW Masse = V x D | 1.80E-08 | μg | ||
| 1 Fe NW Oberfläche = 2π r^2 + 2πrh | 2.76E-01 | μm2 | 2.8E+05 | NM2 |
Tabelle 1: Berechnung der Eisen-NW-Masse.
| Parameter | Wert | Einheit |
| Dichte von APTES/100 μl* | 9.50E-01 | g |
| Molekülgewicht (MW) von APTES | 2.21E+02 | g/mol |
| Anzahl der APTES-Mol = Masse/MW | 4.29E-03 | Mol |
| Anzahl der APTES-Moleküle/100 μl** | 2.57E+21 | moleküle |
| APTES-Größe *** | 5.00E-01 | Nm |
| APTES-Oberfläche | 2.00E-01 | NM2 |
| NW-Fläche**** | 2.76E+05 | NM2 |
| Anzahl der NWs in 0,3 mg NW **** | 1.70E+10 | Nws |
| Anzahl der APTES-Moleküle, die benötigt werden, um eine Schicht um den NW herum zu erzeugen | 1,38E+06 | APTES-Molekül |
| Anzahl der APTES-Moleküle, die für 0,3 mg NWs benötigt werden | 2.35E+16 | APTES-Molekül |
| *Referenznummer 61 | ||
| ** Anzahl der Moleküle = Anzahl der mol*avogadro-Zahl (6E+23) | ||
| Referenznummer 62 | ||
| Aus Tabelle 1 | ||
Tabelle 2: Berechnung der Anzahl der APTES-Moleküle, die für die NW-Beschichtung erforderlich sind.
| Y-förmiger IgG-Antikörper | NW | |
| Masse für einen Antikörper | 2,3E-13 μg | 1,8E-08 μg* |
| Oberfläche für einen Antikörper | 23 nm2 | 2,6E+05 nm2 |
| Basierend auf BCA-Assay | 0,3 mg pro 1 mg | |
| Die Anzahl des Antikörpermoleküls und NW in 0,3 mg Antikörper pro mg NW | ~1E+15 Antikörper ** pro ~5,6E+10 NWs | |
| Anzahl der Antikörpermoleküle pro NW | ~2E+04 Antikörper pro 1 NW*** | |
| *Berechnet aus Tabelle 1 | ||
| **Die Anzahl der Antikörper in 0,3 mg wurde berechnet, indem die Antikörperzahl, die wir aus dem BSA-Assay erhielten (0,3 mg), durch das durchschnittliche Molekulargewicht der Y-förmigen IgG-Antikörper (180 kDa = 3E-16 mg) dividiert wurde. | ||
| Basierend auf der Oberfläche eines Moleküls Y-förmiger IgG-Antikörper (~23 nm2) und der Oberfläche eines NW (~2,6E+05 nm2) würden etwa 1E+04 Antikörper ausreichen, um eine Monoschicht auf dem NW zu bilden. In unserem Fall war die Dichte der Antikörper doppelt so hoch wie erwartet. Dies kann mit der APTES-Beschichtung zusammenhängen, die mehr Arme bietet, die eine hohe Bindung der Antikörper ermöglichen. Dieser Fall stellt sicher, dass der NW vollständig mit den Antikörpern bedeckt ist und die Möglichkeit für den Antikörper, an ein Zelloberflächenantigen zu binden, unabhängig von der Ausrichtung der NWs hoch ist. Wenn die Antikörperdichte jedoch niedriger ist als die erwartete Anzahl (1E+04 Antikörpermolekül), dann ist die Bindungschance zwischen der Zelle und den NWs geringer. | ||
Tabelle 3: Berechnung der Anzahl der Antikörper auf dem Nanodraht.
Discussion
Wie bei jeder Herstellungs- und Beschichtungsmethode von Nanomaterialien ist eine hohe Qualität der verwendeten Lösungen erforderlich. Die Release- (1 M NaOH) und Funktionalisierungslösungen (MES) können mehrfach wiederverwendet werden. Es ist jedoch sehr wichtig, den pH-Wert zu überprüfen, bevor ein neuer Prozess beginnt. Im Freisetzungsschritt sollten die NWs mindestens viermal mit NaOH gewaschen werden. Je besser die Wäsche, desto besser ist die Stabilität der NWs und desto weniger sind sie zuschlagkräftig. Die Oxidschicht erhöht die Stabilität der NWs beim Eintauchen in Ethanol oder Wasser63.
Der Durchmesser und die Länge der NWs wurden beeinflusst, nachdem sie mit APTES und Antikörpern beschichtet wurden. Hier nahm der Durchmesser von 41,5 nm auf 70 nm zu und die Länge verringerte sich von 2,5 μm auf 1,6 μm, was auf die Beschallungsschritte zurückzuführen ist, die die NWs brechen. Daher ist es wichtig, die Morphologie der NWs nach dem Biofunktionalisierungsschritt zu charakterisieren.
Die Bindung der Antikörper an die NWs beruht auf der kovalenten Wechselwirkung zwischen der Amingruppe (auf APTES) und der Carboxylgruppe (auf dem Antikörper). Daher ist die Bestätigung des Vorhandenseins der APTES-Beschichtung ein wichtiger Schritt, für den wir die EELS-Kartierung verwendet haben. Die Beschichtungsmethode ist sicher und unkompliziert. Es braucht keine hohen Temperaturen oder lange Inkubationszeiten. Außerdem fungiert die APTES-Beschichtung als Linker, um die kovalente Bindung anderer Antikörper oder Proteine mit einer Carboxylgruppe zu ermöglichen.
Im Falle der Biofunktionalisierung der NWs mit einem Antikörper kann die Antigenität der Bindungsstellen der Antikörper nach dem Biofunktionalisierungsprozess beeinträchtigt werden. Die IP- und WB-Methode kann verwendet werden, um dieses Problem zu untersuchen. Die Verwendung der in diesem Protokoll erwähnten Biofunktionalisierungsmethode ermöglicht es den Antikörpern, an die NWs mit hoher Antigenität an einen spezifischen Zellrezeptor zu binden. Darüber hinaus wurde durch die Biofunktionalisierung der NWs mit Antikörpern die Fähigkeit hinzugefügt, die Zellen mit dem Rezeptor von Interesse, CD44, anzugreifen. Dies wurde durch konfokale Mikroskopie bestätigt. Obwohl die Biokompatibilität der unbeschichteten NWs hoch war (>95%), verbesserte die Zugabe von APTES-Beschichtung oder Antikörpern zu den NWs ihre Biokompatibilität um 100%.
Darüber hinaus ist das Beschichtungs- und Biofunktionalisierungsprotokoll effizient, wirtschaftlich und reproduzierbar. Es sollte auf jedes andere Eisen-Eisenoxid-Nanomaterial anwendbar sein, wobei die Konzentration sowohl der Beschichtung als auch der gebundenen Antikörper auf der Grundlage der Oberfläche und der Masse des Nanomaterials optimiert werden sollte. Dieses Protokoll kann sicher unter Umgebungsbedingungen im allgemeinen Labor durchgeführt werden. Die Biofunktionalisierung hat die Biokompatibilität der Nanomaterialien und ihre Targeting-Fähigkeit deutlich verbessert. Im Allgemeinen sind die NWs äußerst vielversprechende Materialien für nanomedizinische Anwendungen (einschließlich multimodaler oder kombinatorischer Behandlungen, Zelldetektion oder -führung und biologischer Sensorik). In Kombination mit der hier beschriebenen Biofunktionalisierung kann ein spezifisches Zell-Targeting erreicht werden, um die Präzision und Wirksamkeit zu erhöhen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die in dieser Veröffentlichung vorgestellten Forschungsarbeiten wurden von der King Abdullah University of Science and Technology (KAUST) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL tube (snap-cap Microcentrifuge) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-402-7 | |
| 2-N-Morpholino EthaneSulfonic acid hydrate 99% (MES) | Thermscientific | AC172590250 | Concentration 0.1 M and pH 4.7 |
| 3-3-Dimethyl-aminopropyl Carbodiimide (EDC) | Thermofisher | PG82079 | |
| 3-AminoPropyl-Tri-Ethoxy-Silane (APTES) | Sigma Aldrich | 919302 | |
| 5 mL glass tube | Fisherscientific | 03-339-22C | |
| 96-well plate ( flat bottom) | Sigma Aldrich | CLS3595 | |
| Anti-CD44 antibody | BD Biosciences | 550990 | Clone 515, concentration 1 mg/mL |
| APTES ((3-Aminopropyl)triethoxysilane), 99% | Sigma Aldrich | 919-30-2 | Concentration 99% |
| BCA assay (Pierce BCA Protein Assay Kit) | Thermofisher | 23225 | |
| Bovine Serum Albumin solution (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Concentration 35% |
| Cell incubator | Thermofisher | 50116047 | |
| Cell viability reagent | AlamarBlue,Thermofisher | DAL1025 | |
| Colon cancer cells - HCT116 cell line | ATCC | 430641 | |
| Hardwood Hammer | Any hammer tool can be used, there is no specific brand. | ||
| Inductively coupled plasma Mass Spectrometer (ICP-MS) | Perkin Elmer | ELAN 9000 ICP-MS | The used software is "Elan instrument control session" |
| Laboratory Retort Stand with Clamp | RVFM | 13-0140 | This is used to handle the 5 mL glass tube in the sonicator bath. |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Thermofisher | 12321D | |
| McCoy’s 5A Medium 1x | Gibco | 16600082 | |
| Microplate reader (Bio-Rad xMark Absorbance Spectrophotometer) | Bio-Rad | 1681150 | Microplate Manager 6 software (#168-9520) |
| Phosphate buffered saline (PBS) 10x | Gibco | 14200067 | Concentration 0.1 M (No calcuim, no magnesium) |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 14190136 | Concentration 0.01 M (No calcuim, no magnesium) |
| Plate shaker (Microplate Genie) | Scientific Industries (Genie) | SI-0400 | |
| Single Edge Razor blades | Polysciences | 08410-1 | |
| Sodum hydrixide (NaOH) | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | Concentration 1 M, pH 13 |
| Sulfo-N-HydroxySulfosuccinimide (sulfo-NHS) | Thermofisher | 106627-54-7 | |
| Trypsin | ATCC | 30-2101 | |
| Tube rotator | VWR | 10136-084 | |
| Tube shaker (Eppendorf Thermomixer R Mixer, 2.0 mL) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-400-204 | |
| Ultrasonic bath (2510) | Branson | 2489502 |
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