Summary
In questo lavoro, forniamo un protocollo per biofunzionalizzare nanomateriali magnetici con anticorpi per il targeting cellulare specifico. Ad esempio, utilizziamo nanofili di ferro per colpire le cellule tumorali.
Abstract
I nanomateriali magnetici hanno ricevuto grande attenzione in diverse applicazioni biomediche. La biofunzionalizzazione di questi nanomateriali con agenti mirati specifici è un aspetto cruciale per migliorarne l'efficacia nella diagnostica e nei trattamenti, riducendo al minimo gli effetti collaterali. Il vantaggio dei nanomateriali magnetici rispetto a quelli non magnetici è la loro capacità di rispondere ai campi magnetici senza contatto e su grandi distanze. Questo permette di guidarli o accumularli, mentre possono anche essere monitorati. Recentemente, sono stati sviluppati nanofili magnetici (NW) con caratteristiche uniche per applicazioni biomediche. Il grande momento magnetico di questi NW consente un controllo remoto più efficiente del loro movimento da parte di un campo magnetico. Questo è stato utilizzato con grande successo nel trattamento del cancro, nella somministrazione di farmaci, nel tracciamento cellulare, nella differenziazione delle cellule staminali o nella risonanza magnetica. Inoltre, la fabbricazione NW mediante deposizione elettrochimica assistita da modello fornisce un metodo versatile con uno stretto controllo sulle proprietà NW. In particolare, i NW di ferro e i NW di ossido di ferro-ferro (core-shell) sono adatti per applicazioni biomediche, grazie alla loro elevata magnetizzazione e bassa tossicità.
In questo lavoro, forniamo un metodo per biofunzionalizzare i NW ferro/ossido di ferro con anticorpi specifici diretti contro uno specifico marcatore di superficie cellulare che è sovraespresso in un gran numero di cellule tumorali. Poiché il metodo utilizza le proprietà della superficie dell'ossido di ferro, è applicabile anche alle nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetiche. I NW sono prima rivestiti con 3-amminopropil-tri-etossi-silano (APTES) che funge da linker, a cui gli anticorpi sono attaccati covalentemente. Il rivestimento APTES e la biofunzionalizzazione dell'anticorpo sono dimostrati dalla spettroscopia di perdita di energia elettronica (EELS) e dalle misure del potenziale zeta. Inoltre, l'antigenicità degli anticorpi sui NW viene testata utilizzando l'immunoprecipitazione e il western blot. Il targeting specifico delle NW biofunzionalizzate e la loro biocompatibilità sono studiati mediante microscopia confocale e un saggio di vitalità cellulare.
Introduction
Una proprietà unica dei nanomateriali magnetici è la loro capacità di rispondere ai campi magnetici1, che può essere utilmente utilizzata per attivarli in molti modi, mentre possono anche essere monitorati, ad esempio, mediante risonanza magnetica per immagini (MRI). Quando si applica un campo magnetico alternato ad alta frequenza, possono generare calore, che può indurre ipertermia, fornendo un'opzione terapeutica1. Un altro approccio è il trattamento fototermico, che può essere realizzato con un laser nel vicino infrarosso (NIR) 2,3.
Tra il gran numero di nanomateriali magnetici, l'ossido di ferro ha ricevuto la massima attenzione in applicazioni biologiche come la separazione magnetica, l'ipertermia2,4, la guida cellulare5, la somministrazione di farmaci 6,7,8 e come agente di contrasto nella risonanza magnetica 9,10. Ciò è dovuto alla loro elevata biocompatibilità 11,12, grande magnetizzazione 11,12, capacità di essere rivestiti 9,13,14,15, capacità di trasportare farmaci 2,16, capacità di essere funzionalizzati con farmaci2,16 e/o agenti di targeting12,13,17,18 e capacità di convertire l'energia ottica in calore2. Recentemente, MagForce ha iniziato a condurre studi clinici su pazienti oncologici utilizzando nanoparticelle di ossido di ferro per il trattamento dell'ipertermia19.
Ultimamente, i nanofili magnetici (NW) sono stati sempre più sfruttati per applicazioni biomediche 3,11,16,20,21,22. Hanno proprietà simili alle nanosfere magnetiche, ma offrono una forma anisotropa e un momento magnetico molto grande, che consente un controllo remoto molto efficiente tramite un campo magnetico23,24, compreso l'azionamento a bassa frequenza per indurre effetti magneto-meccanici 25,26,27,28,29. Di conseguenza, i NW sono stati implementati per diverse applicazioni biologiche come l'isolamento degli esosomi30 cell tracking 21, il trattamento del cancro 3,11,16, la somministrazione di farmaci 16,31,32 e come mezzo di contrasto per la risonanza magnetica 33.
I nanomateriali magnetici biofunzionalizzati con capacità specifiche di targeting cellulare hanno un grande potenziale per applicazioni biomediche e nella medicina di precisione34,35. Per attaccare questi agenti di mira, è necessaria una modifica della superficie dei nanomateriali. In genere, hanno bisogno di un rivestimento che fornisca un gruppo funzionale, che faciliti l'adesione degli agenti trattanti. In letteratura, esiste un gran numero di rivestimenti organici e inorganici per nanomateriali magnetici. In base al gruppo funzionale che può essere immobilizzato al nanomateriale, questi rivestimenti possono essere classificati in quattro gruppi principali: molecole basate su gruppi di acidi carbossilici, polimeri, istidina e molecole basate su gruppi silani.
Le molecole basate su gruppi di acidi carbossilici sono uno dei metodi di modifica della superficie. Utilizza l'elevata affinità
tra il gruppo acido carbossilico negativo sul rivestimento e la carica positiva sui nanomateriali magnetici36,37,38. Il processo di legame di un acido carbossilico a una superficie metallica può comportare la generazione di sali di carbossilato metallico o l'adesione del gruppo carbossilico al metallo. Tuttavia, per i NW multisegmentati, come i NW ferro/oro o nichel/oro, che hanno proprietà eccellenti per le bio-applicazioni39,40, questo tipo di rivestimento non può essere applicato facilmente. Richiede due diversi rivestimenti contemporaneamente: gruppi tiolici per modificare i segmenti d'oro e gruppi carbossilici per i segmenti magnetici (ferro o nichel)38. Alcuni esempi di molecole basate su gruppi carbossilici sono l'ematoporfirina, l'acido pimelico, l'acido palmitico e l'acido 3-[(2-amminoetil)ditio] propionico (AEDP)38. Le modifiche superficiali dei nanomateriali magnetici che utilizzano polimeri offrono alcuni vantaggi distinti. A causa del grande peso molecolare dei polimeri, migliora la stabilità del nanomateriale magnetico in una soluzione38. Tuttavia, aumenterà significativamente le dimensioni del nanomateriale38. Il polivinilpirrolidone (PVP), la polietilenimmina (PEI), l'arginina-glicina-acido D aspartico (RGD) e il polietilenglicole (PEG) sono alcuni esempi dei polimeri più comunemente usati per le modifiche superficiali. Ognuno ha le sue caratteristiche e ne utilizza38. Il terzo metodo di modifica della superficie consiste nell'utilizzare un rivestimento di istidina. L'istidina è una proteina con una catena laterale di aminoacidi istidina che ha un'elevata affinità con un numero limitato di nanomateriali magnetici come il nichel38. Può essere impiegato per processi di purificazione delle proteine 38,41,42. Un rivestimento di istidina può essere applicato anche a NW multisegmentati, come i NW nichel/oro38. La silanizzazione della superficie di un nanomateriale è un processo ben consolidato 38,43,44. Si basa su un atomo di silicio legato a qualsiasi superficie di ossido di metallo attraverso tre legami singoli, e allo stesso tempo questo atomo di silicio si lega al gruppo funzionale all'estremità attraverso una catena alchilica 38,43,44. Il vantaggio di questo rivestimento è quello di fornire gruppi amminici liberi e ha la capacità di rivestire materiali magnetici e non magnetici38,45, come nichel e oro, rispettivamente. Pertanto, l'utilizzo di molecole basate sul gruppo salino è una via pratica per biofunzionalizzare NW multisegmentati. Alcuni esempi di molecole basate su gruppi silani sono il (3-amminopropil) trietossisilano (APTES) e il (3-amminopropil) trimetossisilano (APTMS)38,45.
L'aggiunta di un agente mirato al rivestimento può svolgere un ruolo significativo sia nella diagnosi che nel trattamento delle cellule malate e, allo stesso tempo, ridurre al minimo gli effetti collaterali sui tessuti sani46,47. L'aggiunta di un agente mirato sulla superficie dei nanomateriali migliora sia il legame selettivo cellulare che l'internalizzazione attraverso i recettori dell'endocitosi7. Senza questi ligandi mirati, i nanomateriali interagiscono in modo non specifico con le membrane cellulari, che si legano a una velocità inferiore rispetto ai nanomateriali con i ligandi48. Una delle sfide del targeting dei tessuti tumorali è la loro caratteristica somiglianza con i tessuti sani. Pertanto, il successo del targeting dipende principalmente dalla determinazione del ligando appropriato da utilizzare come bersaglio biologico49,50. Vari agenti mirati sono stati impiegati per dirigere i nanomateriali alle cellule tumorali48,51 (ad esempio, CD44, a causa della sua elevata espressione nelle cellule tumorali rispetto alle cellule sane52,53,54,55).
Gli agenti di targeting possono essere classificati in tre gruppi principali, in base ai componenti di cui sono fatti e alla loro complessità: targeting basato su aptameri, targeting basato su ligando e targeting basato su anticorpi. Gli aptameri sono brevi filamenti sintetizzati chimicamente di DNA o RNA-oligonucleotidi che sono ripiegati in strutture bidimensionali e tridimensionali, rendendoli in grado di colpire un antigene specifico, il più delle volte proteine56. Il targeting basato sul ligando include peptidi e catene di amminoacidi corte57. Il targeting basato sugli anticorpi prevede l'uso di un anticorpo intero o di frammenti di anticorpi, come i frammenti variabili a catena singola o i frammenti leganti l'antigene51. L'utilizzo di questo metodo ha il vantaggio di possedere due siti di legame con un'elevata affinità di legame con il suo specifico antigene bersaglio, che gli conferisce una selettività estremamente elevata58. I siti di legame sono analoghi a una serratura e l'antigene a una chiave58.
In questo lavoro, i NW utilizzati sono stati fabbricati per elettrodeposizione su membrane di ossido di alluminio, un metodo descritto in dettaglio in una precedente pubblicazione59. L'obiettivo qui è quello di rilasciare questi NW di ossido di ferro ferro-ferro (core-shell) dalle membrane e biofunzionalizzarli con anticorpi specifici per fornire una capacità di targeting. Gli anticorpi non possono legarsi direttamente ai NW ferro-ossido di ferro e richiedono un linker. Il rivestimento dei NW con APTES fornisce gruppi amminici liberi, consentendo l'adesione covalente tramite il gruppo carbossilico sugli anticorpi (Figura 1). Il vantaggio del rivestimento APTES è la sua capacità di lavorare sia per materiali magnetici21 che non magnetici60 , come ferro/oro o nichel/oro NW45. Tutte le fasi di rivestimento e biofunzionalizzazione spiegate in questo protocollo possono essere utilizzate con qualsiasi nanomateriale di ferro/ossido di ferro, in generale. I NW ferro/ossido di ferro sono stati usati qui come esempio. I risultati mostrano che i NW funzionalizzati con anticorpi hanno un'elevata antigenicità nei confronti di specifici recettori di superficie cellulare, che possono essere utilizzati per diverse applicazioni. Ne sono un esempio la separazione cellulare, la somministrazione di farmaci, il trattamento specifico delle cellule tumorali mediante trattamenti fototermici e/o magnetomeccanici.
Protocol
ATTENZIONE: Consultare sempre tutte le schede di sicurezza dei materiali (MSDS) pertinenti prima dell'uso. Utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate e i dispositivi di protezione individuale (occhiali di sicurezza, guanti, camice da laboratorio, pantaloni lunghi, scarpe chiuse). Eseguire tutte le reazioni biologiche nella cappa biologica.
NOTA: Questo protocollo ha lo scopo di produrre 2 x 10 10 NW biofunzionalizzati/mL equivalenti a 0,36 mg di ferro/mL rivestiti con anticorpi anti-CD44 con una densità di 3 x10 4 anticorpi/NW. I NW di ossido di ferro-ferro (nucleo-guscio) sono lunghi 2,5 μm e hanno un diametro di 41,5 nm.
1. Rilascio di nanofili di ferro
NOTA: Il processo di fabbricazione dei NW ferro/ossido di ferro è stato spiegato in dettaglio in una precedente pubblicazione59.
- Su un tappetino da taglio, tagliare i dischi di alluminio (Al) (Figura 2A) in piccoli pezzi (Figura 2B) utilizzando una lama a filo singolo e un piccolo martello per inserirli in una provetta da 2 ml. Usa una pinzetta per trasferire i piccoli pezzi di alluminio sul tubo.
- Riempire la provetta da 2 mL, contenente i piccoli pezzi di Al, con 1 mL di idrossido di sodio (NaOH) 1 M. Assicurati che tutti i pezzi di alluminio siano ricoperti con NaOH.
- Lasciare agire la soluzione per 30 minuti a temperatura ambiente all'interno di una cappa chimica.
- Rimuovere solo i pezzi di alluminio utilizzando la pinzetta e mantenere i NW rilasciati (cluster neri, Figura 3A) nella soluzione di NaOH per altri 30 minuti. Non modificare la soluzione di NaOH.
- Raccogliere i NW inserendo la provetta da 2 mL in un rack magnetico e attendere 2 minuti prima di rimuovere la vecchia soluzione di NaOH da 1 M. Sostituiscilo con una soluzione fresca di NaOH.
- Sonicare la provetta da 2 mL contenente i NW per 30 s e lasciarla per 1 h all'interno di una cappa chimica.
- Ripetere i passaggi 1.5-1.6 almeno quattro volte.
- Lavare i NW inserendo la provetta da 2 mL nel rack magnetico e attendere 2 min.
- Scartare la soluzione di NaOH e sostituirla con 1 mL di etanolo assoluto.
- Sonicare il tubo per 30 s.
- Posizionare la provetta da 2 mL nel rack magnetico e attendere 2 minuti.
- Scartare la vecchia soluzione di etanolo assoluto e sostituirla con 1 mL di etanolo assoluto fresco e sonicare per 30 s.
- Ripetere i passaggi 1.11 e 1.12 per almeno quattro volte.
- Conservare i NW in 1 mL di etanolo assoluto a temperatura ambiente fino a quando non sono necessari.
- Misurare la concentrazione di ferro e quindi i NW utilizzando la spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente (ICP-MS).
NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Tuttavia, per l'archiviazione prolungata, non rilasciare i NW dal modello Al fino a quando non è necessario. Mantenere i NW rilasciati che precipitano nell'etanolo per lungo tempo senza sonicazione frequente creerà aggregazioni che richiederanno tempi di sonicazione più lunghi per essere separate.
2. Rivestimento dei nanofili con APTES
NOTA: In questo protocollo, 100 μL di soluzione APTES (densità di 0,946 g/mL61) sono sufficienti per rivestire 1,6 x 107 m2/g di NW. Se si verifica un cambiamento nel rapporto o nella massa del nanomateriale, il volume APTES deve essere regolato di conseguenza.
- Trasferire i NW dal passaggio 1.14 a una provetta di vetro da 5 mL utilizzando una pipetta da 1 mL.
- Per raccogliere eventuali NW rimasti nella provetta da 2 mL, lavare due volte la provetta vuota da 2 mL aggiungendo 1 mL di etanolo assoluto e trasferirla nella provetta di vetro da 5 mL utilizzando una pipetta da 1 mL.
- Utilizzando la pipetta, prelevare 100 μL di APTES e aggiungerlo direttamente alla soluzione NW.
- Agitare la provetta di vetro da 5 mL per 10 s.
- Regolare la provetta di vetro da 5 mL sul clamp di un supporto per storta da laboratorio.
- Posizionare metà della provetta di vetro da 5 ml all'interno dell'acqua del bagno ad ultrasuoni e sonicare per 1 ora.
- Estrarre la provetta di vetro da 5 mL dal bagno a ultrasuoni e aggiungere 400 μL di acqua deionizzata (DI) seguita da 20 μL di NaOH 1 M (catalisi basica).
ATTENZIONE: È importante aggiungere prima l'acqua deionizzata. - Regolare la provetta di vetro da 5 ml, come spiegato nei passaggi 2.5-2.6, e sonicare per un'altra 1 ora.
- Estrarre la provetta di vetro da 5 mL dal bagno ad ultrasuoni.
- Posiziona un magnete accanto al tubo di vetro per 5 minuti per raccogliere i NW.
- Sostituire il surnatante con 1 mL di etanolo assoluto fresco e sonicare per 10 s.
- Ripetere i passaggi 2.10-2.11 quattro volte.
- Trasferire tutto l'etanolo in sospensione NW in una nuova provetta di vetro da 5 mL utilizzando una pipetta da 1 mL.
NOTA: I NW rivestiti in APTES possono essere conservati in un tubo di vetro con etanolo fino a quando non sono necessari. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
3. Biofunzionalizzazione dei nanofili
- Attivazione degli anticorpi
NOTA: Per ottenere circa 3 x 104 parti di anticorpo/NW, utilizzare 30 μL di anticorpo (1 mg/mL) per 0,1 mg di ferro.- In una provetta da 2 mL, sciogliere 0,4 mg di 3-3-dimetil-amminopropil carbodiimmide (EDC) e 1,1 mg di sulfo-N-idrossisolfosuccinimide (Sulfo-NHS) in 1 mL di acido 2-N-morfolino etanesolfonico idrato (MES) (pH 4,7).
NOTA: La miscela EDC/sulfo-NHS deve essere fresca e preparata prima dell'uso. - In una nuova provetta da 2 mL, aggiungere rispettivamente 30 μL di anticorpo anti-CD44 (1 mg/mL), 960 μL di soluzione salina tamponata con fosfato 0,1 M (PBS, pH 7) e 10 μL di miscela EDC/sulfo-NHS (preparata nella fase 3.1.1).
- Mettere la provetta da 2 mL in uno scuotitubo a 10 x g per 15 minuti a temperatura ambiente.
- In una provetta da 2 mL, sciogliere 0,4 mg di 3-3-dimetil-amminopropil carbodiimmide (EDC) e 1,1 mg di sulfo-N-idrossisolfosuccinimide (Sulfo-NHS) in 1 mL di acido 2-N-morfolino etanesolfonico idrato (MES) (pH 4,7).
- Preparazione dei nanofili rivestiti di APTES
- Durante l'incubazione di 15 minuti nella fase 3.1.3, lavare le NW posizionando un magnete accanto al tubo delle NW rivestite in APTES (dalla fase 2.13) per 2 minuti per raccogliere le NW.
- Scartare l'etanolo e sostituirlo con 1 mL di PBS 0,1 M (pH 7), quindi sonicare per 10 s.
- Ripetere i passaggi 3.2.1-3.2.2 quattro volte.
- Raccogliere i NW, come spiegato al punto 3.2.1, e scartare il PBS da 0,1 M. Tenere i NW nel tubo senza alcuna soluzione.
- Attacco degli anticorpi
- Trasferire tutta la soluzione di anticorpi attivati (preparata al punto 3.1.3) nella provetta NWs (preparata al punto 3.2.4) e sonicare per 10 s.
- Posizionare il tubo di vetro nel rotatore per una notte a 4 °C.
- Raccogliere i NW usando un magnete come al punto 3.2.1 e scartare il surnatante.
- Aggiungere 1 mL di soluzione di albumina sierica bovina (BSA) al 2% per 1 ora a 4 °C per bloccare la reazione.
- Verificare l'antigenicità dei NW funzionalizzati con anticorpi, ad esempio, utilizzando saggi di immunoprecipitazione (IP) e western blot (WB).
NOTA: Per ottenere risultati migliori, utilizzare i NW biofunzionalizzati nell'IP, nel WB o nel test di biocompatibilità immediatamente dopo la fase di blocco.
4. Saggio di biocompatibilità
NOTA: Per studiare la biocompatibilità dei NW, possono essere impiegati vari saggi di vitalità cellulare e diverse linee cellulari. La concentrazione dei NW qui utilizzata si basa su una precedente pubblicazione16. La semina cellulare deve essere effettuata un giorno prima della biofunzionalizzazione del NW.
ATTENZIONE: Tutti i passaggi seguenti devono essere eseguiti sotto l'armadio di biosicurezza.
- In una piastra da 96 pozzetti, seminare nove pozzetti con 4 x 104 di cellule tumorali del colon (linea cellulare HCT116) sospese nel terreno di coltura cellulare di McCoy (100 μL/pozzetto) e posizionarlo all'interno dell'incubatore per una notte a 37 °C e al 5% di anidride carbonica (CO2 ).
- Lavare i NW (dal punto 3.3.4) con PBS raccogliendoli con un magnete come al punto 3.2.1 e sostituire la vecchia soluzione con 1 mL di PBS 0,01 M (pH 7). Ripeti questo passaggio tre volte.
- Lavare i NW (dal punto 4.2) con il terreno McCoy's riscaldato raccogliendoli utilizzando un magnete come nel passaggio 3.2.1 e sostituire il vecchio PBS con 1 mL di terreno McCoy's riscaldato. Ripeti questo passaggio tre volte.
- Raccogliere i NW (dal punto 4.3) utilizzando un magnete come nel punto 3.2.1 e sostituire 1 mL di terreno di McCoy riscaldato con 900 μL di terreno di McCoy riscaldato. La concentrazione di NW deve essere di 0,02 mg di NWs per mL.
- Portare la piastra a 96 pozzetti (dal punto 4.1) dall'incubatore alla cabina di biosicurezza.
- Sotto la cabina di biosicurezza, scartare il vecchio terreno dalle cellule e sostituirlo con 100 μL di NW sospesi (preparati al punto 4.4).
- Agitare manualmente la piastra (preparata al punto 4.6) e poi incubarla per 24 ore all'interno dell'incubatrice a 37 °C e 5% di CO2 .
- Il giorno successivo, estrarre la piastra a 96 pozzetti (preparata al punto 4.7) dall'incubatrice. Sotto la cabina di biosicurezza, aggiungere 11 μL del reagente di vitalità cellulare (tabella dei materiali) a ciascun pozzetto utilizzando la pipetta a parete multipla.
- Agitare la piastra con lo shaker per piastre a una velocità di 10 x g per 10 s.
- Incubare la piastra per 1 ora nell'incubatrice.
- Estrarre la piastra a 96 pozzetti (preparata al punto 4.10) dall'incubatrice. Leggere la piastra nel lettore per micropiastre (Tabella dei materiali) misurando l'assorbanza del reagente di vitalità cellulare (eccitazione 540 nm, emissione 590 nm).
Representative Results
È importante tagliare i dischi in alluminio (Al) (Figura 2A) in piccoli pezzi (Figura 2B) per adattarli al tubo utilizzato. Dopo aver aggiunto 1 M di NaOH ai pezzi di Al, dovrebbe iniziare immediatamente una reazione, che si osserva con la creazione di bolle. Se non si verifica alcuna reazione entro 1 minuto o se la reazione è molto veloce e la soluzione diventa completamente torbida con una nuvola bianca, rimuovere immediatamente la vecchia soluzione di NaOH e sostituirla con una soluzione nuova. Controllare il valore del pH della soluzione di NaOH. Dovrebbe essere pH>12. Quando i NW vengono rilasciati dai pezzi di Al nei primi 30 minuti con NaOH, i NW (cluster neri, Figura 3A) fluttueranno all'interno della soluzione di NaOH. Nell'ultima fase di rilascio dei NW, la soluzione dovrebbe essere omogenea. Non dovrebbe essere presente alcun cluster di NW (Figura 3B). Se i NW sono stati raccolti con un magnete per 3 minuti, la soluzione dovrebbe essere limpida e il pellet NW dovrebbe essere nero (Figura 3C). Se il pellet era grigio, scartare la provetta e ricominciare con un nuovo campione di Al.
Durante il processo di rilascio, i NW ottengono uno strato nativo di ossido di ferro con uno spessore di circa 5 nm, che è simile ai precedenti rapporti11,16,20. Questo strato di ossido ha un importante contributo alla biocompatibilità 16, alla funzionalizzazione16,18 e alle proprietà magnetiche20 dei NW. Tuttavia, mantenere i NW nel loro modello (cioè non rilasciarli) fino a quando non sarà necessario impedirà loro di avere effetti ambientali su di essi. Il diametro medio e la lunghezza dei NW dopo il processo di rilascio erano rispettivamente di 2,5 μm e 41,5 nm. La massa di un singolo NW può essere calcolata come spiegato nella Tabella 1 ed è confermata dalla spettroscopia di massa al plasma accoppiato induttivamente (ICP-MS). Qui, ogni disco di allumina conteneva circa 0,3 mg di ferro.
Per ridurre l'aggregazione dei NW dopo il rilascio e consentire un'ulteriore funzionalizzazione, i NW sono stati rivestiti con APTES. Questo rivestimento fornisce gruppi amminici liberi e ha la capacità di rivestire materiali magnetici e non magnetici39,45, il che lo rende adatto per il rivestimento di NW multisegmentati come NW ferro/oro. Durante il rivestimento dei nanofili, è importante concentrarsi su due cose. Innanzitutto, calcola il volume necessario dalle molecoleAPTES 62 in base all'area superficiale e alla massa dei NW. Questi calcoli sono stati presentati nella tabella 2. In secondo luogo, mantenere i nanofili in un movimento continuo per evitare che si agglomerino e che alcune parti delle superfici NW si blocchino dal rivestimento APTES. Ad esempio, in questo protocollo, i nanofili sono stati incubati sotto il bagno ultrasonico e il rotatore durante il rivestimento APTES e la funzionalizzazione dell'anticorpo, rispettivamente. Ogni molecola di APTES contiene un atomo di silicio e un gruppo amminico funzionaleterminale 21. Pertanto, le mappe di spettroscopia di perdita di energia elettronica (EELS) possono essere utilizzate per confermare la presenza del rivestimento APTES mostrando atomi di silicio (colore rosa) sulla superficie NW (Figura 4A). Al contrario, i NW non rivestiti mostrano gli atomi di ferro in blu corteccia (Figura 4B) e gli atomi di miscela ferro/ossigeno in azzurro (Figura 4B). La corrispondente mappatura EELS dei NW non rivestiti (Figura 4C,4D) mostra una maggiore intensità di ferro rispetto all'ossigeno al centro (Figura 4C) rispetto alla superficie (Figura 4D), indicando una struttura di ossido di ferro ferro-ferro (nucleo-guscio). La mappatura EELS (Figura 4 C,4D) ha identificato che lo strato di ossido di ferro sui NW è Fe 3 O4 più di Fe2O3, il che è simile a una precedente pubblicazione20.
L'antigenicità degli anticorpi attaccati può essere confermata utilizzando i saggi IP e WB, in cui è possibile osservare una banda sul campione positivo ma non sui controlli negativi (Figura 5). Si noti che per osservare una banda chiara, non utilizzare meno di 0,1 mg di NWs/10 x 106 cellule. Il test BCA (Table of Materials) in combinazione con alcuni calcoli presentati nella Tabella 3 è stato utilizzato per quantificare il numero di anticorpi sul NW.
Inoltre, la misura del potenziale zeta è stata utilizzata per chiarire la funzionalizzazione della superficie. Il gruppo amminico terminale su APTES ha ridotto la carica negativa dei NW non rivestiti, come mostrato nella Figura 6. I NW funzionalizzati con anticorpi hanno anche cambiato la carica rispetto ai NW rivestiti con APTES (Figura 6). Tutte le misurazioni del potenziale zeta sono state effettuate a pH 7.
Il targeting cellulare specifico delle NW funzionalizzate con anticorpi può essere confermato utilizzando la microscopia confocale (Figura 7). La biocompatibilità di qualsiasi nuovo nanomateriale dovrebbe essere testata prima di iniziare qualsiasi applicazione. Pertanto, è stato utilizzato il test di vitalità cellulare che ha confermato che i NW non rivestiti, rivestiti con APTES e rivestiti con anticorpi erano biocompatibili anche con un'alta concentrazione (Figura 8).
Figura 1: Lo schema rappresenta il metodo di rivestimento e biofunzionalizzazione dei nanofili. (A) Rivestimento di ferro NW con APTES. (B) Attivazione degli anticorpi mediante EDC + Sulfo-NHS, per avere all'estremità (C) un nanofilo funzionalizzato anticorpale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Disco in alluminio depositato in ferro. (A) Il disco di alluminio prima del taglio. (B) Le linee rosse indicavano dove tagliare il disco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Fasi di rilascio dei nanofili. (A) Gruppi di nanofili galleggiano in una soluzione di NaOH. L'immagine è stata scattata 10 minuti dopo l'aggiunta di NaOH e dopo aver rimosso la membrana di Al. (B) Nanofili sospesi in etanolo. La foto è stata scattata nell'ultima fase di rilascio, subito dopo la fase di sonicazione. (C) Pellet di nanofili neri raccolti da un magnete. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Mappa della spettroscopia di perdita di energia elettronica (EELS). (A) Nanofilo rivestito di APTES (APTES-NW). I colori blu e rosa rappresentano rispettivamente gli atomi di ferro e silicio. (B) Nanofilo non rivestito (NW). I colori blu corteccia e azzurro rappresentano rispettivamente la mappatura della miscela ferro e ferro/ossigeno. La corrispondente mappatura EELS di (C) il nucleo e (D) il guscio dei NW non rivestiti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Conferma della funzionalizzazione e dell'attività di nanofili coniugati con anticorpi. L'antigenicità dei CD44-NW è stata confermata utilizzando l'immunoprecipitazione (IP) e il western blot (WB). +Ve: rappresenta il controllo positivo (lisato a cellula intera). -Ve: rappresenta il controllo negativo (solo NW non rivestito). – Cellule CD44: rappresentano le cellule che non esprimono l'antigene CD44; + Cellule CD44: rappresenta le cellule tumorali del colon che esprimono l'antigene CD44. Questa è una macchia rappresentativa di n = 3 esperimenti indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Valori del potenziale Zeta per NWs, APTES-NWs e anticorpi. Le barre rappresentano la media ± errore standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Le immagini microscopiche confocali mostrano il targeting specifico. I CD44-NW sono mostrati attaccati (A e C), mentre gli Isotype-NW (controllo negativo) non si sono attaccati (B e D). I colori rosso, blu e verde rappresentano rispettivamente la membrana cellulare, il nucleo e il gruppo di CD44-NW. A e B sono le immagini in campo chiaro di C e D, rispettivamente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Studio di vitalità cellulare di cellule tumorali del colon (HCT116) incubate con diverse formulazioni di nanofili. Le cellule sono state trattate con NW dopo 24 ore di incubazione e poi incubate per 24 ore con i NW. Tutti gli esperimenti sono stati condotti all'interno di un incubatore a 37 °C. Le barre rappresentano la media ± errore standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Parametro | Valore | Unità | ||
| Lunghezza di Fe NW (h) | 2.6 | μm | ||
| Raggio (diametro/2) (r) | 0.01679231 | μm | ||
| Densità Fe (D) | 7.87 | g/cm3 | ||
| 1 Fe NW volume (V)= π r^2h | 2.30E-15 | cm3 | ||
| 1 Massa Fe NW = V x D | 1.80E-08 | μg | ||
| 1 Fe NW area = 2π r^2 + 2πrh | 2.76E-01 | μm2 | 2.8E+05 | nm2 |
Tabella 1: Calcolo della massa NW del ferro.
| Parametro | Valore | Unità |
| Densità di APTES/100 μL* | 9.50E-01 | g |
| Peso molecolare (MW) di APTES | 2.21E+02 | g/mol |
| Numero di mole APTES = massa/MW | 4.29E-03 | Mol |
| Numero di molecole di APTES/100 μL** | 2.57E+21 | Molecole |
| Dimensione APTES *** | 5.00E-01 | Nm |
| Superficie APTES | 2.00E-01 | nm2 |
| Superficie NW**** | 2.76E+05 | nm2 |
| Numero di NW in 0,3 mg di NW **** | 1.70E+10 | Nws |
| Numero di molecole di APTES necessarie per creare uno strato attorno al NW | 1.38E+06 | Molecola di APTES |
| Numero di molecole di APTES necessarie per 0,3 mg di NW | 2.35E+16 | Molecola di APTES |
| *Numero di riferimento 61 | ||
| ** Numero di molecole = Numero di mol*avogadro numero (6E+23) | ||
| Numero di riferimento 62 | ||
| Dalla Tabella 1 | ||
Tabella 2: Calcolo del numero di molecole di APTES necessarie per il rivestimento dei NW.
| Anticorpo IgG a forma di Y | NW | |
| Massa per un anticorpo | 2.3E-13 μg | 1,8E-08 μg* |
| Area superficiale per un anticorpo | 23 nanometro2 | 2.6E+05 nm2 |
| Sulla base del saggio BCA | 0,3 mg per 1 mg | |
| Il numero della molecola dell'anticorpo e della NW in 0,3 mg di anticorpo per mg di NW | ~1E+15 anticorpi** per ~5.6E+10 NWs | |
| Numero di molecole di anticorpi per NW | ~2E+04 anticorpi per 1 NW*** | |
| *Calcolato dalla tabella 1 | ||
| **Il numero di anticorpi in 0,3 mg è stato calcolato dividendo il numero di anticorpi che abbiamo ricevuto dal test BSA (0,3 mg) per il peso molecolare medio degli anticorpi IgG a forma di Y (180 kDa = 3E-16 mg). | ||
| Sulla base dell'area superficiale di una molecola di anticorpi IgG a forma di Y (~23 nm2) e dell'area superficiale di un NW (~2.6E+05 nm2), circa 1E+04 anticorpi sarebbero sufficienti per creare un monostrato sul NW. Nel nostro caso, la densità dell'anticorpo era due volte superiore alla quantità prevista. Ciò può essere correlato al rivestimento APTES che fornisce più bracci che consentono l'elevata adesione degli anticorpi. Questo caso garantisce che il NW sia completamente coperto dagli anticorpi e che l'opportunità per l'anticorpo di legarsi a un antigene di superficie cellulare, indipendentemente dall'orientamento dei NW, sarà elevata. Tuttavia, se la densità dell'anticorpo è inferiore al numero atteso (molecola 1E+04 di anticorpo), la possibilità di legame tra la cellula e i NW sarà inferiore. | ||
Tabella 3: Calcolo del numero di anticorpi sul nanofilo.
Discussion
Come per qualsiasi metodo di fabbricazione e rivestimento di nanomateriali, è richiesta un'elevata qualità delle soluzioni utilizzate. Le soluzioni di rilascio (1 M NaOH) e di funzionalizzazione (MES) possono essere riutilizzate più volte. Tuttavia, controllare il loro valore di pH prima di iniziare un nuovo processo è molto importante. Nella fase di rilascio, il lavaggio dei NW con NaOH deve essere effettuato almeno quattro volte. Migliore è il lavaggio, migliore è la stabilità dei NW e meno sono aggregati. Lo strato di ossido migliora la stabilità dei NW dopo immersione in etanolo o acqua63.
Il diametro e la lunghezza dei NW sono stati influenzati dopo averli rivestiti con APTES e anticorpi. Qui, il diametro è aumentato da 41,5 nm a 70 nm e la lunghezza è diminuita da 2,5 μm a 1,6 μm, a causa delle fasi di sonicazione che rompono i NW. Pertanto, è essenziale caratterizzare la morfologia dei NW dopo la fase di biofunzionalizzazione.
L'attaccamento degli anticorpi ai NW si basa sull'interazione covalente tra il gruppo amminico (su APTES) e il gruppo carbossilico (sull'anticorpo). Pertanto, la conferma della presenza del rivestimento APTES è un passo importante, per il quale abbiamo utilizzato la mappatura EELS. Il metodo di rivestimento è sicuro e semplice. Non necessita di alte temperature o lunghi tempi di incubazione. Inoltre, il rivestimento APTES funziona come un linker per consentire l'attacco covalente di altri anticorpi o proteine che hanno un gruppo carbossilico.
Nel caso di biofunzionalizzazione dei NW con un anticorpo, l'antigenicità dei siti di legame degli anticorpi dopo il processo di biofunzionalizzazione può essere influenzata. Il metodo IP e WB può essere utilizzato per analizzare questo problema. L'utilizzo del metodo di biofunzionalizzazione menzionato in questo protocollo consentirà agli anticorpi di legarsi ai NW con elevata antigenicità a uno specifico recettore cellulare. Inoltre, la biofunzionalizzazione dei NW con anticorpi ha aggiunto la capacità di colpire le cellule con il recettore di interesse, CD44. Ciò è stato confermato dalla microscopia confocale. Sebbene la biocompatibilità dei NW non rivestiti fosse elevata (>95%), l'aggiunta di rivestimenti APTES o anticorpi ai NW ne ha migliorato la biocompatibilità del 100%.
Inoltre, il protocollo di rivestimento e biofunzionalizzazione è efficiente, economico e riproducibile. Dovrebbe essere applicabile a qualsiasi altro nanomateriale di ossido di ferro-ferro, per cui la concentrazione sia del rivestimento che degli anticorpi attaccati dovrebbe essere ottimizzata in base all'area superficiale e alla massa del nanomateriale. Questo protocollo può essere eseguito in modo sicuro in condizioni ambientali nel laboratorio generale. La biofunzionalizzazione ha migliorato significativamente la biocompatibilità dei nanomateriali e la loro capacità di targeting. In generale, i NW sono materiali estremamente promettenti per applicazioni nanomediche (compresi trattamenti multimodali o combinatori, rilevamento o guida cellulare e rilevamento biologico). In combinazione con la biofunzionalizzazione, come descritto qui, è possibile ottenere un targeting cellulare specifico per una maggiore precisione ed efficacia.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dalla King Abdullah University of Science and Technology (KAUST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL tube (snap-cap Microcentrifuge) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-402-7 | |
| 2-N-Morpholino EthaneSulfonic acid hydrate 99% (MES) | Thermscientific | AC172590250 | Concentration 0.1 M and pH 4.7 |
| 3-3-Dimethyl-aminopropyl Carbodiimide (EDC) | Thermofisher | PG82079 | |
| 3-AminoPropyl-Tri-Ethoxy-Silane (APTES) | Sigma Aldrich | 919302 | |
| 5 mL glass tube | Fisherscientific | 03-339-22C | |
| 96-well plate ( flat bottom) | Sigma Aldrich | CLS3595 | |
| Anti-CD44 antibody | BD Biosciences | 550990 | Clone 515, concentration 1 mg/mL |
| APTES ((3-Aminopropyl)triethoxysilane), 99% | Sigma Aldrich | 919-30-2 | Concentration 99% |
| BCA assay (Pierce BCA Protein Assay Kit) | Thermofisher | 23225 | |
| Bovine Serum Albumin solution (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Concentration 35% |
| Cell incubator | Thermofisher | 50116047 | |
| Cell viability reagent | AlamarBlue,Thermofisher | DAL1025 | |
| Colon cancer cells - HCT116 cell line | ATCC | 430641 | |
| Hardwood Hammer | Any hammer tool can be used, there is no specific brand. | ||
| Inductively coupled plasma Mass Spectrometer (ICP-MS) | Perkin Elmer | ELAN 9000 ICP-MS | The used software is "Elan instrument control session" |
| Laboratory Retort Stand with Clamp | RVFM | 13-0140 | This is used to handle the 5 mL glass tube in the sonicator bath. |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Thermofisher | 12321D | |
| McCoy’s 5A Medium 1x | Gibco | 16600082 | |
| Microplate reader (Bio-Rad xMark Absorbance Spectrophotometer) | Bio-Rad | 1681150 | Microplate Manager 6 software (#168-9520) |
| Phosphate buffered saline (PBS) 10x | Gibco | 14200067 | Concentration 0.1 M (No calcuim, no magnesium) |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 14190136 | Concentration 0.01 M (No calcuim, no magnesium) |
| Plate shaker (Microplate Genie) | Scientific Industries (Genie) | SI-0400 | |
| Single Edge Razor blades | Polysciences | 08410-1 | |
| Sodum hydrixide (NaOH) | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | Concentration 1 M, pH 13 |
| Sulfo-N-HydroxySulfosuccinimide (sulfo-NHS) | Thermofisher | 106627-54-7 | |
| Trypsin | ATCC | 30-2101 | |
| Tube rotator | VWR | 10136-084 | |
| Tube shaker (Eppendorf Thermomixer R Mixer, 2.0 mL) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-400-204 | |
| Ultrasonic bath (2510) | Branson | 2489502 |
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