Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Generasjon og kvantitativ karakterisering av funksjonelle og polariserte gallepitelcyster

Published: May 16, 2020 doi: 10.3791/61404
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2
1Physiopathogénèse et traitement des maladies du foie, Université Paris-Saclay, Inserm U1193, 2ESPCI Paris, Université PSL
* These authors contributed equally

Summary

Tredimensjonale (3D) cellulære systemer er relevante modeller for å undersøke organogenese. En hydrogelbasert metode for gallecyster produksjon og deres karakterisering er foreslått. Denne protokollen avdekker barrierene for 3D-karakterisering, med en enkel og pålitelig metode for å vurdere cystedannelseseffektivitet, størrelser og for å teste funksjonaliteten.

Abstract

Cholangiocytes, epitelcellene som stiller opp gallekanalene i leveren, fører tilsyn med galledannelse og modifikasjon. I de siste tjue årene, i sammenheng med leversykdommer, 3-dimensjonale (3D) modeller basert på kolangiocytter har dukket opp som cyster, sfæroider, eller rør-lignende strukturer for å etterligne vev topologi for organogenese, sykdom modellering, og narkotika screening studier. Disse strukturene har hovedsakelig blitt oppnådd ved å bygge inn kolangiocytter i en hydrogel. Hovedformålet var å studere selvorganisering ved å ta opp epitelpolaritet, funksjonelle og morfologiske egenskaper. Imidlertid fokuserer svært få studier på cystedannelseseffektivitet. Når dette er tilfelle, blir effektiviteten ofte kvantifisert fra bilder av et enkelt fly. Funksjonelle analyser og strukturell analyse utføres uten å representere den potensielle heterogeniteten av cystedistribusjon som oppstår fra hydrogelpolymeriserings heterogeniteter og bivirkninger. Derfor kan den kvantitative analysen, når den er gjort, ikke brukes til sammenligning fra en artikkel til en annen. Videre tillater denne metodikken ikke sammenligninger av 3D-vekstpotensial av forskjellige matriser og celletyper. I tillegg er det ingen omtale av eksperimentell feilsøking for immunstaining cyster. I denne artikkelen gir vi en pålitelig og universell metode for å vise at den første cellefordelingen er relatert til heterogen vertikal fordeling av cystedannelse. Kolangiocyttceller innebygd i hydrogel etterfølges med Z-stabler analyse langs hydrogeldybden i løpet av 10 dager. Med denne metoden oppnås en robust kinetikk av cystedannelseseffektivitet og vekst. Vi presenterer også metoder for å evaluere cystepolaritet og sekretorisk funksjon. Til slutt gis flere tips for å optimalisere immunstainingprotokoller for å begrense cystekollaps for bildebehandling. Denne tilnærmingen kan brukes på andre 3D-cellekulturstudier, og dermed åpne mulighetene for å sammenligne ett system med et annet.

Introduction

I løpet av de siste tre tiårene har in vitro-forskningen utviklet seg mot 3D-kultursystemer. En rekke protokoller har dukket opp for å kultere celler i 3D som sfæroider eller aggregater i nærvær eller fravær av et stillas / matrise, i en dråpe, i agitasjon, i mikrofluidiske enheter eller flytende1. Bruken av 3D-kulturmetoder har vist seg å være sine fordeler fremfor 2-dimensjonale (2D) kulturer, spesielt for epitelceller, som ble vist å organisere seg selv i 3D-strukturer, kalt cyster eller acini. I dette tilfellet danner cellene en monolayer som omkranser en lumen, hvor celler får sin fulle epitelfenotype med forbedrede fysiologiske spesifikke funksjoner2.

Tallrike studier har bidratt til utviklingen av metoder for å danne disse epitelorganoider i naturlige matriser. Dette har tillatt å rekapilere in vivo celle-celle og celle-mikromiljø interaksjoner, for å få etablering og stabiliteten av epitelfenotype3,4,5,6,7. Nylig, og spesielt med sikte på å utvikle transplanterbare organoider og dechiffrere kravet til mikromiljøet for å orkestrere epitelprogrammet, har syntetiske hydrogeler blitt utviklet for å forbedre dannelsen av epitel acini8,9,10. Dessverre rapporterer disse studiene om kvalitative data, eller presenterer beregningsmetoder ved hjelp av interne referanser som forholdet mellom cyster over ikke-cyster i et 2D-plan8,9,10. Dette utelukker enhver sammenligning mellom ulike studier når det gjelder effektivitet, stabilitet eller morfologisk og fysiologisk karakterisering av epitelorganoidene.

Mikroinnkapsling av epitelceller i perler ved hjelp av mikrofluidiske enheter har tillatt mer realistiske kvantitative og komparative resultater. Ved hjelp av denne teknologien ble organoider fra ulike celletyper dannet og differensiert basert på morfologien blant forskjellige 3D-cellulærestrukturer 11,12. Denne teknologien er imidlertid ikke lett å jobbe med og krever bruk av rene rom for å produsere mikrofluidiske enheter. Denne teknologien er etablert for noen typer hydrogeler, men krever teknisk tilpasning som skal brukes på andre hydrogeler, noe som begrenser allsidigheten. Derfor er de fleste studier ment å utvikle epitelorganoider avhengig av innebygging av epitelceller i en hydrogelbulk. I disse metodene blir den høye heterogeniteten av gelstrukturering og cellefordeling inne i hele 3D-kulturen ofte neglisjert. Derfor er de fleste analysene knyttet til enkelt 2D-bilder, som bare representerer svært omtrent fordelingen av de ulike cellulære objektene i hele 3D-volumet.

Sykdommer som påvirker gallekanaler, som kolangiokarsinom, galleatresi, primær skleroserende kolangitt, blant annet, er en viktig årsak til dødelighet og sykelighet. Bortsett fra levertransplantasjon, er det ingen effektive behandlinger for disse forholdene13. Innsats for å undersøke gallegangdannelse, sykdomsårsaker og progresjon vil tillate utvikling av nye terapier14.

Galleorganotypiske modeller av cyster, sfæroider eller rørlignende strukturer ved hjelp av normale eller pasientavledede, differensierte eller stamfar-avledede kolangiocyttcellelinjer erutviklet 15,16,17,18,19,20. Ulike studier har rekaitulert kolangiocytt polaritet, uttrykk for kolangiocytt markører, tilstedeværelse av flimmerhår, cholangiocyte sekretorisk og reabsorptiv evne, og lumen dannelse og obstruksjon; alle som representerer viktige egenskaper av kolangiocytt fenotype, morfologi, og funksjon15,17,19. Andre har rapportert vedlikehold av pasientavledede galleorganoider i lange perioder20. Nylig undersøkte vi rollen som biokjemiske og biofysiske signaler på gallecyster organogenese21. Viktigere, patogenesen av galleatrei ble studert i galleveis spheroider og rør7,22. Videre ble viktige trekk ved primær skleroserende kolangitt som kolangiocytt senescence, sekresjon av proinflammatoriske cytokiner, samt makrofagrekruttering vellykket studert ved hjelp av galdesfær15,20. Reproduserbare in vitro 3D kvantitative modeller som fysiologisk modulerer kolangiocyttfenotype, fysiologi og mikromiljø der disse spørsmålene kan tas opp, er fortsatt nødvendig. Videre har bare få publikasjoner rapportert cystedannelse effektivitet21,23. Dette er et viktig poeng å etablere, spesielt når man undersøker organogenese, sykdomsårsak og korrelasjon av legemiddelresponser med kolangiocyttfunksjon og polarisering. I tillegg, med forskjeller i stillas / matrise som brukes fra protokoll til protokoll, er det vanskelig å sammenligne mellom systemer. For å løse disse problemene foreslår vi en kvantitativ, pålitelig og universell metode for å generere gallecyster som etterligner lumendannelse, kolangiocyttpolarisering og kolangiocyttsekretorisk funksjon. Viktigere, vi presenterer en systematisk analyse utført langs Z-aksen over 3D gel når evaluere over tid, cyste formasjon effektivitet, størrelse, levedyktighet, polarisering, og funksjonalitet. Videre brukte vi en naturlig hydrogel og normale rottekolangiocytter (NRC)s, som et eksempel for protokollen, men andre naturlige eller syntetiske hydrogeler, samt epitelceller kan brukes til dannelsen av 3D cystiske strukturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generasjon av cyster

MERK: Denne protokollen kan utføres med alle typer hydrogel, hvis gelasjonen tillater innebygging av celler.

  1. Hydrogel belegg
    MERK: Riktig hydrogelbelegg av kammersklien er et kritisk skritt for å unngå dannelse av 2D-cellelag på bunnen av brønnen, som kan forstyrre etterfølgende cysteavbildning og svekke beregningen av cystedannelseseffektivitet.
    1. For å sikre homogenitet av geloppløsningen, tin hydrogelen ved 4 °C over natten (O/N).
    2. Precool pipette tips på is eller O / N ved -20 ° C og en 8-brønns kammer lysbilde ved -20 ° C O / N.
    3. Plasser hydrogelen og 8-brønns kammersklie på en isbøtte fylt med is.
    4. I et konisk rør på 15 ml tilbereder du en oppløsning som inneholder 40 % hydrogel (V/V) i kaldt NRC komplett medium (se Materialtabell) og plasserer røret på is.
    5. For å belegge et kammersklie, bruk kalde pipettespisser, tilsett 50 μL hydrogelløsning på midten av hver brønn, og spred over hele overflaten ved hjelp av en pipettespiss, mens du holder kammeret lysbildet på is (figur 1A).
      MERK: Spre hydrogelløsningen så jevnt som mulig for å unngå bobler.
    6. For å polymerisere hydrogelen, inkuber kammeret lysbildet i minst 15 min ved 37 °C, 5% CO2.
  2. Celle forberedelse
    1. Varm opp NRC komplett medium, fosfat bufret saltvann (PBS), og trypsin-etylendiamin tetraacetic acid (trypsin-EDTA) i et vannbad forvarmet til 37 °C.
    2. Mens hydrogelen polymeriserer, må du sørge for at NRC-er dyrkes til 70 % samløpet i en T-25 cm2 kollagenbelagt kolbe21. Vask cellene én gang med forvarmet 1x PBS.
    3. Inkuber NRCene med 5 ml forhåndsoppvarmet 1x PBS (for en T-25 cm2 kolbe) i 20 min ved 37 °C, 5 % CO2.
      MERK: Dette trinnet, som forkorter inkubasjonstiden med trypsin-EDTA, er medvirkende til å beholde cellenes selvorganiserende egenskaper.
    4. Kast PBS, tilsett 1 ml trypsin-EDTA, og inkuber i 5-10 min ved 37 °C, 5 % CO2.
    5. Nøytraliser med 4 ml forhåndsoppvarmet komplett NRC-medium. Samle og overfør cellesuspensjonen til et konisk rør på 15 ml, og spinn ved 150 x g i 4 min.
    6. Kast mediet og resuspend cellepellet i 5 ml forvarmet medium.
    7. Bruk en 40 μm cellesil, filtrer celleoppløsningen i et konisk rør på 50 ml og tell cellene.
      MERK: Å sende cellene gjennom en sil er et kritisk skritt for at de kvantitative resultatene skal reproduseres, det vil si å få nesten samme størrelse på celleaggregater som skal bygges inn.
  3. Innebygging av cellefjæring i hydrogeloppløsning
    1. Forbered en oppløsning på 1600 μL med 80 % hydrogel (V/V) i kald komplett NRC-medium (rør 1); holde i is. Fortynn 5 x 105 celler/ml i 1600 μL kald komplett NRC medium (rør 2) og hold i is.
      MERK: Dette trinnet må utføres raskt for å unngå polymerisering av hydrogelen mens du blander den med cellefjæringen og for å opprettholde celle levedyktighet.
    2. For å forberede en cellesåeløsning på 2,5 x 105 celler/ml i 40 % hydrogel (V/V), blanderør 1 og rør 2. Tilsett 400 μL av celleløsningen i hver brønn av det hydrogelbelagte kammersklibildet og unngå bobler (figur 1B).
    3. Hold kammeret i en inkubator ved 37 °C med 5 % CO2 til medieskiftet endres.
    4. Etter 2 dager i kultur, fjern 250 μL av mediet fra et hjørne av hver brønn, vær forsiktig med å ikke pipetter ut hydrogelen. Deretter legger du sakte til 250 μL av kulturmediet. Bytt medium annenhver dag.
      MERK: Minimer bevegelsen av kammersklien, spesielt under cysteinitiering.

2. Cyste kvantifisering

  1. Cyste avbildning
    MERK: Denne delen bør utføres raskt for ikke å gå på akkord med celle levedyktigheten hvis mikroskopet ikke er utstyrt med et varmekammer for å kontrollere CO2 og temperatur. For å sikre konsekvent kvantifisering, representant for cystefordelingen i hele hydrogelvolumet, blir cyster avbildet via fasekontrastmikroskopi og serielavbildning (Z-stabler), med forhåndsdefinerte parametere gjennom ulike tidspunkter.
    1. Ta en Z-stabel langs hydrogelens dybde for hvert tidspunkt (figur 1C, D). I dette eksemplet tas Z-stabler på dag 1, 2, 4, 7 og 10.
      MERK: Kontroller at den første cellefordelingen er ensartet i hydrogelen for å sikre at denne metoden er anvendelig.
      1. Med et mikroskop med fasekontrast utstyrt med en bildeanskaffelsesprogramvare velger du 10x objektiv forstørrelse i det manuelle nesestykkets putevindu (figur 2B(1).
      2. Slå på den hvite lampen, og velg alternativet for bildebehandling på brightfield.
      3. Slå på kameraet ved å velge"Spillav"-knappen i stolpeundermenyen. Fokuser på et felt av cyster og angi eksponeringstiden (figur 2B (2)). Åpne vinduet Auto capture-mappe for automatisk lagring av bilder (figur 2B(3)).
      4. Åpne vinduet i Capture Z-serien og definer med Z-skruen de øverste og nederste planene i Z-stakken (samme XY-koordinater, men forskjellige Z-skjerm). Juster Z-trinnet avhengig av målet, oppløsningsnivået og trykk på knappen "Kjør nå" for å starte oppkjøpet (figur 2B (4)).
        MERK: I dette eksemplet er cyster spredt over en hydrogeltykkelse på 520 μm. 26 bilder er anskaffet langs hydrogeldybden med et 20 μm Z-trinns intervall. Avhengig av målet bør Z-trinnet justeres for å ikke gå glipp av noen cyste og for å sikre påvisning av enkeltceller og aggregater.
      5. Ta minst 3 ikke-overlappende Z-stabler per brønn.
        MERK: Denne prøvetakingen er nødvendig når cyster, som i dette eksemplet, er mer tallrike i dybden av gelen enn på kantene på grunn av heterogeniteter i hydrogelpolymeriseringen.
      6. For å få et representativt datasett gjenta trinn 2.1.1.5. for totalt 3 brønner.
        MERK: Den heterogene fordelingen av cyster avhenger av typen hydrogel, polymerisering og cellelinjen. Tatt i bruk tre Z-stabler per brønn og tre brønner per eksperiment, blir minst 200 cyster avbildet over ni Z-stabler for å karakterisere cystedannelse og cystevekst på hvert tidspunkt.
  2. Bildebehandling
    MERK: I en hydrogel finnes NRCer som enkeltceller, cyster eller aggregater. Cyster identifiseres ved tilstedeværelsen av et rundt og tynt kontrastformet celleskall som omslutter en lumen, mens celleaggregater presenterer en uregelmessig form og ikke har lumen. Aggregater og enkeltceller har et tett og kontrastert utseende (figur 3B(4).
    1. Åpne Fiji-programvaren, åpne Z-stakken og gå til Fiji-menyen og klikk File | Open (Supplerende figur 1). Velg Z-stakken du vil analysere. Velg om nødvendig alternativet "Virtual Stack"og klikker på "Ja" for åpning (Figur 3A(1)).
    2. Dupliser stakken via bilde | Dupliser. Klikk på boksen " Dupliserstakk "og klikk "OK" (Supplerende figur 2).
      MERK: I dette eksemplet er Z-stabler i .nd2 filformat kodet i 16 biter.
    3. Opprett en anslag for minimumsintensitet fra den dupliserte stakken. Gå til Bilde-menyen | Stabler | Z Prosjekt. Velg Projeksjonstype "Min intensitet" og klikk på "OK" (Figur 3A(2)) (Tilleggstall 3).
    4. Trekk bakgrunnen fra projeksjonen. Gå til Prosess-menyen | Trekk fra bakgrunn. Skriv inn 500,0 piksler rullende kuleradius og klikk på"lys bakgrunn"for å gjengi cyster mer kontrastert enn bakgrunnen (Figur 3A (3)) (Tilleggsfigur 4).
      MERK: Den rullende kuleradiusen definerer størrelsen på regionen som bakgrunnsdeltraksjonen betjenes på. Denne parameteren må settes til størrelsen på det største objektet for å identifisere.
    5. Hvis kontrastforbedring er nødvendig, går du til Bilde-menyen | Juster | Lysstyrke/kontrast | Automatisk | Påfør. Fiji optimaliserer automatisk lysstyrke og kontrast. I (Figur 3A(3)ble de nedre og øvre grå verdiene satt til henholdsvis 49702 og 65452 (tilleggstall 5).
      MERK: Hvis projeksjonen ikke er kalibrert, går du til Analyser-menyen | Angi skala og skriv inn det tilsvarende kalibrerings-forholdet mellom μm/piksel( Tilleggstall 6).
  3. Cystetelling og cystestørrelsesmålinger
    1. For å måle den omtrentlige cystediameteren, velg Det rette verktøyet i Fiji-menyen og tegn en linje over diameteren på hver cyste på den endelige projeksjonen (figur 3B (4). Legg til den nye regionen av interesse (ROI) opprettet for hver cyste i ROI manager: trykk på "t" snarvei på tastaturet for raskere telling og åpning av ROI manager. Klikk "Vis alle" for å se de talte cyster (Tilleggsfigur 7)
    2. Kontroller at ingen cyste har blitt igjen uten å telle ved å overliste settet ROIer fra projeksjonen på Z-stabelen. For å gjøre dette, klikk på Z-stakkvinduet for å velge det. I ROI Manager klikker du på "Vis alle" og flytter markøren langs Z-stakken for å kontrollere at bildet per bilde, alle cyster er talt (Supplerende figur 8).
    3. Når nye cyster er talt og ROIer lagt til på trinn 2.3.1., velg ROI-settet og lagre det via ROI Manager-vinduet ved å klikke mer | Lagre (Tilleggsfigur 9).
    4. Velg alle ROIer i ROI Manager og klikk "Mål" i ROI Manager for å få størrelsen på hver cyste. Dette vil åpne et nytt vindu med målinger kalt"Resultater"nummerering hver cyste og den estimerte størrelsen. Deretter lagrer .csv format ved å klikke på "Resultater" vindu og via menyen: Fil | Lagre som (Tilleggstall 10).
      MERK: En makro kan opprettes for å halvautomatisk behandle stabler, estimere cystenummer/-størrelser fra projeksjonene og lagre dataene for raskere opptellingsprosedyre. For å gjøre dette, velg verktøyet "Record" i barmenyen, ved å klikke Plugins | Makroer | Ta opp.
  4. Kvantifisering av cystedannelse effektivitet
    1. Telle antall cyster på dag Y, på Equation 1 en projeksjon (Y = 1, 2, 4, 7 eller 10).
    2. For å beregne cystedannelseseffektiviteten for 1000 celler på dag Y, del antall cyster talt på det tidspunktet med antall celler seeded på dag 0 utledet fra hydrogelvolumet og multipliserer med 1000 (Figur 3C, figur 4).
      Equation 2

3. Celle levedyktighet

  1. Forbered en lagerløsning av fluoresceindiceetat (FDA) ved 5 mg/ml ved å oppløse 5 mg FDA i 1 ml aceton og oppbevares ved -20 °C.
  2. Forbered en lagerløsning av propidiumjodid (PI) i en konsentrasjon på 2 mg/ml i ionisert vann (dH2O) og oppbevares ved 4 °C.
  3. Forbered NRC medium uten fosterkalvserum (FCS).
  4. For å klargjøre FDA/PI-fargeløsningen, tilsett 4 μL FDA-lagerløsning (8 μg/ml endelig konsentrasjon) og 25 μL PI-lagerløsning (20 μg/ml endelig konsentrasjon) i 2,5 ml NRC-medium uten FCS.
  5. Fjern mediet fra kammersklien, tilsett 250 μL fargingsoppløsning i hver brønn og inkuber 4-5 min i mørket ved 37 °C, 5 % CO2. Pipette ut fargeoppløsningen forsiktig og vask en gang med 250 μL 1x PBS.
  6. Tilsett nøye 250 μL komplett NRC medium til hver brønn og ta bilder ved hjelp av et omvendt fluorescensmikroskop med Texas røde og fluoresceinisotyocyanatfiltre (FITC). Levende celler vil være grønne og døde celler vil være røde (Figur 5A).
    MERK: For å kvantifisere levende/døde celler, ta Z-stabler over hydrogelvolumet etter trinn 2 og tilpass bildebehandlingsmetoden for fluorescens.

4. Sekresjonsaktivitet

MERK: Sekresjonsaktiviteten gjennom den a apiske membranen til kolangiocytter vurderes ved sekresjon av fluorescein i lumen. Dens spesifisitet kan evalueres ved å gjøre den samme testen med Verapamil, en multi-resistent (MDR) transportørhemmer24.

  1. For å forberede en fargeløsning av Hoechst 33258 ved 5 μg/ml, tilsett 0,83 μL Hoechst lageroppløsning (15 mg/ml lagerkonsentrasjon i dH2O) i 2,5 ml NRC medium uten FCS.
  2. Tilsett 250 μL Hoechst oppløsning i hver brønn og inkuber ved 37 °C, 5 % CO2 i 15 min.
  3. Fjern Hoechst-oppløsningen og tilsett 250 μL FDA-oppløsning (8 μg/ml endelig konsentrasjon) i hver brønn. Inkuber 4-5 min ved 37 °C, 5 % CO2.
    MERK: Så snart celler utsettes for FDA-fargingsløsning, kan oppfølgingen av fluorescenssekresjonskinetikk være nyttig for å kalibrere tiden som trengs for at cyster skal skilles ut. For å gjøre dette, ta bilder hver min i 1 time via time-lapse imaging. I dette eksemplet er tiden som trengs for å observere NRC utskillende cyster i hydrogelen ca 15-20 min.
  4. Ta bilder med et invertert fluorescensmikroskop 5 min etter skylling med medium uten FCS. Bruk 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) og FITC filtre for å avdekke kjernemerking og fluoresceinakkumulering i lumen (figur 6A). For å kvantifisere antall utskillende cyster, ta Z-stabler som i trinn 2 og tilpasse bildebehandlingstrinnene til fluorescerende bilder.
    MERK: For Verapamil-testen, forut for den forrige prosessen (trinn 4.3. til 4.4.) ved inkubasjon med Verapamil, i henhold til følgende betingelser:
  5. Forbered en lagerløsning på 10 mM Verapamil i dimetylsulfoksid (DMSO). For å forberede 10 μM arbeidsløsning, bland 2,5 μL Verapamil lagerløsning med 2,5 ml kulturmedium uten FCS.
  6. For å vurdere at fluorescensen i lumen skyldes MDR-sekresjon, ta et nytt lysbilde og tilsett 250 μL Verapamils arbeidsløsning i hver brønn og inkuber 20 min ved 37 ° C, 5% CO2
  7. Fjern oppløsningen og tilsett 250 μL FDA-oppløsning (8 μg/ml endelig konsentrasjon) i hver brønn. Inkuber 4-5 min i mørket ved 37 °C, 5 % CO2. Vask deretter med 250 μL 1x PBS, før bildebehandling (figur 6B, C).

5. Epitel polaritetsvurdering ved immunofluorescence

  1. For å forberede festeløsningen, bland 4% formaldehyd med 5% sukrose, i 1x PBS, pH 7,4 og inkubere i et vannbad forvarmet ved 37 °C.
  2. For å fikse cellene, pipetter du forsiktig ut kulturmediet fra brønnen uten å skade matrisen. Tilsett langsomt 400 μL av festeløsningen på siden av brønnene. Inkuber i 20 min ved romtemperatur (RT).
    MERK: La alltid væsken stå 25 μL over matrisen for å unngå skade.
  3. Fjern forsiktig festeløsningen og vask 3x med 400 μL 1x PBS ved (RT).
  4. Pipette ut PBS, tilsett 400 μL permeabiliseringsløsning (0,5% Triton X-100 i 1x PBS) og inkuber 10 min ved RT.
  5. Fjern forsiktig permeabiliseringsløsningen, etterfulgt av 3 raske vasker med 400 μL 1x PBS og et langt vasketrinn på 30 min ved RT.
    MERK: På dette trinnet kan lysbildet lagres ved 4 °C i 2 dager. I dette tilfellet forsegle lysbildet med en parafinfilm for å hindre fordampning og matrisetørking.
  6. Fjern PBS, tilsett 400 μL blokkeringsløsning som inneholder 0,1% storfe serumalbumin (BSA) og 10% geiteserum i 1x PBS og inkubere i 60 min ved RT.
    FORSIKTIG: Konsentrasjoner av BSA høyere enn 0,1 % vil føre til lumen tilbaketrekking og ytterligere cystekollaps (se avsnittet Representative resultater) (figur 7A).
  7. Pipette ut blokkeringsoppløsningen og vask én gang med 400 μL PBS/0,05 % Tween 20 og kast.
  8. Tilsett 150 μL av antistoffoppløsningen, f.eks. E-kadherin antistoff fortynnet 1:400 og falloidin 568 (16,2 nM endelig konsentrasjon) i 1x PBS og inkubere i 90 min ved RT.
    MERK: Denne fortynningen av E-kaderin er den samme som i en standard 2D immunofluorescence-protokoll.
  9. Vask prøven med 400 μL PBS/0,05% Tween 20, 3x; hver gang inkubere prøven i 10 min ved RT.
  10. Tilsett 150 μL av det sekundære antistoffet (geit anti-kanin IgG Alexa Fluor Plus 647), fortynnet 1:500 i 1x PBS og inkubere 60 min ved RT.
  11. Vask 3x med 400 μL PBS/0,05 % Tween 20 hver gang du ruger prøven i 10 min ved RT.
  12. Vask 3x med 400 μL 1x PBS, hver gang inkubere prøven i 10 min ved RT.
  13. Kast PBS for den siste vasken og klargjør kammerlysbildet for visualisering via konfokal mikroskopi etter ett av de to alternativene nedenfor.
    1. Tilsett 400 μL 1x PBS og 50 μL DAPI per brønn. Prøvene kan undersøkes gjennom bunnen av brønnen uten behov for montering med en dekkslipp (figur 7B).
    2. Tilsett 100 μL per brønn antifadereagens som inneholder DAPI og la lysbildet tørke O/N ved RT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dannelse og karakterisering av cyster
3D cellekultursystemer er et viktig verktøy for å studere organogenese og sykdomsmodellering25. Dessverre er de fleste av disse metodene kvalitative eller bruker intern kvantifisering utført på et enkelt plan ved å sammenligne antall cyster versus ikke-cyster, i variable og ofte uspesifiserte volumer, og forhindrer sammenligning i form av cystedannelseseffektivitet mellom de ulikestudiene 7,8,9,10,15,18,23. Metoden foreslått i denne protokollen, ved å registrere hele antall cyster og deres respektive størrelser over tidspunktet for eksperimentet, gjør det mulig å analyse av utviklingen av cystedannelse og vekst (figur 4).

Basert på fasekontrastbilder, på dag 0, 8 timer etter cellesåing, finnes det for det meste småcelleaggregater innebygd i hydrogelen. På dag 1 er små cyster med median diameter på 42,95 (26,53, 50,47) (første, tredje kvartil) μm og fusjon av cyster spredt over hele hydrogelen merkbare. Ved dag 4 er det vanlig å observere aggregerte strukturer samt cyster med median diameter på 75 (56,48, 97,97) μm. Ved dag 7 og 10 nådde median cystediameter 108,67 (75,31, 141,76) μm og 186,46 (henholdsvis 113,98, 278,29) μm (figur 4A-C). Interessant, cysteformasjonen effektivitet øker fra 70,03 ± 5,05 cyster / 1000 celler på dag 1 til 99,83 ± 12,81 cyster /1000 celler på dag 4 gjenværende konstant til dag 10 (Figur 4B), noe som tyder på at cyster dannes i hovedsak fra celleaggregater som er tilstede på tidspunktet for innebygging eller som danner i løpet av de neste 48h, gjennom cellemigrasjon eller fusjon av småcelleaggregater. Med hensyn til cystestørrelsesutviklingen, mens gjennomsnittsstørrelsen følger en langsom og vanlig skråning, øker størrelsesfordelingen mye langs kulturtiden, noe som illustrerer at de ulike cystene ikke vokser i samme hastighet. Interessant, dette kan knyttes til vår observasjon (ikke vist) at cyster ikke er jevnt fordelt i hydrogel, de største cyster som ligger i midten av hydrogelvolumet. Siden økningen av cystediameteren hovedsakelig er avhengig av sekresjonsaktiviteten (siden celledelingsraten er begrenset i NRC-avledede cyster), kan det utledes at denne aktiviteten er svært avhengig av hydrogelegenskapene som ikke er homogene i cellekulturvolumet.

Vi bekreftet deretter levedyktigheten til celler etter å ha innebygging dem i hydrogel (dag 0) og cyster på dag 10 ved hjelp av FDA / PI levende farging (Figur 5A). FDA er et ikke-fluorescerende molekyl som bare levende celler, gjennom en enzymatisk reaksjon, er i stand til å konvertere til den grønne fluorescerende forbindelsen fluorescerende26. PI er et ikke-permeantmolekyl for levende celler som intercalates i DNA av nekrotiske celler27. Interessant, døde celler som representerer mindre enn 3% av hele cellene i kulturvolumet på dag 10, finnes for det meste utenfor cystene, som isolerte celler eller en del av små aggregater. Vi la imidlertid merke til at rusk fra nekrotiske celler akkumuleres i noen store cyster på dag 10 (Figur 5B). Derfor, for vedlikehold av cystiske kulturer, anbefales passaging av cyster før 10 dager under disse forholdene.

Funksjonell vurdering
Under fysiologiske forhold er hovedfunksjonen til kolangiocytter å endre canalicular galle via absorptive og sekretoriske mekanismer som MDR-kanalen er en nøkkelspiller28. For å vurdere funksjonaliteten til cyster, inkuberte vi dag 10 cyster med FDA / Hoechst og observert dannelse av fluorescein og sekresjonen fra basalen inn i det apiske luminalrommet (figur 6A, B). Dermed bekrefter at NRCs i cyster beholder sine sekretoriske funksjoner. Videre ble sekresjonen av fluorescein hemmet ved forbehandling av cyster med MDR-hemmeren Verapamil (figur 6C), som viser at akkumuleringen av fluorescens FDA inn i lumen skyldtes sekresjonen gjennom MDR-transportøren og ikke ved å lekke fra det intercellulære rommet.

Vurdering av cystepolaritet
For å etablere polarisering av NRC-cystene gjennomførte vi en rekke optimaliseringstrinn i immunofluorescence-protokollen. En hoved hindre i undersøkelsen av epitelcellepolaritet i cyster er den hyppige kollapsen av organoid arkitektur under immunofluorescence prosessen, på grunn av lekkasje av væsken som finnes i lumen. For å omgå dette problemet har hvert trinn i immunofluorescence-protokollen blitt evaluert ved å teste hvordan ulike forhold kan påvirke vedlikeholdet av cystestruktur. Vi fant at modulering av fiksering (formaldehyd (2-4%) + sukrose (5-10%)) eller permeabiliseringsforhold (0,1-1% av både Triton X-100 og sukrose) ikke hadde mye innvirkning på cystearkitekturen. Disse områdene kan brukes til å sterkt fikse og forsiktig gjennomsyre kolangiocytter (Figur 7A). Vi observerte imidlertid at å holde BSA på 0,1% eller mindre under metning er et viktig skritt for å opprettholde cysteintegritet, da høyere konsentrasjoner resulterer i cysteuttrekk og lumenkollaps (figur 7A).

Cholangiocyte funksjoner er avhengig av deres riktig apico-basolateral polaritet29. For å verifisere at NRC cyster selvmontering i hydrogel som polariserte strukturer, bekreftet vi den apiske og basolaterale lokaliseringen av henholdsvis F-actin og E-cadherin. E-kadherin uttrykk i våre cyster indikerer også at NRCs opprettholde sin epitel fenotype i hydrogel (Figur 7B) i minst 10 dager.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentell arbeidsflyt av cystedannelse og karakterisering. (A)Hydrogel belegg av kammeret lysbildet. (B) Celleinnbygging i hydrogelen. (C)Mikroskopi av cystedannelse. (D)En 10-dagers oppfølgingsvurdering av cystevekst, levedyktighet, funksjonalitet og polarisering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Metode for bildeanskaffelse. (A) Arbeidsflyten av Z-stack oppkjøpet utført langs hydrogel dybde fra dag 1 til 10: Z-stack oppkjøp (1) bildebehandling av Z-stabel ( 2 ) generasjon av en minimumintensitetprojeksjon og cyste kvantifisering (3). (B) Skjermbilder av bildeanskaffelse som viser valg av målet (1), justering av parametere (2), automatisk lagring av bilder (3) og Z-stakkkalibreringen (4). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Metode for kvantifisering av cystestørrelse og cystedannelseseffektivitet. (A) Bildebehandling layout som viser: Z-stabler for å analysere (1), minimum intensitet Z-projeksjon (2), den endelige Z-projeksjon etter bakgrunn subtraksjon (3) brukes for cyste telling og cyste størrelse estimering. (B) Cyst identifikasjon på projeksjonen (A3) med en zoom av projeksjonen (4) for å vise identifisering av cyster kjennetegnet av en mørk celle skall omslutter en lysere lumen, som er preget av blå linjer plottet for diameter måling vs aggregater med en mørk og uregelmessig utseende pekte av røde piler. (C)Formelen for beregning av cystedannelse effektivitet for 1000 celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Cystdannelse effektivitet og cyste størrelse distribusjon i hydrogel. (A) Time-lapse som viser representative fasekontrastbilder på dag 0, 1, 2, 4, 7 og 10 av 3D-kulturene. (B) Plot graf med kinetikk av gjennomsnittlig cyste formasjon effektivitet ± SEM (n = 3). (C) Box og whisker plot som viser cyste størrelse fordelingen over kulturtiden. Svarte barer representerer den første kvartilen, medianen og den tredje kvartilen; linjer representerer bredden på fordelingen; svarte prikker representerer minimum og maksimum for distribusjonen, n=3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Levedyktighet av NRC cyster i hydrogelen. (A)Representative fluorescerende levende bilder av kulturer på dag 0 og på dag 10, farget med FDA (grønn = live) og PI (rød = død). Merk at den røde fluorescensen hovedsakelig var knyttet til enkeltceller. (B)Representativ fluorescerende levende bilde av en nekrotisk cyste på dag 10, hvor de døde cellene (i rødt) ble sett akkumuleres i lumen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Funksjonaliteten til NRC cyster i hydrogelen. (A) Representative fluorescerende levende bilder av en 10-dagers cyste hvor cellens lag ble avslørt ved kjerner merking med Hoechst (blå) og lumen av utskilles FDA (grønn). (B) Representativ fase kontrast / fluorescerende levende bilder etter en sekresjonstest med FDA, som ble vist akkumulert i lumen. (C)Etter utstillingen til Verapamil, en MDR-hemmer, representativ fasekontrast / fluorescerende levende bilder av cyster som viser at FDA ble beholdt i cellens lag. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Immunofluorescence av NRC cyster i hydrogelen. (A)Optimalisering av immunofluorescence protokollen med lyse feltbilder som viser representative cysteformer i hvert trinn av protokollen. Fra venstre til høyre: (Levende cyste) en levende cyste i komplett medium førfiksering,( Fiksering ) en cyste etterfiksering,(Permeabilisering) en annen cyste etter permeabilisering, (Metning) en cyste etter metningstrinnet og ( Merking ) en cyste på immunolabeling trinn. (B) (1-2): Konfokale bilder av en seksjon gjennom en cyste som viser den a apiske overflatemarkøren F-actin (rød-oransje), basolateral markør E-kadherin (grønn) og kjernene farget med DAPI (blå). (3): 3D-rekonstituering av et sett cyster med følgende merking: rød-oransje for F-actin og grønn for E-kadherin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 1: Åpning av en stabel. Skjermbilde opptak av programvaren som viser prosedyren for å åpne en Z-stabel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 2: Stakk duplisering. Skjermbildeopptak av programvaren som viser prosessen for å duplisere en Z-stabel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggstall 3: Generering av en minimumsintensitetsprojeksjon. Skjermbildeopptak av programvaren som illustrerer prosedyren for å opprette en minimumsintensitetsprojeksjon fra den dupliserte Z-stakken. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 4: Fjerning av bakgrunn. Skjermbilde opptak av programvaren som skildrer metoden for å fjerne bakgrunnen fra Z-stakkprojeksjonen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 5: Kontrastforbedring. Skjermbildeopptak av programvaren som skisserer trinnene for å forbedre kontrasten til Z-stakkprojeksjonen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 6: Bildekalibrering. Skjermbildeopptak av programvaren som delineating prosessen for å kalibrere Z-stakken og Z-stack projeksjon i mikroner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggstall 7: Cystetelling. Skjermbilde opptak av programvaren som viser prosedyren for å telle cyster på Z-stack projeksjon med rettlinjeverktøy. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 8: Cystetellingskontroll. Skjermbilde opptak av programvaren som skisserer metoden for å sammenligne antall cyster regnet med Z-stack projeksjon og Z-stakken. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggstall 9: AVKASTNINGssparing. Skjermbildeopptak av programvaren som viser hvordan du lagrer avkastningssettet som er definert av tellingene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggstall 10: Cystestørrelse og tallmålinger. Skjermbilde opptak av programvaren detaljering hvordan å måle og lagre cyste størrelse og cyste nummer fra Z-stabel projeksjon og Z-stakken. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For å studere organogenese og vedlikehold av 3D cellulære strukturer, ulike vev har blitt modellert, ved hjelp av ulike cellulære opprinnelse, men også ulike typer ekstra cellulære matriser inkludert syntetiske vanngel8,9,10,21. Men på grunn av mangel på 3D kvantitativ analyse som muliggjør sammenligninger mellom metoder i form av organoider dannelse ellerfunksjonalitet 7,8,9,10,15,18, ytterligere standardisering for hydrogel eller narkotika screening forblir utenfor rekkevidde.

For å løse disse manglene foreslår vi en hydrogelbasert, reproduserbar og standardisert protokoll for å generere epitelcelleavledede cyster. Her eksemplifiserte vi det med dannelsen av gallecyster i en basal lamina avledet hydrogel, fra en referert kolangiocyttcellelinje. For å låse opp begrensningen av 3D-kvantifisering beregnes cystedannelseseffektivitet i forhold til det totale antallet celler som seedes inn i hydrogel- og cystevekstkinetikken måles over et konstant hydrogelvolum.

Vi tilbyr en rekke systematiske skritt for å generere og karakterisere cyster, for å tillate relevant cyste kvantitativ analyse. For dette målet er det gjort spesielle anstrengelser for å generere en jevn fordeling av celleaggregater på tidspunktet for hydrogelinnbygging og omgå heterogeniteten til hydrogelens struktur, noe som påvirker cystedannelse ved å sette forholdene for å ha en representativ prøve for cystetelling.

Eksperimentell reproduserbarhet håndteres gjennom kritiske trinn som filtrering av cellesuspensjoner for å begrense cellemengdestørrelse og pre-belegg av kammeret lysbilder før celle-hydrogel tillegg for å unngå 2D lagdannelse når celler kontakter overflaten av kulturfartøyet. Konsekvent kvantifisering løses ved å ta bilder langs Hydrogelens Z-akse med et konstant sett med parametere på tvers av ulike prøver og eksperimenter.

Cystdannelse effektivitet og cyste vekst kinetikk er anslått fra det totale antall celler seeded inn i hydrogel. Følgelig foreslås en tilpasningsdyktig algoritme for bildebehandling for å segmentere bilder for cystetelling og cystestørrelsesmålinger. Nyheten om metoden foreslått er at telling og målinger er gjort på Z-stack projeksjoner. Etter fjerning av den spesifikke bakgrunnen, er antall bilder som skal analyseres begrenset, noe som gir en betydelig gevinst av tid og begrenser harddiskens metning. Immunofluorescence er et betydelig verktøy for å analysere 3D-kulturer på strukturnivå, spesielt polarisering, nøkkelen i riktig epitelcellefunksjon4. Dermed foretok vi oppgaven med å nøye optimalisere fiksering, permeabilisering og blokkere trinnene i immunofluorescence-delen av vår protokoll; feilsøking BSA konsentrasjon for å hindre cyste tilbaketrekking og ytterligere lumen kollaps.

Til sammen åpner metoden som foreslås veien for å generere en enkel, reproduserbar og kostbar effektiv protokoll, 3D-cellulære kulturer og undersøke kvalitative og kvantitative parametere. Videre gjør denne metoden det mulig for sammenligninger mellom ulike typer matriser: ved hjelp av samme metode med poly(etylenglykol) (PEG)-avledede hydrogeler kan vi vise at lumendannelse og vekst er kritisk avhengig av hydrogelstivhet og limhet,henholdsvis 21. Denne protokollen gjelder også for sammenligning av dannelse og funksjon av sfæroider avledet fra forskjellige celler, som kan delta i standardisering av vevsspesifikke epitelspæroidmodeller. En begrensning er imidlertid at optimalisering av kulturforhold som kulturmedier, innledende cellesåing og tiden som trengs for cystedannelse, kan være nødvendig for andre celletyper. I galle duct feltet, Dette arbeidet kan bidra til å svare på spørsmål om galle duct organogenese, samt molekylære veier av sykdom, og narkotikatesting. Denne protokollen vil også finne sin grense når den brukes på høy gjennomstrømmingsanalyse siden noen trinn som cystetelling og bildebehandling ikke automatiseres ennå, selv om vi foreslår makroer for halvautomatisering av bildebehandlingsprosessen som kan videreutvikles for automatisering. Begrensningen for automatisk behandling i dette tilfellet er bildebakgrunnen. Dette skyldes heterogen struktur av naturlige komplekse hydrogeler som kjellermembran type geler, men vi tror at automatisering kan brukes på gjennomsiktige geler som PEG-avledede hydrogeler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Nicholas LaRusso (Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, USA), som vennligst ga NRC cellelinjen.

Dette arbeidet fikk økonomisk støtte fra både iLite RHU-programmet (gi ANR-16-RHUS-0005) og DHU Hepatinov.

Vi takker Isabelle Garcin og Réseau d'Imagerie Cellulaire Paris Saclay for deres støtte til bildebehandling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 µl- Pipette Eppendorf Research Plus Thermo Fisher Scientific 3120000020
100 µl - Pipette Eppendorf Research Plus Thermo Fisher Scientific 3120000046
1000 µl - Pipette Eppendorf Research Plus Thermo Fisher Scientific 3120000062
1X PBS Thermo Fisher Scientific 14190-094
200 µl - Pipette Eppendorf Research Plus Thermo Fisher Scientific 3120000054
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt Sigma-Aldrich T5516 NRC complete medium final concentration = 3.4 µg/mL
Acetic acid VWR 20104-298 0.02N final
Aerosol barrier pipettes tips 10 µl (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 2707439
Aerosol barrier pipettes tips 1000 µl (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 2707404
Aerosol barrier pipettes tips 200 µl (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 2707430
Antibiotic Antimicotic Solution (100X) Sigma-Aldrich A5955 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Bovine pituitary extract Thermo Fisher Scientific 13028-014 NRC complete medium final concentration = 30 µg/mL
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A2153 1:1000 dilution
Chemically Defined Lipid Concentrate (100X) Thermo Fisher Scientific 11905-031 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Collagen high concentration, rat tail Thermo Fisher Scientific 354249 50 µg/mL final concentration
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902 NRC complete medium final concentration = 0.393 µg/mL
DMEM F12 Thermo Fisher Scientific 21331-020 NRC complete medium final concentration = 1X
E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal Thermo Fisher Scientific PA5-32178 1:400 dilution
Eclipse TE300 inverted microscope Nikon imaging
Ethanolamine Sigma-Aldrich E9508 NRC complete medium final concentration = 0.32 mM
Fetal calf serum Thermo Fisher Scientific 10270-106 NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution
Fluoroshield with DAPI (Mounting medium) Sigma-Aldrich F6057
Formaldehyde 16% (W/V) Thermo Fisher Scientific 28906 4% (W/V)
Goat serum Thermo Fisher Scientific 16210-064 1:10 dilution
Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA - flash 4.OLT) Hamamatsu imaging
Hoechst 33258 Sigma-Aldrich B1155 5 µg/mL final concentration
IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647 Thermo Fisher Scientific A32733 1:500 dilution
ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n Open source image processing software
Insulin-Transferrin-Selenium (100X) Thermo Fisher Scientific 51300-044 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
L-Glutamine (100X) Thermo Fisher Scientific 25030-024 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL) Thermo Fisher Scientific 356231 4:10 dilution
NIS Elements software version 4.50.00 Nikon image acquisition and display
Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-035 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (∞/1.2 WD 15.2) Nikon
Prolong Gold Antifade Reagent Thermo Fisher Scientific P36931
Propidium Iodide (PI) Sigma-Aldrich P4170 20 µg/mL final concentration
Rhodamine Phalloidin Thermo Fisher Scientific R415 16.2 nM final concentration
Sir-Actin / Verapamil kit Spirochrome SC001 10 µM final concentration
Soybean trypsin inhibitor Thermo Fisher Scientific 17075-029 NRC complete medium final concentration = 50 µg/mL
Sterile cell strainer 40 µm (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 22363547
Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 1367811E
Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 1367811D
Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 11926955
Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 7200886
Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 553913
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 5:100 dilution
Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon) Thermo Fisher Scientific 353108
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 5:1000 dilution
Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red Thermo Fisher Scientific 25300-054 1X
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 5:10000 dilution
Vitamin (100X) Thermo Fisher Scientific 11120-037 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
μ-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi Clinisciences 80826

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  2. Martín-Belmonte, F., et al. Cell-polarity dynamics controls the mechanism of lumen formation in epithelial morphogenesis. Current Biology. 18, 507-513 (2008).
  3. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  4. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging Cells in Three-Dimensional Collagen Matrix. Current Procotols in Cell Biology. , Chapter 10 (Unit 10) (2010).
  5. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bisell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9064-9068 (1992).
  6. Kim, S. P., Lee, D. H., Park, J. K. Development of hepatocyte spheroids immobilization technique using alternative encapsulation method. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 3, 96-102 (1998).
  7. Lorent, K., et al. Identification of a plant isoflavonoid that causes biliary atresia. Science Translational Medicine. 7 (286), 67 (2015).
  8. Nowak, M., Freudenberga, U., Tsurkana, M. V., Wernera, C., Levental, K. R. Modular GAG-matrices to promote mammary epithelial morphogenesis in vitro. Biomaterials. 112, 20-30 (2017).
  9. Miroshnikova, Y. A., et al. Engineering Strategies to Recapitulate Epithelial Morphogenesis Within Synthetic Three-Dimensional Extracellular Matrix With Tunable Mechanical Properties. Physical Biology. 8 (2), 026013 (2011).
  10. Ozdemir, T., et al. Tuning Hydrogel Properties to Promote the Assembly of Salivary Gland Spheroids in 3D. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (12), 2217-2230 (2016).
  11. Dolega, M. E., Abeille, F., Picollet-D'hahan, N., Gidrol, X. Controlled 3D culture in Matrigel microbeads to analyze clonal acinar development. Biomaterials. 52, 347-357 (2015).
  12. Laperrousaz, B., et al. Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens. Nucleic Acids Research. 46 (12), 70 (2018).
  13. Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
  14. Tam, P. K., Yiua, R. S., Lendahl, U., Andersson, E. R. Cholangiopathies - Towards a molecular understanding. EBioMedicine. 35, 381-393 (2018).
  15. Loarca, L., et al. Development and characterization of cholangioids from normal and diseased human cholangiocytes as an in vitro model to study primary sclerosing cholangitis. Laboratory Investigation. 97, 1385-1396 (2017).
  16. De Assuncao, T. M., Jalan-Sakrikar, N., Huebert, R. C. Regenerative medicine and the biliary tree. Seminars in Liver Disease. 37, 17-27 (2017).
  17. Dianat, N. H., et al. Generation of functional cholangiocyte-like cells from human pluripotent stem cells and HepaRG cells. Hepatology. 60, 700-714 (2014).
  18. Masyuk, A. I., et al. Cholangiocyte autophagy contributes to hepatic cystogenesis in polycystic liver disease and represents a potential therapeutic target. Hepatology. 67 (3), 1088-1108 (2018).
  19. Sampaziotis, F., Cardoso, M., Madrigal, P., Bertero, A., Saeb-Parsy, K., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nature Biotechnology. 33 (8), 845-852 (2015).
  20. Soroka, J. C., et al. Bile-Derived Organoids From Patients With Primary Sclerosing Cholangitis Recapitulate Their Inflammatory Immune Profile. Hepatology. 70 (3), 871-882 (2019).
  21. Funfak, F., et al. Biophysical Control of Bile Duct Epithelial Morphogenesis in Natural and Synthetic Scaffolds. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7 (417), 417 (2019).
  22. Du, Y., et al. Bile Duct-on-a-Chip With Organ-Level Functions. Hepatology. 0 (0), (2019).
  23. Shiota, J. M., Mohamad Zaki, N. H., Merchant, J. L., Samuelson, L. C., Razumilava, N. Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts. Journal of Visualized Experiments. (146), e59544 (2019).
  24. Bircsak, K. M., Richardson, J. R., Aleksunes, L. M. Inhibition of Human MDR1 and BCRP Transporter ATPase Activity by Organochlorine and Pyrethroid Insecticides. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (2), 157-164 (2013).
  25. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., Blitterswijk, C., Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  26. Kanade, S., Nataraj, G., Ubale, M., Mehta, P. Fluorescein Diacetate Vital Staining for Detecting Viability of Acid-Fast Bacilli in Patients on Antituberculosis Treatment. International Journal of Mycobacteriology. 5 (3), 294-298 (2016).
  27. Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death. Journal of Visualized Experiments. (50), e2597 (2011).
  28. Tabibian, J. H., Masyuk, A., Masyuk, T. V., O'Hara, S. P., LaRusso, N. F. Physiology of Cholangiocytes. Comprehensive Physiology. 3 (1), (2013).
  29. Spirlì, C., et al. Functional polarity of Na+/H+ and Cl-/HCO3- exchangers in a rat cholangiocyte cell line. American Journal Physiology. 275, 1236-1245 (1998).

Tags

Bioengineering Utgave 159 kolangiocytter selvorganisering lumen cellepolaritet cyster organogenese gallekanaler
Generasjon og kvantitativ karakterisering av funksjonelle og polariserte gallepitelcyster
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bouzhir, L., Gontran, E., Loarca,… More

Bouzhir, L., Gontran, E., Loarca, L., Collado-Hilly, M., Dupuis-Williams, P. Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts. J. Vis. Exp. (159), e61404, doi:10.3791/61404 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter