Summary
Tredimensionella (3D) cellulära system är relevanta modeller för att undersöka organogenes. En hydrogel-baserad metod för gallans cystor produktion och deras karakterisering föreslås. Detta protokoll unravels hindren för 3D-karakterisering, med en okomplicerad och tillförlitlig metod för att bedöma cysta bildning effektivitet, storlekar, och att testa deras funktionalitet.
Abstract
Cholangiocytes, de epitelceller som rada upp gallgångarna i levern, övervaka gallbildning och modifiering. Under de senaste tjugo åren, i samband med leversjukdomar, 3-dimensionella (3D) modeller baserade på cholangiocytes har uppstått såsom cystor, sfäroider, eller rör-liknande strukturer för att efterlikna vävnad topologi för organogenes, sjukdom modellering, och läkemedel screeningstudier. Dessa strukturer har huvudsakligen erhållits genom ingjutning av konlangiocyter i en hydrogel. Huvudsyftet var att studera själv-organisation genom att ta itu med epitelpolalitet, funktionella och morfologiska egenskaper. Men mycket få studier fokuserar på cysta bildning effektivitet. När så är fallet kvantifieras effektiviteten ofta från bilder av ett enda plan. Funktionella analyser och strukturell analys utförs utan att representera potentiella heterogenitet av cysta distribution som härrör från hydrogel polymerisation heterogeniteter och biverkningar. Därför kan den kvantitativa analysen, när den är klar, inte användas för jämförelse från en artikel till en annan. Denna metod tillåter inte heller jämförelser av 3D-tillväxtpotential av olika matriser och celltyper. Dessutom finns det inget omnämnande av den experimentella felsökning för immunfärgning cystor. I denna artikel ger vi en tillförlitlig och universell metod för att visa att den inledande cellfördelningen är relaterad till den heterogena vertikala fördelningen av cysta bildas. Cholangiocyte celler inbäddade i hydrogel följs med Z-stackar analys längs hydrogel djup under tiden kursen 10 dagar. Med denna metod erhålls en robust kinetik av cystbildningseffektivitet och tillväxt. Vi presenterar också metoder för att utvärdera cysta polaritet och secretory funktion. Slutligen, ytterligare tips för att optimera immunfärgning protokoll tillhandahålls för att begränsa cysta kollaps för bildbehandling. Detta tillvägagångssätt kan tillämpas på andra 3D-cellodlingsstudier, och på så sätt öppnas möjligheterna att jämföra ett system med ett annat.
Introduction
Under de senaste tre decennierna har området in vitro-forskning avancerat mot 3D-kultursystem. Ett antal protokoll har uppstått för odlingsceller i 3D som sfäroider eller aggregat i närvaro eller frånvaro av en byggnadsställning/matris, i en droppe, i agitation, i mikrofluidiska anordningar eller flytande1. Användningen av 3D-odlingsmetoder har visat sina fördelar jämfört med 2-dimensionella (2D) kulturer, särskilt för epitelceller, som visades att själv organisera i 3D-strukturer, kallas cystor eller acini. I detta fall bildar cellerna en monolayer som omger en lumen, där celler förvärvar sin fulla epitelial fenotyp med förbättrade fysiologiska specifika funktioner2.
Ett flertal studier har bidragit till utvecklingen av metoder för att bilda dessa epitelorganoider i naturliga matriser. Detta har gjort det möjligt att rekapitulera in vivo cell-cell och cell-microenvironment interaktioner, för att få etablering och stabiliteten i epitelial fenotyp3,4,5,6,7. Nyligen, och i synnerhet med syfte att utveckla transplanterbara organoider och dechiffrera kravet på mikromiljö för att iscensätta epitelprogrammet, har syntetiska hydrogeler utvecklats för att förstärka bildandet av epitelial acini8,9,10. Tyvärr rapporterar dessa studier om kvalitativa data, eller presenterar beräkningsmetoder med hjälp av interna referenser som förhållandet mellan cystor över icke-cystor i ett 2D-plan8,9,10. Detta utesluter varje jämförelse mellan olika studier i fråga om effektivitet, stabilitet, eller morfologiska och fysiologiska karakterisering av epitelial organoider.
Mikroinkapsling av epitelceller i pärlor med hjälp av mikrofluidiska enheter har möjlig gjort det möjligt för mer realistiska kvantitativa och jämförande resultat. Med hjälp av denna teknik, organoider från olika celltyper bildades och differentierades baserat på morfologin bland olika 3D cellulärastrukturer 11,12. Denna teknik är dock inte lätt att arbeta med och kräver användning av rena rum för att producera de mikrofluidiska enheterna. Denna teknik har etablerats för några få typer av hydrogeler men kräver att teknisk anpassning tillämpas på andra hydrogeler, vilket begränsar dess mångsidighet. Därför är de flesta studier avsedda att utveckla epitelorganoider förlita sig på inbäddning av epitelceller i en hydrogel bulk. I dessa metoder är den höga heterogeniteten hos gel-strukturering och cellfördelning inuti hela 3D-kulturen ofta försummade. Därför gäller de flesta analyserna enstaka 2D-bilder, som endast mycket grovt representerar fördelningen av de olika cellulära objekten i hela 3D-volymen.
Sjukdomar som påverkar gallgångarna, såsom cholangiocarcinoma, gallans atresia, primär sklerosiserande kolangit, bland andra, är en viktig orsak till dödlighet och sjuklighet. Med undantag för levertransplantation, det finns inga effektiva behandlingar för dessa villkor13. Insatser för att undersöka gallgången bildning, sjukdomsorsaker, och progression kommer att möjliggöra utvecklingen av nya terapier14.
Gallans organotypiska modeller av cystor, sfäroider eller rörliknande strukturer med hjälp av normala eller patient-härledda, differentierade, eller progenitor-härledda konlangiocyte cellinjer har utvecklats15,16,17,18,19,20. Olika studier har rekapitlat kolangiocyte polaritet, uttryck av konlangiocyte markörer, närvaro av cilier, cholangiocyte sekretoriska och reabsorptive förmåga, och lumen bildning och obstruktion; som alla representerar viktiga egenskaper för kolangiocyte fenotyp, morfologi, ochfunktion 15,17,19. Andra har rapporterat underhåll av patient-derived gallans organoider under långa tidsperioder20. Nyligen undersökte vi rollen av biokemiska och biofysiska ledtrådar på gallans cystor organogenesis21. Viktigt var patogenesen vid gallans atresia studerades i gallans sfäroider och rör7,22. Vidare, viktiga funktioner i primära skleroserande kolangit såsom kolangiocyte senescence, utsöndring av proinflammatoriska cytokiner, samt makrofag rekrytering studerades framgångsrikt med hjälp av gallans sfäroider15,20. Reproducerbara in vitro kvantitativa modeller som fysiologiskt modulera kolangiocyte fenotyp, fysiologi och mikromiljö där dessa frågor kan behandlas behövs fortfarande. Dessutom har endast få publikationer rapporterat cysta formation effektivitet21,23. Detta är en viktig punkt att fastställa, särskilt när man undersöker organogenes, sjukdom orsak, och korrelation av läkemedelssvar med cholangiocyte funktion och polarisering. Dessutom, med skillnader i ställningar / matris som används från protokoll till protokoll, är det svårt att jämföra mellan system. För att lösa dessa frågor föreslår vi en kvantitativ, tillförlitlig och universell metod för att generera gallans cystor härma lumen bildning, cholangiocyte polarisering och cholangiocyte sekretoriska funktion. Viktigt, presenterar vi en systematisk analys som utförs längs Z-axeln över 3D-gelen vid utvärdering över tiden, cysta formation effektivitet, storlek, viabilitet, polarisering och funktionalitet. Vidare använde vi en naturlig hydrogel och normala råttcholangiocyter (NRC)s, som ett exempel för protokollet, men andra naturliga eller syntetiska hydrogeler, samt epitelceller kunde användas för bildandet av 3D-cystiska strukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering av cystor
OBS: Detta protokoll kan utföras med någon typ av hydrogel, om gelationen tillåter ingjutning av celler.
- Hydrogel beläggning
OBS: Korrekt hydrogel beläggning av kammaren slide är ett kritiskt steg för att undvika bildandet av 2D-cell lager på botten av brunnen, som kan störa efterföljande cysta bildbehandling och försämra beräkningen av cysta bildning effektivitet.- För att säkerställa homogenitet hos gellösningen, tina hydrogelen vid 4 °C över natten (O/N).
- Förkylningspipettsspetsar på is eller O/N vid -20 °C och en 8-brunnskammaresglas vid -20 °C O/N.
- Placera hydrogel och 8-brunnskammaren på en ishink fylld med is.
- I ett koniskt rör på 15 mL, bered en lösning innehållande 40% hydrogel (V/V) i kallt NRC komplett medium (se Tabell of Materials) och placera röret på is.
- För att belägga en kammarsglid, med hjälp av kallpipettsspetsar, tillsätt 50 μL hydrogellösning på mitten av varje brunn, och sprids över hela ytan med hjälp av en pipettspets, medan du håller kammarens glid på is (Figur 1A).
OBS: Sprid hydrogellösningen så jämnt som möjligt undvika bubblor. - För att polymerisera hydrogelen, inkubera kammarsglaset i minst 15 min vid 37 °C, 5% CO2.
- Förberedelse av celler
- Värm upp NRC komplett medium, fosfat buffrad saltlösning (PBS), och trypsin-etylendiamin tetraättiksyra (trypsin-EDTA) i ett vattenbad föruppvärmt till 37 °C.
- Medan hydrogel är polymeriserande, se till att NRCs odlas till 70% konfluency i en T-25 cm2 kollagen-belagda kolv21. Tvätta cellerna en gång med föruppvärmd 1x PBS.
- Inkubera NRC:erna med 5 mL föruppvärmd 1x PBS (för en T-25 cm2 kolv) i 20 min vid 37 °C, 5% CO2.
OBS: Detta steg, som förkortar inkubationstiden med trypsin-EDTA är avgörande för att behålla cellers självorganiserande egenskaper. - Kassera PBS, tillsätt 1 mL trypsin-EDTA, och inkubera i 5-10 min vid 37 °C, 5% CO2.
- Neutralisera med 4 mL föruppvärmt komplett NRC-medium. Samla och överför cellupphängningen till ett 15 mL koniskt rör, och snurra på 150 x g i 4 min.
- Kassera mediet och resuspend cell pelleten i 5 mL av föruppvärmt medium.
- Med hjälp av en 40 μm cellsil, filtrera celllösningen i ett 50 mL koniskt rör och räkna cellerna.
OBS: Passerar cellerna genom en sil är ett kritiskt steg för de kvantitativa resultaten som skall reproducerbara dvs, för att få nästan liknande storlek cell aggregat som ska bäddas in.
- Ingjutning av cellfjädring i hydrogellösning
- Preparera en lösning på 1 600 μL av 80% hydrogel (V/V) i kallt komplett NRC medium (rör 1); hålla i is. Späd 5 x 105 celler/mL i 1 600 μL kallt komplett NRC-medium (rör 2) och håll i is.
OBS: Detta steg måste utföras snabbt för att undvika polymerisering av hydrogelen samtidigt som den blandas med cellfjädringen och för att bibehålla cellens livskraft. - För att förbereda en cellsåddlösning på 2,5 x 105 celler/mL i 40% hydrogel (V/V), blanda rör 1 och rör 2. Tillsätt 400 μL av celllösningen i varje brunn av hydrogelbelagd kammarsschbana undviker bubblor (Figur 1B).
- Håll kammaren glida i en inkubator vid 37 °C med 5% CO2 tills media ändras.
- Efter 2 dagar i kultur, ta bort 250 μL av mediet från ett hörn av varje brunn, var noga med att inte pipettera ut hydrogel. Tillsätt sedan långsamt 250 μL av odlingsmediet. Byt medium var 2:e dag.
OBS: Minimera förflyttning av kammarens glidning, särskilt under cystininitieringen.
- Preparera en lösning på 1 600 μL av 80% hydrogel (V/V) i kallt komplett NRC medium (rör 1); hålla i is. Späd 5 x 105 celler/mL i 1 600 μL kallt komplett NRC-medium (rör 2) och håll i is.
2. Kvantifiering av cystor
- Avbildning av cystor
OBS: Detta avsnitt bör utföras snabbt för att inte äventyra cellens livskraft om mikroskopet inte är utrustat med en värmekammare för att styra CO2 och temperatur. För att säkerställa en konsekvent kvantifiering, representativ för cysta fördelningen i hela hydrogel volymen, cystor avbildas via fas-kontrast mikroskopi och seriell avbildning (Z-stackar), med fördefinierade parametrar i olika tidspunkter.- Ta en Z-stack längs hydrogelens djup för varje tidspunkt (Bild 1C, D). I det här exemplet tas Z-stacks vid dag 1, 2, 4, 7 och 10.
OBS: Kontrollera att den initiala cellfördelningen är enhetlig i hydrogelen för att säkerställa denna metods tillämplighet.- Med ett faskontrastmikroskop utrustat med en programvara för bildanskaffning väljer du den objektiva förstoringen 10x i det manuella fönstret för nos-bit-pad (Figur 2B(1)).
- Slå på den vita lampan och välj alternativet brightfield imaging.
- Koppla på kameran genom att välja knappen "Spelaupp " i undermenyn bar. Fokusera på ett fält med cystor och ställ in exponeringstiden (Figur 2B(2)). Öppna fönstret Automatisk upptagningsmapp för en automatisk besparing av bilder (Bild 2B(3)).
- Öppna fönstret för fånga Z-serien och definiera med Z-skruven topp- och bottenplanen på Z-stacken (samma XY-koordinater men olika Z-skärmade). Justera Z-steget beroende på målsättning, upplösningsnivå och tryck på knappen "Kör nu" för att lansera förvärvet (Figur 2B(4)).
OBS: I detta exempel sprids cystor över en hydrogeltjocklek på 520 μm. 26 bilder förvärvas längs hydrogeldjupet med ett 20 μm Z-stegsintervall. Beroende på målsättningen bör Z-steget justeras för att inte missa någon cysta och för att säkerställa detektering av enstaka celler och aggregat. - Ta minst 3 icke-överlappande Z-stackar per brunn.
OBS: Denna provtagning är nödvändig när, som i detta exempel, cystor är mer talrika i djupet av gelen än på kanterna på grund av heterogeniteter i hydrogel polymerisation. - För att få en representativ datamängdsrepet steg 2.1.1.5. för 3 brunnar totalt.
OBS: Den heterogena fördelningen av cystor beror på vilken typ av hydrogel, dess polymerisation, och cellinjen. Med tanke på tre Z-stackar per brunn och tre brunnar per experiment, är minst 200 cystor avbildas över nio Z-stackar för att karakterisera cysta formation och cysta tillväxt vid varje tidpunkt.
- Ta en Z-stack längs hydrogelens djup för varje tidspunkt (Bild 1C, D). I det här exemplet tas Z-stacks vid dag 1, 2, 4, 7 och 10.
- Bildbehandling
OBS: I en hydrogel kan NRC hittas som enstaka celler, cystor eller aggregat. Cystor identifieras genom förekomsten av en rund och tunn kontrasterade cell skal omsluter en lumen, medan cell aggregat presentera en oregelbunden form och inte har en lumen. Aggregat och enstaka celler har ett tätt och kontrastutst utseende (Figur 3B(4)).- Öppna Fiji-programvaran, öppna Z-stacken och gå till Fiji-menyn och klicka på Arkiv | Öppna (Kompletterandebild 1). Välj Z-stacken som ska analyseras. Om det behövs väljer du alternativet "Virtual Stack" (virtuell stack) och klickar på "Ja" för öppning (Bild 3A(1)).
- Duplicera stacken via Bild | Duplicera. Klicka på rutan "Dubblettstack" och klicka på "OK" (Supplementary Figure 2).
OBS: I det här exemplet är Z-stackar i .nd2-filformat kodade i 16 bitar. - Skapa en projektion med minsta intensitet från den duplicerade stacken. Gå till Bild-menyn | Staplar | Z-projektet. Välj Projektionstyp " Min Intensity "(Min intensity)(minintensity) och klicka på " OK " (Bild 3A(2)) (Tilläggsfigur 3).
- Subtrahera bakgrunden från projektionen. Gå till Process-menyn | Subtrahera Bakgrund. Skriv 500,0 pixlar med rullande kulradie och klicka på "ljus bakgrund" för att återge cystor mer kontrasterade än bakgrunden (Bild 3A(3)) (Kompletterande Figur 4).
OBS: Den rullande bollen radie definierar storleken på den region på vilken bakgrund subtraktion drivs. Den här parametern måste anges till storleken på det största objektet för att identifiera. - Om det behövs kontrastförbättring går du till Bildmenyn | Justera | Ljusstyrka/Kontrast | Auto | Tillämpa. Fiji kommer automatiskt att optimera ljusstyrka och kontrast. I (Figur 3A(3)) sattes de nedre och övre gråa värdena till 49702 respektive 65452 (Kompletterande figur 5).
OBS: Om projektionen inte är kalibrerad, gå till Menyn Analysera | Ställ in skala och skriv motsvarande kalibrering μm/pixel-förhållande( Kompletterande figur 6).
- Potatiscystnematodsräkning och mått på cyststorlek
- För att mäta den ungefärliga cystdiametern väljer du verktyget Straight-line i Fiji-menyn och drar en linje tvärs över diametern på varje cysta på den slutliga projektionen ( Bild3B(4)). Lägg till den nya intresseregionen (ROI) som skapats för varje cysta till ROI-hanteraren: tryck på genvägen "t" på tangentbordet för snabbare räkning och öppning av ROI-hanteraren. Klicka på" Visaalla " för att se de räknade cystorna (Tilläggsfigur 7)
- Kontrollera att ingen cysta har lämnats utan att räkna genom att överlagra de inställda ROIs från projektionen på Z-stacken. För att göra det, klicka på Z-stack fönstret för att markera den. I ROI-hanteraren klickar du på "Visa alla" och flyttar markören längs Z-stacken för att kontrollera att bild per bild, alla cystor har räknats ( KompletterandeBild 8).
- När nya cystor har räknats och ROIs läggs på steg 2.3.1., välj ROI-set och spara den via ROI Manager fönstret genom att klicka på Mer | Spara (Kompletterande figur 9).
- Välj alla ROIs i ROI-hanteraren och klicka på "Mät" i ROI Manager för att få storleken på varje cysta. Detta kommer att öppna ett nytt fönster av mätningar med namnet "Resultat" numrering varje cysta och dess uppskattade storlek. Spara sedan i .csv genom att klicka på "Resultat" fönstret och via menyn: Arkiv | Save As (kompletterande bild 10).
OBS: Ett makro kan skapas för att halvautomatiskt bearbeta stackar, uppskatta cysta antal / storlekar från prognoserna, och lagra data för snabbare räkning förfarande. För att göra det, välj verktyget "Spelain " i baren menyn, genom att klicka plugins | Makron | Spela in.
- Kvantifiering av cysta bildning effektivitet
- Räkna antalet cystor på dag Y,
på en projektion (Y=1, 2, 4, 7 eller 10). - För att beräkna cystbildningseffektiviteten för 1000 celler på dag Y, dividera antalet cystor som räknades vid den tidpunkten punkt med antalet celler som är seedade på dag 0 härledas från hydrogelvolymen och multiplicera med 1000 (Figur 3C, Figur 4).
- Räkna antalet cystor på dag Y,
på en projektion (Y=1, 2, 4, 7 eller 10).
3. Cellens livskraft
- Bered en stamlösning av fluoresceindiacetat (FDA) vid 5 mg/mL genom att lösa upp 5 mg FDA i 1 mL aceton och förvara vid -20 °C.
- Bered en stamlösning av propidiumdid (PI) vid en koncentration av 2 mg/mL i avjoniserat vatten (dH2O) och förvara vid 4 °C.
- Förbered NRC medium utan fetala kalv serum (FCS).
- För att förbereda lösningen för INFÄRGNING AV FDA/PI, tillsätt 4 μL av FDA:s stamlösning (8 μg/mL slutkoncentration) och 25 μL PI-stamlösning (20 μg/mL slutkoncentration) i 2,5 mL NRC-medium utan FCS.
- Ta bort mediet från kammarsglaset, tillsätt 250 μL färgningslösning i varje brunn och inkubera 4-5 min i mörker vid 37 °C, 5% CO2. Pipettera ut färgningslösningen försiktigt och tvätta en gång med 250 μL av 1x PBS.
- Tillsätt försiktigt 250 μL komplett NRC-medium till varje brunn och ta bilder med hjälp av ett inverterat fluorescensmikroskop med Texas röda och fluorescein isothiocyanate (FITC) filter. Levande celler kommer att vara gröna och döda celler kommer att vara röd( Bild 5A).
OBS: För att kvantifiera levande/döda celler, ta Z-staplar över hydrogelvolymen efter steg 2 och anpassa bildbehandlingsmetoden för fluorescens.
4. Sekretionsaktivitet
OBS: Sekretionsaktiviteten genom kollangiocyternas apikala membran bedöms genom utsöndring av fluorescein i lumen. Dess specificitet kan utvärderas genom att göra samma test med Verapamil, en multiresistent (MDR) transportörhämmare24.
- För att förbereda en färgningslösning av Hoechst 33258 vid 5 μg/mL, tillsätt 0,83 μL hoechst stamlösning (15 mg/mL lagerkoncentration i dH2O) i 2,5 mL NRC-medium utan FCS.
- Tillsätt 250 μL Hoechst-lösning i varje brunn och inkubera vid 37 °C, 5% CO2 i 15 min.
- Ta bort Hoechst-lösningen och tillsätt 250 μL AVDR lösning (8 μg/mL slutkoncentration) i varje brunn. Inkubera 4-5 min vid 37 °C, 5% CO2.
OBS: Så snart celler utsätts för FDA färgning lösning, uppföljningen av fluorescein sekretion kinetik kan vara användbart för att kalibrera den tid som behövs för cystor att utsöndra. För att göra det, ta bilder varje min för 1 h via time-lapse imaging. I detta exempel är den tid som behövs för att observera NRC som utsöndrar cystor i hydrogelen ca 15-20 min. - Ta bilder med hjälp av ett inverterat fluorescensmikroskop 5 min efter sköljning med medium utan FCS. Använd 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) och FITC-filter för att avslöja kärnors etikettering och fluoresceinackumulering i lumen (Bild 6A). För att kvantifiera antalet utsöndrande cystor, ta Z-stackar som i steg 2 och anpassa bildbehandlingsstegen till fluorescerande bilder.
OBS: För Verapamil-testet, föregå den tidigare processen (steg 4.3. till 4.4.) genom en inkubation med Verapamil, enligt följande villkor: - Bered en stamlösning på 10 mM Verapamil i dimetylsulfoxid (DMSO). För att förbereda 10 μM arbetslösning, blanda 2,5 μL verapamil stamlösning med 2,5 mL odlingsmedium utan FCS.
- För att bedöma att fluorescensen i lumen resulterar av MDR-utsöndring, ta en annan bild och tillsätt 250 μL Verapamil arbetslösning i varje brunn och inkubera 20 min vid 37° C, 5% CO2
- Ta bort lösningen och tillsätt 250 μL AVDR lösning (8 μg/mL slutkoncentration) i varje brunn. Inkubera 4-5 min i mörker vid 37 °C, 5% CO2. Därefter, tvätta med 250 μL av 1x PBS, före bildbehandling (Bild 6B, C).
5. Epitelial polaritet bedömning genom immunofluorescens
- För att förbereda fixeringslösningen, blanda 4% formaldehyd med 5% sackaros, i 1x PBS, pH 7,4 och inkubera i ett vattenbad föruppvärmt vid 37 °C.
- För att fixera cellerna, försiktigt pipettera ut odlingsmediet från brunnen utan att skada matrisen. Tillsätt långsamt 400 μL av fästlösningen på sidan av brunnarna. Inkubera i 20 min vid rumstemperatur (RT).
OBS: Lämna alltid 25 μL av vätskan ovanför matrisen för att förhindra dess skador. - Ta försiktigt bort fästlösningen och tvätta 3x med 400 μL på 1x PBS vid (RT).
- Pipa ut PBS, tillsätt 400 μL permeabiliseringslösning (0,5% Triton X-100 i 1x PBS) och inkubera 10 min vid RT.
- Ta försiktigt bort permeabiliseringslösningen, följt av 3 snabbtvättar med 400 μL av 1x PBS och ett långt tvättsteg på 30 min vid RT.
OBS: Vid detta steg kan objektglaset förvaras vid 4 °C i 2 dagar. I så fall förseglar du objektglaset med en paraffinfilm för att förhindra avdunstning och matrixtorkning. - Ta bort PBS, tillsätt 400 μL av blockerande lösning som innehåller 0,1% bovint serumalbumin (BSA) och 10% getserum i 1x PBS och inkubera i 60 min vid RT.
FÖRSIKTIGHET: Koncentrationer av BSA högre än 0,1% kommer att resultera i lumen upprullning och ytterligare cysta kollaps (se representativa Resultat avsnitt) (Figur 7A). - Pipa ut blockeringslösningen och tvätta en gång med 400 μL PBS/0,05% Tween 20 och kassera.
- Tillsätt 150 μL av antikroppslösningen, t.ex., E-kadherinantikropp utspädd 1:400 och Phalloidin 568 (16,2 nM slutkoncentration) i 1x PBS och inkubera i 90 min vid RT.
OBS: Denna utspädning av E-cadherin är samma som används som i ett standardprotokoll för 2D-immunofluorescens. - Tvätta provet med 400 μL PBS/0,05% Tween 20, 3x; varje gång inkubera provet i 10 min vid RT.
- Tillsätt 150 μL av den sekundära antikroppen (getantikan igG Alexa Fluor Plus 647), späds 1:500 i 1x PBS och inkubera 60 min vid RT.
- Tvätta 3x med 400 μL PBS/0,05% Tween 20, varje gång inkubera provet i 10 min vid RT.
- Tvätta 3x med 400 μL av 1x PBS, varje gång inkuberas provet i 10 min vid RT.
- Kassera PBS av den sista tvätten och förbereda kammaren glida för visualisering via confocal mikroskopi efter ett av de två alternativen nedan.
- Tillsätt 400 μL av 1x PBS och 50 μL DAPI per brunn. Proverna kan undersökas genom brunnens botten utan behov av montering med täckslip (Figur 7B).
- Tillsätt 100 μL per brunn av antifade reagens som innehåller DAPI och låt gliduttorkningen O/N vid RT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bildande och karakterisering av cystor
3D-cellodlingssystem är ett viktigt verktyg för att studera organogenes och sjukdomsmodellering25. Tyvärr är de flesta av dessa metoder kvalitativa eller använda interna kvantifiering utförs på ett enda plan genom att jämföra antalet cystor kontra icke-cystor, i variabel och ofta ospecificerade volymer, förhindra någon jämförelse i termer av cysta formation effektivitet mellan de olika studierna7,8,9,10,15,18,23. Den metod som föreslås i detta protokoll, genom att registrera hela antalet cystor och deras respektive storlekar under tiden för experimentet, möjliggör analys av utvecklingen av cysta bildning och tillväxt (Figur 4).
Baserat på faskontrastbilder, på dag 0, 8 timmar efter cell seedning mestadels små cell aggregat finns inbäddade i hydrogel. På dag 1, små cystor av median diameter av 42,95 (26,53, 50,47) (första, tredje kvartilen) μm och fusion av cystor utspridda i hydrogel märks. Vid dag 4 är det vanligt att observera aggregerade strukturer samt cystor av mediandiametern på 75 (56,48, 97,97) μm. Vid dag 7 och 10 nådde medianen cystdiameter 108.67 (75.31, 141.76) μm och 186.46 (113.98, 278.29) μm, respektive (bild 4A-C). Intressant nog ökar cystbildningen effektivitet från 70,03 ± 5,05 cystor/1000 celler på dag 1 till 99,83 ± 12,81 cystor /1000 celler på dag 4 återstående konstant till dag 10 (Figur 4B), vilket tyder på att cystor bildas i huvudsak från cell aggregat som är närvarande vid tidpunkten för inbäddningen eller som bildar under nästa 48h, genom cellmigration eller fusion av småcelliga aggregat. När det gäller utvecklingen cyststorlek, medan medelstorleken följer en långsam och regelbunden lutning, ökar storleksfördelningen brett längs kulturtiden, vilket illustrerar att de olika cystorna inte växer med samma hastighet. Intressant nog kan detta kopplas till vår observation (inte visat) att cystor inte är jämnt fördelade i hydrogel, de största cystor som ligger i mitten av hydrogelvolymen. Eftersom ökningen av cysta diameter huvudsakligen bygger på utsöndring verksamhet (eftersom celldelningshastigheten är begränsad i NRC härledda cystor), kan man dra slutsatsen att denna verksamhet är mycket beroende av hydrogel egenskaper som inte är homogena i cellen kultur volym.
Vi bekräftade sedan livskraften hos celler efter inbäddning dem i hydrogel (dag 0) och cystor på dag 10 med hjälp av FDA / PI levande färgning (Figur 5A). FDA är en icke-fluorescerande molekyl som endast levande celler, genom en enzymatisk reaktion, kan konvertera till den gröna fluorescerande förening fluorescein26. PI är en icke-permeant molekyl för levande celler som intercalates i DNA av nekrotiska celler27. Intressant, döda celler som utgör mindre än 3% av hela cellerna i odlingsvolymen vid dag 10, finns mestadels utanför cystor, som isolerade celler eller en del av små aggregat. Vi märkte dock att skräp från nekrotiska celler ackumuleras i vissa stora cystor på dag 10 (Figur 5B). Därför rekommenderas för upprätthållandet av cystiska kulturer, passaging av cystor före 10 dagar i dessa villkor.
Funktionell bedömning
I fysiologiska förhållanden, är den huvudsakliga funktionen av konlangiocyter att modifiera canalicular galla via absorptive och secretory mekanismer varav MDR-kanalen är en nyckelspelare28. För att bedöma funktionaliteten hos cystor, inkuberade vi dag 10 cystor med FDA/Hoechst och observerade bildandet av fluorescein och dess utsöndring från basala in i det apikala luminalt utrymme (Figur 6A,B). Således bekräftar att NRCs i cystor behålla sina sekretoriska funktioner. Dessutom hämmades utsöndring av fluorescein av förbehandling av cystor med MDR-hämmaren Verapamil (Figur 6C), som visar att ansamling av fluorescens FDA i lumen berodde på utsöndring genom MDR transportör och inte genom att läcka från det intercellulära utrymmet.
Bedömning av cysta polaritet
För att etablera polarisering av NRC-cystorna genomförde vi en serie optimeringssteg i immunofluorescensprotokollet. En huvudsakliga hindrar i undersökningen av epitelial cell polaritet i cystor är den täta kollapsen av organoid arkitektur under immunofluorescens processen, på grund av läckage av vätskan som ingår i lumen. För att kringgå detta problem har varje steg i immunofluorescensprotokollet utvärderats genom att testa hur olika tillstånd kan påverka upprätthållandet av cystestruktur. Vi fann att modulera den fastställande (formaldehyd (2-4%) + sackaros (5-10%)) eller permeabilization villkor (0,1-1% av både Triton X-100 och sackaros) inte har stor inverkan på den cysta arkitekturen. Dessa intervall kan användas för att starkt fixera och försiktigt permeabilisera kolangiocyterna (Figur 7A). Vi observerade dock att hålla BSA på 0,1% eller mindre under mättnad är ett viktigt steg för att upprätthålla cysta integritet, som högre koncentrationer resultera i cysta upprullning och lumen kollaps (Figur 7A).
Cholangiocyte funktioner är beroende av deras korrekt apico-basolateral polaritet29. För att kontrollera att NRC cystor själv montera i hydrogel som polariserade strukturer, bekräftade vi apikala och basolateral lokalisering av F-aktin och E-cadherin, respektive. E-cadherin uttryck i våra cystor visar också att NRCs behålla sin epitelial fenotyp i hydrogel (Figur 7B) under minst 10 dagar.
Bild 1: Experimentellt arbetsflöde av cystbildning och karakterisering. (A) Hydrogelbeläggning av kammarsglaset. (B) Cellinbäddning i hydrogelen. (C) Mikroskopi av cystbildning. (D) En 10-dagars uppföljning bedömning av cystor tillväxt, livskraft, funktionalitet, och polarisering. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Metod för bildanskaffning. (A) Arbetsflöde av Z-stack förvärvet utförs längs hydrogel djup från dag 1 till 10: Z-stack förvärv (1) bildbehandling av Z-stacken (2) generering av en minsta intensitet projektion och cysta kvantifiering (3). (B) Bildanskaffning programvara skärmdumpar som visar valet av målet (1), justering av parametrar (2), automatisk besparing av bilder (3), och Z-stack kalibrering (4). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Metod för kvantifiering av cyststorlek och cystbildningseffektivitet. (A) Bildbehandling layout föreställande: Z-staplar för att analysera (1), dess minsta intensitet Z-projektion (2), den slutliga Z-projektion efter bakgrund subtraktion (3) används för cysta räkna och cysta storlek uppskattning. (B) Cysta identifiering på projektionen (A3) med en zoom av projektionen (4) för att visa identifiering av cystor som visas av en mörk cell skal omsluter en ljusare lumen, som utmärks av blå linjer plottade för diameter mätning vs aggregat med en mörk och oregelbunden utseende pekade med röda pilar. (C) Formeln för beräkning av cysta formation effektivitet för 1.000 celler. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Cystbildningseffektivitet och cyststorleksfördelning i hydrogelen. (A) Time-lapse som visar representativa faskontrastbilder vid dag 0, 1, 2, 4, 7, och 10 av 3D-kulturerna. (B) Plot graf med kinetiken av medelvärdet cysta bildning effektivitet ± SEM (n = 3). (C) Låda och morrhår tomt som visar cysta storlek fördelning över tiden för kultur. Svarta staplar representerar den första kvartilen, medianen och den tredje kvartilen; linjer representerar bredden på fördelningen; svarta prickar representerar minimum och maximalt av fördelningen, n=3. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Genomg-bärbarhet för NRC-cystor i hydrogelen. (A) Representant fluorescerande levande bilder av kulturer på dag 0 och på dag 10, färgas med FDA (green=live) och PI (red=dead). Observera att den röda fluorescensen främst var förknippad med enstaka celler. (B) Representativ fluorescerande levande bild av en nekrotisk cysta på dag 10, där de döda cellerna (i rött) sågs ackumuleras i lumen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 6: Funktionalitet av NRC-cystor i hydrogelen. (A) Representativa fluorescerande levande bilder av en 10-dagars cysta där cellens skikt avslöjades av atomkärnor märkning med Hoechst (blå) och lumen av utsöndras FDA (grön). (B) Representativ faskontrast/fluorescerande livebilder efter ett utsöndringstest med FDA, som visades ackumulerat i lumen. (C) Efter utläggningen av Verapamil, en MDR-hämmare, representativ faskontrast/fluorescerande levande bilder av cystor som visar att FDA behölls i cellens lager. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 7: Immunofluorescens av NRC-cystor i hydrogelen. (A) Optimering av immunofluorescensprotokollet med ljusa fältbilder som visar representativa cysta former vid varje steg i protokollet. Från vänster till höger: (Living cysta) en levande cysta i komplett medium före fixering, (Fixering) en cysta efter fixering, (Permeabilization) en annan cysta efter permeabilisering, (Mättnad) en cysta efter mättnadssteget och ( Märkning ) encystavid immunolabeling steg. (B) (1-2): Confocal bilder av ett avsnitt genom en cysta som visar den apikala ytmarkören F-aktin (röd-orange), den basolaterala markören E-cadherin (grön) och kärnorna färgas med DAPI (blå). (3): 3D reconstitution av en uppsättning cystor med följande märkningar: röd-orange för F-aktin och grönt för E-cadherin. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Öppning av en stapel. Skärmdump fångar av programvaran som skildrar förfarandet för att öppna en Z-stack. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande figur 2: Stack duplicering. Skärmdump fångar av programvaran som visar processen att duplicera en Z-stack. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande figur 3: Generering av en minsta intensitetsprojektion. Skärmdump fångar av programvaran som illustrerar proceduren för att skapa en minsta intensitet projektion från den duplicerade Z-stacken. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande figur 4: Borttagning av bakgrund. Skärmdump fångar av programvaran porträtterar metoden för att ta bort bakgrunden från Z-stack projektion. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande figur 5: Kontrastförstärkning. Skärmdump fångar av programvaran beskriver stegen för att förbättra kontrasten i Z-stack projektion. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande figur 6: Bildkalibrering. Skärmdump fångar av programvaran avgränsa processen för att kalibrera Z-stacken och Z-stack projektion i mikrometer. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande figur 7: Cysträkning. Skärmdump fångar av programvaran som visar förfarandet för att räkna cystor på Z-stack projektion med den räta-line verktyg. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande figur 8: Kontrollkontroll av cystor som räknar. Skärmdump fångar av programvaran som beskriver metoden för att jämföra antalet cystor räknas på Z-stack projektion och Z-stacken. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande figur 9: ROI-sparande. Skärmdump fångar av programvaran som visar hur man sparar ROI-set som definieras av räknarna. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande figur 10: Cyststorlek och antalsmått. Skärmdump fångar av programvaran beskriver hur man mäter och sparar cysta storlek och cysta nummer från Z-stack projektion och Z-stacken. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att studera organogenes och underhåll av 3D cellulära strukturer, olika vävnader har modellerats, med hjälp av olika cellulära ursprung men också olika typer av extra-cellulära matriser inklusive syntetiska hydrogeler8,9,10,21. Men på grund av brist på 3D kvantitativ analys som möjliggör jämförelser mellan metoder i form av organoider bildande eller funktionalitet7,8,9,10,15,18, ytterligare standardisering för hydrogel eller drog screening förblir utom räckhåll.
För att åtgärda dessa brister föreslår vi en hydrogel-baserade, reproducerbara och standardiserade protokoll för att generera epitelial cell-härledda cystor. Här exemplifierade vi det med bildandet av gallans cystor i en basal lamina härledd hydrogel, från en refererad kolangiocyte cellinje. För att låsa upp begränsningen av 3D-kvantifiering beräknas cystbildningseffektivitet i förhållande till det totala antalet celler som sås in i hydrogelen och cysttillväxtkinetiken mäts över en konstant hydrogelvolym.
Vi tillhandahåller en rad systematiska steg för att generera och karakterisera cystor, för att möjliggöra relevanta cysta kvantitativ analys. I detta syfte har särskilda ansträngningar gjorts för att generera en enhetlig fördelning av cellaggregat vid tidpunkten för hydrogelinbäddning och kringgå heterogeniteten i hydrogelens struktur, vilket påverkar cystbildningen genom att ställa in villkoren för att ha ett representativt prov för cysträkning.
Experimentell reproducerbarhet behandlas genom kritiska steg såsom, filtrering cell suspensioner för att begränsa cellen aggregerad storlek och pre-beläggning av kammaren glider före cell-hydrogel tillägg för att undvika 2D skiktbildning när celler kontakta ytan av odlingskärlet. Konsekvent kvantifiering löses ta bilder längs hydrogelens Z-axel med en konstant uppsättning parametrar över olika prover och experiment.
Cysta bildande effektivitet och cysta tillväxt kinetik uppskattas från det totala antalet celler seedade i hydrogel. Följaktligen föreslås en anpassningsbar algoritm för bildbehandling till segmentbilder för potatiscystnematodsräkning och mått på cyststorlek. Den nya metoden som föreslås är att räkning och mätningar görs på Z-stack prognoser. Efter borttagning av den specifika bakgrunden begränsas antalet bilder som ska analyseras, vilket möjliggör en avsevärd vinst av tid och begränsar hårddiskens mättnad. Immunofluorescens är ett betydande verktyg för att analysera 3D-kulturer på strukturell nivå, i synnerhet polarisering, nyckel i korrekt epitelial cellfunktion4. Således åtog vi oss uppgiften att noggrant optimera fixeringen, permeabiliseringen och blockerande stegen i immunofluorescensdelen av vårt protokoll; felsökning BSA koncentration för att förhindra att cysta upprullning och ytterligare lumen kollaps.
Sammantaget den metod som föreslås öppnar vägen för att generera en enkel, reproducerbara, och kostsamma effektiva protokoll, 3D cellulära kulturer och undersöka kvalitativa och kvantitativa parametrar. Vidare möjliggör denna metod för jämförelser mellan olika typer av matriser: med samma metod med poly(etylenglykol) (PEG)-härledda hydrogeler vi kunde visa att lumen bildning och tillväxt är kritiskt beroende av den hydrogel styvhet och lim, respektive21. Detta protokoll är också tillämpligt för att jämföra bildande och funktion av sfäroider som härrör från olika celler, som skulle kunna delta i standardiseringen av vävnadsspecifika epitelsfäroidmodeller. En begränsning är dock att optimering av odlingsförhållanden som kulturmedia, initial cellsådd och den tid som behövs för cystbildning kan krävas för andra celltyper. I gallgången fältet, detta arbete kan bidra till att svara på frågor om gallgången organogenes, samt molekylära vägar för sjukdom, och drogtester. Detta protokoll kommer också att hitta sin gräns när den tillämpas på hög genomströmning analys eftersom vissa steg som cysta räkna och bildbehandling inte är automatiserade ännu, trots att vi föreslår makron för halvautomatisera bildhantering process som skulle kunna vidareutvecklas för automatisering. Begränsningen till automatisk bearbetning i detta fall är bilden bakgrund. Detta beror på heterogen struktur av naturliga komplexa hydrogels sådana källare membran typ geler, men vi tror att automatisering kan tillämpas på transparenta geler såsom PEG-härledda hydrogels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Nicholas LaRusso (Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, USA), som vänligt förutsatt att NRC cellinje.
Detta arbete fick ekonomiskt stöd av både iLite RHU-programmet (grant ANR-16-RHUS-0005) och DHU Hepatinov.
Vi tackar Isabelle Garcin och Réseau d'Imagerie Cellulaire Paris Saclay för deras stöd på bildframställning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 µl- Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000020 | |
| 100 µl - Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000046 | |
| 1000 µl - Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000062 | |
| 1X PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| 200 µl - Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000054 | |
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma-Aldrich | T5516 | NRC complete medium final concentration = 3.4 µg/mL |
| Acetic acid | VWR | 20104-298 | 0.02N final |
| Aerosol barrier pipettes tips 10 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707439 | |
| Aerosol barrier pipettes tips 1000 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707404 | |
| Aerosol barrier pipettes tips 200 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707430 | |
| Antibiotic Antimicotic Solution (100X) | Sigma-Aldrich | A5955 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Bovine pituitary extract | Thermo Fisher Scientific | 13028-014 | NRC complete medium final concentration = 30 µg/mL |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | 1:1000 dilution |
| Chemically Defined Lipid Concentrate (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11905-031 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Collagen high concentration, rat tail | Thermo Fisher Scientific | 354249 | 50 µg/mL final concentration |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | NRC complete medium final concentration = 0.393 µg/mL |
| DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 21331-020 | NRC complete medium final concentration = 1X |
| E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal | Thermo Fisher Scientific | PA5-32178 | 1:400 dilution |
| Eclipse TE300 inverted microscope | Nikon | imaging | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | NRC complete medium final concentration = 0.32 mM |
| Fetal calf serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution |
| Fluoroshield with DAPI (Mounting medium) | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Formaldehyde 16% (W/V) | Thermo Fisher Scientific | 28906 | 4% (W/V) |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 16210-064 | 1:10 dilution |
| Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA - flash 4.OLT) | Hamamatsu | imaging | |
| Hoechst 33258 | Sigma-Aldrich | B1155 | 5 µg/mL final concentration |
| IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647 | Thermo Fisher Scientific | A32733 | 1:500 dilution |
| ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n | Open source image processing software | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium (100X) | Thermo Fisher Scientific | 51300-044 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 356231 | 4:10 dilution |
| NIS Elements software version 4.50.00 | Nikon | image acquisition and display | |
| Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (∞/1.2 WD 15.2) | Nikon | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 20 µg/mL final concentration |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | R415 | 16.2 nM final concentration |
| Sir-Actin / Verapamil kit | Spirochrome | SC001 | 10 µM final concentration |
| Soybean trypsin inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 17075-029 | NRC complete medium final concentration = 50 µg/mL |
| Sterile cell strainer 40 µm (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 11926955 | |
| Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 7200886 | |
| Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 553913 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | 5:100 dilution |
| Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon) | Thermo Fisher Scientific | 353108 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 5:1000 dilution |
| Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | 1X |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 5:10000 dilution |
| Vitamin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11120-037 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| μ-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi | Clinisciences | 80826 |
References
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Martín-Belmonte, F., et al. Cell-polarity dynamics controls the mechanism of lumen formation in epithelial morphogenesis. Current Biology. 18, 507-513 (2008).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging Cells in Three-Dimensional Collagen Matrix. Current Procotols in Cell Biology. , Chapter 10 (Unit 10) (2010).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bisell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9064-9068 (1992).
- Kim, S. P., Lee, D. H., Park, J. K. Development of hepatocyte spheroids immobilization technique using alternative encapsulation method. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 3, 96-102 (1998).
- Lorent, K., et al. Identification of a plant isoflavonoid that causes biliary atresia. Science Translational Medicine. 7 (286), 67 (2015).
- Nowak, M., Freudenberga, U., Tsurkana, M. V., Wernera, C., Levental, K. R. Modular GAG-matrices to promote mammary epithelial morphogenesis in vitro. Biomaterials. 112, 20-30 (2017).
- Miroshnikova, Y. A., et al. Engineering Strategies to Recapitulate Epithelial Morphogenesis Within Synthetic Three-Dimensional Extracellular Matrix With Tunable Mechanical Properties. Physical Biology. 8 (2), 026013 (2011).
- Ozdemir, T., et al. Tuning Hydrogel Properties to Promote the Assembly of Salivary Gland Spheroids in 3D. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (12), 2217-2230 (2016).
- Dolega, M. E., Abeille, F., Picollet-D'hahan, N., Gidrol, X. Controlled 3D culture in Matrigel microbeads to analyze clonal acinar development. Biomaterials. 52, 347-357 (2015).
- Laperrousaz, B., et al. Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens. Nucleic Acids Research. 46 (12), 70 (2018).
- Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F.
- Tam, P. K., Yiua, R. S., Lendahl, U., Andersson, E. R. Cholangiopathies - Towards a molecular understanding. EBioMedicine. 35, 381-393 (2018).
- Loarca, L., et al. Development and characterization of cholangioids from normal and diseased human cholangiocytes as an in vitro model to study primary sclerosing cholangitis. Laboratory Investigation. 97, 1385-1396 (2017).
- De Assuncao, T. M., Jalan-Sakrikar, N., Huebert, R. C. Regenerative medicine and the biliary tree. Seminars in Liver Disease. 37, 17-27 (2017).
- Dianat, N. H., et al. Generation of functional cholangiocyte-like cells from human pluripotent stem cells and HepaRG cells. Hepatology. 60, 700-714 (2014).
- Masyuk, A. I., et al. Cholangiocyte autophagy contributes to hepatic cystogenesis in polycystic liver disease and represents a potential therapeutic target. Hepatology. 67 (3), 1088-1108 (2018).
- Sampaziotis, F., Cardoso, M., Madrigal, P., Bertero, A., Saeb-Parsy, K., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nature Biotechnology. 33 (8), 845-852 (2015).
- Soroka, J. C., et al. Bile-Derived Organoids From Patients With Primary Sclerosing Cholangitis Recapitulate Their Inflammatory Immune Profile. Hepatology. 70 (3), 871-882 (2019).
- Funfak, F., et al. Biophysical Control of Bile Duct Epithelial Morphogenesis in Natural and Synthetic Scaffolds. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7 (417), 417 (2019).
- Du, Y., et al. Bile Duct-on-a-Chip With Organ-Level Functions. Hepatology. 0 (0), (2019).
- Shiota, J. M., Mohamad Zaki, N. H., Merchant, J. L., Samuelson, L. C., Razumilava, N. Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts. Journal of Visualized Experiments. (146), e59544 (2019).
- Bircsak, K. M., Richardson, J. R., Aleksunes, L. M. Inhibition of Human MDR1 and BCRP Transporter ATPase Activity by Organochlorine and Pyrethroid Insecticides. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (2), 157-164 (2013).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., Blitterswijk, C., Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Kanade, S., Nataraj, G., Ubale, M., Mehta, P. Fluorescein Diacetate Vital Staining for Detecting Viability of Acid-Fast Bacilli in Patients on Antituberculosis Treatment. International Journal of Mycobacteriology. 5 (3), 294-298 (2016).
- Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death. Journal of Visualized Experiments. (50), e2597 (2011).
- Tabibian, J. H., Masyuk, A., Masyuk, T. V., O'Hara, S. P., LaRusso, N. F.
- Spirlì, C., et al. Functional polarity of Na+/H+ and Cl-/HCO3- exchangers in a rat cholangiocyte cell line. American Journal Physiology. 275, 1236-1245 (1998).
