Summary
Ce protocole permet la préparation de sections transversales de graines de céréales (par exemple, le riz) pour l’analyse de la morphologie des endospermes et des granules d’amidon à l’aide de la microscopie électronique à balayage.
Abstract
Les granules d’amidon (SG) présentent des morphologies différentes selon les espèces végétales, en particulier chez l’endosperme de la famille des Poaceae. Le phénotypage des endospermes peut être utilisé pour classer les génotypes en fonction du morphotype SG à l’aide d’une analyse microscopique électronique à balayage (MEB). Les SG peuvent être visualisés à l’aide de SEM en tranchant à travers le noyau (péricarpe, couches d’aleurone et endosperme) et en exposant le contenu organellaire. Les méthodes actuelles exigent que le noyau de riz soit incorporé dans une résine plastique et sectionné à l’aide d’un microtome ou incorporé dans une pointe de pipette tronquée et sectionné à la main à l’aide d’une lame de rasoir. La première méthode nécessite un équipement spécialisé et prend beaucoup de temps, tandis que la seconde introduit une nouvelle série de problèmes en fonction du génotype du riz. Les variétés de riz crayeux, en particulier, posent un problème pour ce type de sectionnement en raison de la nature friable de leur tissu endosperme. Présenté ici est une technique pour préparer des sections de grains de riz translucides et crayeux pour la microscopie, ne nécessitant que des pointes de pipette et une lame de scalpel. La préparation des sections dans les limites d’une pointe de pipette empêche l’endosperme du noyau de riz de se briser (pour les phénotypes translucides ou « vitreux ») et de s’effriter (pour les phénotypes crayeux). En utilisant cette technique, on peut observer le motif des cellules endospermes et la structure des SG intacts.
Introduction
Les granules d’amidon (SG) présentent des morphologies différentes selon les espèces végétales, en particulier chez les endospermes de la famille des Poaceae 1,2. Le phénotypage des endospermes peut être utilisé pour classer les génotypes en fonction du phénotype SG à l’aide d’une analyse microscopique électronique à balayage. Les SG peuvent être visualisés à l’aide de la microscopie électronique à balayage (MEB) en tranchant le noyau et en évinçant les parois cellulaires de l’endosperme2.
Le but de cette technique est de préparer facilement des sections transversales de grains de riz uniquement pour l’analyse SEM rapide. Le développement de cette technique a été motivé par la nécessité d’une approche de coupe transversale rapide dans laquelle les échantillons sont préparés pour la microscopie SEM immédiatement avant la visualisation à l’aide d’un équipement minimal.
Cette technique implique l’insertion du grain de riz décortiqué dans la pointe de la pipette pour une immobilisation complète. Ceci est particulièrement important lors de la coupe transversale des phénotypes de noyau de riz crayeux, qui sont friables et s’effritent facilement sous pression3. La craie est une qualité indésirable dans le riz car elle affecte l’apparence de l’amande et provoque la rupture facile de l’amande lors du polissage et du broyage3. La craie se présente comme une zone opaque dans une section transversale du noyau qui peut être observée à l’œil nu; au niveau microscopique, la craie est caractérisée par de petits granules d’amidon lâchement emballés. Les causes de la craie peuvent êtregénétiques4,5 ouenvironnementales 6,7.
Les coupes transversales de semences de céréales ont traditionnellement été préparées à l’aide de méthodes de fixation chimique et de sectionnement après l’incorporation de l’échantillon dans de la cire de paraffine ou une autre matrice solide4,8,9,10. En 2010, la méthode Matsushima a été introduite comme un moyen d’éviter la préparation compliquée et fastidieuse d’échantillons de grains de riz4. Cette méthode impliquait l’insertion du grain de riz décortiqué dans une pointe de pipette tronquée. La pointe est maintenue immobile par une tondeuse à blocs et de fines sections partielles d’endosperme sont récoltées à l’aide d’une lame de rasoir portative. Une autre technique rapide développée en 2016 a permis de sectionner toutes une grande variété de graines sèches, y compris des variétés crayeuses10. Ces méthodes ont motivé le développement de la technique rapide présentée ici.
Cette nouvelle technique convient aux chercheurs qui souhaitent obtenir des coupes transversales intactes de grains de riz pour le phénotypage des endospermes et l’analyse de la morphologie de l’amidon à l’aide de SEM.
Ce protocole représente une adaptation de la méthode4de la pointe de pipette tronquée de Matsushima, avec plusieurs modifications notables : (1) les amandes ne sont absorbées à aucun point de la technique ; 2° ni une tondeuse à blocs ni un ultramicrotome ne sont nécessaires pour préparer les sections. Un cultivar « translucide » de type sauvage (Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) et une lignée mutagénisée « crayeuse » de Nipponbare (ssg1, grain d’amidon de qualité inférieure1)4 ont été examinés dans cette étude. Ces deux cultivars ont été sélectionnés pour l’analyse ici afin de démontrer les différences techniques et visuelles dans le traitement des sections de riz translucides et crayeux.
Protocol
1. Préparation de la section transversale de riz
- Déscursser les grains secs et intacts, comme le montre la figure 1A.
- Desserrez les enveloppes et débrayez les grains de riz en broyant les grains entre deux bouchons plats en caoutchouc. Retirez les grains de riz décortiqués de la panicule, si nécessaire.
- Placez un seul noyau sur un bouchon plat en caoutchouc sur un établi(Figure 1B). Assurez-vous que ce bouchon reste immobile.
- Utilisez un deuxième bouchon plat en caoutchouc (Figure 1C) pour abraser le noyau en le tordant contre le premier bouchon en caoutchouc, en utilisant une pression suffisante (Figure 1D). Retirez les enveloppes du noyau, en prenant soin de ne pas briser l’endosperme. Retirez toute enveloppe restante à l’aide d’une pince fine. Un noyau décortiqué est illustré à la figure 1E.
- À l’aide de pinces fines, insérez un noyau décortiqué individuel dans une pointe de pipette en plastique (taille de 250 μL, une graine/pointe) (Figure 1F). S’assurer que l’extrémité embryonnaire du noyau est orientée vers l’extrémité (conique) de l’extrémité de la pipette(Figure 1G).
REMARQUE: L’insertion du noyau de cette façon garantit que le noyau s’adaptera aussi bien que possible à l’extrémité de la pipette, car le noyau est plus étroit vers son extrémité proximale. - Insérez une deuxième pointe de pipette de 250 μL pour forcer le noyau dans l’embout de la pipette et pour garder le noyau immobile pendant le sectionnement, en prenant soin de ne pas endommager le noyau ou de plier la deuxième pointe de pipette (Figure 1H). L’assemblage approprié du « télescope » est indiqué à la figure 1I.
- Posez l’assemblage de la pointe de la pipette à plat sur un établi et maintenez-le en place à la main (Figure 1J). D’autre part, utilisez une lame de scalpel tranchante (n ° 20) pour trancher le centre du noyau et couper l’extrémité de la pointe de la pipette (Figure 1K). À l’aide du scalpel, couper des sections de 1 mm d’épaisseur du grain de riz(Figure 1L).
REMARQUE: La section du noyau est étroitement enfermée dans un anneau de plastique (Figure 1M). L’épaisseur moyenne de la section pour trois génotypes exemplaires se trouve dans le tableau 1. Les sections significativement plus minces que 1 mm se briseront ou s’effriteront. Il est important de noter de quelle partie du noyau provient chaque section si cette expérience est réalisée sur plusieurs variétés de riz à des fins de comparaison, car la morphologie de l’amidon varie tout au long de l’endosperme11.
2. Microscopie à lumière réfléchie de sections transversales de riz
- Utilisez des pinces fines pour placer les sections transversales de riz (préparées dans la section 1) sur un morceau noir de papier noir de calibre lourd.
- Obtenez des images lumineuses de sections transversales de Nipponbare à l’aide d’un stéréomicroscope avec des cols de cygne montés pour un éclairage oblique, comme le montre la figure 1N-S.
- Observez la morphologie de l’endosperme sous un grossissement d’au moins 10x.
REMARQUE: Toute source d’épilumière est préférable à la microscopie à champ lumineux car les sections obtenues à l’aide de cette technique ne sont pas assez minces pour que la lumière puisse passer.
3. Microscopie électronique à balayage de sections transversales de riz
- Placez les échantillons sur un disque de carbone collé à un talon en aluminium et placez-les sur un porte-échantillon de réduction de charge. Retirez l’anneau en plastique du support de la pointe de la pipette à l’aide de pinces fines pour empêcher le plastique de pénétrer dans l’appareil à vide du SEM.
REMARQUE: Les images des cellules endospermes, des SG et des sous-subventions sont obtenues à l’aide d’une machine SEM de bureau qui ne nécessite pas que les échantillons soient enduits de pulvérisation. - Obtenez les images à l’aide d’un détecteur d’électrons à rétrodiffusion multimode (ESB) haute sensibilité à 10 kV.
Representative Results
Les sections Nipponbare de type sauvage (Figure 2A) et ssg1 (Figure 2B) ont été examinées sous trois grossissements : 260x, 920x et 4200x. Cette technique permet de préparer des sections de qualité suffisante pour observer l’ensemble de la cellule endosperme (Figure 3A), des granules d’amidon composés (Figure 3B), et des sous-abreuilles individuels (Figure 3C). Les amandes décortiquées prennent plus de temps à traiter que les amandes polies, car les coques sèches doivent être éliminées par abrasion avant le sectionnement. Les grains crayeux prennent également plus de temps à traiter que les grains translucides polis, car il faut veiller à ne pas briser le noyau pendant le sectionnement. Une section de riz bien préparée doit avoir une épaisseur d’environ 0,9 mm (Tableau 1) avec un éclatement minimal ou nul de l’endosperme (Figure 1N) et des couches intactes de péricarpe et d’aleurone (Figure 1O). Un mauvais placement du scalpel sur l’extrémité de la pipette lors du sectionnement peut conduire à des sections « ébréchées »(Figure 1P). De même, des images en champ clair de sections transversales optimales de ssg1 (Figure 1Q)ont montré intactes des couches d’endosperme, de péricarpe et d’aleurone intactes et disponibles pour la visualisation (Figure 1R). Une section de noyau crayeux cassée (Figure 1S) peut toujours être utilisable pour la visualisation si le seul but est d’observer les SG, mais le motif de cellule endosperme ne sera pas visible. Une section cassée peut être difficile à manipuler pour l’analyse. Un plus grand cisaillement des parois cellulaires des endospermes a été observé chez les Nipponbare de type sauvage, car les cellules sont plus serrées et moins friables que les grains ssg1. Aucun cisaillement des cellules d’endosperme n’a été observé dans les sections ssg1 et les granules d’amidon composés sont intacts.
La figure S1 démontre la fiabilité des résultats à l’aide de la technique du « télescope » pour couper les grains de riz. Les lignées de riz identifiées comme producteurs de grains translucides – lignée hybride d’amidon résistant (RS) de type sauvage Xieyou 7954 (Oryza sativa L. ssp. indica) 12,13,14( Figure S1A ) et mutantrs111 13,15générée par cobalt(Figure S1B) ont produit des sections à travers lesquelles la lumière était visible à l’aide d’un stéréomicroscope. Les images SEM correspondantes ont révélé que ces lignes produisent le phénotype « normal » de l’endosperme de riz: des granules d’amidon polyédrique étroitement emballés. Les producteurs de noyaux crayeux, la variété commerciale Yi-Tang16 (Figure S1C)et RS413,un mutant de RS11115 (Figure S1D),présentaient des sections de noyau blanches et opaques. Les images SEM correspondantes affichaient une morphologie nettement différente de celle de la ligne de fond RS translucide de type sauvage: les granules d’amidon étaient ronds et lâchement emballés. Le type sauvage Xiushui 11 (Oryza sativa L. ssp. japonica) (Figure S1E) et son mutant, KMD1 (Kemingdao1), qui expriment le gène Cry1Ab pour inhiber la prédation des insectes17,18,19 ( FigureS1F) présentaient des sections et des morphotypes d’endospermes similaires aux lignées RS translucides.
La technique présentée ici est optimale pour préparer des échantillons de grains de riz de type crayeux pour l’analyse phénotypique, mais offre également des avantages pour la section des phénotypes translucides de grains de riz20: trancher les échantillons en utilisant la pression d’en haut réduit le risque de rupture de l’endosperme et de luxation. Les échantillons peuvent facilement être préparés en quelques secondes (Tableau 2). Plusieurs génotypes ont été analysés à l’aide de cette technique pour tester son efficacité (Tableau 3). Comme le montre la figure S2,cette technique peut être appliquée aux graines d’autres espèces. Le modèle monocotylédone Brachypodium distachyon produit des graines très dures contenant uniquement de l’amidonB-granule 21, qui manque de puroindoline A, une protéine qui confère une douceur aux granules d’amidon22. Il était encore possible d’obtenir une section transversale intacte(figure S2A). L’obtention d’une section transversale intacte à partir de blé d’hiver blanc tendre (SWWW) était difficile, mais peut être réalisée(figure S2B). Les graines SWWW sont riches en puroindoline A et grosses par rapport aux graines de B. distachyon et aux grains de riz. Ces graines s’effritent fréquemment lors de la section à l’aide de l’assemblage du télescope.
| Génotype | Largeur moyenne de section (μm) à l’aide de l’assemblage de télescopes | Largeur moyenne de section (μm) sectionnement à main levée |
| Nipponbare (décortiqué) | 971,7 ± 152,4ab | 1059.571 ± 394.2ab |
| Xieyou 7954 | 825,1 ± 128,3b | 1306,187 ± 179,1a |
| RS4 | 910,6 ± 165,0ab | 1126.694 ± 395.3ab |
| Les moyennes suivies des mêmes lettres ne sont pas significativement différentes à P < 0,01 en utilisant une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) et le test de Tukey (n = 10). Les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide du logiciel JMP 15. | ||
Tableau 1 : Épaisseur moyenne de la section du noyau.
| Génotype | Temps moyen(s)* |
| Nipponbare (décortiqué) | 14,7 ± 1,36a |
| Xieyou 7954 | 9,81 ± 0,98b |
| RS4 | 11,9 ± 1,28c |
| *Utilisation de l’assemblage du télescope. | |
| Les moyennes suivies des mêmes lettres ne sont pas significativement différentes à P < 0,01 en utilisant une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) et le test de Tukey (n = 10). Les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide du logiciel JMP 15. | |
Tableau 2 : Temps moyen de préparation de l’échantillon.
| Génotype | Arrière-plan | Qualité |
| Nipponbare | Type sauvage | Translucide |
| Grain d’amidon de qualité inférieure1 (ssg1) | Nipponbare | Calcaire |
| Amidon résistant (RS) Xieyou 7954 | Type sauvage | Translucide |
| RS111 | Xieyou 7954 | Translucide |
| RS4 | RS111 | Calcaire |
| Yi-Tang, 'New Life', marque Lujuren | Xieyou 7954 | Calcaire |
| Xiushui 11 | Type sauvage | Translucide |
| Kemingdao1 (KMD1) | Xiushui 11 | Translucide |
Tableau 3 : Génotypes de riz examinés dans la présente étude.
Figure 1 : Préparation des sections transversales de riz. (A) Noyau Nipponbare de type sauvage avec enveloppe intacte. (B). Noyau placé sur un bouchon plat en caoutchouc de quatre pouces de diamètre. (C) Les enveloppes ont été enlevées en broyant l’amande entre deux bouchons en caoutchouc apposant. (D) L’enveloppe a été séparée du grain de riz. (E) Gros plan sur le grain de riz décortiqué. La fin de l’embryon est indiquée. (F) Insertion de l’amande dans l’extrémité de la pipette à l’aide de pinces fines. (G) Le noyau a été logé dans l’extrémité distale de l’extrémité de la pipette. (H) Insertion de la deuxième pointe de pipette pour immobiliser le noyau en vue du sectionnement (assemblage « télescope »). (I) Le grain de riz était bien ajusté dans l’extrémité distale de l’extrémité de la pipette. J) Sectionnement du grain de riz à l’intérieur de l’assemblage. (K) Gros plan de la coupe de section. (L) Section de l’amande entourée de l’anneau en plastique. (M) Gros plan de la section transversale. (N) Section transversale de type sauvage Nipponbare. (O) Gros plan de l’endosperme dans la section de type sauvage Nipponbare. (P) Section pauvre et sous-optimale de noyau Nipponbare de type sauvage. (Q) Section transversale du mutant Nipponbare ssg14. (R) Gros plan de l’endosperme dans la section ssg1. (S) Section pauvre et sous-optimale de ssg1. Barre (panneaux A, N-S)= 1 mm. Le grain de riz entier et des sections ont été photographiés à l’aide d’un stéréomicroscope avec un appareil photo zoom numérique et des lumières en col de cygne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images SEM de sections transversales du noyau. (A) Nipponbare de type sauvage, un cultivar translucide. Les granules d’amidon composés ont été cimentés hermétiquement les uns aux autres; (B) Nipponbare mutant ssg14, un phénotype crayeux. Les granules d’amidon composés étaient faiblement emballés et n’avaient pas la nature cimentaire du morphotype d’amidon Nipponbare de type sauvage. Grossissement de gauche à droite : 260x, 920x et 4200x. La longueur de la barre est indiquée dans les panneaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Anatomie microscopique SEM d’une section transversale du noyau de Xiushui 11. (A) Une seule cellule endosperme est soulignée en rouge. Grossissement 260x. (B) Un granulé d’amidon composé est souligné en rouge. Grossissement 920x. (C) Les sous-dividendes multiples de l’amidon sont soulignés en rouge. Grossissement 2250x. Les longueurs de barres sont indiquées dans les panneaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure S1 : Sections transversales d’autres génotypes de riz préparés pour le MEB à l’aide de cette technique. (A) Amidon résistant (RS) Xieyou 795412. (B) RS111, un mutant transparent à haute RS de 795413. (C) RS4, un mutant crayeux de RS11115. (D) Yi-Tang, une variété commerciale de riz à haute teneur en amylose16. (E) Xiushui 11. (F) KMD1 (Kemingdao1)17,18,19. Grossissement 10x pour les images en champ lumineux. Barre blanche = 1 mm. Grossissement 2250x pour les images SEM. Les longueurs de barres sont indiquées dans les panneaux. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.
Figure S2 : La technique est utile pour d’autres graines. (A) Section transversale de fausses graines de brome pourpre (Brachypodium distachyon L. accession Bd21). (B) Section transversale de semences de blé d’hiver blanc tendre (Triticum aestivum L. cv. Augusta). Champ lumineux, grossissement 20x. Barre = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.
Discussion
La technique présentée ici représente une approche rapide, simple et précise de la préparation de coupes transversales de riz pour la visualisation SEM de bureau. Cette technique de sectionnement permet l’observation rapide de la structure de l’endosperme, de la forme, de la taille et du motif des cellules de l’endosperme, des granules composés et de la morphologie de l’amidon. Aux fins du phénotypage de l’endosperme et du dépistage du matériel génétique, il est essentiel d’obtenir une section transversale entière du noyau de riz4,23,24. Il est primordial d’insérer le noyau entièrement dans l’extrémité de la pipette pour éviter que la pression de la lame du scalpel ne force l’endosperme à s’effriter ou à se briser. À condition que l’assemblage du « télescope » soit correctement construit, les échantillons peuvent être préparés pour la visualisation dans les 15 secondes(tableau 2)en utilisant des matériaux déjà en main dans un environnement de laboratoire typique. Cette technique est applicable à la coupe transversale de toute graine ellipsoïdale d’environ quatre millimètres de diamètre à son point le plus large. Les graines de l’herbe modèle Brachypodium distachyon (Figure S2A) peuvent être sectionnées de la même manière mais ne restent pas enfermées dans l’anneau. Les graines plus grosses, comme le blé, se fracturent facilement et nécessitent des soins lors du sectionnement(figure S2B).
Cependant, il existe plusieurs limites à la technique présentée ici. Les sections obtenues à l’aide de cette technique ne sont pas assez minces pour que la lumière puisse passer, ce qui interdit l’utilisation de cette technique pour les approches microscopiques à base de lumière transmise comme le champ lumineux (épaisseur maximale de l’échantillon de 500 μm pour les sections de grains de riz25)et la microscopie électronique à transmission (TEM) (épaisseur maximale de l’échantillon de 500 nm26 ). L’utilisation d’une pointe de pipette comme « matrice » de sectionnement limite également la taille des graines qui peuvent être sectionnées à l’aide de cette technique. Un dépannage supplémentaire serait nécessaire pour adapter cette technique à des espèces très différentes du riz, et la taille de la « matrice » est limitée par la taille des embouts de pipette disponibles à l’achat.
Un autre avantage distinct de cette technique est la qualité des échantillons qui peuvent être produits à partir de grains de riz phénotypiques crayeux. Il convient de noter que même l’étude de Matsushima a admis qu’il était difficile d’obtenir des coupes transversales en utilisant cette méthode particulière pour les phénotypes crayeux4, tels que reproduits dans cette étude à des fins de comparaison(Figure 1S). Dans leur cas, il est devenu nécessaire de fixer chimiquement leurs échantillons de riz crayeux et de les incorporer dans de la résine pour le sectionnement. La nouvelle technique, associée à l’imagerie SEM de bureau, permet au chercheur de préparer facilement des sections transversales de grains de riz pour la microscopie avec plus de cohérence que sans support d’immobilisation (Tableau 3).
Dans la nouvelle ère de la phénomique et de la métabolomique, il est important de surveiller les lignées mutagénisées et les bibliothèques marquées par transposon pour mieux comprendre la fonction et l’importance de l’amidon dans les graines. En outre, la Banque internationale de gènes du riz détient plus de 130 000 accessions de riz27. Une technique rapide de phénotypage des graines comme celle présentée ici accélérerait la classification et l’échantillonnage pour la qualité nutritionnelle28. Enfin, cette technique peut être utile à la lumière des impacts du changement climatique qui empiètent. Le stress saisonnier à haute température pendant le remplissage des grains avait déjà été identifié comme une cause majeure de craie6, mais des études récentes ont impliqué la hausse des températures mondiales dans l’augmentation de la craie des rendements en riz7,29. Un tel phénotypage accéléré de l’endosperme peut aider à fournir une image agricole large de l’effet de l’augmentation des températures mondiales.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Systems for Research (SFR Corp.) pour l’utilisation de leur instrument Phenom ProX Desktop SEM, ainsi que pour l’assistance technique fournie par Maria Pilarinos (Systems for Research (SFR) Corp.) et Chloë van Oostende-Triplet (Cell Biology and Image Acquisition Core Facility, Faculté de médecine, Université d’Ottawa). Le financement a été fourni par le Fonds d’innovation à faible émission de carbone (LCIF) du ministère du Développement économique, de la Création d’emplois et du Commerce du gouvernement de l’Ontario et de Proteins Easy Corp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| JMP 15 | SAS | N/A | N/A |
| Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100) | Agar Scientific | AGG3347N | N/A |
| Phenom Pro Desktop SEM | Thermo Scientific | PHENOM-PRO | N/A |
| Pipette Tips RC UNV 250 µL | Rainin | 17001116 | N/A |
| SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium | Micro to Nano | 10-002012-50 | N/A |
| Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm | Thermo Scientific | 3120019 | N/A |
| Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm | Thermo Scientific | 28618256 | N/A |
| Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle | Thermo Scientific | 5334 | N/A |
| Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope | Zeiss | N/A | N/A |
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