Summary
该协议提供了使用复杂的输送和监测系统准确输送磁性纳米颗粒热疗所需的技术和方法。
Abstract
热疗长期以来一直用于治疗癌症。技术从热铁棒的肿瘤内插入到全身递送的肿瘤抗体靶向磁性纳米颗粒，温度从39°C（发烧水平）到1，000°C（电灼），治疗时间从几秒钟到几小时不等。温度-时间关系（热剂量）决定了高热剂量导致组织消融和低热剂量导致亚致死效应的效果，例如血流量增加、药物积累和免疫刺激。目前最有前途的医学疗法之一是磁性纳米颗粒热疗（mNPH）。该技术涉及激活磁性纳米颗粒，该纳米颗粒可以通过非侵入性，无毒的交变磁场进行全身或肿瘤内递送。磁性纳米颗粒的大小、构造和关联以及磁场的频率和场强是主要的加热决定因素。我们开发了先进的仪器和技术，用于在大型和小型动物模型和培养细胞中提供可重复的磁性纳米颗粒热疗。这种方法在多个位置使用连续的实时温度监测，允许将明确定义的热剂量输送到目标组织（肿瘤）或细胞，同时限制非目标组织加热。精确控制和监测多个站点的温度，并使用行业标准算法（43 °C /CEM43 下的累积等效分钟数），可以准确测定和量化热剂量。我们的系统允许各种温度、热剂量和生物效应，是通过商业收购和内部工程和生物学开发相结合而开发的。该系统已经过优化，允许在离体、体外和体内技术之间快速转换。该协议的目标是演示如何设计，开发和实施有效的技术和系统，以提供可重复和准确的磁性纳米颗粒治疗（mNP）热疗。
Introduction
热疗历来用于癌症治疗，无论是单独使用还是与其他治疗联合使用。尽管它有很长的使用历史，但提供这种治疗的最有利方法仍在争论中，并且取决于疾病部位和位置。热疗方法包括微波、射频、聚焦超声、激光和金属纳米颗粒（如金或氧化铁）1，2，3，4。这些输送方法可以导致从发烧水平到数百摄氏度的一系列治疗温度。热疗的生物学效应主要取决于使用的温度和治疗的持续时间5。对于这份手稿和目的，我们专注于磁性纳米颗粒热疗（mNPH）。该方法允许使用无毒、FDA批准的氧化铁纳米颗粒进行集中，局部，良好监测和控制的温度变化。
其他热疗方式的一个缺陷是缺乏精确的细胞靶向;热疗没有固有的高治疗比例，因此，仔细的测温和靶向是必要的6.mNPH允许全身或肿瘤内注射mNPs，仅在mNPs所在的位置产生热量，从而直接针对肿瘤进行治疗。当磁性纳米颗粒位于细胞内部或外部时，mNPH可能有效。对于癌症治疗，mNPH的一般概述是注射磁性纳米颗粒（肿瘤内或静脉内），然后施加交变磁场，使纳米颗粒磁极不断重新排列，导致与纳米颗粒相关的细胞和组织的局部加热7，8.通过调整纳米颗粒的体积和交变磁场（AMF）的频率/强度，可以仔细控制组织内产生的温度。
这种治疗在靠近体表的肿瘤中效果很好，因为更深的肿瘤需要更强的AMF，因此涡流加热的风险增加9。有证据表明热疗在临床上被用作单一疗法，然而，通常热疗与放射治疗或化疗相结合，导致更有针对性的抗癌作用10，11，12。热疗与放疗联合使用的临床证据在先前的出版物13中进行了回顾。我们的实验室使用mNPH方法12，14，15成功治疗了各种动物，从小鼠到猪和自发性犬癌。该方案专为那些有兴趣研究局部热疗效果的人而设计，无论是单独使用还是与其他疗法联合使用。
热疗最重要的因素之一是能够实时测量和理解传递到靶标/肿瘤组织的热剂量。计算和比较剂量的标准方法是通过演示在43°C下加热的累积等效分钟数;该算法允许比较独立于输送系统、最高和最低温度（在特定范围内）和加热/冷却参数5，16 的剂量。CEM计算最适合39-57°C之间的温度5。例如，在我们进行的一些研究中，我们选择了CEM43 30的热剂量（即在43°C下30分钟）。选择这种剂量使我们能够在体外观察安全，有效的免疫遗传效应，无论是单独使用还是与单剂量辐射结合使用17。
对于磁性纳米颗粒热疗，在构建适当的输送系统时需要考虑几个因素。仪器设计包括重要的安全因素，例如使用冷却器来确保磁场输送设备即使在高功率下运行时也能保持冷却，以及故障安全程序，如果所有温度、功率评估和控制系统尚未激活，则防止系统打开。此外，对于体内和体外情况，需要考虑一些重要的生物学因素。使用培养细胞时，有必要在生长培养基中处理并保持一致的活温度，以避免可能影响结果的生理变化。对于单个纳米颗粒类型，在计算基于AMF的加热参数时，了解比吸收率（SAR）非常重要。同样，了解细胞和组织中的mNP / Fe浓度对于实现所需的加热是必需的也很重要。体内方法需要更加注重细节，因为在治疗期间必须将动物保持在麻醉下，并且在整个治疗过程中动物的核心体温保持在正常水平。允许动物的体温下降，就像在麻醉下发生的那样，会影响整体结果，相对于被治疗组织的热剂量。
在这篇手稿中，我们讨论了用于设计和构建多功能磁性纳米颗粒热疗系统的方法，以及需要考虑的重要使用因素。所描述的系统允许稳健、一致、生物学上适当、安全和控制良好的磁性纳米颗粒热疗输送。最后，应该注意的是，我们进行的mNPH研究通常涉及其他疗法，例如放疗，化学疗法和免疫疗法。为了使这些结果有意义，重要的是要确定传递的热量如何影响其他方式的功效和/或安全毒性（反之亦然）以及动物的健康。由于这个原因以及前面提到的剂量学和治疗情况，必须严格注意磁性纳米颗粒热疗的剂量精度以及连续的核心和目标温度测量。该协议的目标是为输送安全有效的磁性纳米颗粒热疗提供一种简单，一致的方法和描述。
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Protocol
达特茅斯学院动物护理和使用计划由美国实验动物护理认证协会（iAAALAC）认可，并遵守所有UDSA和NIH（实验动物福利办公室）指南和法规。所有体内研究均获得达特茅斯学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。安乐死程序遵守 2020 年 AVMA 动物 安乐死指南。
1. 系统的仪表/设计
- 将定制的AMF天线（线圈）设计为闭环，选择形状以创建所需的磁场。使用发电机选择中的电感公式和特性来设计兼容的线圈以产生所需的磁场。使用不同的设计进行体外和体内实验。
- 确保AMF天线电感在发电机的可接受范围内。添加或减去电容器以使天线与发电机匹配（调谐）。
- 对于体外实验，设计一个 14 圈螺旋线圈，内径 2 cm，长度 14 cm，可以包含 1.5 mL 管，允许同时处理多个样品。用乙烯基聚合物绝缘线圈，并使用聚苯乙烯垫片将线圈与管子分开。设计规范和考虑因素的详细信息见 补充文件 1。
- 对于体内实验，请从具有专有设计信息的制造商处购买定制的全身螺旋线圈。使用8毫米方形管（因为它在线圈孔内产生更均匀的磁场），并在目标治疗区域使用浓缩器。使浓缩器长 5.0 厘米，总共转 5 圈，产生 3.6 厘米内径、5.2 厘米外径，并将其定位在目标治疗区域。用聚碳酸酯外壳包围线圈。
- 使用功率和频率可调的AMF发电机作为电源，额定功率为10kW或更高。电感将电源和天线/线圈匹配在 0.62 至 1.18 μH 的范围内，允许频率范围在 30-300 kHz 之间。通过离心增压泵使用循环水冷却发电机，压力调节至 50 psi。
- 用 5.6 吨制冷量冷却器冷却盘管，该冷水机泵送用水稀释的 25% 乙二醇基传热流体通过 AMF 天线。将冷却器的温度设置为天线不会加热或冷却样品。
- 对于动物收容，构造一个管状支架，该支架可以悬挂在线圈的中心，支架和线圈表面之间有 0.5 厘米的气隙。连接一个可调节的调节气泵，该气泵使空气通过线圈周围的外壳循环，并将其设置为保持正常的动物核心温度。将麻醉机连接到动物头部附近的管状动物支架上，以确保麻醉的正确输送。
- 对于细胞遏制，创建一个装置，使水浴中的水通过放置管子的垫片循环。设置此水浴的温度，使管子被水包围在37°C。
- 使用光纤探针监测肿瘤、动物核心和动物环境的温度，或进行体外研究，监测细胞沉淀的温度和管周围的水。
- 在所有实验中使用尺寸为 100 nm 的磁性氧化铁纳米颗粒。
注意：浓度和比吸收率（SAR）是选择纳米颗粒时必须考虑的两个特性，因为它们直接影响可能的加热和热剂量18。
2. 体外热疗
- 在含有 10% FBS 和 1% Pen/链球菌的 RPMI 培养基中培养 B16F10 鼠黑色素瘤细胞。在 6 孔板中板 150， 000 个细胞/孔，用 2 mL 完全培养基。
- 确定每个孔的适当处理，即没有mNP和没有AMF的细胞，有mNP和没有AMF的细胞，没有mNP和AMF的细胞，有mNP和AMF的细胞。
注意：此外，如果将热疗与另一种疗法相结合，请确保有适当的控制措施。AMF在标准研究台实验室中进行，该实验室经过改造，具有所需的电源和冷却能力。 - 电镀后24小时，按照上一步中的确定将mNP添加到适当的孔中。添加 mNP 至浓度为 3 毫克铁/毫升。通过创建储备培养基/mNP溶液（去除旧培养基，添加此溶液）或直接添加mNP并轻轻旋转板以实现均匀分布，确保mNP分布在整个孔中。
- 加入mNPs后48小时开始处理，当孔~80%汇合时，通过去除培养基并用新鲜培养基洗涤孔。取出介质。
- 向每个接受治疗的孔中加入 0.5 mL 胰蛋白酶，然后轻轻旋转。使用显微镜检查细胞是否分离。
- 向每个孔中加入 1 mL 培养基，将细胞收集到 1.5 mL 管中。从孔中收集所有细胞（~1 x 106 个细胞）。为每个孔使用明确标记的单独管。
- 以60× g 离心管2-3分钟以使细胞沉淀。将颗粒保留在培养基中。
- 将管子放在盘管内装满水的垫片中。设置水浴的温度，使培养基和细胞沉淀保持在37°C。 使用单独的光纤温度探头监测管内和水浴内的温度。
- 打开冷却器，检查冷却液是否流过盘管。打开电源并将最大值的百分比调整为所需的字段。以 165 kHz 和 23.87 kA/m （300 Oe） 的频率运行由 10 kW 发电机供电的 14 匝电磁线圈。
- 将单独的光纤温度探头放入其中一个管中。处理细胞直到先前确定的方案热剂量。一个例子是在43°C下30分钟（CEM43的30）。
- 将细胞重悬于试管中的培养基中，然后将细胞重新铺板到新的 6 孔板中。清楚地标记新板。目标是重新铺板所有收集的细胞（~1 x 106 个细胞）。
注意：应使用新的6孔板以确保培养的细胞接受处理。如果使用旧板，则平板上仍可能残留未成功胰蛋白酶消化的细胞。 - 如有必要，对于下一个实验程序，裂解细胞以进行RNA或蛋白质表达分析。
3.体内热疗
- 细胞培养和接种
- 在含有 10% FBS 和 1% Pen/链球菌的 RPMI 培养基中培养 B16F10 鼠黑色素瘤细胞。使用能够提供足够细胞接种所需数量动物的盘子/培养皿。例如，10， 100 mm培养皿，接种在100， 000个细胞上，将在48小时内与足够的细胞汇合以进行20只小鼠注射。
- 胰蛋白酶消化细胞并使用纯RPMI培养基（无FBS或笔/链球菌）收集。
- 计数细胞并根据接种体积和小鼠数量为所需浓度的细胞创建溶液。
- 使用汽化异氟醚和氧气麻醉6周龄雌性C57Bl / 6小鼠。将动物放入含有5%异氟醚和95%氧气的有机玻璃盒中，直至诱导。诱导后，取出动物并使用2%异氟醚的面锥完成步骤3.1.5-3.1.7和3.3.3-3.3.6。
注意：对于治疗期间的麻醉，请使用内置麻醉容器。遵循小鼠麻醉的标准机构方案。在动物实验之前，请确保适当的IACUC批准。麻醉后，将动物放回笼子并监测恢复情况，以确保没有并发症。 - 检查是否对矫正反射缺乏反应。
- 使用电动剃须刀剃除右胁。
- 用酒精湿巾清洁注射区域。使用带有28G针头的100μL玻璃注射器注射1-2 x 106 细胞，在麻醉的剃光右胁皮内分散在50μL培养基中。
- 肿瘤生长/纳米颗粒注射
- 使用卡尺（长度、宽度和深度）测量 3 维肿瘤，并通过（长 x 宽 x 深度 x π）/6 计算体积。
- 当肿瘤体积达到120mm 3（+/- 20mm3）时，将动物置于研究中。设计研究，确保有适当的对照和治疗组，包括联合治疗队列（即对照、mNPH、放疗和联合治疗）。
- 麻醉将接受mNP的小鼠，如3.1.4中所述。
- 用酒精湿巾清洁该区域。在AMF治疗前3小时将mNPs注射到肿瘤中。注射体积，使剂量为7.5mg铁/cm 3 肿瘤。
注意：实验室未发表的数据表明最大mNP摄取发生在3-6小时。
- AMF治疗
- 麻醉鼠标并放在加热垫上以保持核心温度。
- 检查是否对矫正反射缺乏反应。取下鼠标上的耳标或任何其他金属物体。
- 轻轻地将润滑的光纤温度探头放入鼠标的直肠中。
- 将导管插入肿瘤，取出针头。切开导管，使其不会过多地从肿瘤中伸出。
注意：在小鼠全身麻醉时放置和移除光纤温度导管，即导管仅在肿瘤加热过程中就位。在手术时给予小鼠单次皮下剂量的NSAID镇痛药物酮洛芬（5mg / kg）。我们没有观察到与导管放置相关的短期或长期不适或发病率。 - 将 3 传感器光纤温度探头插入导管。导管保护光纤温度探头传感器。
- 将直肠和肿瘤内探针粘在动物的尾巴上，以确保它们保持在原位。
- 将鼠标放入 50 mL 管中，头部到底部。管子应该在头部附近有一个孔，麻醉将连接和输送。
- 将管子放在设置好的线圈内，然后重新连接麻醉。
- 将光纤温度探头松散地放入管中以测量环境温度。
- 打开冷却器，并确保冷却液正在循环。
- 检查并确保计算机软件显示各种温度并开始记录，以便实时显示CEM43计算。所需的CEM43是先前确定的剂量。
注意：在打开磁铁之前，请确保没有金属物品附着在动物身上，因为它们会迅速加热。此外，确保房间里的每个人都没有心脏起搏器，并且他们在那里是安全的。 - 以低功率百分比打开磁铁。
- 确保光纤温度探头记录温度变化。一旦AMF被激活，温度就会随着磁场的增加而升高。确保动物的核心温度保持在38°C。 使用调节空气夹套调节核心温度。
- 使用内置控制拨盘通过改变发电机上的功率来调整磁场强度，进而控制肿瘤中的温度水平。
- 一旦在肿瘤内达到先前由用户确定的所需剂量（例如CEM43 40），关闭AMF。
- AMF 关闭后，从线圈中取出管子。
- 从管中取出鼠标，提取各种探针和导管。如有必要，用新的金属耳标标记动物。
- 处理完成后，关闭冷却器。
- 从麻醉中恢复动物，确保没有并发症。监控他们的行为以确保恢复正常。
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Representative Results
体外研究
只有当磁性纳米颗粒/铁和AMF的量和浓度适当匹配时，细胞才能达到并保持所需的温度和热剂量。当使用磁性纳米颗粒在体外（和体内）加热细胞时，应该注意的是，为了在具有内化磁性纳米颗粒的细胞中实现热疗，需要特定水平的细胞内mNP / Fe，并且mNP负载细胞的数量和接近度将是必要的。如果靶细胞/组织中的mNP/Fe水平足以达到加热效果，则可以调节磁场频率和强度以达到所需的温度和效果。如果接种得当，则可以进行进一步的研究，研究不同剂量和时间之间的遗传和分子差异17。 图1 示意图为体外方法。
这些体外方法可用于研究细胞mRNA和蛋白质表达变化。我们实验室最近的一个例子确定了CEM43 30 mNPH治疗，8 Gy放射治疗和组合后的免疫遗传差异。我们能够确定免疫和细胞毒性途径表达的异同，以更好地了解效果背后的机制，以及它们如何协同结合17。每个实验都使用各种环境和加热的对照样品。与接受热疗的对照组相比，对照组将具有不同的mRNA和蛋白质表达水平。
体内研究
在体内研究中还有其他考虑因素。无论目标热剂量如何，在被治疗的动物中保持生理上可接受的核心温度是绝对必要的。这对于麻醉下的啮齿动物来说可能具有挑战性，因为核心温度会很快丢失（通常需要加热垫等核心温度调节技术）。低于正常体温可能需要将AMF-mNPH推得太远，当试图在肿瘤中达到特定的热剂量时，导致非靶组织中产生不可接受的效果（非靶标组织涡流加热就是这样一种可能性）。即使是核心体温的微小偏差也会导致肿瘤或正常组织中出现不良的生理并发症。如前所述，无论值得重复的是，为了准确、可重复的加热，必须实现mNP/Fe组织浓度、AMF频率和场强温度监测参数与目标组织尺寸和深度之间的匹配。肿瘤内必须有mNPs的基线浓度，以便进行可测量的加热。热的水平/能力不仅取决于mNP组织浓度（mg Fe / g组织）及其在肿瘤内的相对分布，还取决于AMF的频率和随后的场强。上述任何一种的变化都可能导致组织内可达到的温度范围不同。通过多年的经验，我们优化了用于临床前肿瘤治疗的浓度以及AMF系统的频率和场强，以实现安全有效的激活。由于不可能测量所有组织部位的温度/热剂量，因此在战略部位放置尽可能多的光纤温度探头也很重要，以便进行实时功效和安全性评估，如图 2所示。这些探头允许在整个实验过程中记录温度，从而实现实验的准确剂量测定和热历史。 图3 显示了体内实验期间产生的曲线，突出了密切监测温度和调整系统以将肿瘤温度保持在所需范围内的能力。 图4 总结了体内方法。
这些体内方法与体外方法类似，可用于研究不同的癌症类型、不同的热疗剂量以及各种联合治疗。例如，我们实验室以前的研究已经调查了热疗和化疗的组合12。我们还完成了许多热疗和辐射实验，以确定功效和分子机制。这些实验的对照小鼠经历了除实际产生热疗之外的所有程序。图5包含两个火山 图 ，显示了体外和体内mNP热疗（mNPH）后的差异表达基因。这些数字是我们如何使用分子技术来监测热疗效应的例子。
图 1：体外 mNP 热疗示意图。 该示意图演示了体外磁性纳米颗粒热疗的方法。为了确保加热发生，必须为细胞提供足够的颗粒和时间，以实现足够的mNP摄取。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：用于温度监测的导管放置。 该图显示了容纳光纤温度探头的导管的位置，以记录肿瘤和/或肿瘤区域不同位置的温度。此图改编自文献19。 请点击此处查看此图的大图。
图3：小鼠肿瘤治疗期间的实时温度监测。 该图显示了实时温度读数，允许在体内实验期间监测核心体温、环境温度和肿瘤内的多个温度。肿瘤内温度的控制通过图的放大部分的最小大尺度变化来证明。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：体内 mNP 热疗示意图。 该示意图演示了 体内 磁性纳米颗粒热疗的方法。注入足够的纳米颗粒以及足够的分布和吸收时间，确保能够提供所需的热剂量。 请点击此处查看此图的大图。
图5：差异基因表达。 体外（A）和体内（B）mNP热疗治疗后的差异基因表达。这些火山图在对数 2 x 轴上表示遗传变化，在 y 轴上具有显著性，适用于体外和体内 mNPH 方法。每个圆圈代表一个不同的基因，标记了20个最显着的差异表达基因。基因在 x 轴上离零越远，倍数变化越大，基因在 y 轴上越高，p 值越低。虽然两者具有相同的热剂量，但体内热疗导致比体外更大的基因表达变化。这些图是可以使用所述协议生成的生物数据的示例。体外火山图改编自文献17。 请点击此处查看此图的大图。
补充文件 1.请点击这里下载此文件。
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Discussion
该系统的设计和实施提供了进行准确和可重现的体外和体内磁性纳米颗粒热疗实验的能力。至关重要的是，该系统的设计使AMF频率和场强与磁性纳米颗粒类型，浓度以及所需的组织位置和温度充分匹配。此外，实时精确监测温度对于安全和计算准确的热剂量（43 °C/CEM 下的累积当量分钟）至关重要。如图1所示，探头的放置允许实时监测热剂量和核心体温，如图2所示。
准确输送磁性纳米颗粒热疗的第一步是为动物和操作人员构建安全系统。从操作和交付的角度来看，还应充分了解系统的所有组成部分。在这种情况下，这意味着了解AMF涡流的潜力并知道磁性粒子的位置。天线或线圈是影响磁场形状和强度的关键因素，所使用的冷却系统对于防止线圈过热很重要20.导体外部的场强与流过导体的电流强度成正比。导体周围空间中任何一点的磁场强度是周围区域导体产生的场的矢量和。根据Biot-Savart平方反比规则21，磁场以与电流成直角产生，强度呈指数下降，这是与导体距离的函数。因此，方管用于体内热疗，以获得线圈内更均匀的场。产生具有潜在临床相关系统所需强度和体积的磁场需要高电流。因此，天线设计必须能够适应显著的电功率水平。此外，AMF天线的设计必须使其电感在发电机的可接受范围内。在通常使用的频率下，大部分电流都在天线导体的表面上，这意味着表面会影响电阻加热，这可以通过消除表面缺陷来最小化。这种电阻加热也意味着需要一个盘管冷却系统来确保盘管和环境不会过热。
我们系统设计的一个局限性是，它不允许总范围的频率和磁场，但它确实允许产生适合细胞、啮齿动物和大型动物的场。具体来说，任何感应加热系统可获得的最大场强与天线（线圈）中的电流直接相关。AMF 发电机的额定单位为千瓦，其计算方法是将可用电压乘以可用电流（安培）。因此，具有 500 V 限制的 10kW 系统的最大安培数为 20 A。线圈设计将决定首先达到哪个极限，从而确定系统极限。任何电流产生的磁场强度都会随着与导体的距离呈指数下降。因此，在同一系统上运行的具有相同几何形状的较小直径线圈的较大直径线圈在线圈中心具有较低的场强。因此，所需的磁场大小和强度受到AMF发生器容量的限制。构建更大的线圈并使用更多的功率会导致额外的问题，主要是涡流加热。
使用此系统来保护用户、动物和系统本身时，必须解决几个安全问题。首先，在使用麻醉期间必须保持足够的室内通风。其次，与线圈相关的所有区域都必须清除金属和/或导体，包括高盐混合物。用户在AMF周围工作时必须取下戒指和其他珠宝，样品不应含有任何类型的金属。最重要的是，使用心脏起搏器或其他植入装置或物体的人在治疗AMF之前应咨询医生。为了保护系统，应使用故障安全系统，以确保在通电之前满足发电机和盘管的冷却需求。此外，应使用热像仪概览来检测意外发热。
对于体外研究，要遵循的最重要步骤是细胞中铁的浓度、细胞浓度、AMF 参数和热剂量评估。通过将磁性纳米颗粒置于上清液、细胞或两者中，可以用磁性纳米颗粒热疗处理/加热细胞。磁性纳米颗粒的加热量将取决于磁性纳米颗粒/Fe的水平。如果希望只用内化铁治疗细胞，我们的经验是单个癌细胞只会吸收有限数量的磁性纳米颗粒，即使摄取是最佳的，细胞也必须聚集/沉淀以产生细胞加热情况，即使优化了AMF。将培养基和细胞的温度保持在生物学相关水平（未加热时）对于准确测量真实加热也很重要。这里描述的 14 圈电磁线圈允许通过将样品浸入热控水柱中来保持生物学相关的温度。
对于体内研究，保持动物核心温度和准确测量肿瘤内的温度是关键因素。这种动物收容系统和线圈设计消除了由于线圈/功率设置而导致的动物环境中的热漂移，并有助于保持正常的核心体温。保持体核温度对于有意义的实验结果至关重要。直肠探头可以实时监测动物的核心温度。在麻醉下，动物的核心温度会自然降低。为了解决这种情况，我们开发了一种环境加热系统，该系统在动物收容容器周围提供温暖的空气，使核心温度保持在正常范围内。保持正常的核心温度对于确保准确解释热疗治疗结果和消除环境因素至关重要。将温度监测探针放置在靶组织/肿瘤的多个部位对于准确评估所达到的温度和热剂量非常重要。由于在肿瘤内均匀分布磁性纳米颗粒非常困难（如果不是不可能的话），因此了解多个位点的加热参数对于实现一致和准确的组织/肿瘤热剂量至关重要。重要的是要注意，体外和体内研究的浓度是可变的。这种变化是因为细胞培养中的边界较少，细胞更容易获得mNP，因此可以使用较低的浓度。在体内，由于肿瘤的异质性和复杂的3D形态，需要更高的浓度。因此，在体内和体外使用相同浓度的颗粒将导致细胞吸收的颗粒少得多。
本手稿描述了开发用于磁性纳米颗粒热疗治疗的有效且灵活的交变磁场发生器和线圈系统所需的参数和仪器。该系统可用于体外和体内研究。与其他 AMF-mNP 热疗系统相比，该系统对局部/靶向热疗有效，并且保留了正常组织，使其具有吸引力。这些热疗治疗可以改变以研究不同剂量的影响，使用各种纳米颗粒或纳米载体和辅助治疗。由于组织加热，尤其是磁性纳米颗粒加热，会受到许多变量的影响，因此了解研究中的参数至关重要。如果满足这些标准，磁性纳米颗粒热疗可以解决许多分子、细胞和临床情况，包括独立和辅助肿瘤控制。虽然这里描述的方法需要付出很大的努力，但如果遵循指南，就可以充分发挥mNP热疗的潜力。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该研究由资助号资助：NCI P30 CA023108和NCI U54 CA151662。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| .25% Trypsin | Corning | 45000-664 | available from many companies |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Eppendorf 22363204 | available from many companies |
| B16F10 murine melanoma cells | American Type Culture Collection | CRL-6475 | |
| C57/Bl6 mice | Charles river | 027C57BL/6 | 6-week-old female mice |
| Chiller | Thermal Care | NQ 5 series | chiller that cools the coil |
| Coolant fluid | Dow Chemical Company | Dowtherm SR-1 | antenna cooling fluid |
| Fetal Bovine serum | Hyclone | SH30071 | available from many companies |
| fiber optic probes, software and chassis | FISO | FISO evolution software used to read the temperatures | |
| IR camera | Flir | infrared camera to monitor unintentional heating | |
| iron oxide nanoparticles | micromod Partikeltechnologie GmbH | Bionized NanoFerrite | dextran coated iron oxide nanoparticles |
| mouse coil, solenoid | Fluxtrol | custom built | |
| penicillin/streptomycin | Corning | 45000-652 | available from many companies |
| RF generator | Huttinger | TIG 10/300 | power source |
| RPMI media | Corning | 45000-396 | available from many companies |
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