Summary
Este protocolo apresenta técnicas e metodologia necessárias para a entrega precisa de hipertermia de nanopartículas magnéticas usando um sofisticado sistema de entrega e monitoramento.
Abstract
A hipertermia tem sido usada há muito tempo no tratamento do câncer. As técnicas têm variado desde a inserção intratumoral de barras de ferro quente, até nanopartículas magnéticas direcionadas a anticorpos tumorais administradas sistemicamente, a temperaturas de 39 °C (nível de febre) a 1.000 °C (eletrocautério) e tempos de tratamento de segundos a horas. A relação temperatura-tempo (dose térmica) dita o efeito com altas doses térmicas, resultando na ablação tecidual e doses térmicas mais baixas, resultando em efeitos subletais, como aumento do fluxo sanguíneo, acúmulo de drogas e estimulação imunológica. Uma das terapias médicas atuais mais promissoras é a hipertermia de nanopartículas magnéticas (mNPH). Esta técnica envolve a ativação de nanopartículas magnéticas, que podem ser entregues sistemicamente ou intratumoralmente, com um campo magnético alternado não invasivo e não tóxico. O tamanho, a construção e a associação das nanopartículas magnéticas e a frequência e a intensidade do campo magnético são os principais determinantes do aquecimento. Desenvolvemos instrumentação e técnicas sofisticadas para fornecer hipertermia de nanopartículas magnéticas reprodutíveis em modelos animais grandes e pequenos e células cultivadas. Essa abordagem, usando monitoramento contínuo e em tempo real da temperatura em vários locais, permite a entrega de doses térmicas bem definidas para o tecido alvo (tumor) ou células, limitando o aquecimento do tecido não alvo. O controle e o monitoramento precisos da temperatura, em vários locais, e o uso do algoritmo padrão da indústria (minutos equivalentes cumulativos a 43 °C /CEM43) permitem uma determinação e quantificação precisas da dose térmica. Nosso sistema, que permite uma ampla variedade de temperaturas, doses térmicas e efeitos biológicos, foi desenvolvido por meio de uma combinação de aquisições comerciais e desenvolvimentos internos de engenharia e biologia. Este sistema foi otimizado de uma forma que permite a rápida conversão entre técnicas ex vivo, in vitro e in vivo. O objetivo deste protocolo é demonstrar como projetar, desenvolver e implementar uma técnica e um sistema eficazes para fornecer hipertermia reprodutível e precisa da terapia de nanopartículas magnéticas (mNP).
Introduction
A hipertermia tem sido historicamente usada na terapia do câncer, isoladamente ou em combinação com outros tratamentos. Embora tenha uma longa história de uso, o método mais vantajoso para a entrega deste tratamento ainda está sendo debatido e depende do local e localização da doença. Os métodos de entrega de hipertermia incluem micro-ondas, radiofrequência, ultrassom focalizado, laser e nanopartículas metálicas (como ouro ou óxido de ferro)1,2,3,4. Esses métodos de entrega podem levar a uma variedade de temperaturas de tratamento desde o nível da febre até centenas de graus C. O efeito biológico da hipertermia depende principalmente das temperaturas utilizadas e da duração do tratamento5. Para este manuscrito e propósito, estamos nos concentrando na hipertermia de nanopartículas magnéticas (mNPH). Este método permite mudanças de temperatura focadas, localizadas, bem monitoradas e controladas, usando nanopartículas de óxido de ferro não tóxicas, aprovadas pela FDA.
Uma armadilha de outras modalidades de hipertermia é a falta de direcionamento celular preciso; a hipertermia não tem uma razão terapêutica inerentemente alta, portanto, é necessária uma termometria e direcionamento cuidadosos6. A mNPH permite a injeção sistêmica ou intratumoral de mNPs, com o calor sendo gerado apenas onde as mNPs estão localizadas, direcionando assim o tratamento diretamente para o tumor. O mNPH pode ser eficaz quando as nanopartículas magnéticas estão localizadas dentro ou fora da célula. Para a terapia do câncer, a visão geral da mNPH é que as nanopartículas magnéticas são injetadas (intratumoral ou intravenosamente), em seguida, um campo magnético alternado é aplicado, fazendo com que os polos magnéticos das nanopartículas se realinhem constantemente, levando a um aquecimento localizado das células e tecidos associados às nanopartículas 7,8 . Ajustando o volume de nanopartículas e a frequência/intensidade do campo magnético alternado (FMA), é possível controlar cuidadosamente a temperatura gerada dentro do tecido.
Esse tratamento funciona bem em tumores que estão próximos à superfície corporal, pois tumores mais profundos requerem FMA mais forte, de modo que o risco de aquecimento por correntes parasitas aumenta9. Há evidências de hipertermia sendo utilizada clinicamente como monoterapia, no entanto, muitas vezes a hipertermia é combinada com radioterapia ou quimioterapia, levando a um efeito anticâncer mais direcionado10,11,12. Evidências clínicas de hipertermia trabalhando em combinação com radioterapia são revisadas em publicação anterior13. Nosso laboratório tem tratado com sucesso uma variedade de animais, de camundongos a porcos e cânceres caninos espontâneos, utilizando o método mNPH12,14,15. Este protocolo é projetado para aqueles interessados em investigar os efeitos do tratamento da hipertermia localizada, isoladamente ou em combinação com outras terapias.
Um dos fatores mais importantes na hipertermia é ser capaz de medir e entender, em tempo real, a dose térmica que está sendo entregue ao tecido alvo / tumoral. Uma forma normalizada de calcular e comparar a dose é através da demonstração dos minutos equivalentes cumulativos de aquecimento a 43 °C; esse algoritmo permite a comparação de doses independentes do sistema de entrega, temperaturas máximas e mínimas (dentro de uma faixa específica) e parâmetros de aquecimento/resfriamento 5,16. O cálculo CEM funciona melhor para temperaturas entre 39-57 °C5. Por exemplo, em alguns dos estudos que realizamos, escolhemos uma dose térmica de CEM43 30 (ou seja, 30 min a 43 °C). A escolha dessa dose permitiu observar efeitos imunogenéticos seguros, eficazes e in vitro, tanto isoladamente quanto em combinação com uma dose única de radiação17.
Com a hipertermia de nanopartículas magnéticas, existem vários fatores que precisam ser considerados na construção de um sistema de entrega apropriado. O projeto de instrumentação inclui importantes fatores de segurança, como o uso de um resfriador para garantir que o equipamento de entrega de campo magnético permaneça frio mesmo quando operado em alta potência e procedimentos à prova de falhas que impedem que o sistema seja ligado se todos os sistemas de temperatura, avaliação de energia e controle não tiverem sido ativados. Além disso, existem fatores biológicos importantes que precisam ser considerados para situações in vivo e in vitro. Ao usar células cultivadas, é necessário tratar em meios de crescimento e manter a uma temperatura viável consistente para evitar alterações fisiológicas que possam afetar os resultados. Para tipos individuais de nanopartículas, é importante conhecer a taxa de absorção específica (SAR) ao calcular os parâmetros de aquecimento baseados em FMA. Da mesma forma, é importante conhecer a concentração de mNP/Fe, em células e tecidos, que é necessária para alcançar o aquecimento desejado. Os métodos in vivo requerem ainda mais atenção aos detalhes, uma vez que o animal deve ser mantido sob anestesia durante o tratamento e a temperatura corporal central do animal mantida em um nível normal durante todo o tratamento. Permitir que a temperatura corporal do animal caia, como acontece sob anestesia, pode afetar os resultados gerais, no que diz respeito à dose térmica do tecido a ser tratado.
Neste manuscrito, discutimos os métodos utilizados para projetar e construir um versátil sistema de hipertermia de nanopartículas magnéticas, bem como importantes fatores de uso que precisam ser considerados. O sistema descrito permite a entrega robusta, consistente, biologicamente apropriada, segura e bem controlada da hipertermia de nanopartículas magnéticas. Finalmente, deve-se notar que os estudos de mNPH que conduzimos geralmente envolvem outras terapias, como radiação, quimioterapia e imunoterapia. Para que esses resultados sejam significativos, é importante determinar como o calor fornecido pode afetar a eficácia e/ou a toxicidade de segurança de outras modalidades (ou vice-versa) e o bem-estar do animal. Por esta razão e pela dosimetria e situações terapêuticas anteriormente mencionadas, é essencial prestar muita atenção à precisão da dosagem de hipertermia de nanopartículas magnéticas e às medições contínuas de temperatura central e alvo. O objetivo deste protocolo é fornecer um método e uma descrição simples e consistentes para a entrega de hipertermia segura e eficaz de nanopartículas magnéticas.
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Protocol
O Dartmouth College Animal Care and Use Program é credenciado pela American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (iAAALAC) e adere a todas as diretrizes e regulamentos da UDSA e do NIH (Office of Laboratory Animal Welfare). Todos os estudos in vivo foram aprovados pelo Dartmouth College Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). O procedimento de eutanásia adere às Diretrizes da AVMA de 2020 para a Eutanásia de Animais.
1. Instrumentação/concepção do sistema
- Projete a antena AMF personalizada (bobina) para ser um circuito fechado, escolhendo formas para criar o campo magnético desejado. Use fórmulas e características de indutância da escolha do gerador de energia para projetar bobinas compatíveis para gerar o campo desejado. Use diferentes projetos para experimentos in vitro e in vivo.
- Certifique-se de que a indutância da antena AMF esteja dentro do alcance aceitável do gerador de energia. Adicione ou subtraia capacitores para combinar (sintonizar) a antena com o gerador de energia.
- Para experimentos in vitro, projete uma bobina helicoidal de 14 voltas, diâmetro interno de 2 cm e comprimento de 14 cm, que pode conter tubos de 1,5 mL, permitindo o tratamento de múltiplas amostras simultaneamente. Isole a bobina com um polímero de vinil e use um espaçador de poliestireno para separar a bobina dos tubos. Detalhes da especificação e considerações do projeto estão presentes no Arquivo Suplementar 1.
- Para experimentos in vivo, adquira uma bobina helicoidal de corpo inteiro personalizada de um fabricante com informações de design proprietárias. Use tubos quadrados de 8 mm (pois cria um campo mais uniforme dentro do furo da bobina) e um concentrador na área de tratamento direcionada. Faça o concentrador 5,0 cm de comprimento, com um total de 5 voltas resultando em um diâmetro interno de 3,6 cm, 5,2 cm de diâmetro externo e tenha sua localização na área de tratamento alvo. Envolva a bobina com um invólucro de policarbonato.
- Use um gerador AMF com potência e frequência ajustáveis, avaliado em 10 kW ou mais como fonte de energia. A indutância corresponde à fonte de energia e às antenas/bobinas para uma faixa de 0,62 a 1,18 μHenries (μH), permitindo frequências que variam entre 30-300 kHz. Arrefecer o gerador utilizando água reciclada através de uma bomba centrífuga de impulso, pressão regulada para 50 psi.
- Resfrie as bobinas com um resfriador de capacidade de resfriamento de 5,6 toneladas que bombeia 25% de fluido de transferência de calor à base de etilenoglicol diluído com água através da antena AMF. Ajuste a temperatura do resfriador para que a antena não aqueça ou resfrie a amostra.
- Para a contenção do animal, construa um suporte tubular que possa ser suspenso no centro da bobina com um espaço de ar de 0,5 cm entre o suporte e a superfície da bobina. Conecte uma bomba de ar condicionado ajustável que circula o ar através do invólucro ao redor da bobina e configure-a para manter uma temperatura central normal do animal. Conecte a máquina de anestesia ao suporte tubular do animal perto da cabeça do animal para garantir a entrega adequada da anestesia.
- Para a contenção celular, crie um aparelho que circule a água de um banho-maria através do espaçador onde os tubos são colocados. Ajuste a temperatura deste banho-maria de modo a que os tubos sejam rodeados por água a 37 °C.
- Use sondas de fibra óptica para monitorar as temperaturas dentro do tumor, o núcleo do animal e o ambiente animal ou para estudos in vitro, monitorando a temperatura da pelota celular e a água ao redor dos tubos.
- Use nanopartículas magnéticas de óxido de ferro com 100 nm de tamanho para todos os experimentos.
NOTA: A concentração e a taxa de absorção específica (SAR) são duas características que devem ser consideradas na escolha das nanopartículas, pois afetam diretamente o possível aquecimento e a dose térmica18.
2. Hipertermia in vitro
- Cultura de células de melanoma murino B16F10 em meio RPMI com 10% de FBS e 1% de Pen/estreptococo. Placa 150, 000 células/poço em placas de 6 poços, com 2 mL de meio completo.
- Determinar o tratamento adequado para cada poço, ou seja, células sem mNPs e sem FMA, células com mNPs e sem FMA, células sem mNPs e FMA, células com mNPs e FMA.
NOTA: Além disso, certifique-se de que existem controlos adequados se combinar hipertermia com outra terapêutica. O AMF é realizado em um laboratório de bancada de pesquisa padrão adaptado com os recursos de energia e resfriamento necessários. - 24 h após o revestimento, adicionar mNPs aos poços apropriados, conforme determinado na etapa anterior. Adicionar mNPs a uma concentração de 3 mg de ferro/mL. Certifique-se de que os mNPs estejam distribuídos por todo o poço, seja criando uma solução de mídia de estoque/mNP (removendo a mídia antiga, adicionando essa solução) ou adicionando as placas de rodopio direta e suave para distribuição homogênea.
- Iniciar o tratamento, 48 h após a adição de mNPs, quando os poços estiverem ~80% confluentes, removendo o meio e lavando os poços com meio fresco. Remova a mídia.
- Adicione 0,5 mL de tripsina a cada poço a ser tratado e gire suavemente. Use um microscópio para verificar se as células estão separadas.
- Adicione 1 mL de meio a cada poço para coletar as células em tubos de 1,5 mL. Colete todas as células do poço (~1 x 106 células). Use um tubo separado claramente rotulado para cada poço.
- Tubos de rotação a 60 x g por 2-3 min para permitir que as células sejam pellet. Retenha o pellet na mídia.
- Coloque os tubos no espaçador cheios de água dentro da bobina. Regule a temperatura do banho-maria de modo a que o meio e o pellet celular sejam mantidos a 37 °C. Monitore a temperatura dentro do tubo e do banho de água usando sondas de temperatura de fibra óptica separadas.
- Ligue o chiller, verifique se o refrigerante está fluindo através da bobina. Ligue a fonte de alimentação e ajuste a porcentagem do máximo para o campo desejado. Operar a bobina solenoide de 14 voltas, alimentada por gerador de 10 kW, a 165 kHz e 23,87 kA/m (300 Oe).
- Coloque uma sonda de temperatura de fibra óptica separada em um dos tubos. Trate as células até a dose térmica do protocolo previamente determinado. Um exemplo é 30 min a 43 °C (CEM43 de 30).
- Ressuspeite as células no meio que está em seus tubos e re-prato em novas placas de 6 poços. Rotule claramente as novas placas. O objetivo é re-placa todas as células coletadas (~ 1 x 106 células).
NOTA: Novas placas de 6 poços devem ser usadas para garantir que as células que estão sendo cultivadas recebam tratamento. Se as placas antigas forem usadas, ainda pode haver células deixadas nas placas que não foram tripsinizadas com sucesso. - Se necessário, para o próximo procedimento experimental, lise as células para análise de RNA ou expressão de proteínas.
3. Hipertermia in vivo
- Cultura celular e inoculação
- Cultura de células de melanoma murino B16F10 em meio RPMI com 10% de FBS e 1% de Pen/estreptococo. Use pratos / pratos que fornecerão células suficientes para a inoculação do número desejado de animais. Por exemplo, pratos de 10, 100 mm, banhados a 100.000 células, serão confluentes com células suficientes para 20 injeções de camundongos dentro de 48 h.
- Tripsinize as células e colete usando mídia RPMI pura (sem FBS ou caneta/estreptococo).
- Conte células e crie uma solução para a concentração desejada de células, com base no volume de inoculação e no número de camundongos.
- Anestesiar camundongos C57Bl/6 fêmeas de 6 semanas de idade usando isoflurano vaporizado e oxigênio. Coloque os animais em uma caixa de plexiglass com 5% de isoflurano e 95% de oxigênio até induzir. Uma vez induzido, remova o animal e use um cone facial a 2% de isoflurano para completar as etapas 3.1.5-3.1.7 e 3.3.3-3.3.6.
NOTA: Para anestesia durante o tratamento, use uma contenção de anestesia embutida. Siga os protocolos institucionais padrão para anestesia de camundongos. Antes da experimentação animal, assegure a aprovação apropriada da IACUC. Após a anestesia, devolva o animal à gaiola e monitore a recuperação para garantir que não haja complicações. - Verifique a falta de resposta aos reflexos de endireitamento.
- Raspe o flanco direito usando um barbeador elétrico.
- Limpe a área de injeção com um toalhete com álcool. Injetar 1-2 x 106 células, utilizando uma seringa de vidro de 100 μL com uma agulha de 28 G, dispersa em 50 μL de meio intradérmico no flanco direito raspado de anestesiado.
- Crescimento tumoral/Injeção de nanopartículas
- Meça tumores em 3 dimensões usando paquímetros (comprimento, largura e profundidade) e calcule os volumes por (comprimento x largura x profundidade x π)/6.
- Quando os volumes tumorais atingirem 120 mm 3 (+/- 20 mm3), coloque os animais em estudo. Projetar o estudo, garantindo que haja grupos de controle e tratamento apropriados, incluindo coortes de terapia combinada (ou seja, controle, mNPH, radiação e a combinação).
- Anestesiar ratinhos que irão receber mNPs, conforme descrito no ponto 3.1.4.
- Limpe a área com um toalhete com álcool. Injete mNPs no tumor 3 h antes do tratamento com FMA. Injete um volume tal que a dose seja de 7,5 mg de ferro/cm3 de tumor.
NOTA: Dados não publicados do laboratório sugerem que a captação máxima de mNP ocorre em 3-6 h.
- Tratamento de FMA
- Anestesiar o mouse e colocar em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura central.
- Verifique a falta de resposta aos reflexos de endireitamento. Remova a marca auricular ou quaisquer outros objetos de metal no mouse.
- Coloque suavemente uma sonda de temperatura de fibra óptica lubrificada no reto do mouse.
- Coloque um cateter no tumor, removendo a agulha. Corte o cateter de tal forma que ele não saia muito do tumor.
NOTA: Os cateteres de temperatura de fibra óptica são colocados e removidos enquanto os ratos estão sob anestesia geral, ou seja, os cateteres só estão no lugar durante o procedimento de aquecimento do tumor. Os ratos recebem uma dose subcutânea única de um medicamento para analgesia de AINEs, cetoprofeno (5 mg / kg), no momento do procedimento. Não observamos desconforto ou morbidade a curto ou longo prazo associados à colocação dos cateteres. - Insira uma sonda de temperatura de fibra óptica de 3 sensores no cateter. O cateter protege os sensores de sonda de temperatura de fibra óptica.
- Cole a sonda retal e intratumoral na cauda do animal para garantir que eles permaneçam no lugar.
- Coloque o rato num tubo de 50 ml, dirija-se ao fundo. O tubo deve ter um orifício perto da cabeça, onde a anestesia será conectada e entregue.
- Coloque o tubo dentro da bobina configurada e reconecte a anestesia.
- Coloque uma sonda de temperatura de fibra óptica frouxamente no tubo para medir a temperatura ambiente.
- Ligue o resfriador e certifique-se de que o líquido de arrefecimento está circulando.
- Verifique e verifique se o software do computador está exibindo as várias temperaturas e comece a gravar para permitir que um cálculo CEM43 seja exibido em tempo real. O CEM43 necessário é a dose previamente determinada.
NOTA: Antes que o ímã seja ligado, certifique-se de que nenhum item de metal esteja ligado ao animal, pois eles aquecerão rapidamente. Além disso, certifique-se de que todos na sala não tenham um marcapasso e que seja seguro para eles estarem lá. - Ligue o ímã em uma porcentagem de baixa potência.
- Certifique-se de que as sondas de temperatura de fibra óptica estão registrando as mudanças de temperatura. As temperaturas aumentarão quando o FMA for ativado à medida que o campo aumentar. Assegurar que a temperatura central do animal se mantém a 38 °C. Regule a temperatura central usando a camisa de ar condicionado.
- Ajuste a força do campo magnético alterando a energia no gerador, usando o mostrador de controle embutido, que por sua vez controla o nível de temperatura no tumor.
- Desligue o FMA uma vez que a dose desejada, conforme previamente determinado pelo usuário (por exemplo, CEM43 40), seja alcançada dentro do tumor.
- Uma vez que o AMF é desligado, remova o tubo da bobina.
- Remova o mouse do tubo, extraindo as várias sondas e cateter. Se necessário, marque o animal com uma nova marca auricular de metal.
- Uma vez que os tratamentos são concluídos, desligue o chiller.
- Recupere os animais da anestesia garantindo que não haja complicações. Monitore seu comportamento para garantir o retorno ao normal.
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Representative Results
Estudos in vitro
As células só alcançarão e manterão a temperatura e a dose térmica desejadas se a quantidade e a concentração das nanopartículas magnéticas/ferro e do FMA forem adequadamente combinadas. Ao usar nanopartículas magnéticas para aquecer células in vitro (e in vivo), deve-se notar que, para alcançar a hipertermia em células com nanopartículas magnéticas internalizadas, será necessário um nível específico de mNP/Fe intracelular, e o número e a proximidade de células carregadas de mNP, entre si, serão necessários. Se o nível de mNP/Fe nas células/tecidos-alvo for suficiente para alcançar um efeito de aquecimento, a frequência e a intensidade do campo magnético podem ser ajustadas para atingir a temperatura e os efeitos desejados. Se banhados corretamente, estudos adicionais que analisam as diferenças genéticas e moleculares entre diferentes doses e tempos podem ser realizados17. A Figura 1 representa um esquema dos métodos in vitro.
Esses métodos in vitro podem ser usados para investigar o mRNA celular e a mudança na expressão de proteínas. Um exemplo recente do nosso laboratório determinou diferenças imunogenéticas após o tratamento CEM43 30 mNPH, um tratamento de radiação de 8 Gy e a combinação. Conseguimos identificar semelhanças e diferenças na expressão entre as vias imunes e citotóxicas para obter uma melhor compreensão do mecanismo por trás dos efeitos e como eles se combinam sinergicamente17. Cada experimento utiliza uma variedade de amostras de controle ambientalmente e aquecidas. Os controles terão diferentes níveis de mRNA e expressão de proteínas em comparação com aqueles que recebem tratamento de hipertermia.
Estudos in vivo
Em estudos in vivo, há considerações adicionais. Independentemente da dose térmica alvo, é absolutamente essencial manter uma temperatura central fisiologicamente aceitável no animal a ser tratado. Isso pode ser um desafio com roedores sob anestesia, pois a temperatura central pode ser rapidamente perdida (técnicas de modulação de temperatura central, como almofadas de aquecimento, são frequentemente necessárias). Temperaturas corporais mais baixas do que o normal podem exigir a necessidade de empurrar o AMF-mNPH muito longe, ao tentar atingir uma dose térmica específica no tumor, resultando em efeitos inaceitáveis no tecido não alvo (o aquecimento da corrente parasita do tecido não alvo é uma dessas possibilidades). Mesmo pequenos desvios na temperatura corporal central podem levar a complicações fisiológicas indesejáveis no tumor ou tecido normal. Como mencionado anteriormente, no entanto, vale a pena repetir, para um aquecimento preciso e reprodutível, é essencial alcançar uma correspondência entre a concentração tecidual mNP / Fe, a frequência AMF e os parâmetros de monitoramento de temperatura da força do campo e o tamanho e a profundidade do tecido alvo. Deve haver uma concentração basal de mNPs dentro do tumor para permitir um aquecimento mensurável. O nível/capacidade de calor depende não apenas da concentração tecidual de mNP (mg Fe/g de tecido) e sua distribuição relativa dentro do tumor, mas também da frequência do FMA e da força de campo subsequente. Alterações em qualquer um dos itens acima podem levar a diferentes faixas de temperaturas atingíveis dentro do tecido. Através de muitos anos de experiência, otimizamos a concentração que usamos para tratamentos pré-clínicos de tumores e a frequência e a força de campo do sistema AMF para permitir uma ativação segura e eficaz. Como é impossível medir a temperatura/dose térmica em todos os locais teciduais, também é essencial colocar o maior número possível de sondas de temperatura de fibra óptica em locais estratégicos que permitam a avaliação de eficácia e segurança em tempo real, como visto na Figura 2. Essas sondas permitem o registro de temperaturas ao longo do experimento, permitindo dosimetria precisa e histórico térmico do experimento. A Figura 3 demonstra as curvas geradas durante um experimento in vivo, destacando a capacidade de monitorar de perto a temperatura e ajustar o sistema para manter as temperaturas do tumor dentro da faixa desejada. A Figura 4 resume os métodos in vivo.
Estes métodos in vivo, semelhantes aos métodos in vitro, podem ser usados para investigar diferentes tipos de câncer, diferentes doses de hipertermia e com vários tratamentos combinados. Por exemplo, estudos prévios em nosso laboratório investigaram a combinação de hipertermia e quimioterapia12. Também concluímos numerosos experimentos de hipertermia e radiação para a determinação da eficácia e dos mecanismos moleculares. Os ratos de controle para esses experimentos passam por todos os procedimentos, exceto para a geração real de hipertermia. A Figura 5 contém dois gráficos vulcânicos que demonstram genes diferencialmente expressos após o tratamento de hipertermia mNP in vitro e in vivo (mNPH). Essas figuras são exemplos de como usamos técnicas moleculares para monitorar os efeitos da hipertermia.
Figura 1: Esquema de hipertermia mNP in vitro. Este esquema demonstra o método para hipertermia de nanopartículas magnéticas in vitro. Para garantir que o aquecimento ocorra, as células devem receber partículas e tempo suficientes para a absorção adequada de mNP. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Colocação de cateteres para monitoramento de temperatura. Esta figura demonstra a colocação de cateteres que abrigam as sondas de temperatura de fibra óptica para registrar temperaturas em diferentes locais do tumor e/ou da região tumoral. Este valor é adaptado da ref.19. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Monitoramento da temperatura em tempo real durante o tratamento de um tumor de camundongo. Este gráfico demonstra as leituras de temperatura em tempo real que permitem monitorar a temperatura corporal central, as temperaturas ambientais e as múltiplas temperaturas dentro do tumor, durante um experimento in vivo. O controle das temperaturas dentro do tumor é demonstrado através das variações mínimas em larga escala na porção ampliada da figura. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Esquema de hipertermia mNP in vivo. Este esquema demonstra o método para hipertermia de nanopartículas magnéticas in vivo. A injeção de nanopartículas suficientes, bem como tempo suficiente para distribuição e absorção, garante a capacidade de fornecer a dose térmica desejada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Expressão gênica diferencial. Expressão gênica diferencial após tratamento de hipertermia mNP in vitro (A) e in vivo (B). Essas parcelas vulcânicas representam mudanças genéticas em um eixo x log 2, com significância no eixo y, tanto para métodos mNPH in vitro quanto in vivo. Cada círculo representa um gene diferente, com os 20 genes diferencialmente expressos mais significativos marcados. Quanto mais longe o gene é de zero no eixo x, maior a mudança da dobra, e quanto maior o gene está no eixo y, menor o valor de p. Embora ambos tivessem a mesma dose térmica, a hipertermia in vivo levou a maiores alterações na expressão gênica do que in vitro. Esses gráficos são exemplos dos dados biológicos que podem ser gerados usando o protocolo descrito. A parcela do vulcão in vitro foi adaptada da ref.17. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O projeto e a implementação deste sistema fornecem a capacidade de conduzir experimentos precisos e reprodutíveis de hipertermia de nanopartículas magnéticas in vitro e in vivo. É fundamental que o sistema seja projetado de tal forma que a frequência e a intensidade do campo AMF sejam adequadamente combinadas com o tipo de nanopartícula magnética, a concentração e a localização e temperatura do tecido desejadas. Além disso, o monitoramento preciso da temperatura em tempo real é crucial para a segurança e o cálculo de uma dose térmica precisa (minutos equivalentes cumulativos a 43 °C / CEM). A colocação de sondas, conforme demonstrado na Figura 1, permite o monitoramento em tempo real da dose térmica e da temperatura corporal central, conforme observado na Figura 2.
O primeiro passo na entrega precisa da hipertermia de nanopartículas magnéticas é a construção de um sistema seguro para animais e operadores. Todos os componentes do sistema também devem ser bem compreendidos do ponto de vista operacional e de entrega. Nessa situação, isso significa entender o potencial das correntes parasitas AMF e saber onde as partículas magnéticas estão localizadas. As antenas, ou bobinas, são um fator-chave na forma e resistência do campo, e o sistema de resfriamento usado é importante para evitar o superaquecimento da bobina20. A intensidade do campo fora do condutor é diretamente proporcional à força da corrente que flui através do condutor. A intensidade do campo magnético em qualquer ponto do espaço ao redor do condutor é a soma vetorial dos campos produzidos pelos condutores na área circundante. O campo magnético é produzido em um ângulo reto com o fluxo de corrente e a força diminui exponencialmente, em função da distância do condutor, de acordo com a regra do quadrado inverso de Biot-Savart21. Assim, a tubulação quadrada é usada para hipertermia in vivo para um campo mais uniforme dentro da bobina. Criar um campo magnético com a força e o volume necessários para um sistema potencialmente clinicamente relevante requer uma alta corrente elétrica. Portanto, os projetos de antenas devem ser capazes de acomodar níveis significativos de energia elétrica. Além disso, as antenas AMF devem ser projetadas para que sua indutância fique dentro da faixa aceitável do gerador de energia. Nas frequências normalmente usadas, a maior parte do fluxo de corrente está na superfície do condutor da antena, o que significa que a superfície afeta o aquecimento resistivo, que pode ser minimizado pela eliminação de defeitos de superfície. Este aquecimento resistivo também significa que um sistema de resfriamento da bobina é necessário para garantir que a bobina e o ambiente não superaqueçam.
Uma limitação do projeto do nosso sistema é que ele não permite uma gama total de frequências e campos magnéticos, mas permite que sejam gerados campos apropriados para células, roedores e animais de grande porte. Especificamente, a intensidade máxima de campo disponível de qualquer sistema de aquecimento por indução está diretamente relacionada ao fluxo de corrente na antena (bobina). Os geradores AMF são classificados em quilowatts, que são calculados multiplicando a tensão disponível pela corrente disponível (amperes). Assim, um sistema de 10kW com um limite de 500 V teria uma amperagem máxima de 20 A. O projeto das bobinas determinará qual limite é atingido primeiro e, portanto, o limite dos sistemas. A intensidade do campo magnético criada por qualquer corrente diminui exponencialmente em função da distância do condutor. Portanto, uma bobina de diâmetro maior com a mesma geometria que uma bobina de diâmetro menor, executada no mesmo sistema, teria uma menor força de campo no centro da bobina. Assim, o tamanho e a força do campo magnético necessários são limitados pela capacidade do gerador AMF. Construir uma bobina maior e usar mais energia leva a preocupações adicionais, principalmente aquecimento por correntes parasitas.
Existem várias preocupações de segurança que devem ser abordadas ao usar esse sistema para proteger usuários, animais e o próprio sistema. Primeiro, a ventilação adequada da sala deve ser mantida durante o uso da anestesia. Em segundo lugar, todas as áreas associadas à bobina devem estar livres de metal e/ou condutores, incluindo misturas salinas elevadas. Os usuários devem remover anéis e outras joias ao trabalhar em torno do AMF, e as amostras não devem conter nenhum tipo de metal. Da maior importância, as pessoas com marcapassos ou outros dispositivos ou objetos implantados devem consultar seu médico antes de trabalhar em torno do AMF. Para proteger o sistema, um sistema à prova de falhas deve ser usado para garantir que as necessidades de resfriamento do gerador e da bobina sejam atendidas antes que a energia seja aplicada. Além disso, uma visão geral da câmera térmica deve ser usada para detectar o aquecimento não intencional.
Para estudos in vitro, os passos mais importantes a seguir são a concentração de ferro nas células, a concentração de células, os parâmetros de FMA e a avaliação da dose térmica. As células podem ser tratadas/aquecidas com hipertermia de nanopartículas magnéticas, colocando as nanopartículas magnéticas no sobrenadante, células ou ambos. A quantidade de aquecimento de nanopartículas magnéticas dependerá do nível de nanopartículas magnéticas/Fe. Se o desejo é tratar apenas células com ferro internalizado, nossa experiência é que as células cancerosas individuais só absorverão um número limitado de nanopartículas magnéticas e que, mesmo quando a absorção é ótima, as células devem ser agregadas / peletizadas para criar uma situação de aquecimento celular, mesmo com FMA otimizada. Manter a temperatura do meio e das células em níveis biologicamente relevantes (quando não estão sendo aquecidos) também é importante para a medição precisa do aquecimento verdadeiro. A bobina solenoide de 14 voltas descrita aqui permite que temperaturas biologicamente relevantes sejam mantidas submergindo as amostras em uma coluna de água controlada termicamente.
Para os estudos in vivo, manter a temperatura central do animal e medir com precisão a temperatura dentro do tumor são fatores-chave. Este sistema de contenção animal e o design da bobina eliminam a deriva térmica no ambiente do animal devido às configurações de bobina / energia e ajudam a manter a temperatura corporal central normal. Manter a temperatura central do corpo é fundamental para resultados significativos do experimento. A sonda retal permite o monitoramento em tempo real da temperatura central do animal. Quando sob anestesia, a temperatura central de um animal diminui inerentemente. Para resolver essa situação, desenvolvemos um sistema de aquecimento ambiental que fornece ar quente ao redor do recipiente de contenção animal, permitindo que a temperatura central permaneça na faixa normal. Manter a temperatura central normal é essencial para garantir uma interpretação precisa dos resultados do tratamento da hipertermia e a eliminação de fatores ambientais. A colocação das sondas de monitoramento de temperatura em vários locais no tecido/tumor alvo é importante para obter uma avaliação precisa da temperatura e da dose térmica alcançada. Como é extremamente difícil, se não impossível, distribuir nanopartículas magnéticas de forma homogênea dentro de um tumor, conhecer os parâmetros de aquecimento em vários locais é essencial para alcançar uma dose térmica consistente e precisa de tecido/tumor. É importante notar que a concentração para estudos in vitro e in vivo é variável. Essa variação ocorre porque há menos limites na cultura de células, com as células tendo mais acesso aos mNPs, de modo que uma concentração menor pode ser usada. In vivo, uma maior concentração é necessária devido à natureza heterogênea dos tumores e à complicada morfologia 3D. Portanto, usar a mesma concentração de partículas in vivo e in vitro levaria a muito menos sendo absorvido pelas células.
Este manuscrito descreve os parâmetros e a instrumentação necessários para desenvolver um gerador de campo magnético alternado eficaz e flexível e um sistema de bobinas para tratamentos de hipertermia de nanopartículas magnéticas. Este sistema pode ser utilizado para estudos in vitro e in vivo. O sistema é eficaz para hipertermia localizada/direcionada e a preservação de tecido normal, tornando-o atraente, em comparação com outros sistemas de hipertermia AMF-mNP. Esses tratamentos de hipertermia podem ser alterados para investigar os efeitos de diferentes doses, com uma variedade de nanopartículas ou nanocarreadores e tratamentos adjuntos. Como o aquecimento tecidual, especialmente o aquecimento de nanopartículas magnéticas, pode ser afetado por tantas variáveis, é essencial entender os parâmetros em uma investigação. Se esses critérios forem atendidos, a hipertermia de nanopartículas magnéticas pode abordar muitas situações moleculares, celulares e clínicas, incluindo o controle independente e adjuvante do tumor. Embora os métodos aqui descritos exijam um esforço significativo, se as diretrizes forem seguidas, todo o potencial da hipertermia mNP pode ser realizado.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O estudo foi financiado por números de subvenção: NCI P30 CA023108 e NCI U54 CA151662.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| .25% Trypsin | Corning | 45000-664 | available from many companies |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Eppendorf 22363204 | available from many companies |
| B16F10 murine melanoma cells | American Type Culture Collection | CRL-6475 | |
| C57/Bl6 mice | Charles river | 027C57BL/6 | 6-week-old female mice |
| Chiller | Thermal Care | NQ 5 series | chiller that cools the coil |
| Coolant fluid | Dow Chemical Company | Dowtherm SR-1 | antenna cooling fluid |
| Fetal Bovine serum | Hyclone | SH30071 | available from many companies |
| fiber optic probes, software and chassis | FISO | FISO evolution software used to read the temperatures | |
| IR camera | Flir | infrared camera to monitor unintentional heating | |
| iron oxide nanoparticles | micromod Partikeltechnologie GmbH | Bionized NanoFerrite | dextran coated iron oxide nanoparticles |
| mouse coil, solenoid | Fluxtrol | custom built | |
| penicillin/streptomycin | Corning | 45000-652 | available from many companies |
| RF generator | Huttinger | TIG 10/300 | power source |
| RPMI media | Corning | 45000-396 | available from many companies |
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