Summary
Dit protocol presenteert technieken en methodologie die nodig zijn voor de nauwkeurige afgifte van magnetische nanodeeltjeshyperthermie met behulp van een geavanceerd leverings- en monitoringsysteem.
Abstract
Hyperthermie wordt al lang gebruikt bij de behandeling van kanker. De technieken varieerden van het intratumorale inbrengen van hete ijzerstaven tot systemisch afgeleverde tumorantilichaamgerichte magnetische nanodeeltjes, bij temperaturen van 39 °C (koortsniveau) tot 1.000 °C (elektrocauterie) en behandelingstijden van seconden tot uren. De temperatuur-tijdrelatie (thermische dosis) dicteert het effect met hoge thermische doses die resulteren in de weefselablatie en lagere thermische doses, wat resulteert in subletale effecten zoals verhoogde bloedstroom, accumulatie van geneesmiddelen en immuunstimulatie. Een van de meest veelbelovende huidige medische therapieën is magnetische nanodeeltjeshyperthermie (mNPH). Deze techniek omvat het activeren van magnetische nanodeeltjes, die systemisch of intratumoraal kunnen worden toegediend, met een niet-invasief, niet-toxisch afwisselend magnetisch veld. De grootte, constructie en associatie van de magnetische nanodeeltjes en de frequentie en veldsterkte van het magnetisch veld zijn belangrijke verwarmingsdeterminanten. We hebben geavanceerde instrumentatie en technieken ontwikkeld voor het leveren van reproduceerbare magnetische nanodeeltjeshyperthermie in grote en kleine diermodellen en gekweekte cellen. Deze aanpak, met behulp van continue, real-time temperatuurbewaking op meerdere locaties, maakt de levering van goed gedefinieerde thermische doses aan het doelweefsel (tumor) of cellen mogelijk, terwijl de verwarming van niet-doelweefsel wordt beperkt. Nauwkeurige controle en bewaking van de temperatuur, op meerdere locaties, en gebruik van het industriestandaard algoritme (cumulatieve equivalente minuten bij 43 °C /CEM43), maakt een nauwkeurige bepaling en kwantificering van de thermische dosis mogelijk. Ons systeem, dat een breed scala aan temperaturen, thermische doses en biologische effecten mogelijk maakt, is ontwikkeld door een combinatie van commerciële overnames en interne technische en biologische ontwikkelingen. Dit systeem is geoptimaliseerd op een manier die de snelle conversie tussen ex vivo, in vitro en in vivo technieken mogelijk maakt. Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe een effectieve techniek en systeem voor het leveren van reproduceerbare en nauwkeurige magnetische nanodeeltjestherapie (mNP) hyperthermie kan worden ontworpen, ontwikkeld en geïmplementeerd.
Introduction
Hyperthermie is van oudsher gebruikt in kankertherapie, alleen of in combinatie met andere behandelingen. Hoewel het een lange geschiedenis van gebruik heeft, wordt de meest voordelige methode voor het leveren van deze behandeling nog steeds besproken en is afhankelijk van de locatie en locatie van de ziekte. Methoden voor hyperthermieafgifte omvatten microgolf, radiofrequentie, gerichte echografie, laser en metalen nanodeeltjes (zoals goud of ijzeroxide)1,2,3,4. Deze toedieningsmethoden kunnen leiden tot een reeks behandelingstemperaturen van koortsniveau tot honderden graden C. Het biologische effect van hyperthermie hangt voornamelijk af van de gebruikte temperaturen en de duur van de behandeling5. Voor dit manuscript en doel richten we ons op magnetische nanodeeltjeshyperthermie (mNPH). Deze methode maakt gerichte, gelokaliseerde, goed bewaakte en gecontroleerde temperatuurveranderingen mogelijk, met behulp van niet-toxische, door de FDA goedgekeurde nanodeeltjes van ijzeroxide.
Een valkuil van andere hyperthermie-modaliteiten is een gebrek aan nauwkeurige cellulaire targeting; hyperthermie heeft geen inherent hoge therapeutische verhouding, daarom is zorgvuldige thermometrie en targeting noodzakelijk6. mNPH maakt systemische of intratumorale injectie van mNP's mogelijk, waarbij warmte alleen wordt gegenereerd waar de mNP's zich bevinden, waardoor de behandeling rechtstreeks op de tumor wordt gericht. mNPH kan effectief zijn wanneer de magnetische nanodeeltjes zich binnen of buiten de cel bevinden. Voor kankertherapie is het algemene overzicht van mNPH dat de magnetische nanodeeltjes worden geïnjecteerd (intratumoraal of intraveneus), waarna een wisselend magnetisch veld wordt toegepast, waardoor de magnetische polen van nanodeeltjes voortdurend opnieuw worden uitgelijnd, wat leidt tot een gelokaliseerde verwarming van de cellen en het weefsel geassocieerd met de nanodeeltjes 7,8 . Door het volume nanodeeltjes en de frequentie/sterkte van het wisselmagnetisch veld (AMF) aan te passen, is het mogelijk om de temperatuur die in het weefsel wordt gegenereerd zorgvuldig te regelen.
Deze behandeling werkt goed in tumoren die zich in de buurt van het lichaamsoppervlak bevinden, omdat diepere tumoren een sterkere AMF vereisen, dus het risico op wervelstroomverwarming neemt toe9. Er zijn aanwijzingen dat hyperthermie klinisch wordt gebruikt als monotherapie, maar vaak wordt hyperthermie gecombineerd met bestralingstherapie of chemotherapie, wat leidt tot een meer gericht antikankereffect 10,11,12. Klinisch bewijs van hyperthermie in combinatie met bestralingstherapie is besproken in een eerdere publicatie13. Ons lab heeft met succes een verscheidenheid aan dieren behandeld, van muizen tot varkens en spontane hondenkankers, met behulp van de mNPH-methode 12,14,15. Dit protocol is bedoeld voor diegenen die geïnteresseerd zijn in het onderzoeken van de effecten van gelokaliseerde hyperthermiebehandeling, alleen of in combinatie met andere therapieën.
Een van de belangrijkste factoren bij hyperthermie is het kunnen meten en begrijpen, in realtime, van de thermische dosis die wordt afgeleverd aan het doel / tumorweefsel. Een standaardmethode voor het berekenen en vergelijken van de dosis is door het aantonen van de cumulatieve equivalente minuten van verhitting bij 43 °C; dit algoritme maakt het mogelijk om doses onafhankelijk van het toedieningssysteem, maximale en minimale temperaturen (binnen een specifiek bereik) en heat up/cool down parameters 5,16 te vergelijken. De CEM-berekening werkt het beste voor temperaturen tussen 39-57 °C5. In sommige van de onderzoeken die we hebben uitgevoerd, hebben we bijvoorbeeld gekozen voor een thermische dosis van CEM43 30 (d.w.z. 30 minuten bij 43 °C). Door deze dosis te kiezen, konden we in vitro kijken naar een veilige, effectieve immunogenetische effecten, zowel alleen als in combinatie met een enkele dosis straling17.
Bij magnetische hyperthermie van nanodeeltjes zijn er verschillende factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij het bouwen van een geschikt afgiftesysteem. Het instrumentatieontwerp omvat belangrijke veiligheidsfactoren, zoals het gebruik van een koelmachine om ervoor te zorgen dat de magnetische veldafgifteapparatuur koel blijft, zelfs wanneer deze op hoog vermogen wordt gebruikt, en fail-safe procedures die voorkomen dat het systeem wordt ingeschakeld als niet alle temperatuur-, vermogensbeoordelings- en besturingssystemen zijn geactiveerd. Bovendien zijn er belangrijke biologische factoren waarmee rekening moet worden gehouden voor zowel in vivo als in vitro situaties. Bij het gebruik van gekweekte cellen is het noodzakelijk om te behandelen in groeimedia en op een consistente levensvatbare temperatuur te blijven om fysiologische veranderingen te voorkomen die de resultaten kunnen beïnvloeden. Voor individuele nanodeeltjestypen is het belangrijk om de specifieke absorptiesnelheid (SAR) te kennen bij het berekenen van op AMF gebaseerde verwarmingsparameters. Evenzo is het belangrijk om de mNP / Fe-concentratie te kennen, in cellen en weefsels, die nodig is om de gewenste verwarming te bereiken. In vivo methoden vereisen nog meer aandacht voor detail, omdat het dier tijdens de behandeling onder narcose moet worden gehouden en de kerntemperatuur van het dier gedurende de behandeling op een normaal niveau moet worden gehouden. Het laten dalen van de lichaamstemperatuur van het dier, zoals gebeurt onder anesthesie, kan de algehele resultaten beïnvloeden, met betrekking tot de thermische dosis van het te behandelen weefsel.
In dit manuscript bespreken we de methoden die worden gebruikt om een veelzijdig magnetisch nanodeeltjeshyperthermiesysteem te ontwerpen en te construeren, evenals belangrijke gebruiksfactoren waarmee rekening moet worden gehouden. Het beschreven systeem zorgt voor de robuuste, consistente, biologisch geschikte, veilige en goed gecontroleerde afgifte van magnetische nanodeeltjeshyperthermie. Ten slotte moet worden opgemerkt dat de mNPH-onderzoeken die we uitvoeren vaak betrekking hebben op andere therapieën zoals bestraling, chemotherapie en immunotherapie. Om deze resultaten zinvol te laten zijn, is het belangrijk om te bepalen hoe de geleverde warmte de werkzaamheid en/of veiligheidstoxiciteit van andere modaliteiten (of omgekeerd) en het welzijn van het dier kan beïnvloeden. Om deze reden en de eerder genoemde dosimetrie en therapeutische situaties, is het essentieel om strikte aandacht te besteden aan de nauwkeurigheid van de magnetische nanodeeltjeshyperthermie en de continue kern- en doeltemperatuurmetingen. Het doel van dit protocol is om een eenvoudige, consistente methode en beschrijving te bieden voor de levering van veilige en effectieve magnetische nanodeeltjeshyperthermie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het Dartmouth College Animal Care and Use Program is geaccrediteerd door de American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (iAAALAC) en houdt zich aan alle richtlijnen en voorschriften van UDSA en NIH (Office of Laboratory Animal Welfare). Alle in vivo studies werden goedgekeurd door het Dartmouth College Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). De euthanasieprocedure voldoet aan de AVMA-richtlijnen voor de euthanasie van dieren 2020.
1. Instrumentatie/ontwerp van het systeem
- Ontwerp aangepaste AMF-antenne (spoel) om een gesloten lus te zijn, waarbij vormen worden gekozen om het gewenste magnetische veld te creëren. Gebruik inductieformules en kenmerken van de keuze van de stroomgenerator om compatibele spoelen te ontwerpen om het gewenste veld te genereren. Gebruik verschillende ontwerpen voor in vitro en in vivo experimenten.
- Zorg ervoor dat de inductie van de AMF-antenne binnen het aanvaardbare bereik van de stroomgenerator valt. Condensatoren toevoegen of aftrekken om de antenne af te stemmen op de stroomgenerator.
- Ontwerp voor in vitro experimenten een 14-draaiige spiraal, binnendiameter 2 cm en lengte 14 cm, die buizen van 1,5 ml kan bevatten, waardoor meerdere monsters tegelijkertijd kunnen worden behandeld. Isoleer de spoel met een vinylpolymeer en gebruik een polystyreen afstandhouder om de spoel van de buizen te scheiden. Details van de ontwerpspecificatie en overwegingen zijn aanwezig in het aanvullend dossier 1.
- Voor in vivo experimenten, koop een op maat gemaakte spiraalvormige spoel voor het hele lichaam van een fabrikant met eigen ontwerpinformatie. Gebruik vierkante buizen van 8 mm (omdat dit een uniformer veld in de boring van de spoel creëert) en een concentrator op het beoogde behandelingsgebied. Maak de concentrator 5,0 cm lang, met in totaal 5 omwentelingen die resulteren in een binnendiameter van 3,6 cm, een buitendiameter van 5,2 cm, en hebben zijn locatie op het beoogde behandelingsgebied. Omring de spoel met een polycarbonaat schaal.
- Gebruik een AMF-generator met regelbaar vermogen en frequentie, nominaal 10 kW of meer als stroombron. De inductie komt overeen met de voedingsbron en antennes/spoelen tot een bereik van 0,62 tot 1,18 μHenries (μH), waardoor frequenties tussen 30-300 kHz mogelijk zijn. Koel de generator met gerecycled water via een centrifugaal boostpomp, druk geregeld tot 50 psi.
- Koel de spoelen met een koelvloeistof met een koelcapaciteit van 5,6 ton die 25% op ethyleenglycol gebaseerde warmteoverdrachtsvloeistof verdund met water door de AMF-antenne pompt. Stel de temperatuur van de koelmachine zo in dat de antenne het monster niet verwarmt of afkoelt.
- Voor de insluiting van het dier, bouw een buisvormige houder die in het midden van de spoel kan worden opgehangen met een luchtspleet van 0,5 cm tussen de houder en het spoeloppervlak. Sluit een instelbare geconditioneerde luchtpomp aan die lucht door de schaal rond de spoel circuleert en stel deze in om een normale kerntemperatuur van het dier te handhaven. Sluit het anesthesieapparaat aan op de buisvormige dierhouder in de buurt van het hoofd van het dier om een goede levering van anesthesie te garanderen.
- Maak voor celinsluiting een apparaat dat water uit een waterbad door de afstandhouder circuleert waar buizen worden geplaatst. Stel de temperatuur van dit waterbad zo in dat de buizen omgeven zijn door water op 37 °C.
- Gebruik glasvezelsondes om de temperaturen in de tumor, de kern van het dier en de dierlijke omgeving te controleren of voor in vitro studies, waarbij de temperatuur van de celpellet en het water rond de buizen wordt bewaakt.
- Gebruik magnetische ijzeroxide nanodeeltjes die 100 nm groot zijn voor alle experimenten.
OPMERKING: Concentratie en specifieke absorptiesnelheid (SAR) zijn twee kenmerken waarmee rekening moet worden gehouden bij het kiezen van nanodeeltjes, omdat ze rechtstreeks van invloed zijn op de mogelijke verwarming en thermische dosis18.
2. Hyperthermie in vitro
- Kweek B16F10 muizenmelanoomcellen in RPMI-media met 10% FBS en 1% Pen/streptokokken. Plaat 150, 000 cellen/put in 6-well platen, met 2 ml compleet medium.
- Bepaal de juiste behandeling voor elke put, d.w.z. cellen zonder mNP's en geen AMF, cellen met mNP's en geen AMF, cellen zonder mNP's en AMF, cellen met mNP's en AMF.
OPMERKING: Zorg er bovendien voor dat er geschikte controles zijn als u hyperthermie combineert met een andere therapie. AMF wordt uitgevoerd in een standaard onderzoeksbanklaboratorium dat is uitgerust met de benodigde stroom- en koelmogelijkheden. - Voeg 24 uur na het beplateren mNP's toe aan de juiste putten zoals bepaald in de vorige stap. Voeg mNP's toe aan een concentratie van 3 mg ijzer/ml. Zorg ervoor dat de mNP's door de put worden verdeeld, hetzij door een voorraadmedia/mNP-oplossing te maken (oude media verwijderen, deze oplossing toevoegen) of door de mNP's direct en voorzichtig wervelende platen toe te voegen voor homogene distributie.
- Begin de behandeling, 48 uur na de toevoeging van mNP's, wanneer putten ~ 80% confluent zijn, door de media te verwijderen en putjes te wassen met verse media. Verwijder de media.
- Voeg 0,5 ml trypsine toe aan elk behandeld welzijn en draai voorzichtig rond. Gebruik een microscoop om te controleren of de cellen los zijn.
- Voeg 1 ml media toe aan elk putje om de cellen in buizen van 1,5 ml te verzamelen. Verzamel alle cellen uit de put (~ 1 x 106 cellen). Gebruik een duidelijk gelabelde aparte buis voor elke put.
- Draai buizen op 60 x g gedurende 2-3 minuten om cellen te laten pelleteren. Houd de pellet vast in de media.
- Plaats buizen in de afstandhouder vol water in de spoel. Stel de temperatuur van het waterbad zo in dat de media en de celpellet op 37 °C worden gehouden. Bewaak de temperatuur in de buis en het waterbad met behulp van afzonderlijke glasvezeltemperatuursondes.
- Zet de koelmachine aan, controleer of de koelvloeistof door de spoel stroomt. Schakel de stroombron in en pas het percentage van het maximum aan het gewenste veld aan. Bedien de 14-draais magneetspoel, aangedreven door een generator van 10 kW, op 165 kHz en 23,87 kA/m (300 Oe).
- Plaats een aparte glasvezeltemperatuursonde in een van de buizen. Behandel de cellen tot de eerder bepaalde protocolthermische dosis. Een voorbeeld is 30 min bij 43 °C (CEM43 van 30).
- Resuspend cellen in de media die zich in hun buizen bevinden en opnieuw verguld tot nieuwe 6 putplaten. Label de nieuwe platen duidelijk. Het doel is om alle verzamelde cellen (~ 1 x 106 cellen) opnieuw te plaatsen.
OPMERKING: Nieuwe 6 putplaten moeten worden gebruikt om ervoor te zorgen dat de cellen die worden gekweekt, een behandeling krijgen. Als de oude platen worden gebruikt, kunnen er nog steeds cellen op de platen achterblijven die niet met succes zijn trypsinized. - Indien nodig, voor de volgende experimentele procedure, lyseer de cellen voor RNA- of eiwitexpressieanalyse.
3. Hyperthermie in vivo
- Celkweek en inenting
- Kweek B16F10 muizenmelanoomcellen in RPMI-media met 10% FBS en 1% Pen/streptokokken. Gebruik borden/schotels die voldoende cellen leveren voor inenting van het gewenste aantal dieren. Bijvoorbeeld, 10, 100 mm schotels, verguld op 100.000 cellen, zullen binnen 48 uur samenvloeien met voldoende cellen voor 20 muizeninjecties.
- Trypsinize cellen en verzamel met behulp van pure RPMI-media (geen FBS of pen / strep).
- Tel cellen en maak een oplossing voor de gewenste concentratie cellen, op basis van het inentingsvolume en muisnummers.
- Verdoof 6 weken oude vrouwelijke C57Bl/6 muizen met behulp van verdampte isofluraan en zuurstof. Plaats dieren in een plexiglas doos met 5% isofluraan en 95% zuurstof totdat ze geïnduceerd zijn. Verwijder het dier eenmaal geïnduceerd en gebruik een gezichtskegel van 2% isofluraan om de stappen 3.1.5-3.1.7 en 3.3.3-3.3.6 te voltooien.
OPMERKING: Gebruik voor anesthesie tijdens de behandeling een ingebouwde anesthesie-containment. Volg standaard institutionele protocollen voor muizenanesthesie. Zorg voorafgaand aan dierproeven voor de juiste IACUC-goedkeuring. Breng het dier na anesthesie terug naar de kooi en controleer het herstel om ervoor te zorgen dat er geen complicaties zijn. - Controleer op het gebrek aan reactie op de rechtzettende reflexen.
- Scheer de rechterflank met een elektrisch scheerapparaat.
- Reinig het injectiegebied met een alcoholdoekje. Injecteer 1-2 x 106 cellen, met behulp van een glazen spuit van 100 μL met een naald van 28 G, gedispergeerd in 50 μL media intradermaal op de geschoren rechterflank van verdoofd.
- Tumorgroei/Nanodeeltje injectie
- Meet tumoren in 3 dimensies met behulp van remklauwen (lengte, breedte en diepte) en bereken volumes met (lengte x breedte x diepte x π)/6.
- Wanneer de tumorvolumes 120 mm3 (+/- 20 mm3) bereiken, plaatst u de dieren op onderzoek. Ontwerp de studie en zorg ervoor dat er geschikte controle- en behandelingsgroepen zijn, waaronder cohorten voor combinatietherapie (d.w.z. controle, mNPH, bestraling en de combinatie).
- Verdoof muizen die mNP's krijgen zoals beschreven in 3.1.4.
- Maak het gebied schoon met een alcoholdoekje. Injecteer mNP's in de tumor 3 uur voor de behandeling met AMF. Injecteer een volume zodanig dat de dosis 7,5 mg ijzer/cm3 tumor is.
OPMERKING: Ongepubliceerde gegevens uit het lab suggereren dat maximale mNP-opname plaatsvindt na 3-6 uur.
- AMF behandeling
- Verdoof de muis en plaats op een verwarmingskussen om de kerntemperatuur te handhaven.
- Controleer op het gebrek aan reactie op de rechtzettende reflexen. Verwijder het oormerk of andere metalen voorwerpen op de muis.
- Plaats voorzichtig een gesmeerde glasvezeltemperatuursonde in het rectum van de muis.
- Plaats een katheter in de tumor en verwijder de naald. Snijd de katheter zodanig door dat deze niet te veel uit de tumor steekt.
OPMERKING: De fiberoptische temperatuurkatheters worden geplaatst en verwijderd terwijl de muizen onder algemene anesthesie zijn, d.w.z. de katheters zijn alleen op hun plaats tijdens de tumorverwarmingsprocedure. Muizen krijgen een enkele subcutane dosis van een NSAID-analgesiemedicijn, ketoprofen (5 mg / kg), op het moment van de procedure. We hebben geen ongemak of morbiditeit op korte of lange termijn waargenomen die verband houdt met de plaatsing van de katheters. - Steek een glasvezeltemperatuursonde met 3 sensoren in de katheter. De katheter beschermt de glasvezeltemperatuurvoelersensoren.
- Plak de rectale en intratumorale sonde op de staart van het dier om ervoor te zorgen dat ze op hun plaats blijven.
- Plaats de muis in een buis van 50 ml, kop naar beneden. De buis moet een gat in de buurt van het hoofd hebben waar de anesthesie zal worden aangesloten en afgeleverd.
- Plaats de buis in de spoelopstelling en sluit de anesthesie opnieuw aan.
- Plaats een glasvezeltemperatuursonde losjes in de buis om de omgevingstemperatuur te meten.
- Zet de koelmachine aan en zorg ervoor dat er koelvloeistof wordt gecirculeerd.
- Controleer en zorg ervoor dat de computersoftware de verschillende temperaturen weergeeft en begin met opnemen om een CEM43-berekening in realtime weer te geven. De vereiste CEM43 is de eerder bepaalde dosis.
OPMERKING: Voordat de magneet wordt ingeschakeld, moet u ervoor zorgen dat er geen metalen voorwerpen aan het dier zijn bevestigd, omdat deze snel zullen opwarmen. Zorg er bovendien voor dat iedereen in de kamer geen pacemaker heeft en dat het veilig is voor hen om daar te zijn. - Zet de magneet aan met een laag vermogenspercentage.
- Zorg ervoor dat de glasvezeltemperatuurvoelers temperatuurveranderingen registreren. De temperaturen zullen stijgen zodra de AMF wordt geactiveerd naarmate het veld toeneemt. Zorg ervoor dat de kerntemperatuur van het dier op 38 °C blijft. Regel de kerntemperatuur met behulp van de geconditioneerde luchtjas.
- Pas de sterkte van het magnetisch veld aan door het vermogen op de generator te wijzigen met behulp van de ingebouwde bedieningsknop, die op zijn beurt het temperatuurniveau in de tumor regelt.
- Schakel de AMF uit zodra de gewenste dosis, zoals eerder bepaald door de gebruiker (bijvoorbeeld CEM43 40), binnen de tumor wordt bereikt.
- Zodra de AMF is uitgeschakeld, verwijdert u de buis van de spoel.
- Verwijder de muis uit de buis en extraheer de verschillende sondes en katheter. Tag het dier indien nodig met een nieuw metalen oormerk.
- Zodra de behandelingen zijn voltooid, sluit u de koelmachine af.
- Herstel de dieren van de anesthesie en zorg ervoor dat er geen complicaties zijn. Controleer hun gedrag om ervoor te zorgen dat ze weer normaal worden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro studies
Cellen zullen alleen de gewenste temperatuur en thermische dosis bereiken en behouden als de hoeveelheid en concentratie van de magnetische nanodeeltjes / ijzer en de AMF op de juiste manier zijn afgestemd. Bij het gebruik van magnetische nanodeeltjes om cellen in vitro (en in vivo) te verwarmen, moet worden opgemerkt dat om hyperthermie te bereiken in cellen met geïnternaliseerde magnetische nanodeeltjes, een specifiek niveau van intracellulaire mNP / Fe nodig zal zijn, en het aantal en de nabijheid van mNP geladen cellen, tot elkaar, zal nodig zijn. Als het niveau van mNP/Fe in de doelcellen/het doelweefsel voldoende is om een verwarmend effect te bereiken, kunnen de frequentie en sterkte van het magnetisch veld worden aangepast om de gewenste temperatuur en effecten te bereiken. Indien goed verguld, kunnen verdere studies naar genetische en moleculaire verschillen tussen verschillende doses en timings worden nagestreefd17. Figuur 1 geeft een schema weer van de in vitro methoden.
Deze in vitro methoden kunnen worden gebruikt om cellulair mRNA en eiwitexpressieverandering te onderzoeken. Een recent voorbeeld uit ons laboratorium bepaalde immunogenetische verschillen na CEM43 30 mNPH-behandeling, een 8 Gy-bestralingsbehandeling en de combinatie. We waren in staat om overeenkomsten en verschillen in expressie tussen immuun- en cytotoxische routes te identificeren om een beter begrip te krijgen van het mechanisme achter de effecten en hoe ze synergetisch combineren17. Elk experiment maakt gebruik van een verscheidenheid aan milieuvriendelijke en verwarmde controlemonsters. De controles zullen verschillende mRNA- en eiwitexpressieniveaus hebben in vergelijking met die welke een hyperthermiebehandeling krijgen.
In vivo onderzoek
In in vivo studies zijn er aanvullende overwegingen. Ongeacht de beoogde thermische dosis is het absoluut noodzakelijk om een fysiologisch aanvaardbare kerntemperatuur te handhaven bij het te behandelen dier. Dit kan een uitdaging zijn met knaagdieren onder narcose, omdat de kerntemperatuur snel verloren kan gaan (kerntemperatuurmodulerende technieken zoals verwarmingspads zijn vaak nodig). Lagere dan normale lichaamstemperaturen kunnen de noodzaak vereisen om de AMF-mNPH te ver te duwen, wanneer wordt geprobeerd een specifieke thermische dosis in de tumor te bereiken, wat resulteert in onaanvaardbare effecten in het niet-doelweefsel (niet-doelweefsel wervelstroomverwarming is zo'n mogelijkheid). Zelfs kleine afwijkingen in de kerntemperatuur van het lichaam kunnen leiden tot ongewenste fysiologische complicaties in de tumor of het normale weefsel. Zoals eerder vermeld, echter de moeite waard om te herhalen, is het voor nauwkeurige, reproduceerbare verwarming essentieel om een match te bereiken tussen de mNP / Fe-weefselconcentratie, AMF-frequentie en veldsterktetemperatuurbewakingsparameters en doelweefselgrootte en -diepte. Er moet een basisconcentratie van mNP's in de tumor zijn om meetbare verwarming mogelijk te maken. Het niveau/vermogen van warmte hangt niet alleen af van de mNP-weefselconcentratie (mg Fe/g-weefsel) en hun relatieve verdeling binnen de tumor, maar ook van de frequentie van de AMF en de daaropvolgende veldsterkte. Veranderingen in een van de bovenstaande kunnen leiden tot verschillende bereiken van haalbare temperaturen in het weefsel. Door jarenlange ervaring hebben we de concentratie die we gebruiken voor preklinische tumorbehandelingen en de frequentie en veldsterkte van het AMF-systeem geoptimaliseerd om een veilige en effectieve activering mogelijk te maken. Omdat het onmogelijk is om de temperatuur/thermische dosis op alle weefsellocaties te meten, is het ook essentieel om zoveel mogelijk optische temperatuursondes van vezels op strategische locaties te plaatsen die real-time werkzaamheids- en veiligheidsbeoordeling mogelijk maken, zoals te zien is in figuur 2. Deze sondes maken het mogelijk om de temperaturen gedurende het hele experiment te registreren, waardoor nauwkeurige dosimetrie en thermische geschiedenis van het experiment mogelijk zijn. Figuur 3 toont curven die zijn gegenereerd tijdens een in vivo experiment, waarbij de mogelijkheid wordt benadrukt om de temperatuur nauwlettend te volgen en het systeem aan te passen om de tumortemperaturen binnen het gewenste bereik te houden. Figuur 4 geeft een overzicht van de in vivo methoden.
Deze in vivo methoden, vergelijkbaar met de in vitro methoden, kunnen worden gebruikt om verschillende soorten kanker, verschillende hyperthermiedoses en met verschillende combinatiebehandelingen te onderzoeken. Eerdere studies in ons laboratorium hebben bijvoorbeeld de combinatie van hyperthermie en chemotherapie onderzocht12. We hebben ook tal van hyperthermie- en stralingsexperimenten voltooid voor de bepaling van werkzaamheid en moleculaire mechanismen. De controlemuizen voor deze experimenten ondergaan alle procedures, behalve de daadwerkelijke generatie hyperthermie. Figuur 5 bevat twee vulkaanplots die differentieel tot expressie gebrachte genen aantonen na in vitro en in vivo mNP hyperthermie behandeling (mNPH). Deze cijfers zijn voorbeelden van hoe we moleculaire technieken gebruiken om de hyperthermie-effecten te monitoren.
Figuur 1: In vitro mNP hyperthermie schematisch. Dit schema toont de methode voor in vitro magnetische nanodeeltjeshyperthermie. Om ervoor te zorgen dat verwarming plaatsvindt, moeten cellen voldoende deeltjes en tijd krijgen voor een adequate mNP-opname. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Plaatsing van katheters voor temperatuurbewaking. Deze figuur toont de plaatsing van katheters die de glasvezeltemperatuursondes huisvesten om temperaturen op verschillende locaties in de tumor en / of het tumorgebied te registreren. Dit cijfer is aangepast van ref.19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Real-time temperatuurbewaking tijdens de behandeling van een muizentumor. Deze grafiek toont de real-time temperatuurmetingen die het mogelijk maken om de kerntemperatuur van het lichaam, de omgevingstemperaturen en meerdere temperaturen in de tumor te bewaken, tijdens een in vivo experiment. De controle van de temperaturen in de tumor wordt aangetoond door de minimale grootschalige variaties op het ingezoomde deel van de figuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: In vivo mNP hyperthermie schematisch. Dit schema demonstreert de methode voor in vivo magnetische nanodeeltjeshyperthermie. Injectie van voldoende nanodeeltjes en voldoende tijd voor distributie en absorptie, zorgt voor het vermogen om de gewenste thermische dosis te leveren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Differentiële genexpressie. Differentiële genexpressie na behandeling van in vitro (A) en in vivo (B) mNP hyperthermie. Deze vulkaanplots vertegenwoordigen genetische veranderingen op een log 2 x-as, met betekenis op de y-as, voor zowel in vitro als in vivo mNPH-methoden. Elke cirkel vertegenwoordigt een ander gen, met de 20 meest significante differentieel tot expressie gebrachte genen gelabeld. Hoe verder het gen van nul op de x-as is, hoe groter de vouwverandering, en hoe hoger het gen op de y-as staat, hoe lager de p-waarde. Hoewel beide dezelfde thermische dosis hadden, leidde in vivo hyperthermie tot grotere genexpressieveranderingen dan in vitro. Deze plots zijn voorbeelden van de biologische gegevens die kunnen worden gegenereerd met behulp van het beschreven protocol. Het in vitro vulkaanplot is aangepast van ref.17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend dossier 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het ontwerp en de implementatie van dit systeem biedt de mogelijkheid om nauwkeurige en reproduceerbare in vitro en in vivo magnetische nanodeeltjes hyperthermie experimenten uit te voeren. Het is van cruciaal belang dat het systeem zo is ontworpen dat de AMF-frequentie en veldsterkte voldoende zijn afgestemd op het magnetische nanodeeltjestype, de concentratie en de gewenste weefsellocatie en -temperatuur. Bovendien is de nauwkeurige bewaking van de temperatuur in realtime cruciaal voor de veiligheid en de berekening van een nauwkeurige thermische dosis (cumulatieve equivalente minuten bij 43 °C/ CEM). De plaatsing van sondes, zoals aangetoond in figuur 1, maakt het mogelijk om de thermische dosis en de kerntemperatuur van het lichaam in realtime te monitoren, zoals te zien is in figuur 2.
De eerste stap in een nauwkeurige levering van magnetische hyperthermie van nanodeeltjes is het bouwen van een veilig systeem voor dieren en operators. Alle componenten van het systeem moeten ook goed worden begrepen vanuit een operationeel en leveringsstandpunt. In deze situatie betekent dat het begrijpen van het potentieel voor AMF-wervelstromen en weten waar magnetische deeltjes zich bevinden. De antennes, of spoelen, zijn een belangrijke factor in de vorm en sterkte van het veld, en het gebruikte koelsysteem is belangrijk om oververhitting van de spoel te voorkomen20. De veldsterkte buiten de geleider is recht evenredig met de stroomsterkte die door de geleider stroomt. De magnetische veldsterkte op elk punt in de ruimte rond de geleider is de vectorsom van de velden die door de geleiders in de omgeving worden geproduceerd. Het magnetisch veld wordt geproduceerd in een rechte hoek met de stroom en de sterkte neemt exponentieel af, als functie van de afstand tot de geleider, volgens de Biot-Savart inverse kwadratenregel21. Zo wordt vierkante buis gebruikt voor in vivo hyperthermie voor een meer uniform veld in de spoel. Het creëren van een magnetisch veld met de sterkte en het volume dat nodig is voor een potentieel klinisch relevant systeem, vereist een hoge elektrische stroom. Daarom moeten antenneontwerpen in staat zijn om aanzienlijke elektrische vermogensniveaus te accommoderen. Ook moeten AMF-antennes zo worden ontworpen dat hun inductie binnen het aanvaardbare bereik van de stroomgenerator valt. Bij de frequenties die doorgaans worden gebruikt, bevindt het grootste deel van de stroomstroom zich op het oppervlak van de antennegeleider, wat betekent dat het oppervlak de resistieve verwarming beïnvloedt die kan worden geminimaliseerd door oppervlaktedefecten te elimineren. Deze resistieve verwarming betekent ook dat een spoelkoelsysteem nodig is om ervoor te zorgen dat de spoel en omgeving niet oververhit raken.
Een beperking van ons systeemontwerp is dat het geen totaal bereik van frequenties en magnetische velden toestaat, maar het maakt het wel mogelijk om velden te genereren die geschikt zijn voor cellen, knaagdieren en grote dieren. In het bijzonder is de maximale veldsterkte die beschikbaar is van elk inductieverwarmingssysteem direct gerelateerd aan de stroom in de antenne (spoel). AMF-generatoren worden geclassificeerd in kilowatt, die worden berekend door de beschikbare spanning te vermenigvuldigen met de beschikbare stroom (ampères). Een 10kW-systeem met een 500 V-limiet zou dus een maximale stroomsterkte van 20 A hebben. Het ontwerp van de spoelen zal bepalen welke limiet als eerste wordt bereikt, en dus de systeemlimiet. De magnetische veldsterkte die door een stroom wordt gecreëerd, neemt exponentieel af als functie van de afstand tot de geleider. Daarom zou een spoel met een grotere diameter met dezelfde geometrie als een spoel met een kleinere diameter, die op hetzelfde systeem wordt uitgevoerd, een lagere veldsterkte hebben in het midden van de spoel. De vereiste magnetische veldgrootte en sterkte worden dus beperkt door de capaciteit van de AMF-generator. Het bouwen van een grotere spoel en het gebruik van meer vermogen leidt tot extra zorgen, voornamelijk wervelstroomverwarming.
Er zijn verschillende veiligheidsproblemen die moeten worden aangepakt bij het gebruik van dit systeem om gebruikers, dieren en het systeem zelf te beschermen. Ten eerste moet voldoende kamerventilatie worden gehandhaafd tijdens het gebruik van anesthesie. Ten tweede moeten alle gebieden die verband houden met de spoel vrij zijn van metaal en of geleiders, inclusief mengsels met een hoge zoutoplossing. Gebruikers moeten ringen en andere sieraden verwijderen wanneer ze rond de AMF werken en monsters mogen geen metaal bevatten. Van het grootste belang is dat mensen met pacemakers of andere geïmplanteerde apparaten of voorwerpen hun arts raadplegen voordat ze rond de AMF werken. Om het systeem te beschermen, moet een fail-safe systeem worden gebruikt dat ervoor zorgt dat aan de koelbehoeften van de generator en de spoel wordt voldaan voordat stroom wordt toegepast. Bovendien moet een overzicht van de thermische camera worden gebruikt om onbedoelde verwarming te detecteren.
Voor in vitro studies zijn de belangrijkste te volgen stappen de concentratie van ijzer in cellen, de concentratie van cellen, AMF-parameters en thermische dosisbeoordeling. Cellen kunnen worden behandeld / verwarmd met magnetische nanodeeltjeshyperthermie door de magnetische nanodeeltjes in het supernatant, cellen of beide te plaatsen. De hoeveelheid magnetische nanodeeltjesverwarming is afhankelijk van het niveau van magnetische nanodeeltjes / Fe. Als het de wens is om alleen cellen met geïnternaliseerd ijzer te behandelen, is onze ervaring dat individuele kankercellen slechts een beperkt aantal magnetische nanodeeltjes zullen opnemen en dat zelfs wanneer de opname optimaal is, de cellen moeten worden samengevoegd / gepelletiseerd om een celverwarmingssituatie te creëren, zelfs met geoptimaliseerde AMF. Het handhaven van de temperatuur van de media en cellen op biologisch relevante niveaus (wanneer ze niet worden verwarmd) is ook belangrijk voor een nauwkeurige meting van echte verwarming. De hier beschreven 14-draaiige magneetspoel maakt het mogelijk om biologisch relevante temperaturen te handhaven door de monsters onder te dompelen in een thermisch geregelde waterkolom.
Voor de in vivo studies zijn het handhaven van de kerntemperatuur van het dier en het nauwkeurig meten van de temperatuur in de tumor belangrijke factoren. Dit insluitingssysteem voor dieren en het ontwerp van de spoel elimineert thermische drift in de omgeving van het dier als gevolg van spoel- / vermogensinstellingen en helpt de normale kerntemperatuur van het lichaam te handhaven. Het handhaven van de kerntemperatuur van het lichaam is van cruciaal belang voor zinvolle experimentresultaten. De rectale sonde maakt real-time monitoring van de kerntemperatuur van het dier mogelijk. Onder narcose neemt de kerntemperatuur van een dier inherent af. Om deze situatie aan te pakken, hebben we een omgevingsverwarmingssysteem ontwikkeld dat warme lucht rond het insluitingsvat van het dier levert, waardoor de kerntemperatuur binnen het normale bereik blijft. Het handhaven van een normale kerntemperatuur is essentieel voor een nauwkeurige interpretatie van de behandelingsresultaten van hyperthermie en de eliminatie van omgevingsfactoren. De plaatsing van de temperatuurbewakingsondes op meerdere plaatsen in het doelweefsel/de tumor is belangrijk om een nauwkeurige beoordeling van de bereikte temperatuur en thermische dosis te krijgen. Omdat het uiterst moeilijk, zo niet onmogelijk is om magnetische nanodeeltjes homogeen in een tumor te verdelen, is het kennen van de verwarmingsparameters op meerdere locaties essentieel voor het bereiken van een consistente en nauwkeurige thermische dosis van weefsel / tumor. Het is belangrijk op te merken dat de concentratie voor in vitro en in vivo studies variabel is. Deze variatie komt omdat er minder grenzen zijn in celkweek met cellen die meer toegang hebben tot de mNP's, waardoor een lagere concentratie kan worden gebruikt. In vivo is een hogere concentratie noodzakelijk vanwege de heterogene aard van tumoren en de gecompliceerde 3D-morfologie. Daarom zou het gebruik van dezelfde concentratie deeltjes in vivo en in vitro ertoe leiden dat cellen veel minder worden opgenomen.
Dit manuscript beschrijft de parameters en instrumentatie die nodig zijn om een effectieve en flexibele roterende magnetische veldgenerator en spoelsysteem te ontwikkelen voor magnetische hyperthermiebehandelingen met nanodeeltjes. Dit systeem kan worden gebruikt voor zowel in vitro als in vivo studies. Het systeem is effectief voor gelokaliseerde / gerichte hyperthermie en het sparen van normaal weefsel waardoor het aantrekkelijk is, in vergelijking met andere AMF-mNP hyperthermiesystemen. Deze hyperthermiebehandelingen kunnen worden gewijzigd om de effecten van verschillende doses te onderzoeken, met een verscheidenheid aan nanodeeltjes of nanodragers en aanvullende behandelingen. Omdat weefselverwarming, met name magnetische nanodeeltjesverwarming, door zoveel variabelen kan worden beïnvloed, is het essentieel om de parameters in een onderzoek te begrijpen. Als aan deze criteria wordt voldaan, kan hyperthermie van magnetische nanodeeltjes veel moleculaire, cellulaire en klinische situaties aanpakken, waaronder onafhankelijke en adjuvante tumorcontrole. Hoewel de hier beschreven methoden aanzienlijke inspanningen vereisen, kan, als de richtlijnen worden gevolgd, het volledige potentieel van mNP-hyperthermie worden gerealiseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De studie werd gefinancierd door subsidienummers: NCI P30 CA023108 en NCI U54 CA151662.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| .25% Trypsin | Corning | 45000-664 | available from many companies |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Eppendorf 22363204 | available from many companies |
| B16F10 murine melanoma cells | American Type Culture Collection | CRL-6475 | |
| C57/Bl6 mice | Charles river | 027C57BL/6 | 6-week-old female mice |
| Chiller | Thermal Care | NQ 5 series | chiller that cools the coil |
| Coolant fluid | Dow Chemical Company | Dowtherm SR-1 | antenna cooling fluid |
| Fetal Bovine serum | Hyclone | SH30071 | available from many companies |
| fiber optic probes, software and chassis | FISO | FISO evolution software used to read the temperatures | |
| IR camera | Flir | infrared camera to monitor unintentional heating | |
| iron oxide nanoparticles | micromod Partikeltechnologie GmbH | Bionized NanoFerrite | dextran coated iron oxide nanoparticles |
| mouse coil, solenoid | Fluxtrol | custom built | |
| penicillin/streptomycin | Corning | 45000-652 | available from many companies |
| RF generator | Huttinger | TIG 10/300 | power source |
| RPMI media | Corning | 45000-396 | available from many companies |
References
- Chen, X., Tan, L., Liu, T., Meng, X. Micro-Nanomaterials for Tumor Microwave Hyperthermia: Design, Preparation, and Application. Current Drug Delivery. 14 (3), 307-322 (2016).
- Luo, W., et al. Effects of radiofrequency ablation versus other ablating techniques on hepatocellular carcinomas: A systematic review and meta-analysis. World Journal of Surgical Oncology. 15 (1), 126 (2017).
- Ter Haar, G. Heat and sound: Focused ultrasound in the clinic. International Journal of Hyperthermia. 31 (3), 223-224 (2015).
- Salunkhe, A. B., Khot, V. M., Pawar, S. H. Magnetic Hyperthermia with Magnetic Nanoparticles: A Status Review. Current Topics in Medicinal Chemistry. 14 (5), 572-594 (2014).
- Dewhirst, M. W., Viglianti, B. L., Lora-Michiels, M., Hanson, M., Hoopes, P. J. Basic principles of thermal dosimetry and thermal thresholds for tissue damage from hyperthermia. International Journal of Hyperthermia. 19 (3), 267-294 (2003).
- Roizin-Towle, L., Pirro, J. P. The response of human and rodent cells to hyperthermia. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 20 (4), 751-756 (1991).
- Hergt, R., Dutz, S., Müller, R., Zeisberger, M. Magnetic particle hyperthermia: Nanoparticle magnetism and materials development for cancer therapy. Journal of Physics Condensed Matter. 18 (38), (2006).
- Kumar, C. S. S. R., Mohammad, F. Magnetic nanomaterials for hyperthermia-based therapy and controlled drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (9), 789-808 (2011).
- Stigliano, R. V., et al. Mitigation of eddy current heating during magnetic nanoparticle hyperthermia therapy. International Journal of Hyperthermia. 32 (7), 735-748 (2016).
- Johannsen, M., et al. Clinical hyperthermia of prostate cancer using magnetic nanoparticles: Presentation of a new interstitial technique. International Journal of Hyperthermia. 21 (7), 637-647 (2005).
- Horsman, M. R., Overgaard, J. Hyperthermia: a Potent Enhancer of Radiotherapy. Clinical Oncology. 19 (6), 418-426 (2007).
- Petryk, A. A., Giustini, A. J., Gottesman, R. E., Kaufman, P. A., Hoopes, P. J. Magnetic nanoparticle hyperthermia enhancement of cisplatin chemotherapy cancer treatment. International Journal of Hyperthermia. 29 (8), 845-851 (2013).
- Peeken, J. C., Vaupel, P., Combs, S. E. Integrating hyperthermia into modern radiation oncology: What evidence is necessary. Frontiers in Oncology. 7, 132 (2017).
- Petryk, A. A., Giustini, A. J., Gottesman, R. E., Trembly, B. S., Hoopes, P. J. Comparison of magnetic nanoparticle and microwave hyperthermia cancer treatment methodology and treatment effect in a rodent breast cancer model. International Journal of Hyperthermia. 29 (8), 819-827 (2013).
- Stigliano, R. V., Shubitidze, F., Petryk, A. A., Tate, J. A., Hoopes, P. J. Magnetic nanoparticle hyperthermia: predictive model for temperature distribution. Energy-based Treatment of Tissue and Assessment VII. 8584, 858410 (2013).
- Dewhirst, M., Viglianti, B. L., Lora-Michiels, M., Hoopes, P. J., Hanson, M. A. Thermal dose requirement for tissue effect: experimental and clinical findings. Thermal Treatment of Tissue: Energy Delivery and Assessment II. 4954, 37 (2003).
- Duval, K. E. A., et al. Immunogenetic effects of low dose (CEM43 30) magnetic nanoparticle hyperthermia and radiation in melanoma cells. International Journal of Hyperthermia. 36, 37-46 (2019).
- Giustini, A. J., Petryk, A. A., Cassim, S. M., Tate, J. A., Baker, I., Hoopes, P. J. Magnetic Nanoparticle Hyperthermia in Cancer Treatment. Nano LIFE. 01, 17-32 (2010).
- Hoopes, P. J., et al. Intratumoral iron oxide nanoparticle hyperthermia and radiation cancer treatment. Thermal Treatment of Tissue: Energy Delivery and Assessment IV. 6440, (2007).
- Semiatin, S. L., Zinn, S. Coil design and fabrication basic design and modifications. Heat Treating. , 32-41 (1988).
- Maxwell, J. C.
