Summary
Præsenteret her er en protokol for kvantitativt at vurdere injicerbarheden af et materiale gennem en sprøjte-nål system ved hjælp af en standard mekanisk test rig.
Abstract
Injicerbare biomaterialer bliver mere og mere populære for minimalt invasiv levering af lægemidler og celler. Disse materialer er typisk mere tyktflydende end traditionelle vandige injektioner og kan være semi-solid, derfor, deres injicerbarhed kan ikke antages. Denne protokol beskriver en metode til objektivt at vurdere injicerbarheden af disse materialer ved hjælp af en standard mekanisk tester. Sprøjtestempleet komprimeres af krydshovedet med en bestemt hastighed, og kraften måles. Den maksimale kraftværdi eller plateaukraftværdien kan derefter bruges til sammenligning mellem prøver eller til en absolut kraftgrænse. Denne protokol kan bruges med ethvert materiale, og enhver sprøjte og nål størrelse eller geometri. De opnåede resultater kan anvendes til at træffe beslutninger om formuleringer, sprøjte- og kanylestørrelser tidligt i oversættelsesprocessen. Endvidere kan virkningerne af at ændre formuleringer på injicerbarhed kvantificeres, og den optimale tid til at injicere tidsskiftende materialer bestemmes. Denne metode er også velegnet som en reproducerbar måde at undersøge virkningerne af injektion på et materiale, at studere fænomener såsom selvheling og filter presning eller studere virkningerne af injektion på celler. Denne protokol er hurtigere og mere direkte anvendelig til injicerbarhed end rotationsredeologi og kræver minimal efterbehandling for at opnå nøgleværdier for direkte sammenligninger.
Introduction
Biomaterialer studeres og anvendes ofte som stilladser til cellebaseret vævsregenerering og depoter til målrettet, vedvarende levering af behandlingsmateriale1. Inden for dette område, injicerbare biomaterialer vokser i popularitet, da de er minimalt invasive, hvilket reducerer risikoen for infektion, smerte og ardannelse forbundet med implantation2. Yderligere, fordi de normalt anvendes som væsker, de er i overensstemmelse perfekt til vævsdefekter, og narkotika og celler kan blandes i dem umiddelbart før ansøgningen3,4,5. Som sådan, mens injicerbare biomaterialer kan fremstilles som præinstallerede sprøjter, de er ofte udarbejdet af klinikere direkte før påføring. F.eks. begynder cement at indstille, når pulveret og væskefaserne er blandet, og kan derfor ikke opbevares i lange perioder før brug6. Karakteriseringen af disse materialer er således tidsafhængig og uløseligt forbundet med deres forberedelse.
Almindelige injicerbare biomaterialer omfatter calciumcementer, polymethyl methacrylat, bioglas og forskellige polymere hydrogels3,7. I modsætning til traditionelle injektioner af lægemidler, som har de samme reologiske egenskaber som vand, disse injicerbare biomaterialer er typisk mere tyktflydende, ikke-newtonske, kan have nogle elastiske karakter, og kan også ændre sig over tid. Derfor kan injicerbarheden af disse materialer ikke antages, men skal vurderes eksperimentelt. Ved at kvantificere den kraft, der kræves til injektion og korrelere det til den lette injektion, kan tidlige beslutninger om, hvilke biomaterialeformuleringer, sprøjte- og nålestørrelser der skal gå fremad, foretages tidligt i udviklingsprocessen8. Sådanne forsøg kan også kvantificere virkningerne af ændrede formuleringer på injicerbarhed9.
Der er flere metoder til at vurdere egenskaberne af injicerbare materialer. Roterende reologi er ofte udnyttet til at vurdere viskositet, ikke-newtonske adfærd, post-shear opsving, indstilling tid, og andre egenskaber af disse materialer10,11,12. Mens denne type test er nyttig til at etablere grundlæggende egenskaber af materialerne, disse egenskaber ikke korrelerer direkte til injicerbarhed. For en newtonsk væske og cylindrisk sprøjte og nål kan injektionskraften estimeres ud fra en form for Hagen-Poiseuille-ligningen13:
Hvor F er den kraft, der kræves til injektion (N), Rs er den interne sprøjteradius (m), Rn er den interne nåleradius (m), L er nålens længde (m), Q er væskestrømningshastighed (m3 s-1),η er den dynamiske viskositet (Pa.s) og F fer friktionskraften mellem stemplet og tøndevæggen (N). Hvis viskositeten måles via rotationsredeologi, er sprøjtens og nålens dimensioner kendt, og strømningshastigheden estimeres, kan injektionskraften derfor estimeres. Denne ligning tager dog ikke højde for sprøjtens koniske ende eller andre geometrier, såsom off-center-afsætninger, og Ffskal estimeres eller findes eksperimentelt ved mekanisk prøvning. Yderligere, biomaterialer er typisk ikke newtonske, men udviser komplekse reologiske egenskaber. For en simpel forskydning udtynding væske, ligningen bliver14:
Hvor n er effektindekset (-) og K er konsistensindekset (Pa.sn)fra Ostwald de Waele-udtrykket: 
hvor er 
forskydningshastigheden (s-1). Kompleksiteten øges meget for materialer, hvis reologiske egenskaber ikke kan karakteriseres ved to værdier, og især for tidsafhængige materialer som indstilling af cement. Hvis materialeegenskaberne er forskydningsafhængige, skal materialet desuden testes med den forskydningshastighed, der forventes i nålen, som langt kan overstige rækkevidden af et rotationsretrometer15.
En anden kvantitativ metode til måling af injicerbarhed indebærer, at tryk- og forskydningssensorer fastgøres til en sprøjte, mens en injektion udføres, enten i hånden eller ved hjælp af en sprøjtepumpe. Dette udstyr er relativt billigt, dog kræver brugerne til at generere scripts og kalibrering kurver til at konvertere til kraft data16. Desuden kan en sprøjtepumpe ikke have tilstrækkeligt drejningsmoment til at komprimere stemplet med en præcis hastighed, hvis høje kræfter er nødvendige for at ekstrudere viskøse eller halvfaste materialer. Alternativt kan det være nyttigt at anvende disse sensorer ved indsprøjtning i hånden, da de kan anvendes i et reelt klinisk scenario under kliniske procedurer17. Men, Dette vil tage meget længere tid og kan indføre bruger bias, og vil derfor brug for større antal gentagelser med forskellige brugere for at opnå pålidelige resultater. Dette kan således være mere hensigtsmæssigt for materialer, der er længere nede i den translationelle rørledning, eller produkter, der allerede er i klinisk brug.
I denne protokol bruges en mekanisk tester til at komprimere stemplet med en bestemt hastighed og måle den kraft, der kræves for at gøre det. Denne type mekaniske tester er almindelig i materialelaboratorier og er blevet anvendt til at kvantificere injicerbarhed for forskellige biomaterialer18,19,20,21,22,23,24. Denne test kan bruges med enhver størrelse og geometri af sprøjte og nål, der indeholder ethvert materiale. Endvidere, i tilfælde af biomaterialer, der er lavet umiddelbart før brug, den nøjagtige formulering procedure, der ville blive brugt i klinikken eller kirurgi kan følges før test. En yderligere fordel ved denne procedure er, at den er forholdsvis hurtig; Når den mekaniske tester er sat op, kan snesevis af prøver undersøges på en time, afhængigt af ekstruderingshastighed og sprøjtevolumen. Dette er i modsætning til roterende reologi, som typisk tager mindst 5 - 10 minutter pr test, plus belastning, ækvilibrering og rengøring tid. Ved hjælp af en mekanisk tester producerer en pålidelig ekstrudering sats lige over stemplet, hvilket er særligt fordelagtigt for tyktflydende formuleringer eller dem med tidsafhængige egenskaber. Efter test er der behov for minimal efterbehandling af data for at trække vigtige værdier ud for objektive sammenligninger.
Protocol
1. Prøveforberedelse
- Klargør prøven, og læg den i sprøjten.
- For at simulere en forudindlæst sprøjte skal prøven forberedes på forhånd, den lægges i sprøjten og fastgør nålen. Opbevares efter behov, indtil testen. Dette kan være egnet til hydrogels og materialer, der ikke ændrer sig med tiden.
BEMÆRK: For eksempel opløses 2 g alginsyresalte i 100 ml deioniseret vand ved omrøring ved stuetemperatur for at forberede 2% alginatopløsninger. Aspirere opløsningen i 5 ml sprøjter, og opbevares i 24 timer ved stuetemperatur. - Alternativt, at simulere en injektion formuleret direkte før ansøgningen, forberede prøven på samme måde, det ville blive foretaget i klinikken, under hensyn til eventuelle indstilling gange. Læg den i sprøjten og fastgør nålen. Dette kan være egnet til cement, og materialer, hvis egenskaber ændrer sig med tiden.
BEMÆRK: For eksempel, at forberede calciumsulfat cement, manuelt blandes 4 g calciumsulfat hemihydrat i 5 ml deioniseret vand med en spatel i 1 min. Fjern stemplet fra sprøjten, og læg cementen i sprøjtetønden med spatel. Begynd den mekaniske test efter 4 min.
FORSIGTIG: Nåle udgør en sikkerhedsrisiko, brug stumpe nåle, hvis det er muligt. Hvis materialet indeholder celler eller andre biologiske materialer, skal der være ekstra forsigtighed for at forhindre skarpe skader.
- For at simulere en forudindlæst sprøjte skal prøven forberedes på forhånd, den lægges i sprøjten og fastgør nålen. Opbevares efter behov, indtil testen. Dette kan være egnet til hydrogels og materialer, der ikke ændrer sig med tiden.
2. Opsætning af den mekaniske tester
- Fastgør flade plader (til kompressionstest) til den mekaniske tester.
- Udstyr den mekaniske tester manuelt med en vejecelle med en maksimal belastning på 200 N.
BEMÆRK: Der kan anvendes en større vejecelle, forudsat at den har tilstrækkelig præcision ved 1-200 N-området. Prøver, der er mere tyktflydende og ikke beregnet til at blive injiceret i hånden, kan kræve en større belastningscelle. - Adskærg pladerne ved hjælp af de manuelle betjeningsknapper for at give tilstrækkelig plads til nålen, sprøjten og stemplet (ca. 30 cm vil være tilstrækkeligt).
- Opret en testprotokol.
- Åbn testguiden, og angiv testtypen til enaksial komprimering.
- Indstil forudindlæsningen. Dette er den målte kraftværdi, som test vil begynde. 0.5 N er tilstrækkelig.
- Indstil hastigheden til forladning til 5 mm/min. Dette er den hastighed, crosshead vil bevæge sig ned, indtil den støder på pre-load.
- Indstil belastningen til forskydningskontrol, og vælg en passende prøvningshastighed. 1 mm/s er en passende hastighed for en standard 5 ml sprøjte.
- Angiv en øvre kraftgrænse til at standse prøvningen, f.eks. Dette er primært af sikkerhedsmæssige årsager. Testen kan også stoppes automatisk ved en given forskydning, f.eks.
3. Opsætning af fastspændingssystemet
- Fastgør to sæt klemmer til to stande med greb, der er store nok til sikkert at ensconce den valgte sprøjte.
- Placer grebene mellem krydshovedet og bundpladen med tilstrækkelig plads under grebene til sprøjten og kanylen.
- Line up centrene for de to greb, og line disse op med midten af korshovedet.
BEMÆRK: Justering af klemmen greb med hinanden og midten af crosshead kan tage lidt tid og iteration at opnå, men er vigtigt at erhverve data af høj kvalitet. - Sørg for, at klemmerne sidder godt fast, så der ikke er bevægelse i klemmerne, når der påføres en nedadgående kraft.
- Anvend en skål på bundpladen for at indsamle det ekstruderede materiale.
4. Kør injicerbarhedsprotokollen
- Sæt sprøjten i klemmegrebene og luk dem. Grebene skal holde sprøjten på plads, men lade den bevæge sig op og ned uden modstand.
- Sørg for, at sprøjten og stemplet er vinkelret på krydshovedet. Dette sikrer, at kun enksaksial kompression af materialet vil blive målt.
BEMÆRK: Der skal anvendes en tom sprøjte til at kontrollere trin 4.1 og 4.2. - Sænk toppladen til en position lige over stemplet ved hjælp af knapperne til manuel bevægelse.
BEMÆRK: Det kan være muligt at vælge en 'Startposition' i den mekaniske testerprotokol, således at den oprindelige position over stemplet nås automatisk og er ensartet under hele prøvningen. - Nul den målte kraft ved at klikke på 'Nul kraft'.
- Kør testprotokollen ved at trykke på 'Kør'.
FORSIGTIG: Eksperimentatoren skal altid være til stede for at observere hvert forsøg og være klar til at aktivere nødstoppet i tilfælde af et uheld. - Løft pladerne til en tilstrækkelig højde ved hjælp af knapperne til manuel bevægelse, så sprøjten kan fjernes.
- Gentag trin 4 for hver prøve.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan sprøjten og den ekstruderede prøve kasseres, hvis der ikke kræves yderligere analyser, men kan opbevares for at undersøge filterpresning, selvhelende, virkningerne på celler osv.
5. Dataindsamling
- Gem dataene fra hvert forsøg i et format, hvorfra der kan genereres en tabel over kraft- og forskydningsværdier (.txt, .xls, .xlsx).
- Afbild resultaterne fra hvert forsøg med forskydning på x-aksen og kraft på y-aksen.
- Læs den maksimale kraft (hvis den findes) og plateaukraft fra graferne.
Representative Results
Opsætningen af det mekaniske tester- og fastspændingssystem er vist i figur 1A. Denne protokol genererer en tabel og en graf over kraft versus forskydning for hver testet prøve. En typisk kraftforskydningskurve består af tre sektioner (Figur 1B):en indledende gradient, da stemplet overvinder friktion fra tønden, og materialet accelereres, en kraft maksimum, og et plateau, som materialet er ekstruderet i en stabil tilstand.
Der findes dog kun et særskilt maksimum, hvis plateaukraften er lavere end den kraft, der kræves for at accelerere stemplet. Som sådan ses toppe kun for inviscidprøver, der passerer gennem brede nåle. For tyktflydende prøver, der passerer gennem en mere smal åbning, er den kraft, der er nødvendig for at injicere prøven ved konstant hastighed, større end den kraft, der kræves for at overvinde friktionen i tønden og accelerere materialet, og der ses ingen særskilt top (Figur 1C). For meget viskøse prøver eller meget smalle nåle kan den kraft, der kræves for at ekstrudere materialet, være så stor, at sprøjten spænder og mislykkes, ofte med meget lidt ekstrudering af materialet (Figur 1D). Hvis det indsprøjtede materiale indeholder partikler eller undergår indstilling, såsom cement, filterpresning (præferenceudvisning af væskefasen) eller masseindstilling, hvilket kan føre til ufuldstændig injektion (figur 1E).
Figur 1: Eksempelkurver, der genereres af denne protokol. (A) Opsætning af den mekaniske tester for denne protokol. (B) Typisk kraft-ekstrudering kurve. c) Kraft-ekstruderingskurve uden tydelig maksimal top. d)Kraft-ekstruderingskurve for sprøjtefejl. (E) Kraft-ekstrudering kurve for en indstilling cement. Dette tal er tilpasset fra Robinson et al.8. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Mekanisk test er måske den enkleste og mest pålidelige måde at kvantificere injicerbarhed. En vigtig fordel ved denne protokol er, at der ikke kræves særligt udstyr, bortset fra den mekaniske tester, som er almindelig i materialelaboratorier. Denne protokol er meget alsidig; ethvert materiale, kanylemåler og sprøjtestørrelse kan anvendes, forudsat at sprøjten kan rummes af klemmerne. Dette er blevet verificeret i denne protokol for sprøjter op til 10 ml. Desuden kan materialet forberedes præcis som det ville for den virkelige verden ansøgning25. Endelig er denne procedure meget hurtig og tager kun op til et par minutter pr. prøve, så snesevis af prøver kan behandles i timen.
For prøver, der giver typiske kurver, kan to værdier udvindes: den maksimale kraft og plateauet kraft kurver. Den maksimale kraft er velsagtens mere objektiv og kan udvindes beregningsmæssigt fra datatabellen for hver prøve. Omvendt kan plateaukraften være mere repræsentativ, da dette vil være den kraft, der opleves i den største mængde tid, og som gennemsnit er mindre påvirket af kurver med store udsving. Disse udsving kan være forårsaget af luftbobler eller partikler i materialet, der forårsager intermitterende ændringer, da de ekstruderes, eller ved lav instrumentpræcision til små kraftmålinger. Men det er bemærkelsesværdigt, at der for mange prøver ikke er nogen maksimal krafttoppe, og så er den maksimale værdi og plateauværdien den samme. Objektive sammenligninger mellem injektionskræfter kan foretages, så længe der anvendes en ensartet værdi.
De opnåede data kan anvendes på flere måder. Værdierne for injicerbarhedskraften kan sammenlignes med injektionssygtighed for at fastslå, hvilke formuleringer, sprøjte- og nålestørrelser der er levedygtige til oversættelse8. Alternativt giver en sammenligning mellem prøverne mulighed for kvantificering af ændringer i formuleringer om injicerbarhed. For eksempel, i cement, ændre viskositeten af den flydende fase, partikelstørrelse distribution, og tilføje tilsætningsstoffer såsom citrat til at ændre kolloid egenskaber, kan have store ændringer i injicerbarhed9. Disse test kan også informere formulering protokol for cement, for eksempel blanding tid, tid til lastning og tid til anvendelse, for optimal injektion og post-injektion ydeevne. Desuden kan denne metode anvendes til at teste den oprindelige gennemførlighed af nye bioinks til 3D-printning.
Denne protokol kan ændres på flere måder. Klemmesystemet kan udskiftes med en skræddersyet 3D-printet konstruktion til at holde sprøjten, hvilket kan gøre det lettere at sikre, at sprøjten og stemplet er vinkelret på krydshovedet, og sprøjten holdes sikkert. Nålen kan udskiftes med en kanyle eller enhver anordning, der ekstruderer materiale ved kompression af et stempel og kan være af enhver størrelse og geometri. For at øge nøjagtigheden af resultaterne, spidsen af nålen kan placeres i et væv eller hydrogel, for mere præcist at simulere klinisk injektion. Dette tilføjer dog yderligere kompleksitet til protokollen, da væv/ gel sammensætning og nål dybde skal holdes konstant. Endvidere anvender denne protokol forskydningsstyret ekstrudering til at måle den kraft, der kræves for at injicere ved den angivne hastighed. Alternativt kan indsprøjtningskraften specificeres, og mængden af ekstrudering kan måles i forhold til tiden. Dette kan være nyttigt for materialer med tidsafhængige egenskaber, f.eks. For eksempel, ved hjælp af en sammenhæng mellem injektion kraft og nem injicerbarhed for at vælge en kraft8, denne protokol kan bruges til at fastslå, om hele mængden af cement kan injiceres med denne hastighed før indstilling. Endelig kan denne protokol nemt kombineres med andre eksperimenter, for at teste effekten af injektion på materialets egenskaber og undersøge fænomener såsom filterpresning og selvheling, eller effekten af injektion på celler.
Den vigtigste begrænsning af denne protokol er, at en universel mekanisk tester er påkrævet. Mens disse er almindelige i materialer test labs, de er dyre at købe, hvis brugeren ikke kan få adgang til en. Endvidere giver den mekaniske tester enksaksial kompression med enten en indstillet kraft eller forskydningshastighed, mens den anvendte kraft og injektionshastighed kan variere i løbet af injektionen i hånden. Denne protokol er også uegnet til at replikere nogle virkelige verden injektioner, såsom injektioner i komplekse væv i teater, eller indsprøjtning i forskellige vinkler. At kvantificere kraften i injektion i klinikken, kraft og forskydning transducere kan være en bedre metode.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af EPSRC CDT for Formulation Engineering i School of Chemical Engineering ved University of Birmingham, UK, Grant reference EP/L015153/1 og Royal Centre for Defence Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginic Acid Sodium Salt | Sigma | A2033-100G | |
| Blunt Needles | Needlez | NB19G1.5 | Any size may be used, depending on application |
| Calcium Sulphate Hemihydrate | Acros Organics | 22441.296 | |
| Clamp stand | Eisco | MTST5 | Two required |
| Clamps | R&L Enterprises | 41 | Two required, should have flat tops |
| Syringes | BD | 307731 | Any size can be used, depending on application |
| Universal Mechanical Tester | Zwick Roell | Z030 |
References
- Webber, M. J., Appel, E. A., Meijer, E. W., Langer, R.
- Mathew, A. P., Uthaman, S., Cho, K. -H., Cho, C. -S., Park, I. -K. Injectable hydrogels for delivering biotherapeutic molecules. International Journal of Biological Macromolecules. 110, 17-29 (2018).
- Zhou, H., et al. Injectable biomaterials for translational medicine. Materials Today. 28, 81-97 (2019).
- Alves, H. L. R., dos Santos, L. A., Bergmann, C. P. Injectability evaluation of tricalcium phosphate bone cement. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, 2241-2246 (2008).
- Yu, L., Ding, J. Injectable hydrogels as unique biomedical materials. Chemical Society Reviews. 37, 1473 (2008).
- Pawelec, K. M., Planell, J. A. Bone Repair Biomaterials: Regeneration and Clinical Applications. , Elseiver, Woodhead Publishing. (2019).
- Fernandez de Grado, G., et al. Bone substitutes: a review of their characteristics, clinical use, and perspectives for large bone defects management. Journal of Tissue Engineering. 9, 204173141877681 (2018).
- Robinson, T. E., et al. Filling the Gap: A Correlation between Objective and Subjective Measures of Injectability. Advanced Healthcare Materials. , 1901521 (2020).
- O'Neill, R., et al. Critical review: Injectability of calcium phosphate pastes and cements. Acta Biomaterialia. 50, 1-19 (2017).
- Gantar, A., et al. Injectable and self-healing dynamic hydrogel containing bioactive glass nanoparticles as a potential biomaterial for bone regeneration. RSC Advances. 6, 69156-69166 (2016).
- Ramin, M. A., Latxague, L., Sindhu, K. R., Chassande, O., Barthélémy, P. Low molecular weight hydrogels derived from urea based-bolaamphiphiles as new injectable biomaterials. Biomaterials. 145, 72-80 (2017).
- Ren, K., He, C., Xiao, C., Li, G., Chen, X. Injectable glycopolypeptide hydrogels as biomimetic scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 51, 238-249 (2015).
- Burckbuchler, V., et al. Rheological and syringeability properties of highly concentrated human polyclonal immunoglobulin solutions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 76, 351-356 (2010).
- Allmendinger, A., et al. Rheological characterization and injection forces of concentrated protein formulations: An alternative predictive model for non-Newtonian solutions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87, 318-328 (2014).
- Davison, P. F. The Effect of Hydrodynamic Shear on the Deoxyribonucleic Acid from T2 and T4 Bacteriophages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 45, 1560-1568 (1959).
- Chen, M. H., et al. Methods to Assess Shear-Thinning Hydrogels for Application As Injectable Biomaterials. ACS Biomaterials Science and Engineering. 3, 3146-3160 (2017).
- Krebs, J., et al. Clinical measurements of cement injection pressure during vertebroplasty. Spine. 30, (2005).
- Bohner, M., Baroud, G.
- Gbureck, U., Barralet, J. E., Spatz, K., Grover, L. M., Thull, R. Ionic Modification of Calcium Phosphate Cement Viscosity. Part I: Hypodermic Injection and Strength Improvement of Apatite Cement. Biomaterials. 25, 2187-2195 (2004).
- Habib, M., Baroud, G., Galea, L., Bohner, M. Evaluation of the ultrasonication process for injectability of hydraulic calcium phosphate pastes. Acta Biomaterialia. 8, 1164-1168 (2012).
- Martin, B. C., Minner, E. J., Wiseman, S. L., Klank, R. L., Gilbert, R. J. Agarose and methylcellulose hydrogel blends for nerve regeneration applications. Journal of Neural Engineering. 5, 221-231 (2008).
- Borzacchiello, A., Russo, L., Malle, B. M., Schwach-Abdellaoui, K., Ambrosio, L. Hyaluronic Acid Based Hydrogels for Regenerative Medicine Applications. BioMed Research International. 2015, 871218 (2015).
- Zhao, L., Weir, M. D., Xu, H. H. K. An injectable calcium phosphate-alginate hydrogel-umbilical cord mesenchymal stem cell paste for bone tissue engineering. Biomaterials. 31, 6502-6510 (2010).
- Ji, D. -Y., Kuo, T. -F., Wu, H. -D., Yang, J. -C., Lee, S. -Y. A novel injectable chitosan/polyglutamate polyelectrolyte complex hydrogel with hydroxyapatite for soft-tissue augmentation. Carbohydrate Polymers. 89, 1123-1130 (2012).
- Vaishya, R., Chauhan, M., Vaish, A.
