הכימות של הזרקה על ידי בדיקות מכניות

Summary

מוצג כאן פרוטוקול להערכה כמותית של הזרקה של חומר באמצעות מערכת מזרק מחט באמצעות אסדת בדיקה מכנית סטנדרטית.

Abstract

חומרים ביולוגיים להזרקה הופכים פופולריים יותר ויותר עבור משלוח פולשני מינימלי של תרופות ותאים. חומרים אלה הם בדרך כלל צמיגיים יותר מאשר זריקות מים מסורתיים עשויים להיות מוצקים למחצה, לכן, הזרקה שלהם לא ניתן להניח. פרוטוקול זה מתאר שיטה להערכה אובייקטיבית של הזרקה של חומרים אלה באמצעות בודק מכני סטנדרטי. בוכנה המזרק נדחס על ידי ראש מוצלב בקצב קבוע, והכוח נמדד. לאחר מכן ניתן להשתמש בערך המקסימלי או כוח הרמה להשוואה בין דגימות, או למגבלת כוח מוחלטת. פרוטוקול זה יכול לשמש עם כל חומר, וכל מזרק וגודל מחט או גיאומטריה. התוצאות שהתקבלו עשוי לשמש כדי לקבל החלטות על ניסוחים, מזרק וגדלי מחט בשלב מוקדם בתהליך התרגום. יתר על כן, ההשפעות של שינוי ניסוחים על הזרקה ניתן לכמת, ואת הזמן האופטימלי להזריק חומרים משתנים בזמן נקבע. שיטה זו מתאימה גם כדרך לשחזור לבחון את ההשפעות של הזרקה על חומר, ללמוד תופעות כגון ריפוי עצמי ולחיצת מסנן או ללמוד את ההשפעות של הזרקה על תאים. פרוטוקול זה מהיר וישים באופן ישיר יותר להזרקה מאשר לראוולוגיה סיבובית, ודורש עיבוד פוסט מינימלי כדי להשיג ערכי מפתח להשוואות ישירות.

Introduction

חומרים ביולוגיים נחקרים לעתים קרובות משמשים פיגומים עבור התחדשות רקמות מבוססות תאים ומחסנים עבור ממוקד, משלוח ממושך של^{טיפולית 1}. בתוך תחום זה, חומרים ביולוגיים להזרקה גדלים בפופולריות כפי שהם פולשניים מינימלית, אשר מפחית את הסיכון של זיהום, כאב וצלקות הקשורים השתלה². יתר על כן, מכיוון שהם מיושמים בדרך כלל כמו נוזלים, הם מתאימים באופן מושלם פגמים ברקמות, תרופות ותאים עשויים להיות מעורבבים^{בהם מיד לפני היישום 3,4,5}. בתור שכזה, בעוד חומרים ביולוגיים להזרקה עשויים להיות מיוצרים כמזרקים טעונים מראש, הם מוכנים לעתים קרובות על ידי רופאים ישירות לפני היישום. לדוגמה, מלטים מתחילים להגדיר ברגע שהשלבים האבקה והנוזל מעורבבים, ולכן לא ניתן לאחסן אותם לתקופות ארוכות לפני השימוש⁶. האפיון של חומרים אלה תלוי אפוא בזמן וקשור להכנתם.

חומרים ביולוגיים להזרקה נפוצים כוללים צמנטים סידן, פולימתיל methacrylate, bioglasses, הידרוג'לים^{פולימריים שונים 3,7}. שלא כמו זריקות מסורתיות של תרופות, אשר יש את אותן תכונות ראולוגיות כמו מים, אלה חומרים ביולוגיים להזרקה הם בדרך כלל צמיגיים יותר, לא ניוטוני, עשוי להיות כמה אופי אלסטי, ואולי גם להשתנות לאורך זמן. לכן, ההזרקה של חומרים אלה לא ניתן להניח אבל יש להעריך באופן ניסיוני. על ידי כימות הכוח הנדרש להזרקה והתאמתו לקלות ההזרקה, החלטות מוקדמות לגבי אילו ניסוחים ביו-חומריים, מזרק, וגדלי מחט לקחת קדימה עשוי להיכנס בשלב מוקדם בתהליך^{ההתפתחותי 8}. ניסויים כאלה עשויים גם לכמת את ההשפעות של ניסוחים שינוי על הזרקה⁹.

ישנן מספר שיטות כדי להעריך את המאפיינים של חומרים להזרקה. ראולוגיה סיבובית מנוצלת לעתים קרובות כדי להעריך צמיגות, התנהגות לא ניוטונית, שחזור לאחר גיה, הגדרת זמן, ומאפיינים אחרים של חומרים^{אלה 10,11,12}. בעוד סוג זה של בדיקה שימושי כדי לבסס מאפיינים בסיסיים של החומרים, מאפיינים אלה אינם תואמים ישירות להזרקה. עבור נוזל ניוטוני ומזרק גלילי ומחט, כוח ההזרקה ניתן להעריך מצורה של משוואת האגן-Poiseuille¹³:

כאשר F הוא הכוח הנדרש להזרקה (N), R s_הוא רדיוס המזרק הפנימי (m), R_n הוא רדיוס המחט הפנימי (m), L הוא אורך המחט (m), Q הוא קצב זרימת נוזלים (m³ s^-1),η הוא צמיגות דינמית (Pa.s) _ו- F הוא כוח החיכוך בין הבוכנה לקיר חבית (N). לכן, אם צמיגות נמדדת באמצעות rheal, הממדים של המזרק והמחט ידועים ואת קצב הזרימה מוערך, כוח ההזרקה ניתן להעריך. עם זאת, משוואה זו אינה מסבירה את הקצה הצורמני של המזרק או כל גיאומטריה אחרת, כגון שקעים מחוץ למרכז, ו- F_fחייב להיות מוערך או למצוא באופן ניסיוני על ידי בדיקות מכניות. יתר על כן, חומרים ביולוגיים הם בדרך כלל לא ניוטוני, אבל להפגין תכונות ראולוגיות מורכבות. עבור נוזל גיזה פשוט, המשוואה הופכת^{ל- 14}:

כאשר n הוא מדד צריכת החשמל (-) ו- K הוא מדד העקביות (Pa.sⁿ⁾מתוך הביטוי Ostwald de Waele: , איפה קצב המהנה (s^-1). המורכבות גדלה במידה רבה עבור חומרים שמאפייניהם הראולוגיים אינם יכולים להיות מאופיינים בשני ערכים, ובמיוחד עבור חומרים תלויי זמן כגון הגדרת מלטים. בנוסף, אם מאפייני החומר תלויים גיה, אז החומר חייב להיבדק בקצב גיה צפוי במחט, אשר עשוי הרבה מעבר לטווח של rheometer^{סיבובי 15}.

שיטה כמותית נוספת למדידת הזרקה כרוכה בהצמדת חיישני לחץ ועקירה למזרק בעת ביצוע הזרקה, ביד או באמצעות משאבת מזרק. ציוד זה הוא זול יחסית, עם זאת, מחייב את המשתמשים ליצור סקריפטים ועקומות כיול להמיר לנתונים כוח¹⁶. יתר על כן, משאבת מזרק לא יכול להיות בעל מומנט מספיק כדי לדחוס את הבוכנה בקצב מדויק אם כוחות גבוהים נדרשים כדי להבלטת צמיגי או חומרים מוצקים למחצה. לחלופין, ניצול חיישנים אלה בעת הזרקה ביד עשוי להיות שימושי כפי שהם יכולים לשמש בתרחיש קליני אמיתי, במהלך הליכים קליניים¹⁷. עם זאת, זה ייקח הרבה יותר זמן עשוי להציג הטיה של המשתמש, ולכן, צריך מספרים גדולים יותר של חזרות עם משתמשים שונים כדי להשיג תוצאות אמינות. זה עשוי, לכן, להיות מתאים יותר עבור חומרים כי הם בהמשך צינור התרגום, או מוצרים כבר בשימוש קליני.

בפרוטוקול זה, בודק מכני משמש לדחוס את הבוכנה בקצב מוגדר, ולרכך את הכוח הדרוש פעולה זו. סוג זה של בודק מכני נפוץ במעבדות חומרים שימש לכמת הזרקה עבור חומרים^{ביולוגיים שונים 18,19,20,21,22,23,24}. בדיקה זו יכולה לשמש עם כל גודל וגיאומטריה של מזרק ומחט, המכיל כל חומר. יתר על כן, במקרה של חומרים ביולוגיים שנעשו מיד לפני השימוש, ניתן לעקוב אחר הליך ניסוח המדויק שישמש במרפאה או בניתוח לפני הבדיקה. יתרון נוסף של הליך זה הוא שהוא מהיר יחסית; לאחר הבדיקה המכנית מוגדר, עשרות דגימות ניתן ללמוד בשעה, בהתאם למהירות ההבלטה ונפח מזרק. זאת בניגוד לראוולוגיה סיבובית, שבדרך כלל אורכת לפחות 5 -10 דקות לבדיקה, בתוספת טעינה, שיווי משקל וזמן ניקיון. שימוש בבדיקה מכנית מייצר קצב הבלטה אמין באותה מידה על הבוכנה, אשר הוא יתרון במיוחד עבור ניסוחים צמיגיים או אלה עם תכונות תלויות זמן. לאחר הבדיקה, נדרש עיבוד מינימלי לאחר עיבוד של נתונים כדי לשלוף ערכים חשובים להשוואות אובייקטיביות.

Protocol

1. הכנה לדוגמה

1. הכן את הדגימה ולטעון אותו לתוך המזרק.
   1. כדי לדמות מזרק טעון מראש, הכינו את הדגימה מראש, העמיסו אותה למזרק וצרףו את המחט. אחסן כנדרש, עד לבדיקה. זה עשוי להתאים הידרוג'לים וחומרים שלא משתנים עם הזמן.
      הערה: לדוגמה, כדי להכין 2% פתרונות אלגינת, להמיס 2 גרם של מלח נתרן חומצה אלגינית ב 100 מ"ל של מים deionized, על ידי ערבוב בטמפרטורת החדר. שאיפה לפתרון למזרקים של 5 מ"ל, ולאחסן במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר.
   2. לחלופין, כדי לדמות זריקה שנוסחה ישירות לפני היישום, להכין את המדגם באותו אופן זה היה נעשה במרפאה, המאפשר כל זמני הגדרה. טען לתוך המזרק וצרף את המחט. זה עשוי להתאים מלטים, וחומרים שמאפיינים שלהם משתנים עם הזמן.
      הערה: לדוגמה, כדי להכין סידן גופרתי מלט, באופן ידני לערבב 4 גרם של סידן גופרתי המידרט לתוך 5 מ"ל של מים deionized עם מרית במשך 1 דקות. מוציאים את הבוכנה מהמזרק ועמיסו את הבטון לתוך חבית המזרק עם המרית. התחל את הבדיקה המכנית לאחר 4 דקות.
      התראה: מחטים מהוות סיכון בטיחותי, להשתמש במחטים קהות במידת האפשר. אם החומר מכיל תאים או חומרים ביולוגיים אחרים, יש לנקוט טיפול נוסף כדי למנוע פציעות חדות.

2. הגדר את הבדיקה המכנית

1. חבר לוחות שטוחים (לבדיקת דחיסה) לבוחן המכני.
2. צייד ידנית את הבדיקה המכנית בתא טעינה עם עומס מרבי של 200 N.
   הערה: ניתן להשתמש בתא טעינה גדול יותר, בתנאי שיש לו דיוק מספיק בטווח של 1– 200 N. דגימות צמיגיות יותר ולא מיועדות להזריק ביד עשויות לדרוש תא עומס גדול יותר.
3. הפרד את הלוחות, באמצעות לחצני הבקרה הידנית, כדי לאפשר מספיק מקום למחט, מזרק בוכנה (סביב 30 ס"מ יספיק).
4. צור פרוטוקול בדיקה.
   1. פתח את אשף הבדיקה והגדר את סוג הבדיקה לדחיסה חד-קסיאלית.
   2. הגדר את הטעינה מראש. זהו ערך הכוח הנמדד שבו יחלו הבדיקות. 0.5 N זה מספיק.
   3. הגדר את המהירות לטעינה מראש ל- 5 מ"מ/דקה. זו המהירות שבה ראש-הצלב יזוז למטה עד שהוא ייתקל בטעינה מראש.
   4. הגדר את הטעינה לפקד עקירה ובחר מהירות בדיקה מתאימה. 1 מ"מ / ת', מהירות מתאימה למזרק סטנדרטי של 5 מ"ל.
   5. הגדר מגבלת כוח עליון שבה כדי לעצור את הבדיקה, למשל, 200 N. זה בעיקר מטעמי בטיחות. ניתן גם לעצור את הבדיקה באופן אוטומטי בהעקירה נתונה, למשל, אורך המזרק.

3. הגדר את מערכת ההידוק

1. חבר שני סטים של מהדקים לשני מעמדים, עם אחיזה גדולה מספיק כדי להדק את המזרק הנבחר בבטחה.
2. מקם את האחיזה בין הראש הצולב לפלח הבסיס, עם מספיק מקום מתחת לאחיזה עבור המזרק והמחט.
3. מסדרים את מרכזי שתי האחיזה, ותסתפו את אלה בשורה עם מרכז הראש הצולב.
   הערה: יישור האחיזה המלחציים זה עם זה ומרכז הראש עשוי להימשך זמן ואיטרציה כדי להשיג, אך חשוב להשיג נתונים באיכות גבוהה.
4. ודא שהמלחציים מאובטחים היטב כך שאין תנועה במלחציים כאשר כוח כלפי מטה מוחל.
5. מניחים צלחת על הצלחת התחתונה כדי לאסוף את החומר הבלטה.

4. הפעל את פרוטוקול ההזרקה

1. הכנס את המזרק לידי המלחציים וסגור אותן. האחיזה צריכה להחזיק את המזרק במקום, אבל לאפשר לו לנוע למעלה ולרדת ללא התנגדות.
2. ודא שהמזרק והבוכנה ניצבים על הראש הצולב. פעולה זו מבטיחה כי רק דחיסה חד-קסיאלית של החומר תימדד.
   הערה: יש להשתמש במזרק ריק כדי לבדוק את שלבים 4.1 ו- 4.2.
3. מנמיכים את הלוח העליון למיקום ממש מעל הבוכנה, באמצעות לחצני התנועה הידנית.
   הערה: ייתכן שיהיה אפשרות לבחור 'מיקום התחלה' בפרוטוקול בודק מכני, כך המיקום המקורי מעל הבוכנה הוא הגיע באופן אוטומטי והוא עקבי לאורך כל הבדיקה.
4. אפס את הכוח הנמדד על-ידי לחיצה על 'אפס כוח'.
5. הפעל את פרוטוקול הבדיקה על-ידי לחיצה על 'הפעל'.
   התראה: הנסוי צריך תמיד להיות נוכח כדי לצפות בכל ניסוי, ומוכן להפעיל את עצירת החירום במקרה של תקלה.
6. הרם את הלוחות לגובה מספיק, באמצעות לחצני התנועה הידנית, כך שניתן יהיה להסיר את המזרק.
7. חזור על שלב 4 עבור כל דוגמה.
   הערה: בשלב זה, ניתן למחוק את המזרק ואת הדגימה הבולטת אם לא נדרש ניתוח נוסף, אך ניתן לשמור על מנת לבחון לחיצה על מסנן, ריפוי עצמי, ההשפעות על תאים וכו'.

5. איסוף נתונים

1. שמור את הנתונים מכל ניסיון בתבנית שמכפה ניתן ליצור טבלה של ערכי כוח והחלמה (.txt, .xls, .xlsx).
2. התווה את התוצאות מכל ניסוי, עם עקירה על ציר ה-x ולחץ על ציר y.
3. קרא את הכוח המרבי (אם הוא קיים) ואת כוח הרמה מהמגרפים.

Representative Results

הגדרת בודק מכני ומערכת הידוק מוצג איור 1A. פרוטוקול זה יוצר טבלה וגרף של כוח לעומת עקירה עבור כל מדגם שנבדק. עקומת עקירת כוח טיפוסית מורכבת משלושהחלקים (איור 1B):מעבר צבע ראשוני, כאשר הבוכנה מתגברת על חיכוך מהחבית והמיות מואץ, כוח מרבי ומישור, כאשר החומר מובלט במצב יציב.

עם זאת, מקסימום ברור קיים רק כאשר כוח הרמה נמוך יותר מהכוח הנדרש כדי להאיץ את הבוכנה. בתור שכזה, פסגות נראים רק עבור דגימות בלתי נראות עובר דרך מחטים רחבות. עבור דגימות צמיגיות העוברות דרך פתח צר יותר, הכוח הדרוש להזריק את הדגימה במהירות קבועה גדול יותר מהכוח הנדרש כדי להתגבר על חיכוך בחבית ולהאיץ את החומר, ולא נראה שיאברור (איור 1C). עבור דגימות צמיגיות מאוד או מחטים צרות מאוד, הכוח הנדרש כדי להבליט את החומר עשוי להיות כל כך גדול כי אבזמים מזרק ונכשל, לעתים קרובות עם מעט מאוד הבלטה של החומר(איור 1D). אם החומר המוזרק מכיל חלקיקים או עובר הגדרה, כגון מלט, לחיצה על מסנן (גירוש מועדף של שלב נוזלי) או הגדרה בצובר עלולה להתרחש, מה שמוביל להזרקה לא שלמה(איור 1E).

איור 1: עקומות לדוגמה שנוצרו על-ידי פרוטוקול זה. (א)הגדרה של בודק המכני עבור פרוטוקול זה. עקומתהבלטת כוח טיפוסית. (ג)עקומת הבלטת כוח ללא שיא מרבי ברור. עקומתהבלטת כוח לכשל במזרק. (ה)עקומת הבלטת כוח עבור מלט הגדרה. נתון זה מותאם לרובינסון^{ואח' 8.} לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

בדיקות מכניות היא אולי הדרך הפשוטה והאמינה ביותר לכמת את ההזרקה. יתרון מרכזי של פרוטוקול זה הוא כי אין צורך בציוד מיוחד, מלבד בודק מכני, אשר נפוץ במעבדות חומרים. פרוטוקול זה הוא רב-תכליתי ביותר; כל חומר, מד מחט וגודל מזרק ניתן להשתמש, בתנאי המזרק יכול להיות אכלס על ידי המלחציים. כך אומת בפרוטוקול זה עבור מזרקים עד 10 מ"ל. יתר על כן, החומר יכול להיות מוכן בדיוק כפי שהוא היה עבור היישום בעולם האמיתי²⁵. לבסוף, הליך זה הוא מהיר מאוד, לוקח רק עד כמה דקות לכל מדגם, המאפשר עשרות דגימות להיות מעובד לשעה.

עבור דגימות הנותנות עקומות אופייניות, ניתן לחלץ שני ערכים: הכוח המרבי ועקומות כוח הרמה. הכוח המרבי הוא לכאורה אובייקטיבי יותר ותוכל להוציא אותו באופן חישובי מטבלת הנתונים עבור כל מדגם. לעומת זאת, כוח הרמה עשוי להיות נציג יותר, כמו זה יהיה הכוח שחווה במשך הזמן הגדול ביותר, כממוצע, מושפע פחות עקומות עם תנודות גדולות. תנודות אלה עלולות להיגרם על ידי בועות אוויר או חלקיקים בחומר הגורמים לשינויים לסירוגין כפי שהם הובלטו, או על ידי דיוק מכשיר נמוך למדידות כוח קטן. עם זאת, ראוי לציין כי, עבור דגימות רבות, אין שיא כוח מרבי, ולכן הערך המרבי והרמות זהים. השוואות אובייקטיביות בין כוחות הזרקה יכולות להיעשות כל עוד נעשה שימוש בערך עקבי.

ניתן להשתמש בנתונים שהושגו במספר דרכים. ניתן להשוות את ערכי כוח ההזרקה להקלת ההזרקה, כדי לקבוע אילו ניסוחים, מזרק וגדלי מחט הם קיימא עבור^{תרגום 8}. לחלופין, השוואה בין דגימות מאפשרת כימות של שינויים ניסוחים על הזרקה. לדוגמה, במלטים, שינוי צמיגות של שלב נוזלי, התפלגות גודל החלקיקים, והוספת תוספים כגון ציטראט כדי לשנות את המאפיינים colloidal, יכול להיות שינויים גדולים הזרקה⁹. בדיקות אלה עשויות גם ליידע פרוטוקול ניסוח עבור מלטים, למשל ערבוב זמן, זמן לטעינה וזמן ליישום, עבור הזרקה אופטימלית וביצועים לאחר ההזרקה. בנוסף, שיטה זו עשויה לשמש כדי לבדוק את הכדאיות הראשונית של bioinks רומן להדפסה בתלת-ממד.

ניתן לשנות פרוטוקול זה במספר דרכים. ניתן להחליף את מערכת המלחציים במבנה מודפס בתלת-ממד מותאם אישית כדי להכיל את המזרק, מה שעשוי להקל על מנת להבטיח שהמזרק והבוכנה ניצבים אל ראש החץ, והמזרק מוחזק היטב. המחט יכולה להיות מוחלפת עם נוולה או כל מכשיר המפרש חומר על ידי דחיסה של בוכנה והוא יכול להיות בכל גודל וגיאומטריה. על מנת להגדיל את נאמנות התוצאות, קצה המחט ניתן להציב לתוך רקמה או הידרוג'ל, על מנת לדמות בצורה מדויקת יותר הזרקה קלינית. עם זאת, זה מוסיף מורכבות נוספת לפרוטוקול, כמו הרכב רקמות / ג'ל ועומק מחט חייב להיות קבוע. יתר על כן, פרוטוקול זה מנצל הבלטה מבוקרת עקירה, כדי למדוד את הכוח הדרוש להזרקה במהירות שצוינה. לחלופין, ניתן לציין את כוח ההזרקה, ואת כמות ההבלטה ניתן למדוד נגד הזמן. פעולה זו עשויה להיות שימושית עבור חומרים עם מאפיינים תלויי זמן, כגון מלטים. לדוגמה, באמצעות מתאם בין כוח הזרקה וקלות הזרקה כדי לבחור^{כוח 8}, פרוטוקול זה עשוי לשמש כדי לקבוע אם ניתן להזריק את כל נפח המלט במהירות זו לפני ההגדרה. לבסוף, פרוטוקול זה יכול בקלות להיות משולב עם ניסויים אחרים, על מנת לבדוק את ההשפעה של הזרקה על תכונות החומר ולבחון תופעות כגון לחיצה על מסנן וריפוי עצמי, או את ההשפעה של הזרקה על תאים.

המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא שדרוש בודק מכני אוניברסלי. בעוד אלה נפוצים במעבדות בדיקת חומרים, הם יקרים לרכישה אם המשתמש אינו יכול לגשת אחד. יתר על כן, הבדיקה המכנית מספקת דחיסה חד-קסיאלית בכוח קבוע או בקצב עקירה, בעוד שהכוח המיושם ומהירות ההזרקה עשויים להשתנות במהלך ההזרקה ביד. פרוטוקול זה אינו מתאים גם לשכפול כמה זריקות בעולם האמיתי, כגון זריקות לתוך רקמות מורכבות בתיאטרון, או הזרקה בזוויות שונות. כדי לכמת את כוח הזריקה במרפאה, כוח ומתמרים עקירה עשויה להיות שיטה טובה יותר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alginic Acid Sodium Salt	Sigma	A2033-100G
Blunt Needles	Needlez	NB19G1.5	Any size may be used, depending on application
Calcium Sulphate Hemihydrate	Acros Organics	22441.296
Clamp stand	Eisco	MTST5	Two required
Clamps	R&L Enterprises	41	Two required, should have flat tops
Syringes	BD	307731	Any size can be used, depending on application
Universal Mechanical Tester	Zwick Roell	Z030