Summary
Presentert her er en protokoll for kvantitativ evaluering av injiserbarheten av et materiale gjennom en sprøyte-nål system ved hjelp av en standard mekanisk testrigg.
Abstract
Injiserbare biomaterialer blir stadig mer populært for minimal invasiv levering av narkotika og celler. Disse materialene er vanligvis mer viskøs enn tradisjonelle vandige injeksjoner og kan være semi-solid, derfor, deres injiserbarhet kan ikke antas. Denne protokollen beskriver en metode for objektivt å vurdere injiserbarheten av disse materialene ved hjelp av en standard mekanisk tester. Sprøytestempelet komprimeres av tverrsnøyet med en innstilt hastighet, og kraften måles. Maksimal eller platåkraftverdi kan deretter brukes til sammenligning mellom prøver, eller til en absolutt kraftgrense. Denne protokollen kan brukes med ethvert materiale, og enhver sprøyte og nål størrelse eller geometri. Resultatene som oppnås kan brukes til å ta beslutninger om formuleringer, sprøyte og nålstørrelser tidlig i den translasjonelle prosessen. Videre kan effekten av å endre formuleringer på injiserbarhet kvantifiseres, og den optimale tiden for å injisere tidsmessig skiftende materialer bestemt. Denne metoden er også egnet som en reproduserbar måte å undersøke effekten av injeksjon på et materiale, å studere fenomener som selvhelbredende og filtrere trykke eller studere effekten av injeksjon på celler. Denne protokollen er raskere og mer direkte anvendelig for injiserbarhet enn rotasjonsreologi, og krever minimal etterbehandling for å oppnå nøkkelverdier for direkte sammenligninger.
Introduction
Biomaterialer studeres ofte og brukes som stillas for cellebasert vevregenerering og depoter for målrettet, vedvarende levering av terapeutiske1. Innenfor dette feltet, injiserbare biomaterialer vokser i popularitet som de er minimalt invasiv, noe som reduserer risikoen for infeksjon, smerte og arrdannelse forbundet med implantasjon2. Videre, fordi de vanligvis brukes som væsker, passer de perfekt til vevsfeil, og legemidler og celler kan blandes inn i dem umiddelbart før søknaden3,4,5. Som sådan, mens injiserbare biomaterialer kan produseres som forhåndslastede sprøyter, de er ofte utarbeidet av klinikere direkte før påføring. Sementer begynner for eksempel å stille når pulver- og væskefasene er blandet, og kan derfor ikke lagres i lange perioder før bruk6. Karakteriseringen av disse materialene er dermed tidsavhengig og uløselig knyttet til deres forberedelse.
Vanlige injiserbare biomaterialer inkluderer kalsiumsementer, polymetylmetakkrylat, biobriller og ulike polymere hydrogeler3,7. I motsetning til tradisjonelle injeksjoner av narkotika, som har de samme revologiske egenskapene som vann, disse injiserbare biomaterialer er vanligvis mer viskøse, ikke-newtonske, kan ha noen elastisk karakter, og kan også endre seg over tid. Injiserbarheten av disse materialene kan derfor ikke antas, men må vurderes eksperimentelt. Ved å kvantifisere kraften som kreves for injeksjon og korrelere den til enkel injeksjon, kan tidlige beslutninger om hvilke biomateriale formuleringer, sprøyte og nålestørrelser som skal tas fremover, gjøres tidlig iutviklingsprosessen 8. Slike eksperimenter kan også kvantifisere effekten av å endre formuleringer på injiserbarhet9.
Det finnes flere metoder for å vurdere egenskapene til injiserbare materialer. Rotasjonsreologi brukes ofte til å vurdere viskositet, ikke-newtonsk oppførsel, post-skjær utvinning, innstillingstid, og andre egenskaper av disse materialene10,11,12. Selv om denne typen test er nyttig for å etablere grunnleggende egenskaper av materialene, korrelerer disse egenskapene ikke direkte til injiserbarhet. For en newtonsk væske og sylindrisk sprøyte og nål kan injeksjonskraften estimeres ut fra en form for Hagen–Poiseuille-ligningen13:
Der F er kraften som kreves for injeksjon (N), Rs er den interne sprøyteradiusen (m), Rn er den indre nålradiusen (m), L er nålelengden (m), Q er væskestrømningshastighet (m3 s-1),η er den dynamiske viskositeten (Pa.s) og Ff er friksjonskraften mellom stempelet og fatveggen (N). Dermed, hvis viskositeten måles via rotasjonsreologi, er dimensjonene på sprøyten og nålen kjent og strømningshastigheten estimert, kan injeksjonskraften estimeres. Denne ligningen tar imidlertid ikke høyde for den koniske enden av sprøyten eller andre geometrier, for eksempel off-center utsalgssteder, og Ffmå estimeres eller finnes eksperimentelt ved mekanisk testing. Videre er biomaterialer vanligvis ikke newtonske, men viser komplekse revologiske egenskaper. For en enkel skjærtynningsvæske blir ligningen14:
Hvor n er strømindeksen (-) og K er konsistensindeksen (Pa.sn) fra Ostwald de Waele-uttrykket: , hvor 
er 
skjærhastigheten (s-1). Kompleksiteten øker i stor grad for materialer hvis revologiske egenskaper ikke kan karakteriseres av to verdier, og spesielt for tidsavhengige materialer som å sette sementer. I tillegg, hvis materialegenskapene er skjæravhengige, må materialet testes med skjærhastigheten som forventes i nålen, noe som langt kan overstige rekkevidden til et rotasjonsreometer15.
En annen kvantitativ metode for måling av injiserbarhet innebærer å feste trykk- og forskyvningssensorer til en sprøyte mens du utfører en injeksjon, enten for hånd eller ved hjelp av en sprøytepumpe. Dette utstyret er relativt billig, men krever brukere å generere skript og kalibrering kurver for å konvertere til kraft data16. Videre kan det hende at en sprøytepumpe ikke har tilstrekkelig moment til å komprimere stempelet nøyaktig hvis høye krefter er nødvendig for å ekstrudere viskøs eller halvfaste materialer. Alternativt kan bruk av disse sensorene ved injeksjon for hånd være nyttig da de kan brukes i et reelt klinisk scenario, under kliniske prosedyrer17. Dette vil imidlertid ta mye lengre tid og kan introdusere brukerbias, og vil derfor trenge større antall repetisjoner med forskjellige brukere for å oppnå pålitelige resultater. Dette kan dermed være mer hensiktsmessig for materialer som er lenger ned i den translasjonelle rørledningen, eller produkter som allerede er i klinisk bruk.
I denne protokollen brukes en mekanisk tester til å komprimere stempelet med en innstilt hastighet, og måle kraften som kreves for å gjøre det. Denne typen mekanisk tester er vanlig i materiallaboratorier og har blitt brukt til å kvantifisere injiserbarhet for ulikebiomaterialer 18,19,20,21,22,23,24. Denne testen kan brukes med alle størrelser og geometri av sprøyte og nål, som inneholder materiale. Videre, i tilfelle av biomaterialer som gjøres umiddelbart før bruk, kan den nøyaktige formuleringsprosedyren som vil bli brukt i klinikken eller operasjonen følges før testing. En ytterligere fordel med denne prosedyren er at den er relativt rask; når den mekaniske testeren er satt opp, kan titalls prøver studeres om en time, avhengig av ekstruderingshastighet og sprøytevolum. Dette er i motsetning til rotasjonsreologi, som vanligvis tar minst 5 - 10 minutter per test, pluss lasting, likevekt og rengjøringstid. Ved hjelp av en mekanisk tester produserer en pålitelig ekstruderingshastighet likt over stempelet, noe som er spesielt fordelaktig for viskøse formuleringer eller de med tidsavhengige egenskaper. Etter testing er minimal etterbehandling av data nødvendig for å trekke ut viktige verdier for objektive sammenligninger.
Protocol
1. Prøve forberedelse
- Forbered prøven og legg den inn i sprøyten.
- For å simulere en forhåndslastet sprøyte, klargjør prøven på forhånd, legg den inn i sprøyten og fest nålen. Oppbevares etter behov til testing. Dette kan være egnet for hydrogeler og materialer som ikke endres med tiden.
MERK: For eksempel, for å forberede 2% alginerte løsninger, oppløs 2 g alginsyrenatriumsalt i 100 ml avionisert vann, ved å røre ved romtemperatur. Aspirer oppløsningen i 5 ml sprøyter, og oppbevar i 24 timer ved romtemperatur. - Alternativt, for å simulere en injeksjon formulert direkte før søknaden, forberede prøven på samme måte som det ville bli gjort i klinikken, slik at for noen innstillingstider. Legg den inn i sprøyten og fest kanylen. Dette kan være egnet for sementer, og materialer hvis egenskaper endres med tiden.
MERK: For eksempel, for å forberede kalsiumsulfatsement, bland manuelt 4 g kalsiumsulfat hemihydrat i 5 ml deionisert vann med en slikkepott i 1 min. Fjern stempelet fra sprøyten og last sementen inn i sprøytesylinderen med slikkepotten. Begynn den mekaniske testingen etter 4 min.
FORSIKTIG: Nåler utgjør en sikkerhetsrisiko, bruk sløve nåler hvis mulig. Hvis materialet inneholder celler eller andre biologiske materialer, bør det tas ekstra forsiktighet for å forhindre skarpe skader.
- For å simulere en forhåndslastet sprøyte, klargjør prøven på forhånd, legg den inn i sprøyten og fest nålen. Oppbevares etter behov til testing. Dette kan være egnet for hydrogeler og materialer som ikke endres med tiden.
2. Sett opp den mekaniske testeren
- Fest flate plater (for kompresjonstesting) til den mekaniske testeren.
- Utstyr den mekaniske testeren manuelt med en lastcelle med en maksimal belastning på 200 N.
MERK: En større lastcelle kan brukes, forutsatt at den har tilstrekkelig presisjon i 1 - 200 N-området. Prøver som er mer viskøs og ikke ment å bli injisert for hånd kan kreve en større lastcelle. - Skill platene, ved hjelp av de manuelle kontrollknappene, for å gi tilstrekkelig plass til nålen, sprøyten og stempelet (ca. 30 cm vil være tilstrekkelig).
- Opprett en testprotokoll.
- Åpne testveiviseren, og sett testtypen til enaksial komprimering.
- Angi forhåndsinnlasting. Dette er den målte kraftverdien som testingen vil begynne på. 0,5 N er tilstrekkelig.
- Still inn hastigheten til forhåndsbelastning til 5 mm/min. Dette er hastigheten crosshead vil bevege seg ned til den støter på forhåndsbelastningen.
- Sett lasting til forskyvningskontroll og velg en passende testhastighet. 1 mm/s er en passende hastighet for en standard 5 ml sprøyte.
- Angi en øvre styrkegrense for å stoppe testen, f.eks. Dette er først og fremst av sikkerhetsmessige årsaker. Testen kan også stoppes automatisk ved en gitt forskyvning, f.eks.
3. Sett opp klemsystemet
- Fest to sett med klemmer til to stativer, med grep som er store nok til å sikre den valgte sprøyten.
- Plasser håndtakene mellom tverrspissen og bunnplaten, med nok plass under håndtakene til sprøyten og nålen.
- Linje opp sentrene av de to grepene, og linje disse opp med midten av tverrsned.
MERK: Justering av klemmegrepene med hverandre og midten av tverrhodet kan ta litt tid og iterasjon å oppnå, men er viktig å skaffe data av høy kvalitet. - Pass på at klemmene er godt festet slik at det ikke er bevegelse i klemmene når en nedadgående kraft påføres.
- Legg en tallerken på bunnplaten for å samle det ekstruderte materialet.
4. Kjør injiserbarhetsprotokollen
- Sett sprøyten inn i klemmehåndtakene og lukk dem. Håndtakene skal holde sprøyten på plass, men la den bevege seg opp og ned uten motstand.
- Sørg for at sprøyten og stempelet er vinkelrett på tverrhodet. Dette sikrer at bare enaksial kompresjon av materialet vil bli målt.
MERK: En tom sprøyte skal brukes til å kontrollere trinn 4.1 og 4.2. - Senk topplaten til en posisjon like over stempelet ved hjelp av de manuelle bevegelsesknappene.
MERK: Det kan være mulig å velge en 'Startposisjon'i den mekaniske testerprotokollen, slik at den opprinnelige posisjonen over stempelet nås automatisk og er konsistent gjennom testing. - Null den målte kraften ved å klikke 'Zero Force'.
- Kjør testprotokollen ved å trykke 'Kjør'.
FORSIKTIG: Eksperimentereren skal alltid være til stede for å observere hver studie, og klar til å aktivere nødstoppet i tilfelle uhell. - Hev platene til en tilstrekkelig høyde ved hjelp av de manuelle bevegelsesknappene, slik at sprøyten kan fjernes.
- Gjenta trinn 4 for hver prøve.
MERK: På dette tidspunktet kan sprøyten og ekstrudert prøve kastes hvis det ikke er nødvendig med ytterligere analyse, men kan holdes for å undersøke filterpressing, selvhelbredende, effekten på celler osv.
5. Datainnsamling
- Lagre dataene fra hver prøveversjon i et format der en tabell med kraft- og forskyvningsverdier kan genereres (.txt, .xls, .xlsx).
- Plott resultatene fra hver studie, med forskyvning på x-aksen og kraft på y-aksen.
- Les maksimal kraft (hvis den finnes) og platåkraft fra grafene.
Representative Results
Oppsettet av den mekaniske testeren og klemsystemet er vist i figur 1A. Denne protokollen genererer en tabell og graf av kraft versus forskyvning for hver testede prøve. En typisk kraftforskyvningskurve består av tre seksjoner (figur 1B): en innledende gradient, da stempelet overvinner friksjon fra fatet og materialet akselereres, en kraft maksimum og et platå, da materialet ekstruderes i jevn tilstand.
Imidlertid finnes det bare et tydelig maksimum der platåkraften er lavere enn kraften som kreves for å akselerere stempelet. Som sådan er topper bare sett for usynlige prøver som passerer gjennom brede nåler. For viskøse prøver som passerer gjennom en smalere åpning, er kraften som trengs for å injisere prøven ved konstant hastighet større enn kraften som kreves for å overvinne friksjon i fatet og akselerere materialet, og ingen distinkt topp er sett (figur 1C). For svært viskøse prøver eller svært smale nåler, kan kraften som kreves for å ekstrudere materialet være så stor at sprøyten spenner og mislykkes, ofte med svært lite ekstrudering av materialet (figur 1D). Hvis materialet som injiseres inneholder partikler eller gjennomgår innstilling, for eksempel sement, filterpressing (fortrinnsrett utvisning av væskefasen) eller bulkinnstilling kan oppstå, noe som fører til ufullstendig injeksjon (figur 1E).
Figur 1: Eksempelkurver generert av denne protokollen. (A)Oppsett av den mekaniske testeren for denne protokollen. (B)Typisk kraftprofilkurve. (C) Force-ekstruderingskurve uten tydelig maksimal topp. (D)Kraftprofilkurve for sprøytesvikt. (E) Force-ekstruderingskurve for en innstilling sement. Dette tallet er tilpasset fra Robinson et al.8. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Mekanisk testing er kanskje den enkleste og mest pålitelige måten å kvantifisere injiserbarhet. En viktig fordel med denne protokollen er at ingen spesialutstyr er nødvendig, annet enn den mekaniske testeren, som er vanlig i materiallaboratorier. Denne protokollen er svært allsidig; materiale, nålemåler og sprøytestørrelse kan brukes, forutsatt at sprøyten kan innkvarteres av klemmene. Dette er bekreftet i denne protokollen for sprøyter opp til 10 ml. Videre kan materialet være forberedt akkurat som det ville for den virkelige anvendelsen25. Til slutt er denne prosedyren veldig rask, tar bare opptil noen få minutter per prøve, slik at titalls prøver kan behandles per time.
For prøver som gir typiske kurver, kan to verdier ekstraheres: maksimal kraft og platåkraftkurvene. Maksimal kraft er uten tvil mer objektiv og kan trekkes ut beregningsmessig fra datatabellen for hvert utvalg. Omvendt kan platåkraften være mer representativ, da dette vil være kraften som oppleves for størst tid, og som et gjennomsnitt er mindre påvirket av kurver med store svingninger. Disse svingningene kan skyldes luftbobler eller partikler i materialet som forårsaker periodiske endringer etter hvert som de ekstruderes, eller ved lav instrumentpresisjon for små kraftmålinger. Det er imidlertid bemerkelsesverdig at det for mange prøver ikke er noen maksimal krafttopp, og så er maksimums- og platåverdien den samme. Objektive sammenligninger mellom injeksjonskrefter kan gjøres så lenge en konsekvent verdi brukes.
Dataene som er innhentet kan brukes på flere måter. Injiserbarhetskraftverdiene kan sammenlignes med enkel injeksjon, for å fastslå hvilke formuleringer, sprøyte- og nålstørrelser som er levedyktige foroversettelse 8. Alternativt, sammenligne mellom prøver gjør det mulig for kvantifisering av endringer i formuleringer på injiserbarhet. For eksempel, i sementer, endre viskositeten av væskefasen, partikkelstørrelsesfordelingen, og legge til tilsetningsstoffer som citrate for å endre kolloidale egenskaper, kan ha store endringer i injiserbarhet9. Disse testene kan også informere formuleringsprotokollen for sementer, for eksempel blandetid, tid til lasting og tid til påføring, for optimal injeksjon og ytelse etter injeksjon. I tillegg kan denne metoden brukes til å teste den første gjennomførbarheten av nye bioinks for 3D-utskrift.
Denne protokollen kan endres på flere måter. Klemmesystemet kan erstattes med en skreddersydd 3D-trykt konstruksjon for å holde sprøyten, noe som kan gjøre det lettere å sikre at sprøyten og stempelet er vinkelrett på tverrhodet, og sprøyten holdes godt. Nålen kan erstattes med en kanyle eller en hvilken som helst enhet som ekstruderer materiale ved kompresjon av et stempel og kan være av alle størrelser og geometri. For å øke resultatenes gjengivelse kan nålens spiss plasseres i et vev eller hydrogel, for å simulere klinisk injeksjon mer nøyaktig. Dette legger imidlertid ytterligere kompleksiteter til protokollen, da vev / gelsammensetning og nålesybde må holdes konstant. Videre benytter denne protokollen forskyvningskontrollert ekstrudering, for å måle kraften som kreves for å injisere med den angitte hastigheten. Alternativt kan injeksjonskraften spesifiseres, og mengden ekstrudering kan måles mot tiden. Dette kan være nyttig for materialer med tidsavhengige egenskaper, for eksempel sementer. For eksempel, ved hjelp av en korrelasjon mellom injeksjonskraft og enkel injiserbarhet for å velge en kraft8, kan denne protokollen brukes til å fastslå om hele volumet av sement kan injiseres med denne hastigheten før innstilling. Til slutt kan denne protokollen enkelt kombineres med andre eksperimenter, for å teste effekten av injeksjon på materialegenskapene og undersøke fenomener som filterpressing og selvhelbredende, eller effekten av injeksjon på celler.
Hovedbegrensningen i denne protokollen er at en universell mekanisk tester er nødvendig. Mens disse er vanlige i materialer testing laboratorier, de er dyre å kjøpe hvis brukeren ikke får tilgang til en. Videre gir den mekaniske testeren uniaxial kompresjon med enten en fast kraft eller hastighet på forskyvning, mens den påførte kraften og injeksjonshastigheten kan variere i løpet av injeksjonen for hånd. Denne protokollen er også uegnet for å replikere noen virkelige injeksjoner, for eksempel injeksjoner i komplekse vev i teater, eller injisere i forskjellige vinkler. For å kvantifisere injeksjonskraften i klinikken, kan kraft- og forskyvningstransdusere være en bedre metode.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av EPSRC CDT for Formulering Engineering ved School of Chemical Engineering ved University of Birmingham, UK, Grant reference EP/L015153/1, og Royal Centre for Defence Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginic Acid Sodium Salt | Sigma | A2033-100G | |
| Blunt Needles | Needlez | NB19G1.5 | Any size may be used, depending on application |
| Calcium Sulphate Hemihydrate | Acros Organics | 22441.296 | |
| Clamp stand | Eisco | MTST5 | Two required |
| Clamps | R&L Enterprises | 41 | Two required, should have flat tops |
| Syringes | BD | 307731 | Any size can be used, depending on application |
| Universal Mechanical Tester | Zwick Roell | Z030 |
References
- Webber, M. J., Appel, E. A., Meijer, E. W., Langer, R.
- Mathew, A. P., Uthaman, S., Cho, K. -H., Cho, C. -S., Park, I. -K. Injectable hydrogels for delivering biotherapeutic molecules. International Journal of Biological Macromolecules. 110, 17-29 (2018).
- Zhou, H., et al. Injectable biomaterials for translational medicine. Materials Today. 28, 81-97 (2019).
- Alves, H. L. R., dos Santos, L. A., Bergmann, C. P. Injectability evaluation of tricalcium phosphate bone cement. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, 2241-2246 (2008).
- Yu, L., Ding, J. Injectable hydrogels as unique biomedical materials. Chemical Society Reviews. 37, 1473 (2008).
- Pawelec, K. M., Planell, J. A. Bone Repair Biomaterials: Regeneration and Clinical Applications. , Elseiver, Woodhead Publishing. (2019).
- Fernandez de Grado, G., et al. Bone substitutes: a review of their characteristics, clinical use, and perspectives for large bone defects management. Journal of Tissue Engineering. 9, 204173141877681 (2018).
- Robinson, T. E., et al. Filling the Gap: A Correlation between Objective and Subjective Measures of Injectability. Advanced Healthcare Materials. , 1901521 (2020).
- O'Neill, R., et al. Critical review: Injectability of calcium phosphate pastes and cements. Acta Biomaterialia. 50, 1-19 (2017).
- Gantar, A., et al. Injectable and self-healing dynamic hydrogel containing bioactive glass nanoparticles as a potential biomaterial for bone regeneration. RSC Advances. 6, 69156-69166 (2016).
- Ramin, M. A., Latxague, L., Sindhu, K. R., Chassande, O., Barthélémy, P. Low molecular weight hydrogels derived from urea based-bolaamphiphiles as new injectable biomaterials. Biomaterials. 145, 72-80 (2017).
- Ren, K., He, C., Xiao, C., Li, G., Chen, X. Injectable glycopolypeptide hydrogels as biomimetic scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 51, 238-249 (2015).
- Burckbuchler, V., et al. Rheological and syringeability properties of highly concentrated human polyclonal immunoglobulin solutions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 76, 351-356 (2010).
- Allmendinger, A., et al. Rheological characterization and injection forces of concentrated protein formulations: An alternative predictive model for non-Newtonian solutions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87, 318-328 (2014).
- Davison, P. F. The Effect of Hydrodynamic Shear on the Deoxyribonucleic Acid from T2 and T4 Bacteriophages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 45, 1560-1568 (1959).
- Chen, M. H., et al. Methods to Assess Shear-Thinning Hydrogels for Application As Injectable Biomaterials. ACS Biomaterials Science and Engineering. 3, 3146-3160 (2017).
- Krebs, J., et al. Clinical measurements of cement injection pressure during vertebroplasty. Spine. 30, (2005).
- Bohner, M., Baroud, G.
- Gbureck, U., Barralet, J. E., Spatz, K., Grover, L. M., Thull, R. Ionic Modification of Calcium Phosphate Cement Viscosity. Part I: Hypodermic Injection and Strength Improvement of Apatite Cement. Biomaterials. 25, 2187-2195 (2004).
- Habib, M., Baroud, G., Galea, L., Bohner, M. Evaluation of the ultrasonication process for injectability of hydraulic calcium phosphate pastes. Acta Biomaterialia. 8, 1164-1168 (2012).
- Martin, B. C., Minner, E. J., Wiseman, S. L., Klank, R. L., Gilbert, R. J. Agarose and methylcellulose hydrogel blends for nerve regeneration applications. Journal of Neural Engineering. 5, 221-231 (2008).
- Borzacchiello, A., Russo, L., Malle, B. M., Schwach-Abdellaoui, K., Ambrosio, L. Hyaluronic Acid Based Hydrogels for Regenerative Medicine Applications. BioMed Research International. 2015, 871218 (2015).
- Zhao, L., Weir, M. D., Xu, H. H. K. An injectable calcium phosphate-alginate hydrogel-umbilical cord mesenchymal stem cell paste for bone tissue engineering. Biomaterials. 31, 6502-6510 (2010).
- Ji, D. -Y., Kuo, T. -F., Wu, H. -D., Yang, J. -C., Lee, S. -Y. A novel injectable chitosan/polyglutamate polyelectrolyte complex hydrogel with hydroxyapatite for soft-tissue augmentation. Carbohydrate Polymers. 89, 1123-1130 (2012).
- Vaishya, R., Chauhan, M., Vaish, A.
