Summary
Apresentado aqui é um protocolo para avaliar quantitativamente a injeção de um material através de um sistema de agulha de seringa usando uma plataforma de teste mecânico padrão.
Abstract
Biomateriais injetáveis estão se tornando cada vez mais populares para a entrega minimamente invasiva de drogas e células. Esses materiais são tipicamente mais viscosos do que as injeções aquosas tradicionais e podem ser semissólidos, portanto, sua injebilidade não pode ser assumida. Este protocolo descreve um método para avaliar objetivamente a injecência desses materiais usando um testador mecânico padrão. O êmbolo da seringa é comprimido pela cabeça cruzada a uma taxa definida, e a força é medida. O valor máximo ou de força do planalto pode então ser usado para comparação entre amostras, ou para um limite de força absoluta. Este protocolo pode ser usado com qualquer material, e qualquer seringa e tamanho de agulha ou geometria. Os resultados obtidos podem ser usados para tomar decisões sobre formulações, seringas e tamanhos de agulha no início do processo translacional. Além disso, os efeitos da alteração das formulações sobre a injeção podem ser quantificados, e o tempo ideal para injetar materiais de mudança temporal determinados. Este método também é adequado como uma forma reprodutível de examinar os efeitos da injeção em um material, para estudar fenômenos como auto-cura e filtrar prensagem ou estudar os efeitos da injeção nas células. Este protocolo é mais rápido e diretamente aplicável à injetabilidade do que a reologia rotacional, e requer um processo mínimo pós-processamento para obter valores-chave para comparações diretas.
Introduction
Os biomaterias são frequentemente estudados e utilizados como andaimes para regeneração tecidual baseada em células e depósitos para entrega direcionada e sustentada de terapêutica1. Nesse campo, os biomateriais injetáveis estão crescendo em popularidade, pois são minimamente invasivos, o que reduz o risco de infecção, dor e cicatrizes associadas à implantação2. Além disso, como geralmente são aplicados como fluidos, eles se conformam perfeitamente com defeitos teciduais, e drogas e células podem ser misturadas neles imediatamente antes da aplicação3,4,5. Como tal, enquanto os biomateriais injetáveis podem ser fabricados como seringas pré-carregadas, eles são frequentemente preparados por médicos diretamente antes da aplicação. Por exemplo, os cimentos começam a definir uma vez que as fases de pó e líquido são misturadas, e por isso não podem ser armazenados por longos períodos antes do uso6. A caracterização desses materiais é, portanto, dependente do tempo e indissociável mente ligada à sua preparação.
Os biomateriais injetáveis comuns incluem cimentos de cálcio, metacrilato de polimetila, bioglasses e vários hidrogéis poliméricos3,7. Ao contrário das injeções tradicionais de drogas, que têm as mesmas propriedades reológicas que a água, esses biomateriais injetáveis são tipicamente mais viscosos, não newtonianos, podem ter algum caráter elástico, e também podem mudar com o tempo. Portanto, a injebilidade desses materiais não pode ser assumida, mas deve ser avaliada experimentalmente. Ao quantificar a força necessária para a injeção e correlacioná-la à facilidade da injeção, as decisões iniciais sobre quais formulações biomateriais, seringas e tamanhos de agulha para levar adiante podem ser tomadas no início do processo de desenvolvimento8. Tais experimentos também podem quantificar os efeitos da mudança de formulações na injeção9.
Existem vários métodos para avaliar as propriedades dos materiais injetáveis. A reologia rotacional é frequentemente utilizada para avaliar a viscosidade, o comportamento não newtoniano, a recuperação pós-tesoura, o tempo de configuração e outras propriedades desses materiais10,11,12. Embora este tipo de teste seja útil para estabelecer propriedades fundamentais dos materiais, essas propriedades não se correlacionam diretamente com a injeçãobilidade. Para um fluido newtoniano e seringa cilíndrica e agulha, a força de injeção pode ser estimada a partir de uma forma da equação Hagen-Poiseuille13:
Onde F é a força necessária para a injeção (N), Rs é o raio de seringa interna (m), Rn é o raio da agulha interna (m), L é o comprimento da agulha (m), Q é taxa de fluxo de fluido (m3 s-1),η é a viscosidade dinâmica (Pa.s) e Ff é a força de atrito entre o êmbolo e a parede do barril (N). Assim, se a viscosidade for medida via reologia rotacional, as dimensões da seringa e da agulha são conhecidas e a taxa de fluxo estimada, a força de injeção pode ser estimada. No entanto, esta equação não explica a extremidade cônica da seringa ou quaisquer outras geometrias, como tomadas fora do centro, e Ffdeve ser estimada ou encontrada experimentalmente por testes mecânicos. Além disso, os biomateriais normalmente não são newtonianos, mas exibem propriedades reológicas complexas. Para um simples fluido de afinamento de tesoura, a equação torna-se14:
Onde n está o índice de potência (-) e K é o índice de consistência (Pa.sn) da expressão Ostwald de Waele: , onde está a taxa 
de 
cisalhamento (s-1). A complexidade aumenta consideravelmente para materiais cujas propriedades reológicas não podem ser caracterizadas por dois valores, e particularmente para materiais dependentes do tempo, como a fixação de cimentos. Além disso, se as propriedades do material forem dependentes da tesoura, o material deve ser testado na taxa de corte esperada na agulha, que pode exceder em muito a faixa de um reômetro rotacional15.
Outro método quantitativo para medir a injeção envolve a fixação de sensores de pressão e deslocamento a uma seringa durante a realização de uma injeção, seja à mão ou usando uma bomba de seringa. Este equipamento é relativamente barato, no entanto, exige que os usuários gerem scripts e curvas de calibração para converter em dados de força16. Além disso, uma bomba de seringa pode não possuir torque suficiente para comprimir o êmbolo a uma taxa precisa se forem necessárias forças altas para extrusão de materiais viscosos ou semissólidos. Alternativamente, utilizar esses sensores ao injetar à mão pode ser útil, pois eles podem ser usados em um cenário clínico real, durante os procedimentos clínicos17. No entanto, isso levará muito mais tempo e pode introduzir viés de usuário, e, portanto, precisará de um número maior de repetições com diferentes usuários para obter resultados confiáveis. Isso pode, portanto, ser mais apropriado para materiais que estão mais abaixo do pipeline translacional, ou produtos já em uso clínico.
Neste protocolo, um testador mecânico é usado para comprimir o êmbolo a uma taxa definida, e medir a força necessária para fazê-lo. Este tipo de testador mecânico é comum em laboratórios de materiais e tem sido usado para quantificar a injeção para vários biomateriais18,19,20,21,22,23,24. Este teste pode ser usado com qualquer tamanho e geometria de seringa e agulha, contendo qualquer material. Além disso, no caso de biomateriais que são feitos imediatamente antes do uso, o procedimento exato de formulação que seria utilizado na clínica ou cirurgia pode ser seguido antes do teste. Outra vantagem deste procedimento é que ele é relativamente rápido; uma vez configurado o testador mecânico, dezenas de amostras podem ser estudadas em uma hora, dependendo da velocidade de extrusão e do volume da seringa. Isso contrasta com a reologia rotacional, que normalmente leva pelo menos 5 a 10 minutos por teste, além de tempo de carga, equilíbrio e limpeza. O uso de um testador mecânico produz uma taxa de extrusão confiável igualmente sobre o êmbolo, o que é particularmente vantajoso para formulações viscosas ou aquelas com propriedades dependentes do tempo. Após o teste, é necessário um mínimo pós-processamento de dados para extrair valores importantes para comparações objetivas.
Protocol
1. Preparação da amostra
- Prepare a amostra e carregue-a na seringa.
- Para simular uma seringa pré-carregada, prepare a amostra com antecedência, carregue-a na seringa e conecte a agulha. Armazene conforme necessário, até o teste. Isso pode ser adequado para hidrogéis e materiais que não mudam com o tempo.
NOTA: Por exemplo, para preparar 2% de soluções de alginato, dissolva 2 g de sal de sódio ácido alginico em 100 mL de água deionizada, mexendo à temperatura ambiente. Aspire a solução em seringas de 5 mL e armazene por 24 horas em temperatura ambiente. - Alternativamente, para simular uma injeção formulada diretamente antes da aplicação, prepare a amostra da mesma forma que seria feita na clínica, permitindo qualquer tempo de configuração. Coloque na seringa e anexe a agulha. Isso pode ser adequado para cimentos e materiais cujas propriedades mudam com o tempo.
NOTA: Por exemplo, para preparar cimento sulfato de cálcio, misture manualmente 4 g de hemihidrato de sulfato de cálcio em 5 mL de água desionizada com uma espátula por 1 min. Retire o êmbolo da seringa e carregue o cimento no cano de seringa com a espátula. Comece o teste mecânico depois de 4 minutos.
ATENÇÃO: As agulhas representam um risco de segurança, use agulhas cegas, se possível. Se o material contiver células ou outros materiais biológicos, deve-se tomar cuidado extra para evitar lesões bruscas.
- Para simular uma seringa pré-carregada, prepare a amostra com antecedência, carregue-a na seringa e conecte a agulha. Armazene conforme necessário, até o teste. Isso pode ser adequado para hidrogéis e materiais que não mudam com o tempo.
2. Configure o testador mecânico
- Conecte as placas planas (para testes de compressão) ao testador mecânico.
- Equipar manualmente o testador mecânico com uma célula de carga com uma carga máxima de 200 N.
NOTA: Uma célula de carga maior pode ser usada, desde que tenha precisão suficiente na faixa de 1 a 200 N. Amostras mais viscosas e não destinadas a serem injetadas à mão podem exigir uma célula de carga maior. - Separe as placas, utilizando os botões de controle manual, para permitir espaço suficiente para a agulha, seringa e êmbolo (cerca de 30 cm serão suficientes).
- Crie um protocolo de teste.
- Abra o assistente de teste e defina o tipo de teste como compressão uniaxial.
- Defina a pré-carga. Este é o valor de força medido no qual os testes começarão. 0,5 N é suficiente.
- Defina a velocidade para pré-carga para 5 mm/min. Esta é a velocidade que o crosshead vai descer até encontrar a pré-carga.
- Defina o carregamento para o controle de deslocamento e selecione uma velocidade de teste apropriada. 1 mm/s é uma velocidade apropriada para uma seringa padrão de 5 mL.
- Estabeleça um limite de força superior para parar o teste, por exemplo, 200 N. Isso é principalmente por razões de segurança. O teste também pode ser interrompido automaticamente em um determinado deslocamento, por exemplo, o comprimento da seringa.
3. Configure o sistema de fixação
- Conecte dois conjuntos de grampos a dois estandes, com apertos grandes o suficiente para ensconce a seringa escolhida com segurança.
- Coloque as aderências entre a cabeça cruzada e a placa base, com espaço suficiente abaixo das aderências para a seringa e a agulha.
- Alinhe os centros das duas garras, e alinhá-los com o centro da cabeça cruzada.
NOTA: O alinhamento das aderências do grampo entre si e o centro da cabeça cruzada pode levar algum tempo e iteração para conseguir, mas é importante adquirir dados de alta qualidade. - Certifique-se de que os grampos estão firmemente fixados para que não haja movimento nos grampos quando uma força descendente for aplicada.
- Coloque um prato na placa inferior para coletar o material extrudado.
4. Execute o protocolo de injeção
- Insira a seringa nas garras do grampo e feche-as. As garras devem manter a seringa no lugar, mas permitem que ela se mova para cima e para baixo sem resistência.
- Certifique-se de que a seringa e o êmbolo são perpendiculares à cabeça cruzada. Isso garante que apenas a compressão uniaxial do material será medida.
NOTA: Uma seringa vazia deve ser usada para verificar as etapas 4.1 e 4.2. - Abaixe a placa superior para uma posição logo acima do êmbolo, usando os botões de movimento manual.
NOTA: Pode ser possível selecionar uma'posição inicial' no protocolo do testador mecânico, de tal forma que a posição original acima do êmbolo seja atingida automaticamente e seja consistente durante todo o teste. - Zero a força medida clicando em 'Zero Force'.
- Execute o protocolo de teste pressionando 'Executar'.
ATENÇÃO: O experimentador deve estar sempre presente para observar cada ensaio, e pronto para ativar a parada de emergência em caso de acidente. - Eleve as placas a uma altura suficiente, usando os botões de movimento manual, de modo que a seringa possa ser removida.
- Repita o passo 4 para cada amostra.
NOTA: Neste ponto, a seringa e a amostra extrudada podem ser descartadas se nenhuma análise adicional for necessária, mas podem ser mantidas para examinar a prensagem do filtro, a auto-cicatrização, os efeitos sobre as células, etc.
5. Coleta de dados
- Salve os dados de cada ensaio em um formato a partir do qual uma tabela de força e valores de deslocamento podem ser gerados (.txt, .xls, .xlsx).
- Plote os resultados de cada ensaio, com deslocamento no eixo x e força no eixo y.
- Leia a força máxima (se existir) e a força do planalto dos gráficos.
Representative Results
A configuração do testador mecânico e do sistema de fixação é mostrada na Figura 1A. Este protocolo gera uma tabela e um gráfico de força versus deslocamento para cada amostra testada. Uma curva típica de deslocamento de força consiste em três seções (Figura 1B): um gradiente inicial, à medida que o êmbolo supera o atrito do barril e o material é acelerado, um máximo de força e um platô, pois o material é extrudido em um estado estável.
No entanto, um máximo distinto só existe onde a força do planalto é menor do que a força necessária para acelerar o êmbolo. Como tal, picos só são vistos para amostras inviscidas que passam por agulhas largas. Para amostras viscosas que passam por um orifício mais estreito, a força necessária para injetar a amostra em velocidade constante é maior do que a força necessária para superar o atrito no barril e acelerar o material, e nenhum pico distinto é visto(Figura 1C). Para amostras altamente viscosas ou agulhas muito estreitas, a força necessária para extrusão do material pode ser tão grande que a seringa dobra e falha, muitas vezes com muito pouca extrusão do material(Figura 1D). Se o material que está sendo injetado contiver partículas ou estiver em fase de ajuste, como cimento, prensagem do filtro (expulsão preferencial da fase líquida) ou ajuste a granel pode ocorrer, levando à injeção incompleta(Figura 1E).
Figura 1: Curvas de amostra geradas por este protocolo. (A) Configuração do testador mecânico para este protocolo. (B) Curva típica de extrusão de força. (C) Curva de extrusão de força sem pico máximo distinto. (D) Curva de extrusão de força para falha da seringa. (E) Curva de extrusão de força para um cimento de ajuste. Este número é adaptado de Robinson et al.8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Testes mecânicos são talvez a maneira mais simples e confiável de quantificar a injeção. Uma das principais vantagens deste protocolo é que não é necessário nenhum equipamento especial, além do testador mecânico, o que é comum em laboratórios de materiais. Este protocolo é altamente versátil; qualquer material, medidor de agulha e tamanho da seringa pode ser usado, desde que a seringa possa ser acomodada pelos grampos. Isso foi verificado neste protocolo para seringas de até 10 mL. Além disso, o material pode ser preparado exatamente como seria para a aplicação do mundo real25. Finalmente, este procedimento é muito rápido, levando apenas até alguns minutos por amostra, permitindo que dezenas de amostras sejam processadas por hora.
Para amostras que dão curvas típicas, dois valores podem ser extraídos: a força máxima e as curvas de força do planalto. A força máxima é indiscutivelmente mais objetiva e pode ser extraída computacionalmente da tabela de dados para cada amostra. Por outro lado, a força do planalto pode ser mais representativa, pois esta será a força experimentada pela maior quantidade de tempo e, como média, é menos afetada por curvas com grandes flutuações. Essas flutuações podem ser causadas por bolhas de ar ou partículas no material que causam alterações intermitentes à medida que são extrudadas, ou por baixa precisão de instrumentos para medições de pequenas forças. No entanto, é notável que, para muitas amostras, não há pico de força máxima, e por isso o valor máximo e planalto são os mesmos. Comparações objetivas entre forças de injeção podem ser feitas desde que um valor consistente seja usado.
Os dados obtidos podem ser usados de várias maneiras. Os valores da força de injeção podem ser comparados à facilidade de injeção, para estabelecer quais formulações, seringas e tamanhos de agulha são viáveis para tradução8. Alternativamente, a comparação entre as amostras permite a quantificação de alterações nas formulações sobre a injeção. Por exemplo, nos cimentos, alterar a viscosidade da fase líquida, a distribuição do tamanho das partículas e adicionar aditivos como citrato para alterar as propriedades coloidais, podem ter grandes alterações na injebilidade9. Esses testes também podem informar o protocolo de formulação de cimentos, por exemplo, tempo de mistura, tempo de carregamento e tempo de aplicação, para ótima injeção e desempenho pós-injeção. Além disso, este método pode ser usado para testar a viabilidade inicial de novos bioinks para impressão 3D.
Este protocolo pode ser modificado de várias maneiras. O sistema de grampos pode ser substituído por uma construção impressa 3D sob medida para segurar a seringa, o que pode facilitar a garantia de que a seringa e o êmbolo sejam perpendiculares à cabeça-de-cruz, e a seringa seja mantida com segurança. A agulha pode ser substituída por uma cânula ou qualquer dispositivo que extrude o material por compressão de um êmbolo e pode ser de qualquer tamanho e geometria. A fim de aumentar a fidelidade dos resultados, a ponta da agulha pode ser colocada em um tecido ou hidrogel, a fim de simular com mais precisão a injeção clínica. No entanto, isso adiciona mais complexidades ao protocolo, já que a composição do tecido/gel e a profundidade da agulha devem ser mantidas constantes. Além disso, este protocolo utiliza extrusão controlada por deslocamento, para medir a força necessária para injetar na velocidade especificada. Alternativamente, a força de injeção pode ser especificada, e a quantidade de extrusão pode ser medida contra o tempo. Isso pode ser útil para materiais com propriedades dependentes do tempo, como cimentos. Por exemplo, usando uma correlação entre a força de injeção e a facilidade de injeção para selecionar uma força8,este protocolo pode ser usado para estabelecer se todo o volume de cimento pode ser injetado com essa velocidade antes da configuração. Finalmente, este protocolo pode ser facilmente combinado com outros experimentos, a fim de testar o efeito da injeção nas propriedades do material e examinar fenômenos como prensagem de filtros e auto-cura, ou o efeito da injeção nas células.
A principal limitação deste protocolo é que um testador mecânico universal é necessário. Embora estes sejam comuns em laboratórios de testes de materiais, eles são caros de comprar se o usuário não puder acessar um. Além disso, o testador mecânico fornece compressão uniaxial em uma força definida ou taxa de deslocamento, enquanto a força aplicada e a velocidade de injeção podem variar ao longo da injeção manualmente. Este protocolo também é inadequado para replicar algumas injeções do mundo real, como injeções em tecidos complexos no teatro, ou injetar em diferentes ângulos. Para quantificar a força da injeção na clínica, transdutores de força e deslocamento podem ser um método melhor.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo CDT EPSRC para Engenharia de Formulação na Escola de Engenharia Química da Universidade de Birmingham, Reino Unido, referência de Grant EP/L015153/1, e pelo Royal Centre for Defense Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginic Acid Sodium Salt | Sigma | A2033-100G | |
| Blunt Needles | Needlez | NB19G1.5 | Any size may be used, depending on application |
| Calcium Sulphate Hemihydrate | Acros Organics | 22441.296 | |
| Clamp stand | Eisco | MTST5 | Two required |
| Clamps | R&L Enterprises | 41 | Two required, should have flat tops |
| Syringes | BD | 307731 | Any size can be used, depending on application |
| Universal Mechanical Tester | Zwick Roell | Z030 |
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